NO783545L - Fremgangsmaate til fremstilling av deoksynarasinantibiotisk kompleks - Google Patents

Description

Deoksynarasinantibiotika samt fremgangsmåter for deres fremstilling.

Deoksynarasinantibiotikakomplekset som består av 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin fremstilles ved nedsenket aerob fermentering av Streptomyces aureofaciens NRRL 11.181. 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin kan skilles og isoleres ved hjelp av kromatografi. Deoksynarasinkomplekset, dvs. 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin, er virksomme mot bakterier og mikroorganismer som frembringer kokkidase, og oker dessuten forutnyttelseseffektiviteten hos drovtyggere.

Det er et stadig okende behov innenfor veterinærmedisinen for bedrede antibiotika. F.eks. er kokkidiose et meget alvarlig problem i fjærkreindustrien. Kokkidiose opp-står ved infeksjon av én eller flere arter av slektene Eimeria eller Isospora (for en oppsummering, sé Lund og Farr i "Dis-eases of Poultry", 5. utgave, Biester og Schwarte, utgave Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1965, side 1056 - 1096). Hver år opplever man store tap på grunn av kokkidiose, og det er folgelig et behov for et middel som kan bekjempe denne sykdommen.

Det å oke veksten hos kveg og sau og andre drovtyggere er også meget onskelig. Av spesiell interesse er den vekstokning man kan oppnå ved å oke forutnyttelseseffekten. Selve mekanismen for utnyttelsen av hovednæringsdelen (karbohydratene) i for for drovtyggere er velkjent. Mikroorganismer i magen hos dyret nedbryter karbohydratene til monosakka-rider og omdanner, så disse monosakkaridene til pyruvatfor-bindelser. Pyruvatforbindelsene blir metabolisert ved hjelp av mikrobiologiske prosesser til acetater, butyrater eller propionater, kollektivt ofte betegnet flyktige fettsyrer. For en mer detaljert beskrivelse og diskusjon, se Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, side 408 - 410. «

Den relative effektiviteten ved utnyttelsen av såkal-te flyktige fettsyrer er beskrevet og diskutert av McCullough i Feedstuffs, 19. juni 1971, side 19; Eskeland et al i J. An. Sei. 33, 282 (1971) og Church et al. i "Digestive Physiology

and Nutrition of Ruminants", bind 2, 1971, side 622 og 625. Skjont acetater og butyrater blir utnyttet, så. blir propiona-tene med storre effektivitet. Videre er det slik at når det er for lite propionat, så kan dyrene utvikle ketose. Det er folgelig meget onskelig hvis man kan frembringe forbindelser som stimulerer dyrene til å produsere en hoyere mengde av propionater fra karbohydrater, hvorved man vil oke karboutnyt-telseseffektiviteteh og dessuten redusere faren for ketose.

20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin er

nye polyeterantibiotika, og de er nær beslektet til det tidligere kjente polyeterantibiotikum narasin (antibiotikum ■ A-28.086 faktor A, U.S. patenter 4.035.481 og 4.038.^84). Narasinets struktur som er foreslått i disse patenter og av Occolowitz et al (Biomed. Mass Spectrometry 3, 272 - 277 (1976)) ble nylig bekreftet av H. Seto et al. (J. Antibiotics 30 (6), 530 - 532 (1977)) og viste seg å være folgende:

Som også angitt av Seto et al., så er narasin nær beslektet til salinomycin (salinomycin = 4-demetyl-narasin).

Mer nylig har J. ¥. Westley et al rapportert angående C-17-epimere av deoksy-(0-8)-salinomycin (J. Antibiotics 30 (7),

610 -. 612 (1977))'Skjont epimerene av deoksysaLtnomycin er analoge til epimerene av deoksynarasin ifolge foreliggende oppfinnelse, er det ikke kjent noen kjemisk fremgangsmåte

ved hjelp av hvilken deoksynarasinepimerene kan fremstilles fra de nevnte deoksysalinomycinepimerene.

Foreliggende oppfinnelse angår deoksynarasinantibiotikakomplekset som består av minst to individuelle faktorer, nemlig 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin. Kom-plekset kan fremstilles ved at man kultiverer en rase av organismen Streptomyces aureofaciens Duggar, NRRL 11.181.

Med begrepet "antibiotikakompleks" slik det brukes

i fermenteringsindustrien og i foreliggende oppfinnelse, refererer det seg ikke til et kjemisk kompleks, men til en blanding av samproduserte, individuelle antibiotikafaktorer.

Det tor være.velkjent i forbindelse med antibiotika at forholdet mellom de individuelle faktorer som fremstilles i et slik antibiotikakompleks, vil variere sterkt, avhengig av de betingelser som brukes under fermenteringen.

Farmasøytisk akseptable salter av 20-deoksynarasin

og 20-deoksy-epi-17-narasin inngår også i foreliggende oppfinnelse. Av hensiktsmessighetsgrunner vil begrepet "deoksynarasinantibiotikum" bli brukt om enhver forbindelse valgt fra gruppen bestående av deoksynarasinantibiotikakomplekset, 20-deoksynarasin, 20-deoksy-epi-17-narasin, og farmasoytisk akseptable salter av de to sistnevnte forbindelser.

Deoksynarasinantibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse hemmer veksten av organismer som er patogene både for dyr og planter. Det har videre vist seg at nevnte deoksynarasinantibiotika virker mot<:>organismer som fremkaller kokkidiose. I tillegg til dette oker nevnte antibiotika forutnyttelseseffektiviteten hos drovtyggere..

Deoksynarasinantibiotikakomplekset består av 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin og oppnås ved fermenteringen som en blanding og kan siden skilles fra deoksy narasinkomplekset og isoleres som individuelle forbindelser slik det vil bli beskrevet i det etterfølgende. Deoksynarasinkomplekset inneholder også mindre faktorer som kan fjernes ved de fremgangsmåter som vil bli beskrevet. Deoksynarasinantibiotikakomplekset er opploselig i de fleste organiske opplosningsmidler, men uopplbselig i vann.

20- deoksynarasin

20-deoksynarasin som er en av faktorene ifolge fore-liggene oppfinnelse, har samme absolutte konfigurasjon som narasin. Strukturen på 20-deoksynarasin er vist ved hjelp av formel 1:

20- deoksv- epi- 17- narasin

Strukturen på denne forbindelsen er vist ved formel 2.

En av de beste fremgangsmåter for å skille narasin .

(A-28.086 faktor A), 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin er å bruke<13>C kjernemagnetisk resonansspektrometri. Tabell. I viser 1^-^C NMR-spektra av disse forbindelser, hver som den frie syre, kjort i deuterokloroform (data--.i ppm).

tabell I forts. En annen god fremgangsmåte for å skille 20-deoksy-narasin fra 20-deoksy-epi-17-narasin og fra kjente A-28.086-faktorer, innbefatter papir- og tynnsjiktkromatografi. Således er Rf-verdiene for narasin (A-28.086 faktor A), A-28.086 faktor D, 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin i forskjellige papirkromatografiske systemer, hvor man brukte Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme, angitt i tabell II.

R^-verdiene for disse antibiotika ved et typisk tynnsjiktkromatografisystem hvor man brukte silisiumdioksydgel er vist i tabell III.

Deoksynarasinantibiotika (20-deoksyriarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin er qpplbselige i en rekke organiske

. opplosningsmidler såsomnetanol, etanol, dimetylformamid, di-metylsulfoksyd, etylacetat, kloroform, aceton og benzen, men bare svakt opploselige i ikke-polare organiske opplosningsmidler såsom heksan, og er uoppløselige i vann. Det skal imidlertid angis at. 20-deoksynarasin fri syre er ustabil i alkoholer og omdannes til 20-deoksy-epi-17-narasin fri syre. Således, når 20-deoksynarasinsyre (4,35,1 mg) blir opplost

i 40 ml metanol og hensatt ved romtemperatur i 4 timer. Opp-løsningen ble så fordampet til torrhet under vakuum og residuet ble gjenopplost i dioksan og lyofilisert, hvorved man fikk 417,8 mg 20-deoksy-epi-17-narasinsyre.

Et annet stoff som kromatografisk faller sammen med A-28086-1 som er beskrevet i U.S. patent r.038.384, blir produsert samtidig med deoksynarasinkomplekset. Skjbnt denne forbindelsen begynnelsen felles ut sammen med nevnte deoksynarasinantibiotika, så kan den lett skilles fra disse ved silisiumdioksydgel-kromatografi. Ved slik kromatografi er denne forbindelsen mindre polar enn både 20-deoksy-narasin og 20-deoksy-epi-17-narasin når man bruker etylacetat som utviklende opplosningsmiddel. Vanillin-reagens ( 3% vanillin i metanol + 0,5 ml konsentrert I^SO^pr. 100 ml opplosning) kan hensiktsmessig brukes for påvisning. Etter sproyt-ing med vanillin og oppvarming, vil denne forbindelsen, som A-28086-1, gi et blått punkt, mens deoksynarasinantibiotika vil gi klare gule flekker som siden morkner.

20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17.-narasin er istand til å danne salter. Farmasoytisk akseptable alkali-

metall-, jordalkalimetall-og aminsalter av 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin inngår også i foreliggende oppfinnelse. Med "farmasbytisk apseptable salter" forstås salter hvor toksisiteten av forbindelsen som et hele i varmblodige dyr ikke oker i forhold til ikke-saltformen. Representative og egnede alkalimetall- og alkalijordmetallsalter av 20-doksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin innbefatter natrium-, kalium-, litium-, cesium-, rubidium-, barium-, kalsium- og magnesiumsalter.. Egnede .aminsalter innbefatter- ammonium-saltet og primære, sekundære og tertiære C-^-C^-alkylammonium-og hydroksy-C2-C^-alkylammoniumsalter. Illustrerende aminsalter innbefatter de som dannes ved å reagere 20-deoksy--narasin og 20-deoksy-epi-17-narasin med ammoniumhydroksyd, metylamin, sek.-butylamin, isopropylamin, dietylamin, diiso-propylamin, etanolamin, trietylamin, 3-amino-l-propanol og lignende.

Alkalimetall og alkalijordmetall kationiske- sal-

ter av forbindelsene fremstilles ved hjelp av fremgangsmåter'som vanligvis brukes for fremstilling av kationiske salter. Således kan den frie syreformen av antibiotikumet opplbses

i et egnet opplbsningsmiddel såsom aceton eller dioksan*-vann, hvoretter man tilsetter en opp'lbsning inneholdende den stbkiometriske mengde av den foronskede uorganiske base. Det dannede salt kan så isoleres på kjent måte, f.eks. ved filtrering eller ved fordampning av opplbsningsmidlet. ;De salter som dannes med organiske aminer kan fremstilles på lignende måte. Således kan f.eks. et gass-formet eller flytende amin tilsettes en opplbsning hvor antibiotikumet er i et egnet opplbsningsmiddel, f.eks. aceton, ;og opplbsningsmidlet og overskuddet av amin kan så fjernes ved fordampning. ;En foretrukken fremgangsmåte for fremstillingen av det foronskede salt av én av de angitte deoksynarasinantibiotika er å gjore et passende valg av isoleringsmetode, f.eks. ved å justere pH på mediet med en passende base eller tilsette et passende kationisk salt til det ekstraherende opplbsningsmiddel. ;Det er velkjent innenfor veterinærmedisinen at formen av antibiotikumet er uten betydning når man behandler et dyr med antibiotikumet. I de fleste tilfeller vil betingelser og tilstanden inne i dyret forandre den tilforte aktive forbindelse til andre former enn den form i hvilken den ble tilfort.' Saltformen som kan tilfores er*derfor

uten betydning for behandlingen. Saltet kan imidlertid vel-ges av andre grunner såsom okonomi, hensiktsmessighet og toksisitet.

De nye antibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse fremstilles ved å kultivere en deoksynarasin-produserende

rase av Streptomyces aureofaciens under nedsenkede aerobe

. betingelser i et egnet kulturmedium inntil man får fremstilt en vesentlig antibiotisk aktivitet. Nevnte antibiotika kan så innvinnes på forskjellig måte slik dette gjore i industri-en.

Den organisme som kan brukes for fremstillingen av de angitte doksynaråsinantibiotika, ble fremstilt ved en såkalt N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin-indusert mutering av Streptomyces aureofaciens NRRL 8092. Den taksonomiske basis på hvilken S. aureofaciens NRRL 8092 ble klassifisert som en rase av Streptomyces aureofaciens Duggar, er beskrevet i U.S. patent 4.038.384.

Den angitte Streptomyces aureofaciens-kultur som kan brukes for fremstillingen av de angitte deoksynarasinantibiotika er plasert og utgjor en del av-kultursamlingen i Northern Regional Research Center, U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, hvor-fra den er tilgjengelig for offentligheten under tallet NRRL 11.181.

Kulturen som her er identifisert som NRRL 11.181, ble isolert og mutert fra en kultur av Streptomyces aureofaciens som opprinnelig ble isolert fra en jordprdve fra. Mount Ararat i Tyrkia. Det opprinnelige jordisolatet ble dyrket på agarplater og underkulturer ble oppnådd ved å fjerne individuelle kolonier av mikroorganismen fra overflaten av agarplaten.

En av enkeltisolatene som ble oppnådd fra en kultur av det opprinnelige jordisolatet var kulturen som her er identifisert som NRRL 5758.

Den naturlig utvalgte kultur ble igjen utstroket

på en plate, og igjen ble en enkelt koloni uttatt. Denne naturlige seleksjonsprosess ble gjentatt åtte ganger, og niende generasjon av en enkeltkoloni-isolat ble valgt for videre seleksjon.

Det niende generasjonsisolatet ble dyrket på

et kjemisk vel definert agarmedium med 1% galaktose som eneste karbonkilde. En sporesuspensjon ble fremstilt ved ultralydrbring av agarmediet for å frigjore sporene, og hyfefragmenter ble holdt unna så godt som mulig ved å fil-trere suspensjonen gjennom et Whatman nr. 1 filtrerpapir.

Sporesuspensjonen ble dyrket i et komplekst flytende medium hvis pH ble justert til 8,8, og som inneholdt 2 mg/ml N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin i 72 timer ved

30°C. Kulturene ble så hostet og homogenisert i et vevs-maleapparat.

Den homogeniserte kultur.ble fortynnet og utstroket på agarplater og inkubert ved 30°C inntil man kunne skille individuelle kolonier. En av disse individuelle kolonier ble brukt for å starte en ny kultur som ble gitt nummer-

et NRRL 8092.

Denne kulturen ble "dyrket i et kjemisk definert agarmedium med glukose som eneste karbonkilde. En suspen-

sjon inneholdende både sporer og hyfefragmenter ble frem-

stilt ved ultralydrbring av mediet. Denne blandede suspen-sjon ble så eksponert for 2 mg/ml N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin i et komplekst .flytende medium med pH 8,8 i 96 timer ved 30°C i et rbreapparat, hvoretter kulturen ble hostet, homogenisert og utstroket som beskrevet ovenfor. En av de individuelle kolonier ble utvalgt fra disse agarplater og så

dyrket for å gi den kultur som her er identifisert som NRRL 11.181.

Det tor være innlysende at det nå er mulig å

utvikle ytterligere raser som i alt vesentlig har samme biosyntetiske egenskaper som S. aureofaciens NRRL 11.181

(dvs. evnen til å produsere 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin) ved at man underkaster S. aureofaciens NRRL 5758, 8092 og 11.181 en mutagenisk behandling. Skjbnt N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin ble brukt for å oppnå S.

aureofaciens NRRL 11.181, så kan det også brukes andre kjente mutagene midler såsom ultrafiolette stråler, rontgen, hby-frekvensbblger, radioaktive bolger og andre kjemiske midler. Det er fblgelig en del av oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av deoksynarasinahoibiotika-komplekset som innbefatter at man kultiverer en rase av Steptomyces aureofaciens som har i alt vesentlig de samme biosyntetiske egenskaper og evner som NRRL 11.181.

Det kulturmedium som brukes for å dyrke Streptomyces aureofaciens NRRL 11.181 kan være ethvert av en rekke media. Hensyn til Skonomi ved fremstillingen, optimalt ut-bytte og lett isolering gjor at visse kulturmedia er foretrukket. Således er de foretrukne karbohydratkilder ved fermentering i stor skala tapiokadekstrin og sukrbse, skjbnt man kan bruke glukose, maisstivelse, fruktose, mannose, mal-tose, laktose og lignende. Videre kan man også bruke mais-olje, jordnbttolje, soyaolje og fiskeolje som egnet kilde for karbon. En foretrukken nitrogenkilde er enzymhydrolysert kasein, skjbnt man kan bruke peptoner, soyabbnnemel, bomulls-frbmel, aminosyrer som glutaminsyre o.l. Blant de uorganiske salter som kan tilsettes mediet er de vanlige opplbselige salter som er istand til å gi natrium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, klorid-, karbonat-, sulfat-, nitrat og lignende ioner.

Vesentlige sporelementer som er nbdvendige for vekst og utvikling av organismen bor også tilsettes', kulturmediet. Disse sporelementene vil vanligvis opptre som uren-heter i de andre bestanddelene i tilstrekkelig mengder til at man oppfyller de krav som organismen stiller på dette punkt. Det kan være nbdvendig å tilsette mindre mengder (dvs. 0,2 ml/liter) av et antiskumningsmiddel såsom polypro-pylenglykol til store fermenteringsmedia hvis skumdarinelse blir et problem.

Skjbnt det ikke er vesentlig,så vil antibiotika-fremstillingen bli bedret'ved at man-tilsetter en mindre.

mengde av en olje såsom soyabbnneolje.

Hvis man bnsker å fremstille vesentlige mengder

av de angitte antibiotika, så er det foretrukket å utfore

nedsenket aerob fermentering i tanker. Mindre mengder kan oppnås ved kulturer hvor man rister kolber. På grunn av at man får en relativt stor tidsforsinkelse ved antibiotikafremstilling når man inokulerer store tanker med sporeformen av organismen, er det foretrukket å bruke et vegetativt inokulum. Dette inokulumet kan fremstilles ved å inokulere et mindre volum av mediet med sporeformen eller mycelfragmenter av organismen, for derved å oppnå en frisk og aktiv voksende kultur av organismen. Det vegetative inokulumet kan så overfores til en storre tank. Det medium som brukes for å dyrke det vegetative inokulumet kan være det samme man bruker for den storre fermenteringen, men man kan også bruke forskjellige media.

Den deoksynarasin-fremstillende organismen kan dyrkes ved temperaturer mellom 20 og 40°C, men man får opti-mal produksjon ved temperaturer fra 27 - 30°C.

Som vanlig i forbindelse med aerobe nedsenkede kulturer blåses steril luft gjennom kulturmediet. For å få effektiv vekst av organismen bor luftvolumet i tanken fortrinnsvis være 0,1 volum luft pr. volum av kulturmediet pr. minutt. For å få en effektiv antibiotikafremstilling bor luftvolumet under tankfremstillingen fortrinnsvis være 0,25 volumer luft pr. volum av kulturmediet pr. minutt. Store mengder av opplost oksygen synes ikke å nedsette antibioti-kafremstillingen.

Fremstillingen av de foronskede antibiotika kan folges under fermenteringen ved å ta ut prover av mediet eller ekstrakter av fast mycel og undersoke dette for antibiotisk aktivitet mot organismer .som man vet er folsomme for antibiotika. En proveorganisme som kan brukes for proving av antibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse, er Bacillus subtilis ATCC-6633. En slik. proving kan hensiktsmessig ut-fores ved papirskiveproye på agarplater.

En annen hensiktsmessig metode er en såkalt turbido-metrisk prove i et semiautomatisk system ("Autoturb" microbiolo-gical assay system, Elahco) som er beskrevet av N.R. Kuzel og F.W. Kavanaugh i J. Pharmaceut.. Sei. 60 (5), 764 og 767 (1971). Ved proving av de angitte deoksynarasinantibiotika ble folgende

proveparametere brukt:

Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 i et næringsmedium (pH 7) inkubert i 4 timer ved 37°C. Provene og standard ble opplost i metanol-vann (1:1). Standarden, A-28086 faktor A, ble tilsatt "Autoturb"-karrusein.en i konsentrasjoner på 1, 2, 3, 4 og mcg/ml.

Den begynnende pH på det uinokulerte kulturmedium varierer med type av medium. Vanligvis vil verdien ligge i området fra 6,0 - 7,5. pH ved innhøstningen ved slutten av fermenteringen vil vanligvis være noe hbyere, dvs. i området. fra 6,5 - 8,0.

Antibiotisk aktivitet vil vanligvis kunne påvises

så tidlig som annen dag av fermenteringen. Maksimum produksjon av antibiotisk aktivitet skjer vanligvis mellom fjerde,

og tiende dag etter start .av fermenteringen.

Etter fremstillingen kan nevnte doksynarasinantibiotika innvinnes fra fermenteringsmediet ved velkjente fremgangsmåter. Det antibiotika som er fremstilt opptrer både i mycelmassen og i den filtrerte væsken. Maksimum innvinning av doksynarasinantibiotika oppnås derved ved en kombinasjon av metoder, såsom filtrering, ekstraksjon og adsorbsjons-kromatografi. Et foretrukket 6pplosningsmiddel for å skille deoksynarasinantibiotika enten fra den ufiltrerte eller filtrerte fermenteringsvæsken, er etylacetat, skjont man kan også bruke andre opplosningsmidler.

En annen spesielt fordelaktig fremgangsmåte for

å utskille de foronskede antibiotika er å senke pH på fermenteringsmediet til ca. pH 3,0. Ved denne verdi vil de angitte antibiotika hensiktsmessig kunne skilles sammen med mycelmassen ved hjelp av filtrering. Denne fremgangsmåten er beskrevet for innvinning av nærstående antibiotika, A-28086 faktorene A, B og D og salinomycin, av Boeck og Berg i U.S. patent 4.009.262.. Et annet fordelaktig trekk ved denne fremgangsmåte innbefatter at man tilsetter et bikarbonat, f.eks. natriumbikarbonat, til mediet i en mengde på ca. 1 g pr.

liter. Ved å bruke denne fremgangsmåte kan de angitte deoksynarasinantibiotika hensiktsmessig utskilles med mycelmassen i form av et salt. Metanol er et foretrukket opplosnings-

middel for å skille antibiotika fra mycelmassen, men man kan også bruke andre lavere alkoholer og ketoner.

Azeotropisk destillasjon kan også med fordel

brukes ved innvinning av de angitte deoksynarasinantibiotika.

I denne fremgangsmåte vil man tilsette et organisk opplosningsmiddel som danner en passende azeotrop med vann, til det vandige fermenteringsmediet. Deretter underkaster man blandingen av opplbsningsmidlet og mediet en azeotropisk destillasjon for i det minste å fjerne halvparten av vannet fra mediet, hvorved man får en blanding av vann og opplbsningsmiddel hvor deoksynarasinantibiotika er i opplbsning

i det organiske opplbsningsmiddel. Uoppløselige biprodukter kan fjernes på egnet måte, f.eks. ved filtrering eller sen-trifugering. De angitte og ønskelige antibiotika kan så innvinnes fra den organiske oppløsningen på velkjent måte, f.eks. ved å fordampe opplbsningsmidlet, ved ufelling ved å tilsette et ikke-opplbsningsmiddel eller ved ekstraksjon.

Organiske opplbsningsmidler som danner passende azeotroper med vann og som kan brukes i ovennevnte frem-

gå gsmåte, innbefatter butylalkohol, amylalkohol, heksyl-•alkohol, benzylalkohol, butylacetat, amylacetat, 1,2-diklor-etan, 3-pentanon, 2-heksanon, 'benzen, cykloheksanon, toluen, xylener og lignende.

Det er en spesiell fordel å utfore innvinningen

ved azeotropisk destillasjon når man utforer fermenteringen i stor skala. Både vann og opplbsningsmiddel som tas ut på toppen av kolonnen kan skilles på kjent måte og deretter re-sirkuleres for ny bruk. Det vann som således fjernes er fritt for forurensninger og krever ingen videre behandling for annet bruk.

Ytterligere rensing av deoksynarasinantibiotika krever ytterligere ekstraksjon og adsprbsjon. Adsorberende materialer man kan bruke kan f.eks. silisiumdioksydgel, karbon, "Florisil" (magnesiumsilikat, Floridin Co., P.O. Box 989, Tallahassee, Fla.) og lignende.

Alternativt kan de faste stoffer av kulturen så-

som bestanddeler i mediet og mycelet brukes uten ekstraksjon eller separasjon, men fortrinnsvis etter at man har fjernet

vann, som en kilde for nevnte deoksynarasinantibiotikakompleks. F.eks. etter fremstillingen av deoksynarasinanti-biotisk aktivitet kan mediet torkes ved lyofilisering eller ved tromraeltbrking og fores direkte inn i en forblanding.

I et annet aspekt etter fremstillingen, av deoksy-narasinaktivlteten i kulturmediet, kan mycelet skilles ut og torkes, hvorved man får et produkt som kan brukes dir-

ekte i en forblanding. Når man utskiller mycelet for dette formål, så vil det lette at man tilsetter kalsiumkarbonat i en mengde på 10 g/l, og dette gir et forbedret torket produkt.

Under de fermenteringsbetingelser man hittil har anvendt, så vil man få fremstilt 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin som hovedfaktorene fra den Streptomyces aur.eo-faciens-rase som er beskrevet tidligere og som er betegnet NRRL 11181. Noen mindre faktorer kan også innvinnes fra S. aureofaciens NRRL 11181 i mengder som er så små at de ikke gjor det mulig å karakterisere dem. Skjbnt forholdet mellom faktorene varierer med hensyn til de fermenterings- og isoler-ingsbetingelser man bruker, så vil man vanligvis innvinne mer 20-deoksy-epi-17-narasin enn 20-deoksynarasin.

De to ovennevnte antibiotika kan skilles fra hverandre og isoleres som individuelle forbindelser ved hjelp av kjente fremgangsmåter, såsom kolonnekromatografi, tynnsjiktkromatografi, motstromsfordeling og lignende. Således kan man bruke kolonnekromatografi over silisiumdioksydgel for å skille 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin ved å eluere kolonnen med varierende opplosningsmiddelbland-inger. Således kan man bruke benzen-etylacetatblandinger over en silisiumdioksydgelkolonne,'da vil 20-deoksy-epi-17-narasin bli eluert forst ,v mens 20-deoksy-narasin elueres senere. Tynnsjiktkromatografi på silisiumdioksydgel idet man bruker 100% etylacetat som opplbsningsmiddel, er en hensiktsmessig fremgangsmåte for å styre elueringsprosessen.

De angitte deoksynarasinantibiotika ifolge fore-, liggende oppfinnelse er virksomme antibakterielle midler. Således er f.eks. den relative mikrobiologiske aktiviteten

for 20-deoksy-epi-17-narasin (fri syre) angitt i tabell IV.

Man brukte den vanlige skivediffusjonsmetoden.

De angitte deoksynarasinantibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse hemmer veksten av anaerobe bakterier. Den minimalt hemmende konsentrasjon (MIC) ved hvilken 20-deoksy-epi-17-narasin (fri syre) hemmer forskjellige anaerobe bakterier, ble bestemt ved den velkjente standard agarfortynnings-proven, og resultatene er angitt i tabell V. Sluttpunktene ble avlest etter 24 timers inkubering.

Aktivitet mot Mycoplasma er en annen verdifull egenskap ved de angitte deoksynarasinantibiotika. Mycoplasma-arter, også kjent som pleuropneumonia-lignende (PPLO organismer, er patogene for mennesker og forskjellige dyr. Midler som er aktive mot PPLO-organismer er spesielt etterspurt' i fjærkreindustrien. Minimalt hemmende konsentrasjoner (MIC) for 20-deoksy-epi-17-narasin (fri syre) mot visse illustrerende Mycoplasma-arter, slik de kunne bestemmes ved en in vitro mediumsfortynningsprove, er angitt i tabell VI.

De angitte deoksynarasinantibiotika er også virksomme mot virus. Således er f.eks. 20-deoksy-epi-17-narasin aktiv mot rhinovirus type 3, kukoppevirus, herpesvirus og influensa A virus, noe som kunne vises i prover som tilsvarer de som er beskrevet av Siminoff, Applied Microbiology 9 (l), 66 - 72 (1961).

I et aspekt av foreliggende oppfinnelse kan folgelig et deoksynarasinantibitikum tilfores oralt, topikalt eller parenterat til pattedyr for å regulere veksten av virus. Brukbare doseringsnivåer for å hindre eller behandle virus-sykdommer vil variere fra ca. 1 - 5 mg/kg kroppsvekt avhengig av .den virus man onsker å bekjempe, og hvorvidt medisinen brukes profylaktisk eller terapeutisk.

Videre kan oppldsninger inneholdende et deoksynarasinantibiotikum, fortrinnsvis sammen med et overflateak-tivt middel, brukes for å rense de steder hvor slike virus er tilstede, f.eks. poliovirus eller herpesvirus. Man kan bruke oppldsninger inneholdende fra ca. 1 til ca. 1500 mcg/ml av et deoksynarasinantibiotikum.

De akutte toksiteter for 20-deoksy-epi-17-narasin (fri syre) og 20-deoksynarasin (Na-salt) når det ble tilfort intraperitonealt til mus og uttrykt som LD^q, er 201 mg/kg og 5 mg/kg, henholdsvis.

Antikokkidal aktivitet er en meget viktig egenskap ved de deoksynarasinantibiotika som er beskrevet her. Så-

ledes viste in vitro eksperimenter at 20-deoksynarasin (Na-salt) og 20-deoksy-epi-17-narasin (fri syre) er aktive mot Eimeria tenella, den protozoorganismen som oftest er forbundet med kokkidiose, ved nivåer så lavt ned som 0,2 ppm.

Et foreksperiment i unge kyllinger bekrefter at deoksynarasinantibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse har antikokkidal aktivitet in vivo. I dette eksperiment ble 20-deoksynarasin (Na-salt) tilfort i mengder på 100 ppm i foret til kyllinger som var smittet med Eimeria tenella, og dette hindret mortalitet, bedret vektøkningen og nedsatte antall lesjoner hos kyllingene. Resultatene av eksperimentet er angitt i tabell VII.

For å hindre eller å behandle kokkidiose hos fjærkre så' kan man tilfore en effektiv mengde av deoksynarasinantibiotikum til fuglene, fortrinnsvis oralt på daglig basis. Det angitte antibiotikum kan tilfores på mange måter, men

det er mest hensiktsmessig å tilfore det sammen med fysiolo-gisk akseptabelt bærestoff, fortrinnsvis det for som spises av fuglene. Skjbnt det må tas hensyn til en rekke faktorer når man skal bestemme en passende konsentrasjon av antibiotikumet, så vil mengden vanligvis ligge i området fra 0,003 - 0,03 vektprosent av foret, fortrinnsvis i området fra 0,004 - 0,02%.

Foreliggende oppfinnelse angår således også anti-kokkidale forsammensetninger for fjærkre som innbefatter et fjærkrefor og fra ca. 35 - ca. 180 g pr. tonn for av et deoksynarasinantibiotikum.

Evnen til å bedre forutnyttelseseffektiviteten hos dyr er et annet viktig trekk ved de angitte deoksynarasinantibiotika. Således vil deoksynarasinantibiotika bedre forutnyttelseseffektiviteten hos drovtyggere som har utviklet en drøvtyggende funksjon.

Som nevnt tidligere så bkes karbohydratutnyttelsen hos drovtyggere ved behandlinger som stimulerer floraen i dyrets mage på en slik måte at man får fremstilt propionatforbindelser heller enn acetat- eller butyratforbindelser. Forutnyttelsen kan styres ved å observere produksjon og konsentrasjon av propionatforbindelser i magevæsken ved at man bruker fremgangsmåter av den type som f.eks. er beskrevet i

U.S. patent 4.038.384.

I. tabell VIII er det vist resultatene av in vitro-prover med 20-deoksynarasin (Na-salt) og 20-deoksy-epi-17-narasin (fri syre) som viser forholdet mellom flyktige fettsyrer i behandlede kolber i forhold til konsentrasjonen i kontrollkolber.

Deoksynarasinantibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse er typisk effektive for å oke mengden av propionater, og derved også effektiviteten ved forutnyttelsen når de tilfores drovtyggere oralt i mengder på fra 0,05 mg/kg/dogn til 5,0 mg/kg/dogn.'Man oppnår de mest fordelaktige resultater i mengder på fra 0,1 mg/kg/dogn til ca. 2,5 mg/kg/dogn. En foretrukken tilfbrselsmetode for nevnte antibiotika er å

blande dem med.dyrets for, men det kan også tilfores på annen måte, f.eks. i form av tabletter, væsker eller kapsler. Opparbeidelse av de forskjellige doseringsformer kan ut-

fores på velkjente fremgangsmåter. Hver av de individuelle doseringsenhetene bor inneholde en mengde av en forbindelse ifolge foreliggende oppfinnelse som står i direkte forhold til den daglige dose som dyret skal ha.

Oppfinnelsen angår således forsammensetninger som

er tilpasset drovtyggere såsom kuer og sauer. Slike forsammensetninger innbefatter selvé foret og fra 1 - 30 g pr.

tonn for av et deoksynarasinantibiotikum.

Svinedysenteri er en vanlig sykdom i' De Forenede Stater og andre land, og forårsaker hvert år store tap for svineindustrien. U.S. patent 3.947.586 beskriver at polyeterantibiotika kan brukes for'å hindre og for å behandle svinedysenteri. Ettersom de angitte deoksynarasinantibiotika er nye forbindelser av denne type polyeterantibiotika, så

skulle de være effektive for å hindre og for å behandle svinedysenteri.

For å behandle eller for å hindre dysenteri hos

svin, så er det foretrukket å inkorporere eller tilsette en effektiv mengde av et deoksynarasinantibiotikum til selve foret. Deoksynarasinantibiotika ifolge foreliggende oppfinnelse skulle være typisk effektive for å hindre eller regulere svinedysenteri når de eller det tilfores svin oralt i mengder på fra 35 - 150 g aktiv forbindelse pr. tonn for. Spesielt foretrukken mengde bor være ca. 100 g aktiv forbindelse pr. tonn for. Skjbnt den foretrukne fremgangsmåte for tilfbrsel er å blande antibiotikumet med foret, så kan det selvsagt også tilfores på andre måter, f.eks. i form av tabletter, i væsker eller i kapsler. Hver individuelle doserings-

enhet bor inneholde en antibiotikamengde som står i et direk-

te forhold til en passende daglig dose for det dyr som skal behandles.

Foreliggende oppfinnelse angår således forsammensetninger for svin som innbefatter selve svineforet og en effektiv mengde av et deoksynarasinantibiotikum. Den typiske mengde i så henseende vil vanligvis være fra ca. 35 til ca.

150 g deoksynarasinantibiotikum pr. tonn for.

Deoksynarasinantibiotika er også antivirale midler

og er også aktive mot anaerobe bakterier såsom Clostridium perfringens. De angitte deoksynarasinantibiotika kan folge-

lig brukes for behandling eller for å hindre enteritis hos kyllinger, svin, kveg og sauer og ved behandlingen av entero-toksemi hos drovtyggere.

Visse deoksynarasinforbindelser (20-deoksynarasin cg dets salter) viser ionebindende og ionetransporterende egenskaper, og er fblgelig ionoforer (ionebærere) (se B.C. Press-, man, Alkali Metal Chelators- The Ionophores i "Inorganic Biochemistry", bind 1, G.L. Eichhorn, Elsevier, 1973). Disse forbindelser kan brukes når man onsker en selektiv fjerning av et spesielt kation. Eksempler på slike anvendelser innbefatter fjerningen og innvinningen av solvioner fra oppløsning-er i fotografiindustrien, fjerning av toksiske kationer fra industrielle avfallsvæsker for slike kan slippes ut, og av-salting av sjovann. En deoksynarasinforbindelse kan brukes som én komponent i en ione-spesifikk elektrode (se 0. Kedem et al, U.S. patent 3.753.887). Disse forbindelser endrer kat-ionepermeabiliteten både i naturlige og kunstige membraner.

En deoksynarasinforbindelse kan folgelig brukes som en komponent i en membran som skal brukes for selektiv transport av kationer mot en konsentrasjonsgradient. Et spesielt anvend-elsesområde for denne egenskap er ved innvinningen av tunge og verdifulle metaller på kommersiell basis (se E. L. Cussler, D.F. Evans og Sister M. A. Matesick, Science 172, 377 (1971)).

I et annet aspekt er 20-depksynarasin og dets salter aktive som en hemmer av enzymet ATPase, ATPase er et al-kalimetallfolsomt enzym som finnes i cellemembraner, og som inngår i mekanismen når det gjelder den energi som er nodven dig for aktiv transport i ledende organismer. Med "aktiv transport" forstås her de energikrevende serier av opera-sjoner hvorved både væsken innenfor og utenfor celler opprettholder sin sammensetning. Hemmere av ATPase reduserer den energi som er nodvendig for aktiv transport. In vitro-prbver har vist at 20-deoksynarasin (Na-salt) hemmer kationtran-sport-ATPase i levermitochondrer ved en halveffektiv konsentrasjon på 0,065 mcg/ml.

20-deoksynarasin og dets salter er også virksomme kardiotoniske midler. I prover hvor man brukte isolerte marsvinarterier, f.eks., så oket 20-deoksynarasin karsammen-trekkbarheten. Et utslag i denne proven uttrykkes som prosent av den maksimale sammentrekningsspenningen som. man kunne frembringe ved en dose av norepinefrin (10~ mol . 20-deoksy-narasin (Na-salt) ved en 10 — 5 molar konsentrasjon produserte

en middel-(- standardfeil) bkning i sammentrekningsspenning

på 43,8 - 1,4 (n=4) For en mer detaljert beskrivelse av denne prove, se U.S. patent 3.985.893.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter derfor en fremgangsmåte for å oke sammentrekningskraften hos hjertemuskelen hos varmblodige pattedyr som innbefatter at man til-forer en effektiv ikke-toksisk dose av 20-deoksynarasin eller et farmasbytisk akseptabelt salt av denne forbindelsen. En effektiv, ikke-toksisk dose ligger i området fra 30 .- 500 mcg/kg kroppsvekt. Et foretrukket dosevariasjonsområde er fra 30 - 100. mcg/kg kroppsvekt. I denne fremgangsmåte blir antibiotikumet tilfort parenteralt, f.eks. ved intravenos infusjon.

En egnet fremgangsmåte for tilfbrsel er dråpemetoden.hvor antibiotikumet inkorporeres i en standard opplbsning, f.eks.

en dekstroseopplbsning.

20-deoksynarasin ble fortrinnsvis tilfort i doser under 100 mcg/kg inntil man får den foronskede bkning av sammentrekningskraften. Deretter kan mengden som tilfores reguleres med infusjonshastigheten slik at man opprettholder det foronskede utslag. Som med klinisk tilfbrsel av andre inotropiske midler, så kan dosen av 20- deoksynarasin varieres alt etter det kliniske tilfelle og etter faktorer såsom indi-videts toleranse, type av hjertelidelse, f.eks. graden av

skade i hjertemuskelen, alder og ellers pasientens generelle fysiske tilstand.

Fremgangsmåten ifolge foreliggende oppfinnelse innbefatter folgelig bruken av det positive inotropiske middel 20-deoksynarasin ,som kan brukes i en rekke kliniske situasjon-

er som generelt klassifiseres som kardiogenisk sjokk. Slike tilstander innbefatter f.eks. myokardial infarkt, klemmende hjertesvikt og post-operative kardiogene sjokk.

De folgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

A. Rysekolbefermentering.

Det ble fremstilt en kultur av Streoptomyces aureofaciens NRRL 11181, og denne ble holdt på en skråagar med folgende sammensetning:

Skråagaren ble inokulert med Streptomyces aureofaciens NRRL 11181, og den inokulerte skråagaren ble inkubert ved 30°C i opptil 7 dogn. Agaren ble så dekket med sterilt storfeserum og skrapet med en steril lokke for å losne sporene. Den resulterende kjottserumsuspensjonen av sporer og mycelfragmenter ble lyofilisert til et.maksimum på 6 pellets.

En således fremstilt lyofilisert pellet ble brukt for å inokulere 50 ml av et vegetativt medium med folgende sammensetning: forts.

Det inokulerte vegetative medium i en 250 ml Erlenmeyerkolbe ble inkubert ved 30°C fra 24 - 48 timer,

på et risteapparat som hadde et utslag på 5 cm og som ble omdreiet med en hastighet på 250 omdr./min.

Det inkuberte vegetative medium som beskrevet ovenfor på 50 ml ble brukt for å inokulere 250 ml av hver av de folgende fermenteringsmedia:

Medium I:

Medium II: forts.

Medium III:

Fermenteringen ble inkubert i opptil 10 dbgn ved 30°C i et risteapparat som hadde 250 omdr./min. og et utslag på 5 cm.

B. Tankfermentering

Tankfermentering ble utfort ved å bruke det vegetative og fermenterte media som beskrevet i avsnitt A ovenfor. For tankfermentering brukte man 10 ml av det vegetative medium, for å inokulere 400 ml av annet trinns vegetative medium i en 2 liters Erlenmeyerkolbe. Etter en 24 timers inkubering ved 30°C ble 800 ml av annet trinns vegetative medium brukt for å inokulere 100 liter av fermenteringsmedium i en tank på 165 liter. pH på mediet etter sterilisering ved 121°C i 45 minutter, var ca. 6,8 - 0,1. Fermenteringen gikk i 10 dogn ved 30 - 1°C. Tanken ble gjennomluftet med steril luft i en mengde på 0,5 volumer luft pr. volum kulturmedium pr. minutt, roring ble utfort med vanlige rorere med (?n hastighet på 300 omdr./min.

Eksempel 2

Utskillelse av. deoksynarasinkomplekset

pH på hele fermenteringsmediet (4 1) 'fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i.eksempel 1 ved å bruke medium II, ble senket til pH 3,0 ved å tilsette konsentrert HC1 og deretter rore i 1 time. Den resulterende opplosning ble filtrert ved hjelp av filterhjelp (125 g "Hyflo Super-Cel",

en diatomerjord, Johns-Manville Corp.). Den utskilte mycel-kake ble ekstrahert porsjonsvis ved å bruke en blander med totalt 2 liter metanol som inneholdt 50 g NaHCO-^pr. liter. ~ Metanolfiltratet ble. fordampet under vakuum til et volum på

ca. 450 ml, og pH for denne oppldsningen ble'justert til pH 7,5 ved å tilsette konsentrert HC1. Den resulterende opplosning ble ekstrahert to ganger med CHCl^(500 ml). Kloro-formekstraktene ble slått sammen, tdrket over natriumsulfat og filtrert. Filtratet ble fordampet under vakuum og ga 2,0 g urent deoksynarasinkompleks.

Eksempel 3

Isolering av deoksynarasin og epi- deoksynarasin

2 g av det urene deoksynarasinkompleks fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble opplost i en minimal mengde benzen og påsatt en 1,5 x 22 cm kolonne av silisiumdioksyd-

gel ("Merck 7729"). I den folgende tabell er det vist de fraksjoner som blir isolert, de brukte oppldsningsmidler og de mengder man fikk ut.

Fraksjonene ble undersokt ved hjelp av tynnsjiktkromatografi idet man brukte et etylacetatopplosningsmiddelsystem. Fraksjonene 16 - 17 (126 mg) inneholdt 20-deoksy-epi-17-narasin. Fraksjonene 18-23 inneholdt en blanding av 20-deoksynarasin og 20-deoksy-epi-17-narasin.

En blanding av 20-deoksynarasin og 20^deoksy-epi-17-narasin fremstilt som beskrevet ovenfor for fraksjonene 18 - 23 hie kromatografert ved preparativ tynnsjiktkromatografi idet man brukte et etylacetatopplosningsmiddelsystem. Blandingen (105 mg på én plate og 130 mg på en annen plate)

ble utviklet i en mindre mengde CHCI2plasert på en silisiumdioksydgel preparativ plate (Merck). Etter utvikling åv platen ble de to separate forbindelsene observert ved hjelp av ultrafiolett lys. Hver av de to områdene som represen-

terte de to forbindelsene ble fjernet fra platene og ekstrahert med C^C^cCH^OH (4:1). I dette system er deoksynarasin den langsomt bevegende^del av de to komponentene. Fra den plate som inneholdt 105 mg materiale fikk man ut 7,5 g 20-deoksy-epi-17-narasin og 27 mg deoksynarasin. Fra platen som inneholdt 130 mg blanding fikk man 4,0 g 2o-deoksy-epi-17-narasin og 56 mg 20-deoksynarasin.

Eksempel 4 '

Alternativ isolering av 20- deoksynarasin

Hele fermenteringsmediet på 95 liter ble justert

til pH 3 ved tilsetning av HC1 og så rbrt i 1 time. 3% filterhjelp ("Hyflo Supercel") ble så tilsatt, og mediet ble filtrert. Den utskilte mycelkaken ble ekstrahert to ganger med ca. 45 liter aceton som inneholdt 50 g NaHCO-^pr. liter. Acetonekstraktene ble slått sammen og konsentrert under

vakuum, hvorved man fikk ca. 10 liter vandig opplbsning. pH

for denne opplbsning ble justert til 8,0 ved å tilsette 5N

HC1, og den resulterende opplbsning ble ekstrahert tre ganger med et halvt volum C^C^. Disse ekstraktene ble slått sam-

men og fordampet under vakuum, hvorved man fikk et oljeaktig residuum. Residuet ble opplost i 500.ml av ovre fase av et opplbsningsmiddelsystem bestående av heksan:metanol:vann i et forhold påv 10:7:1. Den ovre fase ble så ekstrahert 6 ganger med 300 ml porsjoner av lavere fase. Disse ekstraktene ble

slått sammen og konsentrert under vakuum til et residuum.

Dette ble opplost i dioksan, og oppløsningen ble lyofilisert, hvorved man fikk 19,4 g deoksynarasinkompleks.

Flere prover fremstilt på samme måte, ble slått sammen (40 g),opplost i toluen og påsatt en silisinmdiqksyd-gelkolonne i et væskekromatografisystem (Waters' Associates Prep. "LC/System 500"). Kolonnen ble eluert med toluen: etylacetat (9:1.) i en mengde på 250 ml/min., og man oppsam-let ■fraksjoner på 250 ml. Fraksjonsirmholdet ble undérsokt ved hjelp av tynnsjiktskromatografi. Fraksjonene 37 - 52

ble slått sammen og konsentrert under vakuum, hvorved man

fikk et residuum som ble gjenopplbst i dioksan og lyofili-

sert til 7,8 g av et renset materiale rikt på 20-deoksynarasin. Dette materiale ble rekromatografert på samme kolonne som beskrevet ovenfor. Etter eluering av 50fraksjoner.med toluen:etylacetat (9:1) ble elueringsmidlet forandret til 100% etylacetat. Fraksjonene 51 - 53 hie slått sammen og fordampet under vakuum, hvorved man fikk et residuum som ble opplost i dioksan og lyofilisert til 1,12 g 20-deoksy-narasin som dets natriumsalt.

Eksempel 5

Fremstilling av 20- deoksynarasin fri syre

200 mg 20-deoksynarasin-natriumsalt ble opplost i

10 ml etylacetat. Opplbsningen ble vasket med 10 ml 0,IN

HC1 og deretter to ganger med 5 ml vann. Det resulterende organiske lag ble fordampet til tbrrhet, og residuet ble gjenopplost i dioksan og lyofilisert, hvorved man fikk 139,6

mg 20-deoksynarasin fri syre som et hvitt fast- stoff.

Eksempel 6

Kyllingfor for kokkidiosekontroll

En balansert forblanding som var tilpasset rask vekstbkning hos kyllinger, ble fremstilt av de folgende ingredienser:

0,01 vektprosent av deoksynarasinantibiotikakomplekset, dvs. 20-deoksynarasin eller 20-deoksy-epi-17-narasin ble tilsatt dette foret ved hjelp -av vanlig blandeteknikk. Kyllinger som ble foret med dertne blandingen og med vann ad libitum, var beskyttet mot kokkidiose.

Eksempel 7

Forbedret storfefor

Et balansert storfefor ble fremstilt på folgende måte: forts.

Ca. 0,004 vektprosent deoksynarasinantibiotikum-kompleks ble tilsatt dette f5ret ved hjelp av vanlig teknikk. Forblandingen ble presset til pellets. En daglig tilfbrsel

av ca. 7 kg av dette for pr. dyr gir ca. 300 mg antibiotikum pr. dyr pr. dag.

Eksempel 8

Forbedret svinefor

En forblanding ble fremstilt ved hjelp av vanlige fremgangsmåter ved å bruke folgende ingredienser:

Denne forblanding ble tilsatt kommersielt svinefor og man fikk et innhold av aktiv forbindelse på 100 g pr. tonn.

Claims (8)

1. • ■ Fremgangsmåte for fremstilling av deoksynarasinantibiotikakomplekset inneholdende 20-deoksynarasin med folgende formel . og 20-deoksy-epi-17-narasin med folgende formel eller farmasøytisk akseptable salter av disse forbindelser, karakterisert ved at man kultiverer en rase av Streptomyces aureofaciens med i alt vesentlig de samme biosyntetiske egenskaper som NRRL 11181 i et kulturmedium inneholdende assimilerbare karbohydratkilder, nitrogen og uorganiske salter under nedsenkede aerobe fermenteringsbetingelser inntil man får fremstilt- en vesentlig mengde antibiotisk aktivitet, hvoretter man innvinner det angitte antibiotikakompleks i form av syrene eller deres farmasoytisk akseptable salter.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert y e d at Streptomyces aureofaciens-rasen er organismen identifisert som NRRL 11181.

3. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at deoksynarasinantibiotikXkomplekset eller dets farmasbytisk akseptable salter blir isolert fra kulturmediet.

4. Fremgangsmåte ifolge krav 3, karakterisert ved at 20-deoksynarasin eller et farmasbytisk akseptabelt salt av denne forbindelse isoleres fra det angitte deoksynarasinantibiotikakomplekset.

5. Fremgangsmåte ifolge krav 3, karakterisert ved at 20-deoksy-epi-17-narasin eller et farmasbytisk akseptabelt salt av denne forbindelse, isoleres fra det angitte deoksynarasinantibiotikakompleks.

6. Fremgangsmåte ifolge ethvert av kravene 1-5, karakteris, ert ved at deoksynarasinantibiotikakomplekset, dvs. 20-deoksynarasin eller 20-deoksy-epi-17-narasin, innvinnes i form av et farmasbytisk akseptabelt salt.

7. Biologisk ren kultur av mikroorganismen Streptomyces aureofaciens som er identifisert som NRRL 11181, karakterisert ved at nevrrte kultur har evnen til å fremstille 20-deoksynarasin eller 20-deoksy-épi-17-narasin ved fermentering i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare karbohydrat- og nitrogenkilder samt uorganiske salter.

8. Kultur ifolge krav 7, karakterisert ved å være i form av en lyofilisert kultur.