DK143036B - Fremgangsmaade til fremstilling af metabolit a-27106 eller syre-, ammonium-, lithium-, kalium-, rubidium eller caesiumformen deraf - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 143036 C 12 P 19/58 DANMARK (51) int. ci.3 c 07 G 3/00 C 07 G 11/00 C 07 H 15/26 // A 23 K 1/18 (21) Ansøgning nr. 51 ^/7^ (22) Indleveret den J1 . jan. 197^· vSfctS« (24) bebsdag 51 · jan. 197^ ν' (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelseeskriftet offentliggjort den 1 6. mår. 1 98l

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

1. feb. 1973, 328586, US

<71> ELI LILLY AND COMPANY, 3Ο7 East McCarty Street, Indianapolis,

Indiana, US.

(72) Opfinder: Donald Ray Brannon, R.R. 1 Box 201B, Pittsboro, Indiana, US: Donald Roy Horton, R.R. 2 Box 138M, Brownsburg, Indiana, US· (74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af metabolit A-27106 eller syre-, ammonium-, lithium-, kalium-, rubidium- eller cæsiumformen deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af den hidtil ukendte metabolit A-27106 med de i krav l’s indledning angivne fysiske data eller syre-, ammonium-, lithium-, kalium-, rubidium- eller cæsiumformen deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

De omhandlede forbindelser kan anvendes til at hindre eller til at behandle coccidiosis hos fjerkræ ved at indgive dyrene en effektiv mængde af en blanding bestående af metabolit A-27106 eller et af de ovennævnte derivater deraf og en fysiologisk acceptabel bærer. De kan endvidere anvendes til at forøge virkningsgraden af fødeudnyttelsen hos drøvtyggere, der har en udviklet drøvtyggerfunktion ved oral indgivelse af en propionatforøgende mængde af 2 143036 metabolit A-27106 eller et af de ovennævnte derivater deraf til sådanne dyr.

Coccidiosis er en velkendt protozoisk sygdom, der stammer fra infektion med en eller flere arter af Eimeria eller Isospora (se Lund og Farr i "Diseases of Poultry", 5th ed., Biester og Schwar-te, Eds., Iowa State University Press, Ames, la., side 1056-1096).

I betragtning af de store økonomiske tab fra coccidiosis og vanskelighederne i forbindelse med anvendelsen af nogle af de kendte coccidiostater, fortsætter efterforskningen efter bedre coccidio-stater.

Da drøvtyggere er dyr af økonomisk vigtighed, er en forøgelse af drøvtyggeres fødeudnyttelse en meget ønskværdig ting. Mekanismen for udnyttelsen af den næringsgivende del (carbonhydrater) i drøvtyggerens foder er velkendt. Mikroorganismer i dyrets mave forgæ-rer carbonhydrater til monosaccharider, og dernæst nedbrydes disse monosaccharider til pyruvat-forbindelser. Disse metaboliseres ved mikrobiologiske processer til dannelse af acetater, butyrater eller propionater, der kollektivt kendes som flygtige fedtsyrer (VEA).

Den relative effektivitet ved udnyttelsen af VEA’erne er diskuteret i Feedstuffs, 19. juni 1971, side 19; Eskeland et al., J. An.

Sci. 33» 282 (1971)» og Church et al., "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", vol. 2, 1971» side 622 og 625. Selv om acetater og butyrater udnyttes, udnyttes propionater med en relativt bedre virkningsgrad. Når der er for lidt propionat tilgængeligt, kan dyrene udvikle ketosis. Et gavnligt middel forøger produktionen af propionat fra carbonhydrater, hvorved man forøger carbonhydråt-udnyttelseseffektiviteten og også reducerer forekomsten af ketosis.

Monensin, hvorfra metabolit A-27106 fremstilles, er beskrevet i U.S.A.-patentskrift nr. 3 501 568 som en faktor A af antibioticum A 3823-komplekset. Monensin er også et anticoccidielt middel.

Det biologisk aktive middel, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kaldes arbitrært metabolit A-27106. Udtrykket

3 H303G

MA-27106" refererer heri til natriumsaltet.

Et af udgangsmaterialerne for fremstilling af metabolit A-27106 er monensin, hvis natriumsalt har formlen: CHa

i CHa sK

vi a *·........(i E y I CHa

HaCO-CH H O”

c * C

I No CHa

Monensin i dets natriumform produceres af Streptomyces cinnamo-nensis som beskrevet i U.S.A.-patentskrift nr. 3 501 568.

Metabolit A-27106 fremstilles som anført i krav l’s kendetegnende del ud fra monensin i nærvær af glucose ved hjælp af et enzym eller enzymer udviklet af en ny stamme af Streptomyces candidus.

En kultur af den nye stamme er blevet deponeret uden restriktioner med hensyn til tilgængelighed i den permanente kultursamling ved the Northern Utilization Research and Development Division Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 6l604, hvor den blev tildelt accessionsnummeret NRRL 5449.

På grund af uvisheden ved taxonomiske studier af Streptomycesgruppen af organismer er der altid et tvivlspørgsmål forblindet med klassifikation af nyopdagede organismer. I de vigtigste karakteristika minder organismen NRRL 5449, der omdanner monensin til metabolit A-27106,imidlertid nærmest om Streptomyces candidus(Krassil-nikov) Waksman 1953· Typekulturen er beskrevet af S.A. Waksman i "The Actinomycetes", vol. II, Williams og Wilkins, Baltimore, 1961, side 187. Typeorganismen er også deponeret ved the Institute of Microbiology of Rutgers University, New Brunswik, N.J., under accessionsnummeret IMRU 3416. Den foreliggende organisme betragtes som en ny stamme af den beskrevne organisme. Selv om S. candidus NRRL 5449 og den kendte stamme minder om hinanden i den generelle 4 143038 myceliemorphologi og -farve og i sporeudseende, findes der tilstrækkeligt med forskelle mellem dem til at påberåbe, at den heri beskrevne organisme er en ny stamme. For eksempel koagulerer den tidligere beskrevne organisme ikke mælk og gør gelatine langsomt flydende, medens den nye stamme danner valle efter 14 dage og ikke gør gelatine flydende på 21 dage. Hvad der er mere vigtigt er, at en prøvekultur opformeret fra stammen IMRU 3416 ikke omdanner monensin til metabolit A-27106.

Organismen, der omdanner monensin til metabolit A-27106, isolere des fra en jordprøve opsamlet på bjerget Ararat, Tyrkiet, ved at suspendere dele af jorden i sterilt destilleret vand og udstiyge suspensionen på næringsagar. De tilsåede agarplader inkuberedes ved 25 - 35 °C, indtil synlige kolonier blev observeret. Ved slutningen af inkubationsperioden overførtes kolonier af udvalgte organismer ved hjælp af en steril platinnål til agar-skråsubstrater.

Et af skråsubstraterne inkuberedes dernæst til opnåelse af en passende mængde podemateriale af organismen NRRL 5449.

Taxonomiske studier af S. candidus NRRL 5449 udførtes under anvendelse af metoder anbefalet for the International Cooperative Project for Description and Deposition of Streptomycetes i overensstemmelse med procedurer beskrevet af Shirling and Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", International Bulletin of Systematic Bacteriology 16. 313-340 (1966), samt andre supplerende prøvninger. Præfixet ICP refererer til medier beskrevet af Shirling og Gottlieb. De tiloversblevne medier er beskrevet af Waksman, cit. ovenfor. Farvenavnene er angivet ifølge Kelly og Judd i "The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S. Department of Commerce circular 553, 1955. Bogstaverne i parentes refererer til farveserien beskrevet i "System of Color "Wheels for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol.

11, 335 (1963). Farvemærkat-betegnelser er understreget, og Maerz og Paul ("Dictionary of Color", McGraw-Hill, N.Y., 1950) farveblokke er angivet i kantet parentes.

Streptomyces NRRL 5449 er ejendommelig ved lige til bølgeformede sporophorer og ovale til let cylindriske sporer, med en gennemsnitsdimension på 1,165 /um x 0,57 /um, i kæder på 10-50. Sporerne 5 143036 er glatte, når de observeres ved hjælp af et elektron-mikroskop. Luftmycelier er sædvanligvis hvide. Yed 26° C fremkommer kun vegetativ vækst, og ved 45° C fremkommer ingen vækst. Den maksimale vækst og sporulation fremkommer ved 30 - 27° C.

Ifølge standardmetoder studeredes væksten af mikroorganismen NRRL 5449 på en lang række medier, der er accepteret ved studiet af Actinomyceter. Ityrkningsmetoderne var ensartede og standardiserede. De anvendte medier og de observerede kulturelle karakteristika er anført nedenfor: IGP 1: Rimelig vækst; bleggul bagside [1101]; ingen luftmyce lium eller sporer; intet opløseligt pigment.

IOP 2: Rigelig vækst; bagsiden lysegul [10J3]; rigelig luft mycelium of sporer; (W) hvid a; intet opløseligt pigment.

IOP 5: God vækst; bagside lys gulgrøn [1001]; god luftmycelium og sporer; (W) hvidt a; intet opløseligt pigment.

TCP 4: God til rigelig vækst; bagside moderat gul [10H4]; god til rigelig luftmycelium og sporer; (W) hvid a; brunt opløseligt pigment.

IPO 5·· Rigelig vækst; bagside moderat orangegul [1016]; rigelig luftmycelium og sporer; (Y) bleggul 2db; lysebrunt opløseligt pigment.

ICP 1: God vækst; bagside lys gulgrøn [10B1]; god vækstmycelium og sporer; (W) hvid a; intet opløseligt pigment.

Glyoerol-glycin:

Rigelig vækst; middelbrun bagside [11J4]; rigelig sporulation og luftmycelium; (W) hvidt a; (Y) bleggul 2db; en smule lysebrunt opløseligt pigment.

Emerson’s:

Rigelig vækst; gråliggul bagside [12H3]; intet luftmycelium eller sporer; intet opløseligt pigment.

6 163036

Bennett1 s:

God vækst; lysegul tagside [1112]; sparsomt luftmycelium og sporer; (W) hvidt a; intet opløseligt pigment.

Ozapek’s:

Rigelig vækst; moderat orangegul bagside [HJ7]j rigeligt luftmycelium og sporer; (W) hvidt a; intet opløseligt pigment.

Glucose-Asnaragin:

Rimelig til god vækst; hieg gulliggrøn bagside [10B1]; intet luftmycelium eller sporer; intet opløseligt pigment.

Calciummalat:

Rigelig vækst; bagside gråliggul [11E4]; rigeligt luftmycelium og sporer; (Y) bleggul 2ba; en ringe mængde brunt opløseligt pigment.

Næringsagar;

God vækst; bagside bleggulliggrøn [10C1]; intet luftmycelium eller sporer; intet opløseligt pigment.

Organismen studeredes med hensyn til udvalgte fysiologiske egenskaber ifølge standardmetoder. De observerede egenskaber og karakteristika er følgende:

Observeret egenskab Karakteristika

Virkning på skummetmælk Klaring; ostemasse efter 14 dage.

Nitrat-reduktion Positiv

Melanin-pro dukti on

Trypton gærekstrakt Ringe

Tyrosin-agar Ingen

Gelatine-forflydning Ingen efter 21 dage

Temperaturkrav 26° C : Kun vegetativ vækst 30-37° C: God vegetativ vækst; godt luftmycelium og sporer 43-55° C: Ingen vækst.

7 U303G

Resultaterne af carbonudnyttelsesprøver udført med organismen NRRL 5449 er anført nedenfor. De anvendte symboler til at indikere væksten er følgende: + = Udnyttelse - god vækst [+] = Sandsynlig udnyttelse - ringe til rimelig vækst [-] = Mulig udnyttelse - ringe eller ingen vækst.

= Ingen udnyttelse - ingen vækst.

Carbonkilde Respons raffinose + D-fructose [+] cellobiose [+] 1-arabinose [+] D-mannitol [+] rhamnose [+] cellulose dextrose [+] til [-] D-xylose [+] inositol + -C (ikke carbonhydrat) [-] til [+]

Kulturmediet , der anvendes til dyrkning af S. candidus NRR1 5449, kan være ethvert af et antal medier. Af hensyn til økonomisk produktion, optimalt udbytte og nem isolation af produktet foretrækkes visse kulturmedier. Således er blandt de foretrukne carbo nhydratkilder til fermentering i stor målestok invertsukker eller majssirup, selv om glucose, fructose, maltose, stivelse, inositol og lignende også kan anvendes. Når monensin skal omdannes til metabollt A-27106, må mediet indeholde en glucosekilde for at opnå en effektiv omdannelse. Når S. candidus NRRL 5449 dyrkes for at producere dets enzymsystem til senere anvendelse ved omdannelse af monensin til metabolit A-27106, kan glucose være til stede under fermenteringen, hvis det ønskes. Foretrukne nitrogenkilder er pepton, sojamel, aminosyreblandinger og lignende. Blandt uorganiske 8 143036 næringssalte, der kan inkorporeres i kulturmedierne, er sædvanligt opløselige salte, der kan give ioner som jern, natrium, kalium, ammonium, calcium, phosphat, chlorid, carbonat og lignende.

Yæsentlige spormetaller, der er nødvendige for væksten og udviklingen af organismen, skal også være til stede i kulturmediet.

Sådanne spormetaller foreligger sædvanligvis som urenheder i de andre "bestanddele af mediet i mængder, der er tilstrækkelige til at opfylde organismens vækstkrav.

Kulturmediets begyndelses-pH kan varieres. Før podning med organismen er det imidlertid ønskværdigt at indstille kulturmediets pH til ca. 5»7-7,5, afhængigt af det særligt anvendte medium. Som det er tilfældet med andre Actinomyceter, bliver mediet gradvist mere alkalisk, som fermenteringen skrider frem, og kan stige fra et begyndelses-pH på ca. 5*9 til pH 6,9 eller højere under organismens vækstperiode. Det endelige pH bestemmes i det mindste delvist af mediets begyndelses-pH, de puffere der er til stede i mediet og den tid organismen får lov at gro.

Selv om pH kan reguleres ved tilsætning af enten syre eller base, er der opnået gode resultater uden nogen regulering af pH.

I lighed med andre Streptomyces-arter kræver organismen NKR1 5449 aerobe vækstbetingelser. Formering i lille volumen udføres bekvemt på agar-skråsubstrater eller -plader, i rystekolber eller i flår- sker. Til produktion i stor skala foretrækkes submers aerob ' dyrkning i store beholdere.

Gæringsmediet i en steril beholder kan podes med en sporu-leret suspension for at starte gæringen. Da imidlertid podning med en sporuleret suspension medfører en vækstforsinkning, foretrækkes et vegetativt podemateriale. Dette fremstilles ved at pode et lille volumen kulturmedium med sporer fra myceliefrag-menter af organismen, hvorved der opnås en frisk, aktivt voksende kultur af organismen. Det vegetative podningsmedium overføres dernæst til en stor beholder. Det medium, som anvendes til dyrkning af det vegetative podemateriale kan være det samme som det, der anvendes til produktion i stor skala, men der kan naturligvis anvendes andre medier.

9 143036

Organismen S. candidus NRRL 5449 kan dyrkes i et temperaturområde mellem 26 og 40° C. Maksimal vækst og sporulation fremkommer imidlertid imellem 3 0 og 37° C.

Som det er sædvanligt ved aerob submers dyrkning, kan der blæses steril luft igennem kulturmediet under fermenteringen. For at opnå en effektiv vækst af organismen og produktion af metabolit A-27106 skal det anvendte volumen luft i beholderen være over ca.

0,1 volumen luft pr. volumen kulturmedium pr. minut. Optimale udbytter opnås, når det anvendte volumen luft er mindst en tredjedel til halvdelen af kulturmediets volumen pr. minut.

Den nødvendige fermenteringstid til at omdanne monensin til metabolit A-27106 varierer. Nærværelsen af en tilstrækkelig mængde glucose er væsentlig for omdannelse af monenslon til metabolit A-27106. Generelt når glucose er til stede i tilstrækkelige mængder, og monensin er til stede i en koncentration på 0,1 - 1,0 gram pr. liter af mediet, sker omdannelsen af monensin til metabolit A-27106 i det væsentlige fuldstændig på 36 - 72 timer. Den optimale omdannelse sker, når monensin er til stede i en koncentration på 0,5 - 0,7 gram pr. liter medium. En tilstrækkelig mængde glucose er på 2,0 - 2,5 vægtprocent af mediet. Et glucosefølsomt papir kan anvendes til at analysere koncentrationsniveauerne.

Når glucoseindholdet falder til under 2 #, skal glucose tilsættes for at holde koncentrationen på den optimale værdi.

Særlig fordelagtigt er det ifølge opfindelsen, at kilden for monensin er et steriliseret kulturmedium, hvori monensin er fremstillet ved dyrkning af Streptomyces cinnamonensis under submerse aerobe betingelser. Da monensin i alle tilfælde må fremstilles ved en sådan gæringsproces er det meget hurtigere og billigere blot at sterilisere det dyrkningsmedium, hvori monensinet er fremstillet, for at inaktivere den oprindelige organisme og derpå sætte flere rørings-stoffer til det steriliserede medium og anvende dette som dyrkningsmedium for den nye dyrkning af Streptomyces candidus NRRL 5449.

Når S. candidus enzymsystemet anvendes til at omdanne monen ån til metabolit A-27106, er det væsentligt, at enzympræparationen er særdeles ren. For eksempel kan den filtrerede gæringsvæske lyofiliseres og lagres i op til 2 uger før rekonstituering med 10 143036 en vandig puffer, livor der anvendes ca. en sjettedel af volumenet af det oprindelige medium. Effektiv omdannelse vil opnås efter 72 timer, når 2,5 g af et sådant lyoffliseret præparat rekonstitueres i nærværelse af 25 mg monensin og en tilstrækkelig mængde glucosa

Dat aktive enzymsystem er til stede i "både den filtrerede væske og i cellerne. Et enzympræparat af større renhedsgrad kan opnås fra de separerede .gærceller. Cellerne.kan fryses og lagres i perioder, i hvert fald på tre måneder. De optøede celler kan derefter rekonstitueres ved at suspenderes i en pufferopløsning. Puffer-suspensionen renses yderligere ved lydpåvirkning og centrifugering. De rensede cellevægge resuspenderes i puffer og dialyseres. Ved anvendelse af denne metode giver 200 g celler fra fermenteringsmediet et renset dialysat, der er tilstrækkeligt til at omdanne glucose og 25 mg monensin til metaholit A-27106.

Omdannelsesforløbet kan følges ved tyndtlagskromatografi. På silica-gel (forhandlet under betegnelsen "F-254" af E-N Laboratories, Inc. Elms-ford. N.Y.) i benzen/methanol (7-3) er Rf-værdien for monensin 0,62, mens -værdien for metaholit A-27106 er 0,49. Et vanilin spray- reagens kan anvendes til detektionen. Dette reagens fremstilles ved at sætte rygende svovlsyre (2 ml) til en opløsning af vanillin (3 g) i absolut ethanol (100 ml).

Metaholit A-27106 er til stede både i kulturvæsken og i myceliet.

Derfor er den teknik, der anvendes til at isolere metaholit A-27106, indrettet til at muliggøre maksimal udvindelse af produktet fra den ene eller begge kilder. Por eksempel filtreres gæringsmediet, og både filtratet og myceliekagen ekstraheres med passende opløsningsmidler til opnåelse af metaholit A-27106. Produktet udvindes fra ekstraktionsopløsningsmidleme ved kendte metoder.

Alternativt kan de faste stoffer fra kulturmediet omfattende medie-bestanddele og mycelium anvendes uden ekstraktion eller separation, men fortrinsvis med fjernelse af vand fra myceliet og kulturmediet, som en kilde for metaholit A-27106. Por eksempel kan kulturmediet tørres ved lyofilisering og blandes i foderet. Ligeledes kan de faste stoffer omdannes uden total fjernelse af vand til en tynd 11 143036 opslæmning, der er egnet for tilsætning til våd mask og lignende fodermidler.

Ingen bestemt ekstraktion/isolationsmetode er påkrævet. På en tilfredsstillende måde filtreres det endelige kulturmedium under anvendelse af et filtreringshjælpemiddel. Filterkagen extraheres med et polært opløsningsmiddel, såsom methanol. Methanoleketrakten koncentreres og sættes til det oprindelige vandige filtrat. Denne kombinerede opløsning ekstraheres to gange med det halve volumen chloroform. Chloroformekstrakteme inddampes under vakuum til opnåelse af en mørk olie.

Denne affarves over en kolonne af aktivkul under anvendelse af chloroform og ca. 20 g aktiv kul pr. gram olie. Eluatet koncentreres igen under vakuum til opnåelse af en lysegul til farveløs olie. Denne opløses i en minimal mængde chloroform, kro-matograferes på en silicagel-kolonne under anvendelse af ethyl-acetat som opløsningsmiddel. Elueringen følges ved tyndtlagskro-matografi. Urenheder elueres med ethylacetat. Eluering med ethyl-acetat/methanol-blandinger giver metabolit A-27106.

Metabolit A-27106 (natriumsalt) er et hvidt krystallinsk fast stof, med et smeltepunkt under bobling ved 170 - 175° C. Metabolit A-27106 forekommer at danne et hydrat eller et andet solvat meget nemt. Når A-27106 er hydratiseret eller solvatiseret, varierer dets smeltepunkt, idet det generelt smelter nogle få grader lavere end den anførte værdi.

Grundstofanalyse af metabolit A-27106 gav følgende procentvise sam--mensætning: 58,78 % carbon, 0,51 % hydrogen, 27,85 % oxygen og 5,65 % natrium. Disse værdier er korreleret med den empiriske formel C^g^iOigNa, der har følgende teoretiske sammensætning: 59,00 % carbon, 8,37 # hydrogen, 29,94 ί> oxygen og 2,42 $ natrium.

Metabolit A-27106 har praktisk taget ingen UV-absorption over 235 /um.

Det infrarøde absorptionsspektrum af metabolit A-27106 i chloroform er vist på tegningen. De skelnelige abscrptionsmaksima i spektret er 12 143036 følgende: 3,1, 3,36, 6,39, 6,82, 7,1, 7,25, 7,9 (skulder), 8,1, 8,3, 8,67, 8,8 ( skulder), 9,04, 9,22, 9,51, 9,66, 10,03, 10,26, 10,66, 11,23, 11,47, 11,83 og 12,15.

Massespektret af metabolit A-27106 viser en molekylær iontop og andre karakteristiske toppe som anført nedenfor: —___g/e_

Beregnet Observeret Fragment 854,46230 854,44630 C42H?10l6Na (M+) 836,45229 836,44129 °42H69°l5Na (m+-h2o) 779,45490 779,44690 C4()H68013Na (m+-[ch3o +co2]) 761,44540 761,44740 C40H66°12Na (m+[ch5o +co2+h2o])

Bisse fund bekræfter den antagne empiriske formel og en molekylvægt på 854 for metabolit A-27106.

Generelt er metabolit A-27106 let opløseligt i stærkt polære opløsningsmidler, er uopløseligt i ikke-polære opløsningsmidler, og varierer i opløselighed i opløsningsmidler med polaritet derimellem. Som illustration er A-27106 opløseligt i lavere alifatiske alkoholer, er delvis opløseligt i phenol, diethylether og acetone og er relativt uopløseligt i væskeformige lavere alkaner.

Elektrometrisk titrering af metabolit A-27106 på syreform i vand ved et begyndelses-pH på 8 viser tilstedeværelsen af en titrerbar gruppe med en p^. -værdi på 7,2.

Ben ovenfor beskrevne mononatriumform er generelt den naturlige form for metabolit A-27106. Era natriumsaltet kan man nemt fremstille syren. Fra syren kan ammonium- og de øvrige omhandlede alkali-metalsalte fremstilles. De forskellige metalsalt-former opfører sig noget i lighed med'alkalimetalcarboxylåter og noget i lighed med chela-ter.

13 143036

Ved fremstilling af en anden form opløses metabolit A-27106 (på natriumform) i et vandigt opløsningsmiddel, såsom methanol/vand; en syre som f.eks. saltsyre 'tilsættes for at sænke pH til 5 eller lavere. Methanolet fjernes under vakuum, og den fremkomne vandige syre ekstraheres med chloroform. Chloroformekstrak-ten tørres og inddampes til opnåelse af den fri syreform. Dennp kan anvendes som sådan eller kan yderligere modificeres ved titrering med et vandigt alkalimetalhydroxid eller vandig ammoniak til opnåelse af de tilsvarende lithium-, kalium-, rubidium-, cæsiumeller ammoniumformer. Syreformen, ammoniumformen og de omhandlede alkalimetalformer er alle biologisk aktive.

Den eksakte struktur af metabolit A-27106 er ikke kendt. Det er fundet, at glucose er nødvendig for omdannelsen af monensin til metabolit A-27106 og forbruges selv i fravær af metaboliserende S. can-didus celler. Molekylvægten af A-27106 svarer til molekylvægten af en glucosylmonensin.

foruden den stærkt sterisk hindrede tertiære hydroxygruppe på E-ringen, er der fem hydroxy.steder på en glucosylmonensin, der alle kan reagere til dannelse af en simpel ester, såsom eb acetat. Nærværelsen af alle fem sådanne reaktive steder er demonstreret ved esterificeringseksperimenter.

Baseret på de fysiske karakteristika, der er anført ovenfor, kan følgende struktur foreslås for metabolit A-27106: CH a. CH 3 /S?·*8 \ C/ \ D / CHa)—0 O—(

£ ® \ )—( formel II

,Na :........ E y kAJ-OH a / y un a

HaC-CH I / H

i CHa /

HaCO-CH H o“ 0 (glucose) ^C - οζ I ^0 CHa

Da strukturen kun er postuleret, er det klart, at den ovenfor anførte struktur kun er en arbejdshypotese.

14- 143036

Metabolit A-27106 er mindre toxisk end monensin. Ved forsøg, hvor metabolit A-27106 blev indgivet intraperitonealt til grupper på hver 6 mus, døde en ud af seks ved en dosis på 50· mg/kg og 3 ud af seks ved en dosis på 100 mg/kg. Ved lignende forsøg, hvor monensin blev indgivet intraperitonealt til grupper på hver 6 mus, døde en ud af seks ved en dosis på 10 mg/kg og 3 ud af 6 døde ved en dosis på 20 mg/kg.

Por at hindre eller behandle coccidiosis hos fjerkræ indgives dagligt en ikke-toxisk, coccidiostatisk mængde af metabolit A-27106 ' til fuglene, fortrinsvis oralt. Selv om en lang række faktorer må tages i betragtning ved bestemmelse af en egnet koncentration af A-27106, vil den indgivne mængde generelt ligge i området 0,005 -0,05 vægt-% af foderet og fortrinsvis i området 0,01 - 0,04%. Metabolit A-27106 kan tilsættes på mange måder, men tilsættes mest bekvemt sammen med en fysiologisk acceptabel bærer, fortrinsvis til foderet, der spises af fuglene.

Metabolit A-27106 forbedrer også fødeudnyttelsen hos drøvtyggere, der har en udviklet drøvtyggerfunktion. Unge drøvtyggere, især de, der ikke er af vænnet, fungerer som enmavede dyr. Når unge ' drøvtyggere begynder at spise fast foder, begynder drøvtyggerfunktionen at udvikle sig, og den mikrobiologiske population i maven begynder at forøges. Efter at dyret har spist fast føde i et tidsrum når dets mavefunktion fuld udvikling og fortsætter med at fungere igennem dyrets liv. Nogle økonomisk vigtige drøvtyggere er kvæg, får og geder.

Metabolit A-27106 er typisk effektiv til at forøge effektiviteten af fødeudnyttelsen, når den indgives oralt til drøvtyggere i en mængde på frå 0,05 mg/kg/dag til 2,5 mg/kg/dag. Ue gunstigste resultater opnås i en mængde på 0,1 - 1,5 mg/kg/dag. En fore-trukken metode til at indgive metabolit A 27106 er at blande daa med dyrets foder. Imidlertid kan den også indgives på andre måder, f.eks. i form af tabletter, kapsler som kreaturmedicin eller som store piller. Sammensætningen af disse forskellige dosisformer kan udføres ved velkendte metoder. Hver dosisenhed skal indeholde en mængde metabolit A-27106, som står i direkte forhold til den passende daglige dosis for det dyr, der skal behandles.

15 143036 Følgende eksempler belyser nærmere fremgangsmåden Ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af A-27106 ud fra monensin ved hjælp af S. candidus NRRL_5449________________________________________________________ S. candidus NRRL 5449 dyrkedes på et agarsubstrat, fremstillet ud fra Bennett’s medium til opnåelse af en veldefineret koloni. Denne blev fjernet og opslæmmet med sterilt vand (10 ml).

Denne opslæmning opdeltes i fire 500 ml rystekolber, der hver indeholdt 100 ml medium af følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde "Distillers’ solubles" fra destillation af forgæret majs* 25,0 g

Lactose 10,0 g

Maltose 10,0 g

FeS04.7H20 0,01 g

MgS04.7H20 2,0 g KH2P04 2,0 g

CaCOj 2,0 g

Ionbyttet vand til 1 ,_1 liter H Forhandles under navnet "Nadrisol" af National Distiller's Products Company, U.S.A.

De fire podede kolber inkuberedes ved 30° C i en roterende rystemaskine med en omdrejningshastighed på 250 omdrejninger i minuttet i 24 timer. Det vegetative medium (10 ml portioner) anvendtes til at pode 15 rystekolber (500 ml), der hver indeholdt 100 ml sterilt fermenteringsmedium af følgende sammensætning: 16 143036

Ingrediens Mængde

Oks ekødekstrakt 5 g

Casein panereatisk hydrolysat-pepton 5 g

NaCl 5 g

Glycerol 15 g

CaC03 2 g

Ionbyttet vand til 1 liter

Mediet havde et pH på 7,0, der ikke reguleredes. Det podede medium blev inkuberet i 72 timer som beskrevet ovenfor.

I en 40 liter fennentor fremstilledes et produktionsmedium af følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

Polysiloxanolie- antiskummiddel 5 g

Glycerol 375 g

Glucose 625 g

Casein-pancreatisk hydrolysat-pepton 125 g

Oksekødekstrakt 125 g

NaCl 125 g

CaCO^ 50 g

Ionbyttet vand til 24 liter

Mediets begyndelses-pH var 7,0. Mediet blev steriliseret ved autoklavering ved 120° C i 30 minutter ved et tryk på 103 - 138 kPa.

Efter sterilisering var mediets pH 7,6.

25 g renset monensin opløstes i 200 ml ethanol, og dette sattes til det steriliserede medium, og det andet-trins vegetative inoculum (700 ml) fremstillet som beskrevet ovenfor indførtes.

Fermenteringsmediet gennemluftedes med steril luft med en hastighed på ca. 10 liter pr. minut og omrørtes med en konventionel omrører med en hastighed på 420 omdrejninger pr. minut. Det podede medium inkuberedes ved 30°C i 114,5 timer.

17 143036

Fermenteringsforløbet fulgtes ved tyndtlagskromatografi på silica-gel som beskrevet ovenfor. Tidligt i fermenteringen var kun monen-sin til stede. Gradvis viste der sig en anden plet, der angav tilstedeværelsen af metabolit A-27106, og endelig var kun pletten af metabolit A-27106 til stede.

Isolering og rensning af metabolit A-27106

Fermenteringsvæsken fremstillet som beskrevet ovenfor blev filtreret under anvendelse af filtreringshjælpemidler. Myceliekagen blev ekstraheret med methanol (ca. 5 liter) ved stuetemperatur. Methanolekstrakten blev filtreret, og filtratet blev koncentreret under vakuum til fjernelse af methanol og til opnåelse af et vandigt koncentrat.

Dette blev kombineret med det oprindelige filtrat. Den kombinerede opløsning (ca. 22 liter) blev ekstraheret to gange med det halve volumen chloroform. Chloroformekstrakterne kombineredes og koncentredes under vakuum til opnåelse af 500 ml af en mørk ravfarvet olie.

Denne blev opløst i chloroform og affarvet over en 10 kg carbon-kolonne 30,5 x 101,6 cm (carbonet forhandlet af Pittsburg Activi-tet Co., Division of Calgan Corp.) under eluering med chloroform (5 liter). Chloroformeluatet inddampedes under vakuum til opnåelse af 500 ml af en farveløs til lysegul olie.

Den affarvede olie blev kromatograferet i en minimal mængde chloroform over en 25 kg kolonne silicagel (forhandlet under betegnelsen "Grade 62" af W.R. Grace & Company) i ethylacetat. Eluerin-gen fulgtes ved hjælp af tyndtlagskromatografi som beskrevet tidligere. Efter at urenhederne var fjernet med ethylacetat, elue-redes metabolit A-27106 fra kolonnen ved hjælp af ethylacetat /methanol (19:1). Fraktionerne indeholdende metabolit A-27106 blev kombineret og inddampet til tørhed under vakuum til opnåelse af et amorft, næsten hvidt stof. Dette blev vasket med hexan og tørret til opnåelse af 12,84 g metabolit A-27106 (et materiale med én plet ved tyndtlagskromatografi).

18 143036 EKSEMPEL 2

Fremstilling af metabolit A-27106 ved hjælp af S. cinnamonensis og S. candidus NRRL 5449

En anden metode til fremstilling af metabolit A-27106 i fermentor-kultur illustreres ved den følgende procedure:

Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 blev dyrket konventionelt (se US patentskrift nr. 3 501 568) i 55 ml medium i en 250 ml rystekolbe under inkubation i 47 timer til opnåelse af et vegetativt inoculum. Dette sattes til 220 ml medium i en 1 liter kolbe og inkuberedes i 21 timer til opnåelse af et inoculum til podning af fermentoren.

Det således fremstillede inoculum anvendtes til at pode en 40 liter fermentor indeholdende et varmesteriliseret medium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

Glucose 750,0 g

Sojamel 625,0 g

Sojaolie 500,0 g

Methyloleat 500,0 g

Eolysiloxanolie antiskumningsmiddel 5,0 g

Kaliumchlorid 2,5 g

Dikaliumhydrogenphosphat 2,5 g

Manganochlorid, tetrahydrat 15,0 g

Hydratiseret ferrisulfat 7,5 g

Calciumcarbonat 25,0 g

Ionbyttet vand til 24 liter

Det fremkomne medium havde et pH på 5,5, der reguleredes til pH 8,0 ved tilsætning af 10 N kaliumhydroxid o pløsning (15 ml). Det podede medium inkuberedes ved 32° C i 234 timer.

19 1Λ 3 O 3 6

Efter 42 timer forøgedes gennemluftningen fra ca. 10 til ca. 23 liter pr. minut, og omrøringen forøgedes fra 500 til 700 omdrejninger pr. minut. Monensinproduktionen var i det væsentlige tilendebragt efter 210 timer som bestemt ved tyndtlagsbioforsøg med Bacillus subtilis ATCC som detektionsorganisme.

Efter 234 timer pasteuriseredes fermentorens indhold for at inaktivere S. cinnamonensis. Bølgende næringsstoffer sattes til ferment oren:

Ingrediens Mængde

Glucose 750 g

Sojamel 625 g

Manganochlorid, tetrahydrat 155 g

Calciumcarbonat 12,5 g

Eerrisulfat, hexahydrat 7,5 g

Kaliumchlorid 2,5 g

Eikaliumhydrogenphosphat 2,5 g

Methyloleat 250 ml

Sojaolie 250 ml

Ionbyttet vand til 24 liter pH indstilledes til 8,9 med 215 ml 5 N natriumhydroxidopløsning, og mediet steriliseredes. Mediet blev podet med en hurtigvoksende vegetativ kultur af Streptomyces candidus NRRL 5449 og inkuberet i 137 timer ved 30° C. Fermenteringen gennemluftedes med steril luft med en hastighed på 10 liter pr. minut, Fermenteringsmediet omrørtes med en konventionel omrører, først ved 120 omdrejninger pr. minut, stigende efter 16 timer til 420 omdrejninger pr. minut og efter 40 timer til 500 omdrejninger pr. minut. 400 g glucose tilsattes efter 44, 66,5, 89, 97, 113 og 127 timer. 175 g calciumcarbonat tilsattes efter 72 og 99 timer.

Tyndtlagskromatografi som beskrevet ovenfor anvendtes til at følge fermenteringen. Efter 137 timers produktion af metabolit A-27106 var denne i det væsentlige tilendebragt. Oparbejdning og rensning af metabolit A-27106 fulgte metoden beskrevet i eksempel 1.

20 143036 EKSEMPEL 3

Fremstilling af metabolit A-27106 ved hjælp af et særligt S. can-didus NRRL 5449 enzym

Fremstilling S. candidus NRR1 5449 dyrkedes som beskrevet i eksempel 1 i en 100 liter skala. Cellerne skiltes fra gæringsmediet ved vakuumfiltrering og opdeltes i 200 g prøver, der lagredes ved frysning.

To af disse prøver blev optøet ved stuetemperatur og suspenderet i 0,05 N phosphatpuffer (pH 5,8) til et volumen på 600 ml. Denne cellesuspension udsattes for ultralyd i 30 minutter og centrifugeredes ved 10 000 omdrejninger pr. minut i 30 minutter. Den fremkomne cellerest suspenderedes i 100 ml af ovennævnte puffer, og suspensionen dialyseredes i 18 timer med 5 liter afkølet puffer. Til 50 ml af det særlige dialysat sattes D-glucose (120 mg) og 25 mg monensin i 2 ml ethanol. Reaktionsblandingen omrørtes i 72 timer ved 30° C og filtreredes. Filtratet ekstraheredes med chloroform (100 ml). Chloroformekstrakten blev efter koncentrering under vakuum kromatograferet på en silicagel-kolonne (10 g). Eluering med ethylacetat gav kun et spor af monensin. Eluering med ethylacetat/methanol (19:1) gav 17 mg metabolit A-27106, der var identisk med det, der blev opnået i eksempel 1.

EKSEMPEL 4

Syreform af metabolit A-27106 100 mg metabolit A-27106 fremstillet i natriumform ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 opløstes i 100 ml methanol/vand (1:1).

Den fremkomne opløsning titreredes til pH 3 ved dråbevis tilsætning af 1 N saltsyre. Methanolet fjernedes under vakuum.

Den fremkomne opløsning ekstraheredes to gange med chloroform (200 ml hver gang). Chloroformekstrakten blev tørret over magnesiumsulfat og inddampet under vakuum til opnåelse af 85 mg af syreformen af metabolit A-27106.

21 143036

Syreformen af A-27106 er et hvidt, amorft stof, med en molekylvægt på ca. 832. Den biologiske aktivitet af syreformen er næsten den samme som af natriumformen.

EKSEMPEL p

Kontrol af ooccidiosis ved hjælp af metabolit A-27106 -------1------—------f--------~ —----------

En gruppe på 75 en uge gamle, sunde, inkubator- og batteri-opfo-strede haner af en svær slagtekyllingtype anvendtes. Fuglene deltes i grupper med 15 fugle med tre gentagne 5-fugle-undergrup-per. Hver undergruppe blev holdt ude af kontakt med de andre undergrupper. En første gruppe holdtes som ubehandlet sund kontrol under favorable betingelser. En anden gruppe blev behandlet som den første gruppe, men indpodet med poccidiosis ved oral indgivelse af en dosis indeholdende 10^ sporulerede ooqyster af Eimeria tenella. Den tredje, fjerde og femte gruppe behandledes som den anden gruppe med den undtagelse, at 24 timer før denne indpodning blev deres foder ændret ved tflsætning af metabolit A-27106 i koncentrationer på 100, 150 og 200 ppm.

7 dage efter indpodningen blev fuglene vejet, slagtet og undersøgt for tilstedeværelse af cocciplielle læsioner. Den coccidielle beskadigelse udtrykkes på en arbitrær skala fra 0 til 4. Læsionskarakteren angiver antallet af fugle på hvert niveau. 0 angiver ingen tegn på ooccidiosis. 1 betegner den mindste coccidielle beskadigelse, der kan observeres. 2 betegner moderat beskadigelse med lille eller ingen blødning og ingen ødelæggelse af vævet. 3 angiver blødning, en hævning af blindtarmen og en udbredt ødelæggelse af vævet. 4 angiver blødning, en blindtarmskeme af størknet blod og ødelagte epithel-celler. Fugle med karakteren 4 eller mindre bliver sædvanligvis kureret, hvis de ikke yderligere inficeres med coccidia.

Ved anvendelse af ovennævnte metode opnåedes følgende resultater: 22 U3036

Th o in r- r- o r 0

-P

to o o lo r- q ce R c6 M W 0 0 0 ^-0 ra P o

•Hr- O O t- tO O

ra S R

o lo o -=i- lo 10 T—

R

ft 60 0 Η ω S HH (0 P ®H H 60 60

gs CLI t>- C— O LO

M R Ή LO LO LO LO LO

go «- 0 HH H fl-P 60 ΰ 60 3 ω æ<H cis i>

LO

O -P c- ω C- R CLi CD

' rcj

<aj O

HH -O O O O O

•P O LO O

•Η ·Η t- i- (M

rH

O'-' P=> S 0} ft •P ft Øw g

Tb <D £6

Sh

H P

-p ω ω ω pj 60

-dø £ cS cd c6 cS

o -P H >-o t-3 Hd Ha ft rd .

dH

H

0 ft

ft T- CM to -vl- LO

3 R cb 23 143036

De behandlede dyr med de høje læsionskarakterer havde en ringe mængde eller intet fæcalt blod, og fuglene syntes at være i god kondition. Deres gode vægtforøgelse betragtes som mere meningsfuld end læsionskaraktererne.

Da undersøgelser tyder på, at metabolit A-27106 sædvanligvis dræber E. tenella, når den først prøver på at etablere sig i værtscellen, foretrækkes en profylaktisk behandlingsmåde.

Ved andre undersøgelser fandtes metabolit A-27106 at være mere smagstiltrækkende for fugle og mindre toxisk end monensin.

Adskillige andre undersøgelser udførtes med metabolit A-27106 både alene og i kombination med monensin. Disse undersøgelser viste, at selv om metabolit A-27106 ikke gav nogen større vægtforøgelse ved 0,04% end ved 0,01%, resulterede den større mængde i færre blindtarmslæsioner. Der var intet spor af toxicitet ved den største dosis.

Inden for det generelt anvendte område viser monensin og metabolit A-27106 kombineret i diæten mindst en additiv virkning, men ikke i toxicitet. Toxiciteten af kombinationen er lavere end toxiciteten af monensin alene i den mængde, der svarer til den kombinerede mængde.

EKSEMPEL 6

Forbedret forderudnyttelse ved hjælp af metabolit A-27106

Mavesaft opnås fra en stud med en kirugisk installeret fistulQ-åbning ind i maven. Studen holdes på en foderration, hvis sammensætning er følgende; 69,95 % groft formalet majs 10 % formalede majskolber 8 % sojamel (50 % protein) 5 % alfalfa-mel 5 % melasse 0,6 % urinstof 0,5 % dicalciumphosphat 24 1/ 4303b 0,5 f« calciumcarbonat 0,3 $ salt 0,07 $ vitamin A og D2 "blanding* 0,05 $ vitamin E blanding** 0,03'$ spormineralblanding*** * Indeholdende pr. kg: 4 409 000 int. enh. af vitamin A, 500 goo int. enh. af vitamin D2 og 850 g sojamel med 1% olie.

xx Destillationsrest af forgæret majs indeholdende 44 000 int. enh. α-tocopherylacetat pr. kg.

xxx Indeholdende mangan(II)-oxid, kaliumiodid, cobaltcarbonat, kobberoxid og zinksulfat.

En prøve af mavesaften presses igennem filterlag af osteklæde, og filtratet opsamles. Det partikelformede materiale, der bliver tilbage på osteklædet, resuspenderes i tilstrækkelig fysiologisk puffer til, at der opnås det oprindelige volumen af mavesaften, og denne suspension filtreres igen. Den anvendte puffer har følgende sammensætning: g/liter Ingrediens 0,316 Na2HP04 0,152 kh2po4 2,260 NaH003 0,375 EC1 0,375 NaCl 0,112 MgSO^ 0,038 CaCl2 0,008 PeS04.7H20 0,004 MhS04 25 1Λ 3 O 3 6 0,004 ZnS04.7H20

0,002 CUSO4.5H2O

0,001 CaCl2 som beskrevet af Cheng et al. 1 J. Dairy Sci. 38, 1225 (1955).

De to filtrater kombineres og får lov at stå, indtil partikel-formet materiale udskilles ovenpå. Den klare fase skilles fra, fortyndes med den samme puffer (1:1) og indtilles til pH 7,0.

Den fortyndede mavesaft (10 ml) anbringes i en 25 ml kolbe med 40 mg af ovennævnte foder og yderligere 5 mg sojaprotein og den afprøvede forbindelse. Fire sæt kolber anvendes pr. behandling.

To sæt på hvert fire kontrolkolber anvendes også. En nultidskontrol og en kontrol efter inkubation i 16 timer anvendes. Alle prøvekolber inkuberes i 16 timer ved 38° C. Efter inkubationen måles pH, og der sættes 25% metaphosphorsyre (2 ml) til hver kolbe. Prøverne får lov at bundfældes, og den ovenstående væske analyseres ved gaskromatografi for propionat-, acetat- og butyrat-komponenter. Den aktive forbindelse forøger signifikant propio-natproduktionen i forhold til kontrolprøveme.

Prøveforbindelsens resultater sammenlignes statistisk med kontrolresultaterne. Tabellen nedenfor viser forholdet mellem flygtige fedtsyrer i metabolit A-27106-behandlede kolber og koncentrationen i kontrolkolbeme.

yug metabolit A-27106/ml fortyndet mavesaft Propionat Butvrat Total flygtige fedtsyrer 5 2,15 0,73 1,03 1 1,42 0,96 0,98 0,2 1,02 0,91 1,07

Claims (1)

1. 26 143038 Patentkrav : 1. fremgangsmåde til fremstilling af metal) o lit A-27106 eller syre-, ammonium-, lithium-, kalium-, rubidium- eller cæsiumformen deraf, hvilken metabolit er et hvidt krystallinsk fast stof, der er relativt opløseligt i lavere alkanoler, men generelt uopløseligt i lavere alkaner, og som har (a) en molekylvægt på 854·, bestemt ved massespektrometri; (b) en tilnærmet grundstofsammensætning på 58,78 fo carbon, 8,51 f° hydrogen, 27,85 fo oxygen og 5,63 fo natrium; (c) en empirisk formel på Ο^Ηγ^ °16Na; (d) et infrarødt absorptionsspektrum i chloroform som vist på vedlagte tegning; (e) et massespektrum, der viser en molekyle-iontop ved m/e 854,44630 og karakteristiske toppe ved m/e 836,44129, 779,44690 og 761,44740; og (f) en Rf-værdi på 0,49 ved silicagel-tyndtlagskromatografi i benzen/methanol (7:3); og hvor syreformen er et hvidt fast stof med en molekylvægt på 832 og en titrerbar gruppe med en ρκ&-værdi på 7,2, kendetegnet. ved, at Streptomyces candidus NRRL 5449 dyrkes i et kulturmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte, inklusive et natriumsalt, under neddykkede aerobe betingelser, idet der sættes glucose og monensin til kulturmediet før, under eller efter dyrkningen,eller til filtreret dyrkningsvæske eller til celler isoleret fra dyrkningsvæsken efter dyrkningen, til omdannelse af monensin til en væsentlig mængde metabolit A-27106 ved hjælp af de af mikroorganismen producerede enzymer, hvorefter, om ønsket, syreformen af metabolit A-27106 frigøres ved tilsætning af en syre, og syren, om ønsket, omdannes til en af de i kravets indledning angivne saltformer ved omsætning med et tilsvarende alkalimetalhydroxid eller med ammoniakvand.