DK143756B - Antibiotikum x-5108 eller kationiske salte deraf til anvendelse som fodereffektivitetsforoegende og vaekstfremmende middel ved opfodring af fjerkrae - Google Patents

Description

(19) DANMARK (^)

|Ρ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 143756 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1734/73 (51) |nt.CI.s C 07 0 11/00 (22) indleveringsdag mac>· 1973 A 23 K 1/17 (24) Løbedag U* aug. 1971 C 12 P 1/06 (41) Aim. tilgængelig 29· tnar. 1973 (44) Fremlagt 5 · okb · 1 9^1 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag ” (62) Stamansøgning nr. 3979/71

(30) Prioritet 1^. aug. 1970, 64389, US

(71) Ansøger F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT, CH-4002 Ba= sel, CH.

(72) Opfinder Julius Berger, US.

(74) Fuldmægtig Plougmann & Vingtoft Patentbureau.

(54) Antibiotikum X-5108 eller ka= tioniske salte deraf til anvendelse som fodereffektivitets= forøgende og vækstfremmende middel ved opfodring af fjerkræ.

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotikum X-5108 eller kationiske salte deraf til anvendelse som fodereffek-tivitetsforøgende og vækstfremmende middel ved opfodring af fjerkræ, hvilket antibiotikum er ejendommeligt ved, at det er et gult amorft stof, der kan karakteriseres på følgende måde: &

O a' grundstof indhold C Η N O

fundet ved analyse, i procent 63,63 7,81 3,48 25,08 *2 (oxygenindholdet er fundet ved udregning af differencen),

T

^ b) stoffet er opløseligt i methanol, ethanol, 1- og 2-propanol, tert.- 3 butylalkohol, ethylacetat, amylacetat, butylacetat og chloroform, 2 143756 c) stoffet har et karakteristisk IR-spektrum som angivet i fig. 1, d) stoffet har et karakteristisk NMR-spektrum som angivet i fig. 4.

Den foreliggende opfindelse vedrører antibiotiket, X-5108, i ren form, i fortyndede former samt som et råt koncentrat. Det hidtil ukendte antibiotikum er, hvadenten det forefindes i rå eller i en mere ren form, aktivt imod et stort antal mikroorganismer såsom gram-positive og gram-negative bakterier og giver en markant vækstforøgelse hos fjerkræ.

Det hidtil ukendte antibiotikum, som herefter betegnes antibiotikum X-5108, produceres af en hidtil ukendt art af Streptomyces nemlig Streptomyces sp. X-5108. Den hidtil ukendte antibiotikumproduceren= de Streptomycet er isoleret fra en jordprøve, som blev samlet på Bermudaøerne. En levedygtig kultur af organismen mærket med labora= torieangivelsen Streptomyces sp. X-5108, underkultur 5191-2, er deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor denne kultur er indgået i ATCC-samlingen under registerings= nummeret 21586. Den art af Streptomyces, som her betegnes Strepto= myces sp. X-5108, indbefatter alle stammer af Streptomyces, som producerer antibiotikum X-5108 .

I det følgende gives en generel beskrivelse af organismen Strepto= myces sp. X-5108, ATCC 21586 baseret på karakteristika såsom vækst, pigment, morfologi osv.. De angivne farver og farveprøvebetegnelser er sædvanligvis de, som anbefales af the International Streptomyces Project (forkortes ISP): Shirling, E.B. og D0 Gottlieb, 1966, ’•Methods for Characterization of Streptomyces Species”, Inti. J.

Systematic Bact., 16, 513 - 340. Til tilvejebringelse af den diag= nostiske karakteristik og den morfologiske beskrivelse, som angives nedenfor, er anvendt medier af den art, som er fremstillet af Difco laboratories for ISP. Disse mediers sammensætning er angivet i tabel I.

3 143756 TABEL I.

ISP-vækstmedier.

Medium 1. Trypton/gærekstraktfermentationsvæske.

Bacto-trypton (Difeo) 5,0 g

Bacto-gærekstrakt (Difeo) 3,0 g

Destilleret vand 1,0 liter pH-værdien indstilles på 7,0 - 7,2 før autoklavering. 5 ml fermenta·-tionsvæske hældes i et reagensglas med en diameter på 20 mm eller mere.

Medium 2. Gærekstrakt/maltekstraktagar..

Bacto-gærekstrakt (Difeo) ' ' 4,0 g

Bacto-maltekstrakt (Difeo) 10,0 g

Bacto-dextrose’(Difeo) 4*0 g

Destilleret vand 1,0 liter pH-værdien indstilles på 7,3, hvorefter der tilsættes

Bacto-agar 20,0 g

Agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 15 -20 minutter. Der hældes en tilstrækkelig mængde til at danne en skråt lag i mindst 6 reagensglas for hver kultur. Der steriliseres ved autoklavering, og reagensglassene afkøles henstillet i skrå stil= ling.

Sporsal topløsningen., som anvendes i medierne 3, 4, 5 og 7, frem= stilles af:

FeS04.7H20 0,1 g

MnCl2.4H20 0,1 g

ZnS04.7H20 0,1 g

Destilleret vand 100,0 ml 4 143756

Medium 3. Havremelagar

Havremel 20 g

Agar 18,0 g 20 g havremel koges eller behandles med vanddamp i 1000 ml destille= ret vand i 20 minutter. Der filtreres gennem osteklæde. Der til= sættes destilleret vand, indtil rumfanget er 1000 ml. Der tilsættes 1,0 ml sporsaltopløsning.

pH-Værdien instilles på 7,2 med natriumhydroxid. Der tilsættes 18 g agar; agaren gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

Medium 4· Uorganiske salte/stivelsesagar ·

En opløsning 1 fremstilles af 10,0 g opløseligt Difco stivelse.

Der fremstilles en pasta af stivelsen i et lille rumfang koldt destilleret vand, og der tilsættes vand, indtil rumfanget er 500 ml.

Opløsning 2 fremstilles af: E^HPO^ (vandfrit) 1,0 g

MgS04.7H20 1,0 g

NaCl 1,0 g (NH4)2S04 2,0 g

CaCO^ 2,0 g

Destilleret vand 500 ml

Sporsaltopløsning 1,0 ml pH-Værdien indstilles på 7,0 - 7,4» hvis pH-værdien ikke allerede er inden for dette interval. Opløsningerne 1 og 2 blandes. Der tilsættes

Agar (Difco) 20,0 g agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 15 -20 minutter.

5 143756

Medium 5. Glycerol /aspar aginagar.

L-Asparagin (vandfrit) 1,0 g

Glycerol 10,0 g

KgHPO^ (vandfrit) 1,0 g

Destilleret vand 1,0 liter

Sporsaltopløsning 1,0 ml pH-Værdien indstilles på 7,0 - 7,4, hvis den ikke allerede er inden for dette område.

Agar 20,0 g

Agaren gøres flydende ved behandling med dang) ved 10O°C i 15 -20 minutter.

Medium 6. Pep ton/gæreks trakt-.i ernagar.

Bacto-pepton jernagar, dehydratiseret (Difco) 36,0 g

Bacto-gserekstrakt (Difco) 1,0 g

Destilleret vand 1,0 liter pH-Yærdien skal være 7,0 - 7,2 før autoklavering og indstilles om nødvendigt. Agaren gøres flydende ved behandling med 'vanddamp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

Medium 7. Tvrosinagar.

Glycerol 15,0 g I-Tyrosin (Difco) 0,5 g 1-Asparagin (Difco) 1,0 g K2HP04 (vandfrit) 0,5 g

MgS04.7H20 0,5 g

NaCl 0,5 g

FeS04.7H20 0,01 g

Destilleret vand 1,0 liter

Sporsaltopløsning 1,0 ml pH~Yærdien indstilles på 7,2 - 7,4· Der tilsættes 6 143756

Bacto-agar 20,0 g som gøres flydende Ted behandling med damp Ted 100°C i 15 - 20 minutter.

Tomatpastaagar (Berger)

Glucose 10,0 g k2hpo4 1,0 g

Tomatpasta 20,0 g

Wilson!s pepton 1»0 S

CaC03 2,0 g

Agar 15,0 g ledningSTand 1000,0 ml

Der steriliseres Ted et tryk på 6,8 kg i 50 minutter, hrorefter pH= . -Tærdien indstilles på 6,9·

Karakteriseringen af farTerne er taget fra følgende fire kilder: ISCC-NBSU.S. Department of Commerce, 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names”, National Bureau of Standards Circular 553, U.S. GoTernment Printing Office, Washing= ton, D.C.; Tresner, N.D og E.J. Backus, 1963, "System of color wheels for streptomycete taxonomy,” Appl. Microb., 11: 335 - 338; Eckerstrom, R. og C.E. Eoss, 1958, Color Harmony Manual, 4, udgaTe, Container Corporation of America, Chicago, Illinois; H. Prauser, 1964· "Aptness and Application of Colour Codes for Exact Description of Colours of Streptomycetes", Z. Allg. Mikrobiologie, 4 (l); 95 _ 98.

Yækst.

Kulturen danner på mange medier et Teludriklet og forgrenet mycelium og et karakteristisk luftmycelium*, Den submerse Tækst er forhøjet, hård og groT, og afhængigt af det anvendte næringsmedium fremtræder Tæksten fanveløs, gul, gulbrun eller oliTenbrun. Der er sortbrune pletter i randene af Tæksten på gær/maltekstrak tagar (ISP-medium 2).

luftmycelium og/eller en masse-sporefarTe.

7 143766 luftmyceliet er moderat udviklet med fløjIsstruktur, og pigmentet er lyst gråhvidt (d), mellemgråt (2 fe) og gulgråt (2 dc) med en svag hvid rand i tidlige vækststadier. luftmassens farve er ifølge den af Tresner og Backus angivne "color wheel serie" Gy på ISP-me= dium 2 til W-gy på ISP-medieme 4 og 5. Der produceres koncentriske ringe, og koloniopdeling fremkommer hyppigt, ^arveegenskaben ne medfører, at kulturen rubriceres i Gray-serien (Pridham). I tabel II er der angivet en sammenligning af egenskaberne af Streptomyces sp. X-5108 sammenlignet med andre medlemmer af Gray-serien.

8 143756 11 i c« O + -P ·Η •-P H ft H · ft-P ØH -P <D _ m ' ft 0 0 0 0 SS ® I 5 }> +5 .. <* ·>, .ρ Ή S d T1 • HØS bO 2 S3 + CO H +1 + 1 + 1 I I + + +1 + ¾ CO Cd P-1 S S ® U-i m PH M || +> Φ m . II o G) ft ! S . Η b “ «? 1 Φ Tj O 1¾ 1 j5>

Η H 0 0 + É P

S S Pi -P ,¾ _ , f jj h ø h ø ø -PS ' Η p CO fc* ·Η H 0 ·Η Øp — I o M 2 C? 1 HH + i i i + i · i i + o s . cd - ø h !h coh o .S d d II li H +> bo

ύ O Hø ^ ® P

= 0 Sø 1 S •f f, S -PS ^ r o ch S lo S h cd ft S + 'H fl 03 G) S ø 0 ø -P o ® β b

S d S a h <! I>5 Sil O bO oS

0 ftOW bD ffi ΰ + -¾ O + + + I I I I I I + b P

a ui isi a -p · § · d cd o-øø 0 CO+I^ + ·° $ s 11 -Il ® 0 O S % K &

S 0 H + B

ω cd o ‘ co · 13 0 H 0 £ ø ' ' ftp S S S 0 -P ØS β g m •d bo ø 0 ø ΗH °0 X g

rj -pø H <! h> - S 0 bO ø H

cd d a M 2 O ' I O-P ++II + I + II+ SPj COHb ' ® β o il il -H S a 0

O ØH I cP

. CO 0 0 O -p o h S + hossh s i>> ,riPs Η H d 0 SIH -P OO . dh.2 lt\ ø H ø IH ø HØ s p t:

Hl o "d c°v H <! >>3 ,S S o^iØ Η X .001 bo 2 ΰ I O-P + + + I + I I I I + 0 0,,

(Π coHHC η -P

<ί w s 0 0 EH ø ø S 0 , .

b o I O 0 „ a HH- b ^ + 2 o +> co a a η -p O IH o 0 0 op

ft HLf\ 'Ø O +? P

0 HH S ø + S Η -P 0 ..0 0 -P -P S ø ø -¾10,0

w øø bo ¢1 £? + O + + + + +I + II+ M S I

u · .a i φ » o -P § §

s 0 . β & <g jT

SØ >S Η η øo H 0 H 0 H !>j *0 ’d S % ø M co d S ø g M o O ø !> I> 0PCO+> H ø δΟΟ S ftO 0 in >M Η ft 0 ØH H<!!>5 i ' O 0 0 bO S lt\ bOffiO + !*!* + + + + + + + + H+ Hø

0 -p I SS

CO W H S 0 cp 0 ø X> 0' M S „

Ul o -P

bo II ftø

s 0 a s S CO

H -d d ø ø 0 0 ds Sh 'ø wøøøhh h · s bo 0 D30H ØH Η OØØOOO 0 HSØ

Η H Ø-tibO IIS+Ø H ØSOOS + + ø 00 S

H 0 SØ O SØ O 03 ^ØØHS-PHHHSO

S M SHH H O HH SØOHaO+lSØH-P ødØ 0 CQ ØCHOØSSrOØ o OHØØdHSOOO + + +

a S SS+I^Ø'dHS HObSHSØcdflHØ ØS

1 0 oø S SHO-PS S dX<d2fxiff;SHHH HS·0 ø bO ft^oøøSSØ ø Η I I I I I I I 0 0 co W CO O g III g ft «ίϋ OCO'dHH'd'd'dHCOO H-P + 9 143756

Morfologi.

Sporekæderne, som produceres på luftmyceliet, udstrækker sig, éneller flerakset, danner lige kæder, løkker, kroge eller udstrakte og u=; regelmæssige spiraler med 3-4 omdrejninger og forekommer også i en kosteformet orden. Kæderne er såvel lange som korte men sædvanlige vis med mere end 10 sporer. Hvileknolde er iagttaget på de fles= te medier. Sporerne er oval-aflange og cylinderformede (phalangiform, Tresner). Sporeoverfladen er glat uden ornamentering i henhold til bestemmelse med elektronmikroskop (tomatpastaagar, 10 døgn ved 28°C).

Fysiologi.

Opløseligt pigment.

Der dannes spor af brunt pigment på gærekstrakt/maltekstrakrtagar (ISP-medium 2) men ikke på ISP-medieme 3, 4 og 5.

Bagsidefarve.

Gul til gulbrun plus grøn farve dannes ved fra 7 til 21 dage på ISP= -medierne 2, 4 og 5· Refererende til Dr. Prausers farvevejledning dan= nes følgende bagsidefarve på 7 dage: 0 004b, Oo 5m, med farveløse rande (medium 2) og Co 5a, Co 5b (medierne 4 og 5). En tilsætning af base eller syre ændrer ikke bagsidefarven.

Forskellige fysiologiske reaktioner.

Kulturen er pigmentdannende (danner melanin) på pepton/jernagar, tyrosinagar samt på trypton/gærekstraktfermentatlonsvæske. En sam= menfatning af visse af de kulturmæssige karakteristika for Strep= tomyces sp. X-5108 er angivet i tabel III.

10 143756 TABEI III.

Karakteristiske egenskaber af kulturen af Streptomyces sp. X-5108. Inkubation foretaget i 14 døgn red 28 °C.

Fast medium Vækst luftmycelium Opløseligt Underfarve og/eller sporer pigment

Czapek's hvidligt luftmyc.; svagt mør= svag gul sacchairoseagar god sporer gode, hvide kebrunt

Asparagin/ - dextrose-0,25$ godv luftmyc. dunet til intet orange til pulveragtigt, lys gul hvidt, får sløret grå sporulation

Tomatpasta/ luftmyc. hvidt til intet orange peptonagar god lysegråt . . ·- sporer gode, grå

Stivelsesagar god sporulation god, intet orangegul ' bliver røggrå, hvide rande

Krainsky’s glucoseagar god luftmyc. hvidt; intet citrongul sporulation god, bliver røggrå

Mycophilagar god ingen sporulation svagt svag gul (BB1) mørkt Gærekstrakt= god ingen sporulation mørkt grå til næringsagar gulbrun

Glycerolagar jævnt fugtigt, fløde= intet svag· gul god farvet til god (10 døgn)

Kartoffelstykker god ingen sporulation sort

Gulerodsstykker god ingen sporulation - angiver, at der er god vækst i 8 døgn på dette medium ved tempe= raturerne 24, 28, 32 og 37 °C men ikke ved 42°C.

Til tabellen skal følgende bemærkes: Mycelium er forkortet "myc.".

Der er også god vækst på de følgende medier: Tryptonfermentationsvæske (mørkt opløseligt pigment, negativ indol 3 døgn), FDA-næringsfer= mentationsvæske, Czapek saccharose-fermentationsvæske, Krainsky glucose-fermentations væske og calciumcitrat/glycerolfermentations= væske.

11 143786

Nitrat reduceres ikke i organisk nitratfermentationsvæske.

Stivelse hydrolyseres aktivt, og gelatine smeltes kun meget svagt i. løbet af 14 døgn. Nogle yderligere fysiologiske reak= tioner for Streptomyceten er angivet i tabel IV.

TABEL IV.

Fysiologiske reaktioner af Streptomyces sp, X-5108.

Medium Inkuba= Vækst ~ Fysiologisk reak=- tion tion i døgn

Organisk nitrat= 8 moderat, sporulerer ingen nitratreduk= fermentations= ikke tion, ingen luft= væske udvikling

Organisk nitrat” 15 god; mørk pigment ingen nitratreduk= fermentations= tion, ingen luft= væske udvikling .

Gelatine (15$) 5 jævnt god; ingen gelatine= ved 18°C mørk, opløseligt smeltning pigment

Gelatine (15$) 12 jævnt god til god 'svag smeltning ved 18°C vækst; brunt pig= , ment ingen sporulation

Pepton/jernagar 14 god; pigmentdannende meget svag sporu=s ([danner melanin) lation

Lakmusmælk 6 jævnt god overflade= lakmusfarven vækst uændret; ingen sammenløbning eller klaring

Lakmusmælk 13 jævnt svag overflade^ farven svagt brun; vækst, ingen sammenløbning ingen sporulation eller uklarhed "Dorset" 3 god; svag hvid ægagar sporulation "Dorset" 10 meget god vækst; svagt mørk pigment ægagar * overvejende sporu= leret, lysegrå

Oarbonkildeudnyttelsen ifølge Pridham og Gottlieb (J. Bact., 56, 107 - 114, 1948) er følgende (11 døgn ved 28®C); god udnyttelse 12 143756 af 1-arabinose, d-fructose, d-mannitol·, 1-rhamnose, d-raffinose og sucrose; dårlig udnyttelse af d-xylose og i-inositol og ingen udnyt= telse af cellulose. Yderligere oplysninger om Streptomycetens= ud= nyttelse af carbon- og nitrogenkilder er angivet i tabel Y. Kulturerne vokser godt ved 24 og 37° C men ikke ved 42 eller 50°C.

TABEL Y.

Carbon- og nitrogenkilder, som kan udnyttes af Streptomyces sp. X-5108.

Inkubation foretaget i 14 døgn ved en temperatur på 28°C.

© ©

Carbonkilde. Udnyttelse Carbonkilde Udnyttelse 1-Arabinose 1 Acetat 3 1-Rhamnose 3 Citrat 2 d-Xylose 3 Malat 2 d-Mannitol 3 ' Oxalat 1 i-Inositol 3 Salicylat 0

Glucose 3 Succinat 2

Fructose 3 Tartrat - ’ 0

Saccharose 3 Phenol (0,1$) 0

Raffinose - ''3 '- Negativ kontrol 0

Stivelse 0 - 1 (intet carbon)_ d-Ribose 3 Nitrogenkilde Udnyttelse © d-Galactose 3 d-Mannose 3 (NH^JgSO^ 1

Cellobiose 3 NaNO^ 1

Lactose 3 Na-nitrit 1

Maltose 3 Acetamid 1

Dextrin 0 Asparagin 3

Dulcitol 0 Tyrosin 3

Erythritol 0 dl-Tryptophan 2

Sorbitol 1 Negativ kontrol 0-1

Glycerol 0-1 (intet nitrogen) ® Tallet 3 betegner god udnyttelse, tallet 2 betegner jævnt god udnyttelse, tallet 1 betegner dårlig udnyttelse, og tallet 0 be= tegner ingen udnyttelse.

13 143766

Til inokulering benyttes en sporesuspension i destilleret vand; sporerne er fremstillet i tomatagar på skråglas. Udnyttelsen af car= bon- og nitrogenforbindelserne bestemmes på følgende grundmedium: KHgPO^ 2,38 g MnClg.4HgO 0,0079 g K2HP0^ 5,65 g ZnS04.7H20 0,0015 g

MgS0^.7H20 1,00 g agar 15 g

CuS0^.5H20 0,0064 g destilleret vand 1 liter

FeS04.7H20 0,0011 g mediet indstilles på en pH-værdi på 6,8-7,0.

Til bestemmelse af carbonkilderne på dette grundmedium tilsættes der 2,64 g (NH^gSO^ pr. liter som den fælles nitrogenkilde. Car= bonkilden, der skal undersøges, tilsættes i en koncentration på 1$ med undtagelse af natriumsaltene af de organiske syrer, som til= sættes i en koncentration på 0,15$. Til undersøgelse af nitrogen= kilderne anvendes grundmediet, som tilsættes 1$ stivelse og nitrogen= . kilden i en koncentration på 0,1 g nitrogen pr. liter.

På grundlag af sporernes ornamentering og generelle morfologi og forgreningerne af det sporebærende organ, farverne en masse på forskellige medier og visse biokemiske og fysiologiske reaktioner konkluderes det, at Streptomyces sp. X-5108 er forskellig fra en hvilken som helst af kulturerne i den Gray-serie, som er beskrevet i litteraturen.

Dyrkning af organismen Streptomyces sp. X-5108 til dannelse af antibiotikum X-5108 kan udføres under anvendelse af et stort antal fermentationsmetoder. Sædvanligvis kan den følgende grundlæggende metode anvendes ved fremstilling både i kolber og tanke. Ted fer= mentering i kolber sættes en trådøjefuld sporer fra en agarskråkul= tur til 100 ml næringsmedium i en 500 ml*s Erlenmeyer-kolbe og inkuberes ved ca. 28°C i et roterende rysteapparat i indtil 7 døgn.

Der udtages aseptisk prøver af hele fermentationsvæsken til in vitro undersøgelser det 3., 5. og 7. døgn. På tilsvarende måde fremstilles til fremstilling af større rumfang af fermentationsvæs= u 143756 ke først podekultur i 6 liters Erlenmeyer-rystekolber eller i 20 liters pyrexkolber, som er egnede til luftning , prøveudtagning osv.. Denne fermentationsvæske overføres derefter til en fermentationstank, luftningen i kolberne og tankene udføres ved at presse steril luft gennem fermentationsmediet. I tankene foretages yderligere omrøring med mekaniske omrørere. Der tilsættes skumdæmpningsmidler såsom lardolie, soyabønneolie og lignende efter behov til nedsættelse af skumdannelsen.

Streptomyces sp. X-5108 kan dyrkes på et stort antal væskeformede kulturmedier. Medier, som er særlig anvendelige til fremstilling af det' hidtil ukendte antibiotikum, indeholder en assimilerbar car= bonkilde såsom stivelse, glucose, melasse og lignende og en assimi= lerbar nitrogenkilde såsom protein, proteinhydrolysat, polypeptider, • aminosyrer, majsstøbevand og ammoniumsalte og uorganiske kationer og anioner såsom kalium, natrium, calcium, magnesium, sulfat, phos= · phat, chlorid og lignende. Sporstoffer såsom cobolt, kobber, jern, molybdæn, bor og lignende forefindes som urenheder i andre af de til mediet satte stoffer.

Aktiviteten af antibiotikum X-5108 kan bestemmes in vitro ved dets inhiberingszone med den gram-positive bakterie Bacillus E. ved den sædvanligvis anvendte ”cup-plate”-agardiffusionsmetode, hvor prøven f.eks. kan anbringes i en beholder (eventuelt cylinderformet) eller på et stykke væskeabsorberende materiale. Alternativt kan den gram= -positive bakterie Bacillus· simplex anvendes. Begge bakterierne giver en' inhiberingszone på ca. 20 mm med en arbitrært defineret opløsning indeholdende 1 enhed pr. ml opløsning. Ved denne bestemmelse dyrkes en· kultur af prøveorganismen på et næringsmedium, f.eks. "Trypticase Soy Broth”, i 24 til 42 timer ved 28°C i et roterende rysteapparat, idet der anvendes 100 ml medium pr. 500 ml*s Erlenmeyer-kolbe. Der anvendes en inokulumkoncentration på 0,25 - 0,5/¾ til inokulering af 4 ml podelag, som .hældes oven på et forud hærdet 20 ml basislag af næringsagar på en 100 ml*s Petri-skål af glas eller éngangs plastic. Pladerne køles i mindst to timer, inden der anbringes de ovenfor an= givne beholdere, som derefter fyldes med prøveopløsningen indehol= dende antibiotikum. Pladerne inkuberes derefter ved 35°C i 18 timer, og zonediametrene måles derefter med en nøjagtighed på 0,5 mm, Be= stemmelse af aktiviteten i enheder pr. ml foretages derefter ved hjælp.af en standardkurve.

χ5 143756

Eksempler på de fortrinsvis anvendte medier og de fremkomne antibio= tikumudbytter i kolber og i fermentationstanke med luftning er angivet i tabellerne TI - IX. Af de i disse tabeller angivne data vil det ses, at complexe nitrogenforbindelser fra adskillige lcildor, f.eks. plantematerialer såsom soyabønnemel, bomuldsfrømel, havremel, fast tomatpresserest, opløsninger fra fermentering af korn, animal= ske produkter såsom fiskemel, digereret kødmel og aminosyrehydrolysat samt mikrobe celler såsom Torula-gær,-vil medføre antibiotikapro= duktion.

TABEL TI.

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikum-^ produktion af Streptomyces sp. X-5108 i rystekolber.

Alle medierne indeholder 1$ dextrin, 0,1$ EgHPO^ og 0,1$ CaCO^. Der inokuleres 1 ml sporesuspension af Streptomyces sp. X-5108 til hver 100 ml medium. Alle nitrogenkilderne tilsættes i en koncentration på 1$ undtagen i forsøgene 17 og 23, hvor der anvendes 2$. Den antibiotiske aktivitet angives i B. simplex-enheder pr. ml.

Forsøg Nitrogenkilde tid i enheder pr. ml døgn 1 Digereret kødmel 6 50 2 BY-100 (Commercial Solvents Corp.) 5 45 3 Proflo (affedtet bomuldsfrøpro= dukt fra Traders Oil Mill Co.,

Fort Worth, Texas.) 5 23 4 Havremel (Quaker Oats Co.) 5 52 5 Affedtet soyabønnemel (soyalose) 5 50 8 Jornøddeproteinmel 5 41 9 Kokosnøddeproteinmel 5 50 10 Tomatpresserest, fast 5 57 11 Hørfrøoliemel 5 57 12 Majsmel 5 55 13 "Corn distillers dried grain with solubles" (H. Walker) 5 74 16 143756 label VI fortsat 14· "Soludri" (Schenley Destillers) 5 51 15 Fiskemel (Gorton’s) 5 25 16 Fiskerester (Wilkinson) 5 16 17 lactose/ albumin-blanding 5 50 19 Tørret Torula-gær 5 58 20 Gærautolysat (National) 5 16 21 Soyaenzymhydrolysat 5 35 22 Hvedeprotein, surt hydrolysat (Huron Mills) 5 12 23 Homogeniseret kondenseret fisk 5 27 24- "Protopepton nr. 366" (Wilson labs)5 18 25 Tørret majsstøbevand 5 26 TABEL VII.

len ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikum= produktion af Streptomyces sp. X-5108 i rystekolber.

Hvert medium indeholder 0,1$ KgHPO^ og 0,1$ CaCO^, med mindre andet angives, ler inokuleres 1 ml sporesuspension af Streptomyces sp. X-5108 til hver 100 ml medium, len antibiotiske aktivitet angives i B. simplex-enhéder pr. ml.

Forsøg Mediets sammensætning tid i enheder pr.

døgn ml 1 1$ digereret kødmel og 1$ dextrin 4 40 2 1$ kornremanens fra fermentering . . · .

(BY-100) og 1$ dextrin 4 67 3 1$ affedtet bomuldsfrømel (Proflo) og 1$ dextrin ' 4 52 4 1$ fiskerester 4 40 5 1$ korn "corn distiller’s dried grains with solubles" (H. Walker) og 1$ dextrin 6 138 6 som forsøg 3, men uden OaCO^ 4 19 7 som forsøg 3, men uden OaCO^ og KgHPO^ 4 34 8 som forsøg 7, men med 0,25$ Proflo 4 12 9 som forsøg 7, men med 2,0$ Proflo 4 47 17 U3756 label YII fortsat.

10 1# Proflo og 1$ glucose 6 21 11 1# Proflo og 1# stivelse 6 21 .12 1# Proflo og 1$ glycerol 4 35 13 1% Proflo og 1# puddersukker 4 14 14 1$ Proflo og 1# maltose 4 22 15. 1# Proflo og 1# lactose 4 26 16 1$ Proflo og 1 % mannitol 6 25 TABEL· Till.

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikums produktion af Streptomyces X-5108 i rystekolber eller tanke med gennemluftning. Hvert medium indeholder 0,5# OaOO^ og 0,1# KgHPO^, med mindre andet er angivet. Udbyttet af antibiotikum er angivet i B.simplex enheder pr. ml. Alle forsøgene i tank er udført to gange bortset fra nr. 7, som er udført én gang. Alle forsøg i kol=? ber varede 7 døgn, og alle forsøg i tanke varede 6 døgn, idet dog nr. 7 varede 4 døgn.

Nr. Mediets sammensætning i procent Udbytte, enheder/ml '

Tomat= "Distiller’s Majs= Glucose Kolber Tanke presse= solubles" sti= rest, velse fast ·· .

1 1 1 1 0,5 150 100, 120 2 2 O 1 0,5 100 71, 46 3 0 2 1 0,5 91 88, 119 4 11 1,5 O 140 150, 124 5 1 1 O 1,5 180 125, 126 6 1 1 0.0 54 ikke udført

Proflo Stivelse CaCOj KgHPO^ 7 1 1 0,1 0,1 94 97 18 143756 TABEL IX.

Fermentationer i tanke med forskellige medier.

. Fermen= Mediets sammensætning tid i Aktivi= tor døgn tet i enheder pr. ml E12 1$ "Distillers dried solubles", 1$ dextrin, 6 67 0,1$ KgHPO^ og 0,1$ CaCO^ E13 1$ Na-l-glutamat, 1$ dextrin, 0,1$ majsstø= 5 100 bevand-faststof, 0,15$ E5HP0, og 0,05$

MgS04 44

Ell 1$ Tom a tpr esserest, fast, ^'Distillers 7 200 dried solubles", 1$ majsstivelse, 0,5$ glucose, 0,5$ CaC03 og 0,1$ E2HP04 E4 0,5$ Proflo, 0,5$ "Distillers dried solu= '4- 91 bles", 0,5$ tomatpresserest, fast, 0,5$ kødekstraktpasta (protopeptone No.. 366), 1$ stivelse, 0,1$ CaC05 og 0,1$ K2HP04 K16 1,0 Proflo, 0,5$ majsstøbevand, 1,0$ majs= 4 260 stivelse, 0,1$ CaCO^ og 0,1$ E2HP04

Fermentorerne Ell, E12 og E13 er af rustfrit stål med rumfanget 400 liter, som sædvanligvis fyldes med 260 liter medium. E16 er en rustfri, stålfermentor på 3000 liter, som fyldes med 2000 liter me= dium, og E4 er en rustfri stålfermentor på 16800 liter, som fyldes med 12800 liter medium.

Et stort antal carbonkilder medfører god vækst og antibiotikumpro= duktion, f.eks. glucose, glycerol, dextrin og majsstivelse. Foruden de uorganiske salte, som forefindes i naturlige medier, kan en til= sætning af salte såsom kaliumphosphat, calciumcarbonat, magnesiums sulfat og sporstoffer undertiden give forøget vækst og antibiotikums udbytte, afhængigt af de stoffer, som findes i grundmediet. Et af de foretrukne medier til fremstilling af antibiotikum X-5108 i store fermentorer indeholder 1$ affedtet bomuldsfrømel, 1$ majsstivelse, 0,5$ koncentreret majsstøbevand, 0,1$ E2HP04 og 0,1$ calciumcarbonat.

19 143756

Streptomyces X-5108 Tokser også godt og producerer antibiotikum på nogle kemisk definerede syntetiske medier indeholdende ammoniumsal= te, nitrat eller aminosyrer såsom glutamat, arginin og glycin som nitrogenkilde sammen med glucose, dextrin, stivelse, citrat, acetat og lignende som carbonkilde tilsat salte såsom kaliumphosphat, calci= umcarbonat og magnesiumsulfat og sporstoffer såsom Fe++, Cu’*’"*", Mh++, Co++ og Zn++. Resultatet af fermentering af Streptomyces sp. X-5108 på forskellige syntetiske medier er angivet 1 tabel X. Sædvanlig= vis er antibiotikumudbyttet på de syntetiske medier, der er angivet i tabel X, ikke så stort som ved anvendelse af complexe nitrogenme= dier, TABEL X.

Antibiotikumproduktionen af Streptomyces X-5108 på syntetiske medier.

Mediets sammensætning tid i Antibiotisk døgn aktivitet i enheder pr. ml 1,0$ Na-glutamat, 1$ dextrin, 0,1$ K2HP04 og 0,05$ MgS04 5 7,6 1,0$ aminosyreblanding, 1$ dextrin, 0,1$ K2HP04 og 0,1$ USP salte nr. 1 5 11,5 BBL Czapek-Dox fermentationsvæske 5 4»4 1,0$ Arginin, 1,0$ dextrin, 0,1$ K?HP0., 0,1$

CaCO^ og 0,05$ MgS04 * 4 6 0,8 1,0$ dl-Aspartinsyre, 1,0$ dextrin, 0,1$ KJ3P0., 0,1$ CaCOj og 0,05$ MgS04 · * * 6 . 0,8 0,1$ Na-glutamat, 0,6$ (NH4)2HP04, 1$ glucose, 1# dextrin, 0,1$ ΚΡΗΡ0Α, 0,1$ CaCO,, 0,1$ KC1 og 0,05$ MgS04 5 5 6,6 0,33$ (NH4)2S04, 1,5$ glucose, 0,1$ Na-citrat, 0,05$ Na-acetat, 0,5$ NaCl, 0,025$ MgS04.7H20, 0,01$ K2HP04, 0,01$ KH2P04, 0,3$ CaC05, 0,001$

MnS04.4H20, 0,004$ ZnS04.7H20 og 1,6 x 10“6$ K2Cr207 7 20

Aminosyreblandingen er Staley’s Sta-Mino B. BBL Czapek-Dox-fermenta= tionsvæske indeholder 3$ saccharose, 0,3$ NaNO^, 0,1$ K2HP04, 0,05$ MgS04> 0,05$ XC1 og 0,001$ FeS04, og forhandles af Baltimore Biolo= gical Laboratories.

20 1 437 5 6

Dannelsen af antibiotikum X-5108 forøges ved kraftig luftning af fermentationsmediet. Fremstillingen af antibiotikum X-5108 kan udføres ved en hvilken som helst temperatur, som medfører tilfreds= stillende vækst af mikroorganismen. F.eks. dyrkes Streptomyces X-5108 i rystekolber, som inkuberes ved temperaturerne 24, 28, 30 og 32°C. Antibiotikumstyrkebestemmelser efter 3, 4, 5 og 6 døgn viser, at der kan fås samme maksimale‘udbytte ved en hvilken som helst tempe= ratur mellem 24 og 32 °C. Imidlertid fremkommer topudbyttet ved 3 -4 døgn ved 30 og 32°C, hvorimod det tager 4 døgn ved 28°C og 5 - 6 døgn ved 24°C. Sædvanligvis opnås optimal dannelse af antibioti= kum X-5108 efter 2-10 døgn. Fermentationsmediet forbliver sæd= vanligvis ret nær ved neutral reaktion eller på den sure side under fermentationen. Den endelige pH-værdi afhænger dels af den mængde puffer der er tilstede og dels af den oprindelige pH-værdi af me= diet, som sædvanligvis er tæt ved neutral før steriliseringen.

Efter afslutning af fermentationen kan der anvendes forskellige metoder til isolering og rensning af antibiotikum X-5108. Anven= delige isolerings- og rensningsmetoder indbefatter ekstraktion med opløsningsmiddel såsom chargevis ekstraktion eller anvendelse af kontinuerligt virkende modstrøms væske/væske-ekstraktionskolonner og gelpermeationschromatografi i et ikke-vandigt system.

Ted en foretrukken arbejdsmåde udvindes antibiotikum X-5108 fra kultur= mediet ved adskillelse fra myceliet og eventuelle uopløste bestanddele fra fermentationsvæsken ved sædvanlige metoder såsom filtrering eller centrifugering. Antibiotikum X-5108 ekstraheres derefter fra den filtrerede eller centrifugerede fermentationsvæske under anven= delse af enten chargevis ekstraktion eller modstrømsfordelingseks= traktion. Ekstraktionen med opløsningsmiddel kan udføres under anvendelse af en pH-værdi fra ca. 3 til ca. 7,5 og under anvendelse af sådanne opløsningsmidler som ikke-vandblandbare estere såsom e= thylacetat, amylacetat, butylacetat og lignende aliphatiske estere; butylacetat foretrækkes. Et foretrukket opløsningsmiddelsystem til anvendelse ved rensning ved modstrømsfordelingsteknikken er en blan= ding af ethylacetat, isopropanol og 0,1M vandig sek.natriumphosphat= opløsning.

2i 1*3756

Den endelige rensning af antibiotikum X-5108 kan udføres ved gel= permeationschromatografi. Denne rensningsteknik udføres ved adsorption af forud rensede prøver af antibiotikum, hvilken forudgående rensning f.eks, er udført ved ekstraktion med opløsningsmiddel, på tværbundne eller· polymeriserede dextrangeler. Ved en foretrukken måde til endelig rensning chromatograferes det forud rensede anti= biotikum på Sephadex ΙΉ-20, idet der elueres med alkohol.

Efter filtrering eller centrifugering af fermentationsmediet kan anvendes tyndtlags- eller papirchromatografi til analyse til bestem= melse af antibiotikum X-5108. På grund af antibiotikets farveegenskab ber kan til synliggørelse af pletterne anvendes fluorescensindikator= metoden, og yderligere kan med fordel anvendes bioautografi. Chrom= atograferingen kan udføres på papir, men udføres dog sædvanligvis på silicagel-glasplader. Det til udførelsen af tyndtlagschromatografe= ringen anvendte opløsningssystem består af chloroform, methanol og vandigt ammoniumhydroxid.

Det hidtil ukendte antibiotikum X-5108, som fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse, foreligger efter rensning som et gult amorft stof. Der kan fremstilles kationiske salte af antibiotiket under anvendelse af antibiotikum X-5108 og en farmaceutisk tolerabel uor= ganisk eller organisk base. Blandt de salte af antibiotikum X-5108, som kan fremstilles, kan nævnes alkalimetalsalte såsom natrium- og kaliumsalte og Jordalkalimetalsalte såsom calciumsaltet.

Disse salte kan f,eks. fremstilles under anvendelse af vandige op= løsninger af alkalimetal- og jordalkalimetalhydroxider. Således . danner opløsningen af antibiotikum X-5108 i vandigt natriumhydroxid, vandigt kaliumhydroxid eller vandigt calciumhydroxid natrium-» ka= lium- eller calciumsalt. Disse salte kan anvendes til de- samme biologiske formål som antibiotiket. Da opløsninger af salte af antibiotikum X-5108, især natriumsaltet, er betydelig mere stabile end opløsninger af antibiotiket i ikkewsaltfprm, foretrækkes det at anvende svagt basiske puffere til rensning ved modstrømsfordeling og ammoniekalske opløsningsmiddelblandinger til tyndtlags^ chromatografi, hvilket formindsker koncentrationen af antibiotikum i opløsningen.

22 143756

Antibiotiket indeholder grundstofferne carbonj hydrogen, oxygen og nitrogen i· i det væsentlige de nedenfor angivne vægtprocent= mængder.

Grundstof · Antibiotikum X-5108 Natriumsalt deraf C · 63,63 61,48 H 7,81 7,81 N 3,48 3,32 0 (taget som differens) # 25,08 24,45

Na ' - 2,94

Antibiotikum X-5108 er opløseligt i alkoholer, f.eks. methanol, ethanol, 1- og 2-propanol og tert.butylalkohol, ikke-vandblandbare estere, f.eks. ethylacetat, amylacetat, butylacetat og lignende aliphatiske estere, samt chloroform. Antibiotiket er uopløseligt 1 vand. Natriumsaltet af antibiotikum X-5108 er opløseligt i vand, lavere alkoholer såsom methanol, ethanol, isopropanol og butanol og Ν,Ν-dimethylformamid. Det er tungtopløseligt i amylalkohol, te= trahydrofuran og dioxan og meget tungtopløseligt i acetone, amylace= tat, butylacetat og ethylacetat. Det er uopløseligt i benzen, chlo= roform og ethylether.

I det følgende angives forskellige fysiske karakteristika for anti= biotikum X^-5108 og dets natriumsalt.

Den optiske drejning af natriumsaltet af antibiotikum X-5108. er [oc].jp = -82,8 (ethanol, c = 0,52).

IR-Spektret af antibiotikum X-5108 i en EBr-tablet er vist i fig.

1. Antibiotiket udviser karakteristisk absorption i IR-området af spektret ved de følgende bølgelængder, som er angivet i reciprokke cm:

Brede bånd ved 3400 og 1580 cm"·*", stærkt bånd ved 1660 cm~^ og fremtrædende bånd ved 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 og 995 cm"'*'.

23 143756 IR-Spektret af natriumsaltet af antibiotikum X-5108 i en KBr-tablet er vist i fig. 2. Natriumsaltet udviser karakteristisk absorption i IR-området af spektret ved følgende bølgelængder:

Bredt bånd ved 3400 cm-1 og fremtrædende bånd ved 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 og 1000 cm”1.

UV-Absorptionsspektret af antibiotikum X-5108 ved forskellige pH= -værdier er vist i fig. 3. Der er UV-maxima ved: 0.MH01: >W 354 m om = «3> ^max 233 “ = 610> · *max 206 m (Ef 0Jn =500) pH-værdl 7, puffer: λΜ8Χ 327 mn (l^cm = 423) (isopropanol/K2HP04) ^ 231 m = 66o) O.ltT KOH: *max 327 um (E^om = 416) λ 231 mn (E^ = 647) max v 1 cm

Det kernemagnetiske resonansspektrum af antibiotikum X-5108 er vist: i fig. 4. NMR-spektret er optaget under anvendelse af CDCl.^ som · opløsningsmiddel og tetramethylsilan som intern standard. NMR-spek= tret viser fremtrædende signaler ved 0,92 6, i området mellem 1,665 og 2,036, ved 3,16 £og 3,43 6 og i det olefiniske område.

Antibiotikum X-5108 har en lav oral og parenteral toxicitet.

Antibiotikum X-5108 har virkning som vækstfremmende middel til fjerkræ og medfører forøget fodereffektivitet hos dyrene. Således kan antibiotikum X-5108 anvendes som den aktive bestanddel i hidtil ukendte fjerkræfodere, som ved oral indgivelse til fjerkræ resulterer i forøget væksthastighed og en forøget fodereffektivitet hos dyrene. Indgivelse af disse fodere kan opnås ved fremstilling af et ernæringsrigtigt fjerkræfoder som tilfredsstiller dyrenes ernæringsmæssige behov, og hrortil der yderligere sættes det aktive vækstfremmende antibiotikum X-5108.

24 1437 5-6 Når antibiotikum X-5108 anvéndes til fremstilling af de vækstfremmende fodere, er antibiotikumbestanddelen antibiotiket eller et hvilket som helst fysiologisk tolerabelt kationisk salt deraf, fortrinsvis natriumsaltet. I det følgende angiver betegnelsen "antibiotikum X-5108" såvel antibiotikum X-5108 som et hvilket som helst fysio= logisk tolerabelt kationisk salt deraf.

Et vækstfremmende foder indeholdende antibiotikum X-5108 som den aktive bestanddel kan fremstilles på adskillige måder. Ved en af disse metoder sættes antibiotiket direkte til et fortærbart ikke-toxisk bæremateriale. Eet foretrækkes, at bærematerialet har næringsværdi for fjerkræ, idet der især foretrækkes et bæremateriale med høj foderenergi for fjerkræ. X de tilfælde, hvor antibiotiket sættes direkte til foderet, kan blandingstriimet udføres under an= vendelse af kendte metoder. E.eks. sættes næringsmaterialerne, som udgør fjerkræfoderet, enten hver for sig eller samlet til en chargevis virkende blander, og derefter tilsættes antibiotiket.

Blanding fortsættes, indtil produktet helt igennem indeholder en ensartet fordeling af bestanddelene.

Ee næringsmaterialer, der anvendes som fjerkræfoder og som bære= materiale for antibiotikum X-5108, kan varieres inden for et vist område afhængigt af det specielle behov hos den type fjerkræ, som skal fodres, og afhængigt af hvad dyrene senere skal anvendes til. Imidlertid indeholder foderet i de fleste tilfælde proteihkilder såsom fiskemel, soyabønnemel, majs- og jordnøddeprodukter og lig= nende, carbonkilder såsom korn, mel, sukker, og lignende. Yderligere kan mineral- og vitaminbalancen for dyrene være opretholdt ved til foderet at sætte de nødvendige mineraler, f.eks. natrium-, kalium-, magnesium- og calciumcarbonat, og vitaminer, f.eks. A vitamin, B12 vi'*'3111!11» D vitamin og thiamin. Poderet kan naturligvis også indeholde andre sædvanligt anvendte tilsætninger.

Eet er særlig hensigtsmæssigt at anvende antibiotiket X-5108 som aktiv bestanddel til inkorporering i en koncentreret forblan= ding, som derefter kan tilsættes fjerkræfoderet. Ved fremstilling af en fast forblanding, som indeholder antibiotikum X-5108, kan et hvilket som helst bæremateriale eller fyldstof anvendes som inert bestanddel, når blot det er inert over for det tilsatte antibiotikum og ikke-toxisk over for det fjerkræ, som skal indtage 25 143756 præparatet. Adskillige faste materialer tilfredsstiller disse betingelser og kan derfor anvendes med godt resultat. Blandt sådanne faste materialer kan nævnes mineralkilder såsom for= malede østersskaller, spiselige kornsorter og vegetabilske, marine eller animalske materialer, som findes i sædvanligt anvendt animalsk foder, såsom majsmel, citrusmel, soyabønnemel, fiskemel, kødaffald, tørret fermentationsremanens og lignende.

Antibiotikum X-5108 kan blandes med'It eller flere af de ovenfor angivne anvendelige faste stoffer til en mask, pille eller en hvilken som helst foretrukken form på en sædvanlig måde. P.eks. kan forblandingen fremstilles ved findeling eller pulverisering af den aktive bestanddel og de inerte bestanddele under anvendelse af en hvilken som helst kommerciel mølle. Hvis fodermaterialet ikke er til stede, når der formales eller pulveriseres, kan den resulterende forblanding fordeles i et hvilket som helst kommercielt fo= dermateriale.

Den mængde antibiotikum X-5108, som er nødvendig til opnåelse af den ønskede stimulering af væksthastigheden og forøgelse af fodereffek= tiviteten, er kritisk, men kan variere inden for et foreskrevet område. Når antibiotiket anvendes i forbindelse med fjerkræfoder, foretrækkes det pr. 100 vægtdele foder at anvende fra 0,0001 vægtdel til 0,01 vægtdel af det aktive materiale, som er anti= biotikum X-5108 eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. Større koncentrationer af antibiotikum X-5108 end 0,01 vægtdel pr. 100 vægt= dele foder giver sædvanligvis ikke bedre resultater end 0>01 vægt= del pr. 100 vægtdele. Det er således ikke fordelagtigt at anvende mængder, som er større end 0,01 vægtdel aktiv bestanddel pr. 100 vægt= dele foder. Den vækstfremmende foderblanding kan fortrinsvis være et fjerkræsuppleringsfoder, som pr. 100 vægtdele foder indeholder fra 0,0005 vægtdel til 0,0025 vægtdel af den aktive bestand= del antibiotikum X-5108.

En forblanding, som senere kan sættes til foderet, er, som ovenfor anført, en hensigtsmæssig anvendelse af det vækstfremmende stof 4 26 143756 og sikrer en god fordeling af den aktive bestanddel igennem foderet. Den mængde antibiotikum X-5108, der findes i forblandingen, er ikke kritisk. Uden hensyn til mængden af antibiotikum X-5108 i for= blandingen opnås' det ønskede formål ved anvendelse af en sådan mæng= de af forblandingen, som er i stand til at give et færdigt foder, der indeholder den ovenfor angivne effektive mængde antibiotikum X-5108. Forblandingen er en bekvem form til levering til foder= fabrikanten eller fjerkræopdrætteren, som så kan blande en passende mængde af forblandingen med tilgængeligt fjerkræfoder til frem= stilling af et færdigt foder, som indeholder en effektiv mængde anti= biotikum X-5108.

Fremstillingen af antibiotikum X-5108 og anvendelsen heraf belyses nærmere ved de følgende eksempler, hvor dele er vægtdele, med mindre andet er angivet:

Eksempel 1.

Fermentation af streptomyces sp. X-5108.

En suspension af sporer af Streptomyces sp. X-5108 fra en nærings= agar, som var fyldt skråt i et reagensglas, podes til en 20 liter*s Pyrexkolbe, som indeholder 15 liter gennemluftet medium med føl= gende sammensætning: 1$ soyabønnemel, 1$ puddersukker, 0,25$ majsstøbevand, 0,1$ 0,1$ CaCO^ og 0,5$ lardolie (som skumdæmpningsmiddel). Efter 4 døgns vækst under gennemluftning .ved 28°C overføres den trådagtige vækst til en 400 liter's rustfri stålfermentor, som indeholder 240 liter medium med følgende sammen= sætning: 1$ affedtet bomuldsfrømel (Proflo), 1$ majsstivelse, 0,25$ majsstøbevand-faststof, 0,1$ CaCO^, 0,1$ samt lardolie som skumdæmpningsmiddel. Før inolulering indstilles mediets pH-værdi på 6,8. Fermentoren gennemluftes, og væksten fortsættes i 5 døgn. Fermentorens indhold filtreres derefter ved hjælp af diatomeéjord ("Hyflo Filter Cell”). Filtratets pH-værdi indstilles på 3,5, og filtratet ekstraheres med et halvt så stort rumfang butylacetat.

Den klarede ekstrakt koncentreres under reduceret tryk ved en temperatur under 40°C til en brun sirup, som efter triturering med petroleumsether giver et fast stof, nemlig antibiotikum X-5108, som har en aktivitet på 120 enheder Bacillus E pr. mg.

27 M3? 5 6

Eksempel 2.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved chargevis ekstraktion med et opløsningsmiddel.

Den chargevise ekstraktion med et opløsningsmiddel udføres med 12.000 liters fermentationscharger, -som har en aktivitet in vitro på ca. 130 enheder pr. ml over for B. sinqplex. Den filtrerede fer= mentationsvæske ekstraheres med butylacetat ved en pH-værdi på 7,5. Den organiske ekstrakt vaskes med vand og destilleres hurtigt ved en temperatur under 50°C, og den resulterende vandfri opløsning tilsættes natriumdiethylmalonatreagens til indstilling af pH-vaerdien på 9,0. Det gule bundfald, som dannes, frafiltreres og vaskes med butylacetat. Det fordeles derefter mellem vand og butylacetat, og pH-værdien indstilles på 4· Den organiske fåse fraskilles og behandles som ovenfor angivet med den undtagelse, at der tilsættes natriumdiethylmalonatreagens indtil en pH-værdi på 8,5. Det r-esul= terende bundfald gøres surt og ekstraheres med frisk butylacetat. Ekstrakten behandles med "Darco G 60”, og natriumsaltet af anti= biotikum X-5108 udfælder ved tilsætning af natriumdiethylmalonat til en pH-værdi på 8,0. Det på denne måde vundne gule natriumsalt vaskes og tørres, hvorefter det har en aktivitet in vitro på ca.

430 enheder pr. mg over for B. simplex. Den ovenfor beskrevne frem= gangsmåde kan angives ved følgende forenklede flow sheet:

Flow sheet for isolering af antibiotikum X-5108.

_12000 liter fermentationsvæske, høstet efter 5-6 døgn trin 1 cellerne frafiltreres med ved hjælp af Hyflo

V

_10400 liter filtreret fermentationsvæske. pH-værdi 7,5 trin 2 (om nødvendigt indstilles pH-værdien med H^PO^) ekstraheres med 2400 liter butylacetat v _2320 liter ”1. butylacetat”

Flow sheet fortsat 28 U3756 trin 3 vaskes to gange med 100 liter vand, koncentreres hurtigt y 320 liter ”1« butylacetat-koncentrat" trin 4 der tilsættes natriumdiethylmalonatreagens til en pH-værdi på 9 (ca. 1 - 1,5 liter 1,7N), bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butylacetat Ψ' _”1. bundfald" . trin 5 opløses i 100 liter vand, pH-værdien indstilles på 4 med 15$ H^PO^. Der ekstraheres to gange med butylacetat (80 og 40 liter) Ψ 112 liter w2. butylacetat" trin 6 vaskes to gange med 8 liter vand. Koncentreres hurtigt Ψ _16 liter ”2. butylacetat-koncentrat" trin 7 pH-værdien indstilles på 8,5 med natriumdiethylmalonat= reagens. Bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butylacetat Ψ _”2. bundfald” trin 8 opløses i 80 liter vand, pH-værdien indstilles på 5 med 15$ H^PO^.' Der ekstraheres to gange med butylacetat (60 og 30 liter) _84 liter "3. butylacetat” trin 9 vaskes to gange med 8 liter vand. Koncentreres hurtigt ψ _16 liter "3. butylacetat-koncentrat” trin 10 omrøres med 50 g "Darco G 60" i en time ved stuetemperatur filtreres og koncentreres hurtigt .

Ψ 29 U3756 flow sheet fortsat _8 liter "4. butylacetat" trin 11 pH-værdien indstilles på 3,0 med natriumdiethylmalonatrea= gens. Bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butyl= acetat og derefter med 4 liter petroleumsether (30 - 60°C) \f og tørres ved 56°C og 0,5 mm Hg i 36 timer natriumsaltet af antibiotikum X-5108 hvilket er et gult amorft fast stof.

Eksempel 3·

Rensning af antibiotikum X-5108 ved modstrømsfordeling.

Der anvendes 200 glas, rumfanget af den øvre fase er 40 ml, og rumfanget af den nedre fase.er 40 ml. Chargen er på 5 g antibio= tikum X-5108, fremstillet ved ekstraktion med et opløsningsmiddel af den rå fermentationsvæske, opløst i 40 ml af den øvre fase.

Der benyttes en opløsningsmiddelblanding bestående af ethylacetat, isopropanol, vandig 0,1M sekundært natriumphosphatopløsning i rumfangsforholdet 12:9:20. Der udføres 200 overføringer, hvor der er "top" ved 159 overføringer. Fordelingsforholdet er 3,88.

Fordelingen udføres på følgende måde:

Fraktionerne 150 - 170 blandes og tilsættes 1-butanol til ekstraktion af antibiotiket til den organiske fase. Den vandige fase fraskilles, og den organiske fase vaskes fire·gange med vand. Derefter fjernes vandet fra den organiske fase ved azeotropisk destillation, og bundfaldet udfældes ved tilsætning af petroleumsether. Der vindes 3 gram antibiotikum, som har en biologisk aktivitet på ca. det dobbelte af udgangsmaterialet.

• Eksempel 4.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved chromatografi på "Sepha= dex»©lH-20.

30 T437S6

En ethanoli sk opløsning af 300 mg af den ved modstrømsfordeling på den ovenfor angivne måde rensede prøve af antibiotikum X-5108 indstilles på en pH-værdi på 8 - 9 med natriummethoxidopløsning (i henhold til vådt indikatorpapir) og sættes på en nSephadex,r ® IH-20= kolonne (290 mm x 41 mm), som er ækvilibreret med 3A alkohol. Ko= lonnen fremkaldes med 3A alkohol, og det meste af antibiotikumzonen kommer frem ved et effluentrumfang på 950 - 1200 ml. De følgende fraktioner indeholder en del farvede zoner med ubetydelig biologisk aktivitet. De aktive fraktioner samles og inddampes til et lille rumfang, hvortil der sættes ether og petroleumsether til udfældning af antibiotiket. Det resulterende gule faste stof er natriumsaltet af antibiotikum X-5108, som kun giver én plet i henhold til tyndtlags= chromatografisk analyse.

R^ = 0,19 (silicagel F-254, fremkaldt med UY-lys) og = 0,29 (silicagel/kiselgur, fremkaldt bioautografisk).

Eksempel 5.

Fremstilling af antibiotikum X-5108 ud fra dets natriumsalt.

0,464 g natriumsalt afantibiotikum X-5108, fremstillet ved chroma= tograf i på "Sephadex" ^1^-20, opløses i 4,6 ml isvand, og der til= sættes 10 ml ethylacetat til dannelse af et tofasesystem. Til denne blanding, som haves i en skilletragt, sættes 1 ml opløsning af primært natriumphosphat (50 g NaH^PO^.^O i 100 ml vand). Det oprindeligt dannede bundfald opløses ved omrystning. Den vandige fase fraskilles, og den organiske fase vaskes fire gange med is= vand, hver gang med ét rumfang, og dehydratiseres derefter ved azeotropisk destillation med ethanol. Koncentratet på 2 ml for= tyndes med to rumfang ethylacetat, og der tilsættes dråbevis die= thylether indtil uklarhed og derefter 30 ml petroleumsether. Det resulterende bundfald fraskilles ved filtrering og tørres ved stuetemperatur, hvorved fås antibiotikum X-5108.

31 143756

Eksempel 6.

Bestemmelse af den vækststimulerende effekt af antibiotikum X-5108.

Der fremstilles en grundfoderblanding med følgende sammensætning:

Bestanddele · Vægtprocent

Formalet gul majs 56,075 Kød og benmel (50% protein) 4,000

Fiskemel (60% protein) 4,000

Soyabønnemel (50% protein) 28,000

Dehydratiseret alfalfa-mel 1,000

Animalsk fedt 4,000

Methionin 0,200

Fosforit 0,250

Calciumcarbonat 1,200 lodsalt 0,250

Vitaminsupplement 1,000

Spormineralsupplement 0,025

Der sættes til denne foderblanding 50 mg antibiotikum X-5108 pr. kg foderblanding.

Den vækststimulerende effekt af antibiotikum X-5108 bestemmes ved at lade fjerkræ æde ad libitum af den ovenfor angivne foderblan= ding, med den angivne tilsætning af antibiotikum X-5108. Forsøget udføres med én dag gamle "Cornish Cross Sexed Broiler" kyllinger.

Der anvendes en gruppe på 10 kyllinger til hvert'forsøg (5 hanner og 5 hunner). De forskellige grupper har adgang til den foder= blanding, som er tilsat antibiotikum. Der foretages randomiseret fordeling af forsøgene for at udligne faktorer såsom varme, lys og placering. Fuglene observeres i en periode på 2 uger, idet grup= pernes vægt bestemmes flere gange i perioden, og de individuelle vægte bestemmes efter 14 døgns forløb. Det registreres også, hvor meget foderblanding, der indtages, og forbedringen i foderblanding gens effektivitet beregnes, sammenlignet med kontrolgruppen.

32 143756

Der udføres samtidig forsøg med kontrolgrupper på ovenfor angiv= ne måde med den undtagelse, at kyllingerne, som anvendes i kon= trolgrupperne, spiser ad libitum af en foderblanding, som, bort= set fra, at den ikke indeholder antibiotikum X-5108, indeholder de samme næringsbestanddele, som angivet ovenfor..

Den gennemsnitlige vægtforøgelse ved hver gruppe divideres med den gennemsnitlige vægtforøgelse ved kontrolgruppen, og kvotienten mul= tipliceres med 100, hvilket giver den gennemsnitlige procentvise vægtforøgelse. Forøgelseil beregnes ved fra kyllingernes vægt efter 2 ugers forløb at subtrahere kyllingernes vægt på den første levedag. Følgende formel kan opstilles:

Forsøgsårs, gensnt. slutvægt - forsøgsårs, gensnt. begyndelsesvægt _ Kontrolgrs. gensnt. slutvægt - kontrolgrs. gensnt. begyndelsesvægt den procentvise vægtforøgelse 100 -("gruppens"er forkortet-til "grs", og "gennemsnitlig" til "gensnt.") Resultatet af forsøget fremgår af tabel XXI.

TABEI XII.

Forsøg med Kontrolgruppe Gruppe, som får

Antibiotikum X-5108

Tilsætning af antibiotikum i mg pr. kg foder · o 50 Vægtforøgelse efter to ugers forløb, gennemsnit for 40 kyllinger, vægtforøgelse + stan= dardafvigelse ” 154 + 8 185 + 12 > Procentvis vægtforøgelse 100 120

Fodereffektivitet 1,55 1,39

Procentvis forbedret foder= • effektivitet - +12 55 143766

Det fremgår af tabel XII, at kyllinger, der fodres med en foder= blanding, som er tilsat 50 mg antibiotikum X-5108 pr. kg foder, udviser en forøget væksthastighed sammenlignet med en kontrolgrup= pe. Samtidig udnytter kyllingerne foderet mere effektivt, således som det fremgår af den 10$*s forbedring af fodereffektiviteten.

Eksempel 7.

Det i eksempel 6 angivne forsøg gentages flere gange med anven= delse af den samme grundfoderblanding som angivet i eksempel 6, idet dog indholdet af antibiotikum X-5108 varieres i de forskellige forsøg. Forsøgskyllingerne indgives en foderblanding indeholdende 5, 10, 25, 50 og 100 mg aktiv bestanddel pr. kg foderblanding. Forsøgene gentages for at bekræfte resultaterne. Der foretages fire forsøg med kontrolgrupper på 10 fugle, som indgives foderblandin= gen uden indhold af antibiotikum. Ved alle forsøgene bestemmes væksthastigheden i løbet af en periode på to uger sammenlignet med en kontrolgruppe. Det bestemmes, hvor meget foder fuglene indtager, og forbedringen i fodereffektiviteten sammenlignet med kontrolgrup= pen beregnes. Resultaterne fremgår af tabel XIII.

I tabel XIII er for de yderligere forsøg angivet de til tabel XII svarende værdier, idet dog standardafvigelsen ikke er angivet i ta= bel XIII, og der i tabel XIII er angivet, hvor mange fugle for= søgene omfatter.

Claims (1)

1. Antibiotikum X-5108 til anvendelse som fodereffekvitetsforøgende og vækstfremmende middel ved opfodring af fjerkræ, kendetegnet ved, at antibiotiket er et gult amorft stof, der kan karakteriseres på følgende måde: a) grundstofindbold . C Η K 0 fundet ved analyse, i procent 63,63 7,81 3,48 25,08 (osygenindholdet er fundet ved udregning af differencen), b) stoffet er opløseligt i methanol, ethanol, 1- og 2-propanol, tert.butylalkohol, ethylacetat, amyl acetat, butylacetat og chloroform, c) stoffet har et karakteristisk IR-spektrum som angivet i fig. 1, d) stoffet har et karakteristisk MR-spektrum som angivet i fig. 4, eller et fysiologisk tolerabelt kationisk salt deraf.