DK142191B - Vækstfremmende fjerkræfoder og middel til anvendelse ved dets fremstilling. - Google Patents

Description

142191 l

Den foreliggende opfindelse angår et vækstfremmende fjerkræfoder, der medfører en forøgelse af fodereffektiviteten for fjerkræ og forøgelse af fjerkræs vækst, hvilket foder er ejendommeligt ved, at det ud over sædvanlige foderbestanddele indeholder antibiotikum 5 X-5108 eller et fysiologisk tolerabelt salt deraf eventuelt på en ikke- toxisk inert bærer, i hvilket foder antibiotikum X-5108 eller det fysiologisk tolerable salt deraf er til stede i en mængde på fra 0,001 til 0,01 vægtdel pr. 100 vægtdele.

Til den foreliggende opfindelses formål kan anvendes antibiotikum kaldet X-5108 i ren form, i fortyndede former samt som et råt koncentrat. Det hidtil ukendte antibiotikum giver, hvadenten det forefindes i rå eller i en mere ren form, en markant vækstforøgelse hos fjerkræ.

15

Det hidtil ukendte antibiotikum X-5108 produceres af en hidtil ukendt art af Streptomyces nemlig Streptomyces sp. X-5108. Den hidtil ukendte antibiotikumproducerende Streptomycet er isoleret fra en jordprøve, som blev samlet på Bermudaøeme. En levedygtig 20 kultur af organismen mærket med laboratorieangivelsen Streptomy ces sp. X-5108, underkultur 3191-2, er deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor denne kultur er indgået i ATCC-samlingen under registreringsnummeret 21386.

Den art af Streptomyces, som her betegnes Streptomyces sp. X-25 5108, indbefatter alle stammer af Streptomyces, som producerer an tibiotikum X-5108, og som ikke afviger væsentligt fra stammen ATCC 21386.

I det følgende gives en generel beskrivelse af organismen Strepto-20 myces sp. X-5108, ATCC 21386 baseret på karakteristika såsom vækst, pigment, morfologi osv. De angivne farver og farveprøvebetegnelser er sædvanligvis de, som anbefales af the International Streptomyces Project (forkortes ISP): Shirling, E.B. og D. Gottlieb, 1966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Inti. J. Syste-25 matic Bact., 16, 313 - 340. Til tilvejebringelse af den diagnostiske karakteristik og den morfologiske beskrivelse, som angives nedenfor, er anvendt medier af den art, som er fremstillet af Difco Laboratories for ISP. Disse mediers sammensætning er angivet i tabel I.

2 142191

Tabel I

ISP-Vækstmedier.

5

Medium 1. Trypton/gærekstraktfermentationsvæske.

Bacto-trypton (Difco) 5,0 g

Bacto-gærekstrakt (Difco) 3,0 g

Destilleret vand 1,0 liter 10 pH-værdien indstilles på 7,0 - 7,2 før autoklavering. 5 ml fermentationsvæske hældes i et reagensglas med en diameter på 20 mm eller mere.

Medium 2. Gærekstrakt/maltekstraktagar.

15 Bacto-gærekstrakt (Difco) 4,0 g

Bacto-maltekstrakt (Difco) 10,0 g

Bacto-dextrose (Difco) 4,0 g

Destilleret vand 1,0 liter 20 pH-værdien indstilles på 7,3, hvorefter der tilsættes

Bacto-agar 20,0 g

Agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 25 15 - 20 minutter. Der hældes en tilstrækkelig mængde til at danne et skråsubstrat i mindst 6 reagensglas for hver kultur. Der steriliseres ved autoklavering, og reagensglassene afkøles henstillet i skrå stilling.

Sporsaltopløsningen, som anvendes i medierne 3, 4, 5 og 7, fremstilles af: 30

FeS04.7H20 0,1 g

MnCl2.4H20 0,1 g

ZnS04.7H20 0,1 g

Destilleret vand 100,0 ml 35 U2191 3

Medium 3. Havremelagar

Havremel 20 g

Agar 18,0 g 5 20 g havremel koges eller behandles med vanddamp i 1000 ml destil leret vand i 20 minutter. Der filtreres gennem osteklæde. Der tilsættes destilleret vand, indtil rumfanget er 1000 ml. Der tilsættes 1,0 ml sporsaltopløsning.

10 pH-Værdien indstilles pa 7,2 med natriumhydroxid. Der tilsættes 18 g agar; agaren gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

Medium 4. Uorganiske salte/stivelsesagar.

15

En opløsning 1 fremstilles af 10,0 g opløseligt Difco stivelse. Der fremstilles en pasta af stivelsen i et lille rumfang koldt destilleret vand, og der tilsættes vand, indtil rumfanget er 500 Hil.

20 Opløsning 2 fremstilles af:

KgHPO^ (vandfrit) 1,0 g

MgS04.7H20 1,0 g

NaCl 1,0 g 25 (NH4)2S04 2,0 g

CaCOg 2,0 g

Destilleret vand 500 ml

Sporsaltopløsning 1,0 ml 30 pH-værdien indstilles pi 7,0 - 7,4, hvis pH-værdien ikke allerede er inden for dette interval. Opløsningerne 1 og 2 blandes. Der tilsættes

Agar (Difco) 20,0 g 35 agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

142191 4

Medium 5. Glycerol/asparaginagar, L-Asparagin (vandfrit) 1,0 g

Glycerol 10,0 g

KgHPO^ (vandfrit) 1,0 g 5 Destilleret vand 1,0 liter

Spors altopløsning 1,0 ml pH-værdien indstilles på 7,0 - 7,4, hvis den ikke allerede er inden for dette område.

10

Agar 20,0 g

Agaren gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

15

Medium 6. Pep ton/gærekstrakt-jemagar.

Bacto-pepton jemagar, de-hydratiseret (Difco) 36,0 g

Bacto-gærekstrakt (Difco) 1,0 g 20 Destilleret vand 1,0 liter pH-værdien skal være 7,0 - 7,2 før autoklavering og indstilles om nødvendigt. Agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

25

Medium 7. Tyrosinagar. ;

Glycerol 15,0 g ' L-Tyrosin (Difco) 0,5 g ' L-asparagin (Difco) 1,0 g 30 K2HP04 (vandfrit) 0,5 g

MgS04.7H20 0,5 g

NaCl 0,5 g

FeS04.7H20 0,01 g

Destilleret vand 1,0 liter 35 Sporsaltopløsning 1,0 ml i j i pH-værdien indstilles på 7,2 - 7,4. Der tilsættes i i Λ 0

-J

i Λ U2191 5

Bacto-agar 20,0 g som gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.

5

Tomatpastaagar (Berger)

Glucose 10,0 g

KgHPC^ 1,0 g 10 Tomatpasta 20,0 g

Wilson's pepton 1,0 g

CaCOg 2,0 g

Agar 15,0 g

Ledningsvand 1000,0 ml.

15

Der steriliseredes ved et tryk på 6,8 kg i 30 minutter, hvorefter pH-værdien indstilles på 6,9.

Karakteriseringen af farverne er taget fra følgende fire kilder: 20 ISCC-NBS U.S. Department of Commerce 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names",

National Bureau of Standards Circular 553, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.; Tresner, N.D. og E.J. Backus, 1963, "System of color wheels for streptomycete taxonomy," Appl.

25 Microb., 11: 335 - 338; Eckerstrom, R. og C.E. Foss, 1958, Color Harmony Manual, 4. udgave, Container Corporation of America,

Chicago, Illinois; H. Prauser, 1964. "Aptness and Application of Colour Codes for Exact Description of Colours of Streptomycetes", Z. Allg. Mikrobiologie, 4 (1): 95 - 98.

30 Vækst.

Kulturen danner på mange medier et veludviklet og forgrenet mycelium og et karakteristisk luftmycelium. Den submerse vækst er for-35 højet, hård og grov, og afhængigt af det anvendte næringsmedium fremtræder væksten farveløs, gul, gulbrun eller olivenbrun. Der er sortbrune pletter i randene af væksten på gær/maltekstraktagar (ISP-medium 2).

6 142191

Luftmycelium og/eller en masse-sporefarve.

Luftmyceliet er moderat udviklet med fløjlsstruktur, og pigmentet er lyst gråhvidt (d), mellemgråt (2 fe) og gulgråt (2 dc) med en 5 svag hvid rand i tidlige vækststadier. Luftmassens farve er ifølge den af Tresner og Backus angivne "color wheel serie" Gy på ISP-me-dium 2 til W-gy på ISP-medierne 4 og 5. Der produceres koncentriske ringe, og koloniopdeling forekommer hyppigt. Farveegenskaberne medfører, at kulturen rubriceres i Gray-serien (Pridham). I tabel 10 II er der angivet en sammenligning af egenskaberne af Strepto- myces sp. X-5108 sammenlignet med andre medlemmer af Gray-serien.

142191 7 * $ ♦ •PH ft ρ,-ρ ΜΗ -P 0> ,

10 0 0) 0 β S

. H "ø d M Si £? + CO H +I + I + III+ + co øi il· d i o β H b 0 xi 2 •H H ra Cd §J ij S ti -P d ? ^ ^ £ & . HH + ί I I + I I I I + r · cd

f>5 CO <H

ti ,

£_, I I

C5 ° H 2 = 0) d 0 d H d <H d I 2 cd q d -P h d E7 H> 3 cd -p o Φ lio 2| é? + <3 o + + +IIIIII + a ωρί S «dø Φ CO H !s

H

Hl L

φ o a

gø H

m cd o ø H to ? ® .

d β d cd -P md

♦c) ao ø N 0 HH

§ · 3 § bo Si é? i o -P ++I1 + I + II + bO , β O I I "i

O ØH

CO 0 cq ø -P O

Η O β d Η % β

HH pØPH -P OO

LA ΜΗ Øh 0 HØ

Hl O H ca H<!!>j H d Η X *øøl hO 2 C5 I OH + + +I + IIII +

3 COHHC

<ς ra ^

eh ø ø S

O d Η H

{>J o I O

a h ^ b

o -p oo S

-P OH O

Pt Η ΙΑ H

0 PH β d Η -P ro

-P -P d ø O

W b() ff! ti + O + + + + +I + II +

Η H

0 · <H

» Mt“ -g

g S B

ø o y ø & ω a

M O O

cd *P CO *P H S

d ft° ø ^ L ^ g bO d la bO K O + !*! · + + + + + + + + H + 0 -P I CO ><!

H

ø‘

hO I

.S -S i ø 0 0

3 c. 2 J3 π raøøwHH

S 0 M 0 h ø η η o ω co o o o o

Η H ØH bO Π d -P 0 H ØdOOd-P-P M

H 0 d cd O dø o W pH ØWHd-PHHHdO

d Μ β Η Η Η O Η Η P m °, θ 1 2 S 2 '3 o ø ra øcHOøddrQø o ØHøødHdooo a d ββΗ{>0ΗΗβ <° ° ^ b 5 ^ 5 w Ί

1 0 oØddHO-PC β P^iiSfeffiSHHH

ø bO Q<i>OØØddro ø Η I I I I I I i ro ro

CO W WO g fri p, <| Π O ΟΗΗΗΗΠΗΗ C0O

8 14219 1

Til tabellen skal følgende bemærkes: De data, som ikke angår Strep-tomyces X-5108, er taget fra litteraturen. Sporernes overflade er bestemt i elektronmikroskop. RA betegner retinaculum-apertum.

+ betegner, at der er vækst, og - betegner, at stoffet ikke udnyt-5 tes. Gy betegner "Gray"-serien.

Morfologi.

Sporekæderne, som produceres på luftmyceliet, udstrækker sig, 10 én- eller flerakset, danner lige kæder, løkker, kroge eller udstrakte og uregelmæssige spiraler med 3-4 omdrejninger og forekommer også i en kosteformet orden. Kæderne er såvel lange som korte men sædvanligvis med mere end 10 sporer. Hvileknolde er iagttaget på de fleste medier. Sporerne er oval-aflange og cylinderformede (phalangi-15 form, Tresner). Sporeoverfladen er glat uden ornamentering i henhold til bestemmelse med elektronmikroskop (tomatpastaagar, 10 døgn . ved 28°C).

Fysiologi.

20

Opløseligt pigment.

Der dannes spor af brunt pigment på gærekstrakt/maltekstraktagar (ISP-medium 2) men ikke på ISP-medierne 3, 4 og 5.

25

Bagsidefarve.

Gul til gulbrun plus grøn farve dannes ved fra 7 til 21 dage på ISP-medieme 2, 4 og 5. Refererende til Dr. Prausers farvevejled-30 ning dannes følgende bagsidefarve på 7 dage: C 004b, Co 5m, med farveløse rande (medium 2) og Co 5a, Co 5b (medierne 4 og 5). En tilsætning af base eller syre ændrer ikke bagsidefarven. j

Forskellige fysiologiske reaktioner.

35

Kulturen er pigmentdannende (danner melanin) på pepton/jernagar, tyrosinagar samt på trypton/gærekstraktfermentationsvæske. En sam- j i i i 9 U2191 menfatning af visse af de kulturmæssige karakteristika for Strepto-myces sp. X-5108 er angivet i tabel III. Nitrat reduceres ikke i organisk nitratfermentations væske. Stivelse hydrolyseres aktivt, og gelatine forflydes i løbet af 14 døgn kun meget svagt. Nogle 5 yderligere fysiologiske reaktioner for Streptomyceten er angivet i tabel IV. Carbonkildeudnyttelse ifølge Pridham og Gottlieb (J. Bact., 56, 107 - 114, 1948) er følgende (11 døgn ved 28°C): god udnyttelse af 1-arabinose, d-fructose, d-mannitol, 1-rhamnose, d-raffinose og sucrose; dårlig udnyttelse af d-xylose og i-inositol og ingen ud-10 nyttelse af cellulose. Yderligere oplysninger om Strep tom ycetens udnyttelse af carbon- og nitrogenkilder er angivet i tabel V. Kulturerne vokser godt ved 24 og 37°C men ikke ved 42 eller 50°C.

Tabel III 15

Karakteristiske egenskaber af kulturen af Streptomyces sp. X-5108. Inkubation foretaget i 14 døgn ved 28°C.

Fast medium Vækst Luftmycelium Opløseligt Underfarve 2q og/eller sporer pigment

Czapek's hvidligt luftmyc.; svagt mør- svag gul saccharose- sporer, gode, kebrunt agar god hvide Θ

Asparagin/- god luftmyc. dunet til intet orange til 25 dextrose- pulveragtigt, lys gul 0,25% hvidt, får sløret grå sporulation

Tomatpasta/- god luftmyc. hvidt intet orange peptonagar til lysegråt, spo rer gode, grå 30

Stivelsesagar god sporulation ξod, intet orangegul bliver røggra, hvide rande

Krainsky's god luftmyc. hvidt; intet citrongul glucoseagar sporulation god, bliver røggrå 35

Mycophilagar god ingen sporulation svagt mørkt svag gul (BBL)

Tabel III fortsat U2191 10 Gærekstrakt- god ingen sporulation mørkt grå til gulbrun næringsagar

Glycerolagar jævnt fugtigt, fløde- intet svag gul 5 god til farvet god (10 døgn)

Kartoffel- god ingen sporulation sort stykker ^ Gulerods- god ingen sporulation -stykker Λ angiver, at der er god vækst i 8 døgn på dette medium ved temperaturerne 24, 28, 32 og 37°C, men ikke ved 42°C.

15

Til tabellen skal følgende bemærkes: Mycelium er forkortet "myc.".

Der er også god vækst på de følgende medier: Tryptonfermentations-væske (mørkt opløseligt pigment, negativ indol 3 døgn). FDA-næ-ringsfermentationvæske, Czapek saecharose-fermentationsvæske, 20

Krainsky glucose-fermentationsvæske og calciumcitrat/glycerolfermen-tationsvæske.

Tabel IV

25 Fysiologiske reaktioner af Streptomyces sp. X-5108.

Medium Inkuba- Vækst Fysiologisk reaktion tion i døgn

Organisk nitrat- 8 moderat, sporulerer ingen nitratreduk-30 fermentations- ikke tion, ingen luftvæske udvikling

Organisk nitrat- 13 god; mørk pigment ingen nitratreduk- fermentations- tion, ingen luftud- væske vikling 25 Gelatine (15%) 5 jævnt god; mørk, ingen gelatinesmeltning ved 18°C opløseligt pigment

Gelatine (15%) 12 jævnt god til god svag smeltning ved 18°C vækst; brunt pig ment, ingen sporulation 11

Tabel IV fortsat 142191

Pepton/jemagar 14 god; meget svag pigmentdannende sporulation (danner melanin)

Lakmusmælk 6 jævnt god overfla- lakmusfarven uændret; 5 devækst ingen sammenløbning eller klaring

Lakmusmælk 13 jævnt svag overfla- farven svagt brun; devækst, ingen spo- ingen sammenløbning rulation eller uklarhed 1Q "Dorset" ægagar 3 god; svag hvid sporulation "Dorset" ægagar 10 meget god vækst; svagt mørk pigment· overvejende sporula-leret, lysegrå

15 Tabel V

Carbon- og nitrogenkilder, som kan udnyttes af Streptomyces sp.

X-5108.

^ Inkubation foretaget i 14 døgn ved en temperatur på 28°C.

0 0

Carbonkilde Udnyttelse Carbonkilde Udnyttelse 25 l-Arabinose 1 Acetat 3 1-Rhamnose 3 Citrat 2 d-Xylose 3 Malat 2 d-Mannitol 3 Oxalat 1 i-Inositol 3 Salicylat 0 30

Glucose 3 Succinat 2

Fructose 3 Tartrat 0

Saccharose 3 Phenol (0,1%) 0

Raffinose 3 Negativ kontrol 0

Stivelse 0-1 (intet carbon)_ d-Ribose 3 Nitrogenkilde Udnyttelse^ d-Galactose 3 d-Mannose 3 (NH^SO^ 1

Cellobiose 3 NaNOg 1 12 142191

Tabel V fortsat

Lactose 3 Na-nitrit 1

Maltose 3 Acetamid 1 5 Dextrin 0 Asparagin 3

Dulcitol 0 Tyrosin 3

Erythritol 0 dl-Tryptophan 2

Sorbitol 1 Negativ kontrol 0-1

Glycerol 0-1 (intet nitrogen) 10 _ Θ

Tallet 3 betegner god udnyttelse, tallet 2 betegner jævnt god udnyttelse, tallet 1 betegner dårlig udnyttelse, og tallet 0 betegner ingen udnyttelse.

15

Til inokulering benyttes en sporesuspension i destilleret vand; sporerne er fremstillet i tomatagar på skråglas. Udnyttelsen af carbon- og nitrogenforbindelserne bestemmes på følgende grundmedium: 20 KH2P04 2,38 g MnCl2.4H20 0,0079 g K2HP04 5,65 g ZnS04.7H20 0,0015 g

MgS04.7H20 1,00 g agar 15 g 25 CuS04.5H20 0,0064 g destilleret vand 1 liter

FeS04-7H20 0,0011 g mediet indstilles på en pH-værdi på 6,8 - 7,0.

Til bestemmelse af carbonkilderne på dette grundmedium tilsættes 30 der 2,64 g (NH4)2S04 pr. liter som den fælles nitrogenkilde. Carbon-kilden, der skal undersøges, tilsættes i en koncentration på 1% med undtagelse af natriumsaltene af de organiske syrer, som tilsættes i en koncentration på 0,15%. Til undersøgelse af nitrogenkilderne anvendes grundmediet, som tilsættes 1% stivelse og nitrogenkilden i 35 en koncentration på 0,1 g nitrogen pr. liter.

13 142191

Pi grundlag af sporernes ornamentering og generelle morfologi og forgreningerne af det sporebærende organ, farverne en masse på forskellige medier og visse biokemiske og fysiologiske reaktioner konkluderes det, at Streptomyces sp. X-5108 er forskellig fra en 5 hvilken som helst af kulturerne i den Gray-serie, som er beskrevet i litteraturen.

Dyrkning af organismen Streptomyces sp. X-5108 til dannelse af antibiotikum X-5108 kan udføres under anvendelse af et stort antal 10 fermentationsmetoder. Sædvanligvis kan den følgende grundlæggende metode anvendes ved fremstilling både i kolber og tanke. Ved fermentering i kolber sættes en trådøjefuld sporer fra en agarskrå-kultur til 100 ml næringsmedium i en 500 ml's Erlenmeyer-kolbe og inkuberes ved ca. 28°C i et roterende rysteapparat i indtil 7 døgn.

15 Der udtages aseptisk prøver af hele fermentations væsken til in vitro undersøgelser det 3., 5. og 7. døgn. På tilsvarende måde fremstilles til fremstilling af større rumfang af fermentationsvæske først podekultur i 6 liters Erlenmeyer-rystekolber eller i 20 liters pyrexkolber, som er egnede til luftning, prøveudtagning osv. Denne fermentations væske 20 overføres derefter til en fermentationstank. Luftningen i kolberne og tankene udføres ved at presse steril luft gennem fermentations -mediet. I tankene foretages yderligere omrøring med mekaniske om-rørere. Der tilsættes skumdæmpningsmidler såsom lardolie, sojabønneolie og lignende efter behov til nedsættelse af skumdannelsen.

25

Streptomyces sp. X-5108 kan dyrkes på et stort antal væskeformede kulturmedier. Medier, som er særlig anvendelige til fremstilling af det hidtil ukendte antibiotikum, indeholder en assimilerbar carbon-kilde såsom stivelse, glucose, melasse og lignende og en assimiler-30 bar nitrogenkilde såsom protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer, majsstøbevand og ammoniumsalte og uorganiske kationer og anioner såsom kalium, natrium, calcium, magnesium, sulfat, phos-phat, chlorid og lignende. Sporstoffer såsom cobolt, kobber, jern, molybdæn, bor og lignende forefindes som urenheder i andre af de 35 til mediet satte stoffer.

142191 14

Aktiviteten af antibiotikum X-5108 kan bestemmes in vitro ved dets inhiberingszone med den grampositive bakterie Bacillus E. ved den sædvanligvis anvendte "cup-plate"-agardiffusionsmetode, hvor prøven f.eks. kan anbringes i en beholder (eventuelt cylinderformet) 5 eller på et stykke væskeabsorberende materiale. Alternativt kan den grampositive bakterie Bacillus simplex anvendes. Bagge bakterierne giver en inhiberingszone på ca. 20 mm med en arbitrært defineret opløsning indeholdende 1 enhed pr. ml opløsning. Ved denne bestemmelse dyrkes en kultur af prøveorganismen på et næringsmedium, 10 f.eks. "Trypticase Soy Broth", i 24 til 42 timer ved 28°C i et roterende rysteapparat, idet der anvendes 100 ml medium pr. 500 ml's Erlenmeyer-kolbe. Der anvendes en inokulumkoncentration på 0,25 - 0,5% til inokulering af 4 ml podelag, som hældes oven på et forud hærdet 20 ml basislag af næringsagar på en 100 ml's Petri-skål af 15 glas eller éngangsplastic. Pladerne køles i mindst 2 timer, inden der anbringes de ovenfor angivne beholdere, som derefter fyldes med prøveopløsningen indeholdende antibiotikum. Pladerne inkuberes derefter ved 35°C i 18 timer, og zonediametrene måles derefter med en nøjagtighed på 0,5 mm. Bestemmelse af aktiviteten 20 i enheder pr. ml foretages derefter ved hjælp af en standardkurve.

Eksempler på de fortrinsvis anvendte medier og de fremkomne antibiotikumudbytter i kolber og i fermentationstanke med luftning er angivet i tabellerne VI - IX. Af de i disse tabeller angivne data 25 vil det ses, at complexe nitrogenforbindelser fra adskillige kilder, f.eks. plantematerialer såsom sojabønnemel, bomuldsfrømel, havre-mel, fast tomatpresserest, opløsninger fra fermentering af korn, animalske produkter såsom fiskemel, digereret kødmel og aminosyre-hydrolysat samt mikrobe celler såsom Torula-gær, vil medføre anti-30 biotikaproduktion.

Tabel VI

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikum-35 produktion af Streptomyces sp. X-5108 i rystekolber.

15 142191

Alle medierne indeholder 1% dextrin, 0,1% K^HPO^ og 0,1% CaCO^.

Der inokuleres 1 ml sporesuspension af Streptomyces sp. X-5108 til hver 100 ml medium. Alle nitrogenkilderne tilsættes i en koncentration på 1% undtagen i forsøgene 17 og 23, hvor der anvendes 2%.

5 Den antibiotiske aktivitet angives i B. simplex-enheder pr. ml.

Forsøg Nitrogenkilde Tid i døgn Enheder pr. ml 10 1 Digereret kødmel 6 50 2 BY-100 (Commercial Solvents

Corp.) 5 45 3 Proflo (affedtet bomuldsfrøprodukt fra Traders Oil Mill 15 Co., Forth Worth, Texas) 5 23 4 Havremel (Quaker Oats Co.) 5 32 5 Affedtet sojabønnemel (soja- lose) 5 30 8 Jordnøddeproteinmel 5 41 20 9 Kokosnøddeproteinmel 5 50 10 Tomatpresserest, fast 5 57 11 Hørfrøoliemel 5 37 12 Majsmel 5 33 13 "Corn distiller's dried grain 25 with solubles" (H. Walker) 5 74 14 "Soludri" (Schenley Destillers) 5 51 15 Fiskemel (Gorton's) 5 25 16 Fiskerester (Wilkinson) 5 16 17 Lactose/albumin-blanding 5 50 30 19 Tørret Torula-gaer 5 38 20 Gærautolysat (National) 5 16 21 Sojaenzymhydrolysat 5 33 22 Hvedeprotein, surt hydrolysat (Huron Mills) 5 12 35 23 Homogeniseret kondenseret fisk 5 27 24 "Pro topep ton nr. 366" (Wilson

Labs.) 5 18 25 Tørret majsstøbevand 5 26

Tabel VII

16 142191

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikum-produktion af Streptomyces sp. X-5108 i rystekolber.

5

Hvert medium indeholder 0,1% KgHPO^ og 0,1% CaCOg, med mindre andet angives. Der inokuleres 1 ml sporesuspension af Streptomyces sp. X-5108 til hver 100 ml medium. Den antibiotiske aktivitet angives i B. simplex-enheder pr. ml.

10

Forsøg Mediets sammensætning tid i enheder døgn pr. ml 1 1% digereret kødmel og 1% dextrin 4 40 15 2 1% kornremanens fra fermentering (BY-100) og 1% dextrin 4 67 3 1% affedtet bomuldsfrømel (Proflo) og 1% dextrin 4 52 4 1% fiskerester 4 40 20 5 1% kom "corn distiller's dried grains with solubles" (H. Walker) og 1% dextrin 6 138 6 som forsøg 3, men uden CaCOg 4 19 7 som forsøg 3, men uden CaCOg og 25 K2HP04 . 4 34 8 som forsøg 7, men med 0,25% Proflo 4 12 9 som forsøg 7, men med 2,0% Proflo 4 47 10 1% Proflo og 1% glucose 6 21 11 1% Proflo og 1% stivelse 6 21 30 12 1% Proflo og 1% glycerol 4 35 13 1% Proflo og 1% puddersukker 4 14 14 1% Proflo og 1% maltose 4 22 15 1% Proflo og 1% lactose 4 26 16 1% Proflo og 1% mannitol 6 25 35

Tabel VIII

17 142191

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikumproduktion af Streptomyces X-5108 i rystekolber eller tanke med gen-5 nemluftning. Hvert medium indeholder 0,5% CaCOg og 0,1% KgHPO^, med mindre andet er angivet. Udbyttet af antibiotikum er angivet i B.simplex enheder pr. ml. Alle forsøgene i tank er udført to gange bortset fra nr. 7, som er udført én gang. Alle forsøg i kolber varede 7 døgn, og alle forsøg i tanke varede 6 døgn, idet dog nr. 7 10 varede 4 døgn.

Nr. Mediets sammensætning i procent Udbytte, enheder/ml 15 Tomat- "Distiller's Majs- Glucose Kolber Tanke presse solubles" stirest, velse fast 1 1 1 1 0,5 150 100, 120 20 2 2 0 1 0,5 100 71, 46 3 0 2 1 0,5 91 88, 119 4 1 1 1,5 0 140 150, 124 51 1 0 1,5 180 125, 126 6 1 1 0 0 54 ikke udført 25 Proflo Stivelse CaCOg KgHPO^ 71 1 0,1 0,1 94 97

Tabel IX 30

Fermentationer i tanke med forskellige medier.

Fermentor Mediets sammensætning Tid i Aktivitet i enhe- døgn der pr. ml 35 _____ K12 1% "Distiller's dried solubles", 1% 6 67 dextrin 0,1% KgHPO^ og 0,1%

CaCOg

Tabel IX fortsat 18 142191 K13 1% Na-l-glutamat, 1% dextrin, 0,1% 5 100 majsstøbevand-faststof, 0,15% 5 K2HP04 og 0,05% MgS04

Kil 1% Tomatpresserest, fast, 1% "Distil- 7 200 ler's dried solubles", 1% majsstivelse, 0,5% glucose, 0,5% CaCOg og 0,1% Κ2ΗΡ04 10 K4 0,5% Proflo, 0,5% "Distiller's dried 4 91 solubles", 0,5% tomatpresserest, fast 0,5% kødekstraktpasta (protopeptone No. 366), 1% stivelse, 0,1% CaCOg og 0,1% k2hpo4 15 K16 1,0% Proflo, 0,5% majsstøbevand, 4 260 1,0% majsstivelse, 0,1% CaCOg og 0,1% k2hpo4 20 Fermentorerne Kil, K12 og K13 er af rustfrit stål med rumfanget 400 liter, som sædvanligvis fyldes med 260 liter medium. K16 er en rustfri stålfermentor på 3000 liter, som fyldes med 2000 liter medium, og K4 er en rustfri stålfermentor på 16800 liter, som fyldes med 12800 liter medium.

25

Et stort antal carbonkilder medfører god vækst og antibiotikumproduktion, f.eks. glucose, glycerol, dextrin og majsstivelse. Foruden de uorganiske salte, som forefindes i naturlige medier, kan en tilsætning af salte såsom kaliumphosphat, calciumcarbonat, magnesiumsulfat 30 og sporstoffer undertiden give forøget vækst og antibiotikumudbytte, afhængigt af de stoffer, som findes i grundmediet. Et af de foretrukne medier til fremstilling af antibiotikum X-5108 i store fermentorer indeholder 1% affedtet bomuldsfrømel, 1% majsstivelse, 0,5% koncentreret majsstøbevand, 0,1% K2HP04 og 0,1% calciumcarbonat.

35 19 142191

Streptomyces X-5108 vokser også godt og producerer antibiotikum på nogle kemiske definerede syntetiske medier indeholdende ammoniumsalte, nitrat eller aminosyrer såsom glutamat, arginin og glycin som nitrogenkilde sammen med glucose, dextrin, stivelse, citrat, 5 acetat og lignende som carbonkilde tilsat salte såsom kaliumphosphat, calciumcarbonat og magnesiumsulfat og sporstoffer såsom Fe , Cu ,

Mn++, Co++ og Zn++. Resultatet af fermentering af Strep tomyces sp. X-5108 på forskellige syntetiske medier er angivet i tabel X. Sædvanligvis er antibiotikumudbyttet på de syntetiske medier, der 10 er angivet i tabel X, ikke så stort som ved anvendelse af complexe nitrogenmedier.

Tabel X

15 Antibiotikumproduktionen af Strep tomyces X-5108 på syntetiske medier.

Mediets sammensætning Tid i døgn Antibiotisk ak tivitet i enheder pr. ml 20 _____ 1,0% Na-glutamat, 1% dextrin, 0,1% K2HP04 og 0,05% MgS04 5 7,6 1,0% aminosyreblanding, 1% dextrin, 25 0,1% K2HP04 og 0,1% USP salte nr. 1 5 11,5 BBL Czapek-Dox fermentations væske 5 4,4 1,0% Arginin, 1,0% dextrin, 0,1% K2HP04, 0,1% CaCOg og 0,05% MgS04 6 0,8 1,0% dl-Aspartinsyre, 1,0% dextrin, 0,1% 30 K2HP04, 0,1% CaCOg og 0,05% MgS04 6 0,8 0,1% Na-glutamat, 0,6% (NH4)2HP04, 1% glucose, 1% dextrin, 0,1% Κ2ΗΡ04, 0,1%

CaCOg, 0,1% KC1 og 0,05% MgS04 5 6,6 0,33% (NH4)2S04, 1,5% glucose, 0,1% 35 Na-citrat, 0,05% Na-acetat, 0,5% NaCl, 0,025% MgS04.7H20, 0,01% KgHPO^ 0,01% KH2P04, 0,3% CaCOg, 0,001%

Tabel X fortsat 20 142191

MnS04.4H„0, 0,004% ZnSC>4.7H20 og 1,6 x 10-¾ K2Cr20? 7 20 5

Aminosyreblandingen er Staley's Sta-Mino B. BBL Czapek-Dox-fermen-tationsvæske indeholder 3% saccharose, 0,3% NaNO^, 0,1% K2HP04, 0,05% MgS04, 0,05% KC1 og 0,001% FeSC>4, og forhandles af Baltimore 10 Biological Laboratories.

Dannelsen af antibiotikum X-5108 forøges ved kraftig luftning af fermentationsmediet. Fremstillingen af antibiotikum X-5108 kan udføres ved en hvilken som helst temperatur, som medfører tilfredsstillende vækst 15 af mikroorganismen. F.eks. dyrkes Streptomyces X-5108 i rystekolber, som inkuberes ved temperaturerne 24, 28 , 30 og 32°C. Antibiotikumstyrkebestemmelser efter 3, 4, 5 og 6 døgn viser, at der kan fås samme maksimale udbytte ved en hvilken som helst temperatur mellem 24 og 32°C. Imidlertid fremkommer topudbyttet ved 3-4 døgn ved 20 30 og 32°C, hvorimod det tager 4 døgn ved 28°C og 5 - 6 døgn ved 24°C. Sædvanligvis opnås optimal dannelse af antibiotikum X-5108 efter 2-10 døgn. Fermentationsmediet forbliver sædvanligvis ret nær ved neutral reaktion eller på den sure side under fermentationen. Den endelige pH-værdi afhænger dels af den mængde puffer 25 der er til stede og dels af den oprindelige pH-værdi af mediet, som sædvanligvis er tæt ved neutral før steriliseringen.

Efter afslutning af fermentationen kan der anvendes forskellige metoder til isolering og rensning af antibiotikum X-5108. Anvendelige 30 isolerings- og rensningsmetoder indbefatter ekstraktion med opløsningsmiddel såsom chargevis ekstraktion eller anvendelse af kontinuerligt virkende modstrøms væske/væske-ekstraktionskolonner og gelpermeationschromatografi i et ikke-vandigt system.

35 21 142191

Ved en foretrukken arbejdsmåde udvindes antibiotikum X-5108 fra kulturmediet ved adskillelse fra myceliet og eventuelle uopløste bestanddele fra fermentationsvæsken ved sædvanlige metoder såsom filtrering eller centrifugering. Antibiotikum X-5108 ekstraheres der-5 efter fra den filtrerede eller centrifugerede fermentationsvæske un der anvendelse af enten chargevis ekstraktion eller modstrømsfordelingsekstraktion. Ekstraktionen med opløsningsmiddel kan udføres under anvendelse af en pH-værdi fra ca. 3 til ca. 7,5 o g under anvendelse af sådanne opløsningsmidler som ikke-vandblandbare 10 estere såsom ethylacetat, amylacetat, butylacetat og lignende ali- phatiske estere; butylacetat foretrækkes. Et foretrukket opløsningsmiddelsystem til anvendelse ved rensning ved modstrømsfordelings-teknikken er en blanding af ethylacetat, isopropanol og 0,1M vandig sek.natriumphosphatopløsning.

15

Den endelige rensning af antibiotikum X-5108 kan udføres ved gelper-meationschromatografi. Denne rensningsteknik udføres ved adsorption af forud rensede prøver af antibiotikum, hvilken forudgående rensning f.eks. er udført ved ekstraktion med opløsningsmiddel, 20 på tværbundne eller polymeriserede dextrangeler. Ved en foretrukken måde til endelig rensning chromatograferes det forud rensede antibiotikum på Sephadex LH-20, idet der elueres med alkohol.

Efter filtrering eller centrifugering af fermentationsmediet kan an-25 vendes tyndtlags- eller papirchromatografi til analyse til bestemmelse af antibiotikum X-5108. På grund af antibiotikets farveegenskaber kan til synliggørelse af pletterne anvendes fluorescensindikatorme-toden, og yderligere kan med fordel anvendes bioautografi. Chroma-tograferingen kan udføres på papir, men udføres dog sædvanligvis 30 på silicagel-glasplader. Det til udførelsen af tyndtlagschromatografe-ringen anvendte opløsningssystem består af chloroform, methanol og vandigt ammoniumhydroxid.

Det hidtil ukendte antibiotikum X-5108 foreligger efter rensning 35 som et gult amorft stof. Der kan fremstilles kationiske salte af anti-biotiket under anvendelse af antibiotikum X-5108 og en farmaceutisk tolerabel uorganisk eller organisk base. Blandt de salte af antibiotikum X-5108, som kan fremstilles, kan nævnes alkalimetalsalte så- 142191 22 som natrium- og kaliumsalte og· jordalkalimetalsalte såsom calciumsaltet.

Disse salte kan f.eks. fremstilles under anvendelse af vandige opløs-5 ninger af alkalimetal- og jordalkalimetalhydroxider. Således danner opløsningen af antibiotikum X-5108 i vandigt natriumhydroxid, vandigt kaliumhydroxid eller vandigt calciumhydroxid natrium-, kaliumeller calciumsalt. Disse salte kan anvendes til de samme biologiske formål som antibiotiket. Da opløsninger af salte af antibiotikum ΧΙΟ 5108, især natriumsaltet, er betydelig mere stabile end opløsninger af antibiotiket i ikke-saltform, foretrækkes det at anvende svagt basiske puffere til rensning ved modstrømsfordeling og ammoniakal-ske opløsningsmiddelblandinger til tyndtlagschromatografi, hvilket formindsker koncentrationen af antibiotikum i opløsningen.

15

Antibiotiket indeholder grundstofferne carbon, hydrogen, oxygen og nitrogen i i det væsentlige de nedenfor angivne vægtprocentmængder .

20

Grundstof Antibiotikum X-5108 Natriumsalt deraf C 63,63 61,48 H 7,81 7,81 25 N 3,48 3,32 O (taget som differens) 25,08 24,45

Na - 2,94

Antibiotikum X-5108 er opløseligt i alkoholer, f.eks. methanol, ethanol, 30 1- og 2-propanol og tert.butylalkohol, ikke-vandblandbare estere, f.eks. ethylacetat, amylacetat, bu tylacetat og lignende aliphatiske estere, samt chloroform. Antibiotiket er uopløseligt i vand. Natriumsaltet af antibiotikum X-5108 er opløseligt i vand, lavere alkoholer såsom methanol, ethanol, isopropanol, butanol og Ν,Ν-dimethylfor-35 mamid. Det er tungtopløseligt i amylalkohol, tetrahydrofuran og dioxan og meget tungtopløseligt i acetone, amylacetat, butylacetat og ethylacetat. Det er uopløseligt i benzen, chloroform og ethylether.

23 142191 I det følgende angives forskellige fysiske karakteristika for antibiotikum X-5108 og dets natriumsalt.

Den optiske drejning af natriumsaltet af antiobikum X-5108 er 5 = "82,8 (ethanol, c = 0,52).

IR-Spektret af antibiotikum X-5108 i en KBr-tablet er vist i fig. 1. Antibiotiket udviser karakteristisk absorption i IR-området af spektret ved de følgende bølgelængder, som er angivet i reciprokke 10 cm:

Brede bånd ved 3400 og 1580 cm-1, stærkt bånd ved 1660 cm * og fremtrædende bånd ved 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 og 995 cm"1.

15 IR-Spektret af natriumsaltet af antibiotikum X-5108 i en KBr-tablet er vist i fig. 2. Natriumsaltet udviser karakteristisk absorption i IR-området af spektret ved følgende bølgelængder:

Bredt bånd ved 3400cm 1 og fremtrædende bånd ved 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 og 1000 cm 20 UV-Absorptionsspektret af antibiotikum X-5108 ved forskellige pH-vær-dier er vist i fig. 3. Der er UV-maksima ved: 0,IN HC1: w 334 mn (E«^ = 403) 25 ift λ. 233 run (E, = 610) max 1 cm λ 206 nm (e}%_ = 500) max v 1 cm pH-Værdi 7, puffer: λω3χ 327 mn = 423) 30 (isopropanol/K2HP04) ' \max 231 mn (eJ*^ = 660) 0,W KOH: λΜχ 327 mn (eJ^ = 416)

Xnax 231 mn (e}^ = 647).

35 Det kernemagnetiske resonansspektrum af antibiotikum X-5108 er vist i fig. 4. NMR-Spektret er optaget under anvendelse af CDClg som opløsningsmiddel og tetramethylsilan som intern standard. NMR-Spektret viser fremtrædende signaler ved 0,926, i området mellem 1,666 og 2,036, ved 3,166 og 3,436 og i det olefiniske område.

142191 24

Antibiotikum X-5108 har en lav oral og parenteral toxicitet.

Antibiotikum X-5108 har virkning som vækstfremmende middel til fjerkræ og medfører forøget fodereffektivitet hos dyrene. Således kan 5 antibiotikum X-5108 anvendes som den aktive bestanddel i hidtil ukendte fjerkræfodere, som ved oral indgivelse til fjerkræ resulterer i forøget væksthastighed og en forøget fodereffektivitet hos dyrene. Indgivelse af disse fodere kan opnås ved fremstilling af et ernæringsrigtigt fjerkræfoder som tilfredsstiller dyrenes ernæringsmæssige 10 behov og yderligere tilfører det aktive vækstfremmende antibiotikum X-5108.

Når antibiotikum X-5108 anvendes til fremstilling af det vækstfremmende foder, er antibiotikumbestanddelen antibiotiket eller et hvilket som 15 helst fysiologisk tolerabelt kationisk salt deraf, fortrinsvis natriumsaltet.

I det følgende angiver betegnelsen "antibiotikum X-5108" såvel antibiotikum X-5108 som et hvilket som helst fysiologisk tolerabelt kationisk salt deraf.

20 Et vækstfremmende foder ifølge opfindelsen indeholdende antibiotikum X-5108 som den aktive bestanddel kan fremstilles på adskillige måder.

Ved en af disse metoder sættes antibiotiket direkte til et fortærbart ikke-toxisk bæremateriale. Det foretrækkes, at bærematerialet har næringsværdi for fjerkræ, idet der især foretrækkes et bæremateriale 25 med høj foderenergi for fjerkræ. I de tilfælde, hvor antibiotiket sættes direkte til foderet, kan blandingstrinnet udføres under anvendelse af kendte metoder. F.eks. sættes næringsmaterialerne, som udgør fjerkræfoderet, enten hver for sig eller samlet til en chargevis virkende blander, og derefter tilsættes antibiotiket. Blanding fortsæt-30 tes, indtil produktet helt igennem indeholder en ensartet fordeling af bestanddelene.

De næringsmaterialer, der anvendes som fjerkræfoder og til den foreliggende opfindelses formål som bæremateriale for antibiotikum 35 X-5108, kan varieres inden for et vist område afhængigt af det spe cielle behov hos den type fjerkræ, som skal fodres, og afhængigt af hvad dyrene senere skal anvendes til. Imidlertid indeholder foderet i de fleste tilfælde proteinkilder såsom fiskemel, sojabønnemel, 25 142191 majs- og jordnøddeprodukter og lignende, carbonkilder såsom korn, mel, sukker, og lignende. Yderligere kan mineral- og vitaminbalancen for dyrene være opretholdt ved til foderet at sætte de nødvendige mineraler, f.eks. natrium-, kalium-, magnesium- og calciumcarbonat, 5 og vitaminer, f.eks. A vitamin, B^ vitamin, D vitamin og thiamin.

Foderet kan naturligvis også indeholde andre sædvanligt anvendte tilsætninger.

Det foretrækkes, at antibiotikum X-5108 eller et fysiologisk tolerabelt 10 salt deraf som aktiv bestanddel inkorporeres i en koncentreret foder blanding, som derefter kan tilsættes fjerkræfoderet. Et aspekt af opfindelsen angår derfor et middel til anvendelse ved fremstilling af det ovenfor beskrevne fjerkræfoder, hvilket middel er ejendommeligt ved, at det består af antibiotikum X-5108 eller et fysiologisk 15 tolerabelt salt deraf og en ikke-toxisk inert bestanddel. Ved fremstilling af en fast forblanding, som indeholder antibiotikum X-5108, kan et hvilket som helst bæremateriale eller fyldstof anvendes som inert bestanddel, når blot det er inert over for det tilsatte antibiotikum og ikke-toxisk over for det fjerkræ, som skal indtage præpa-20 ratet. Adskillige faste materialer tilfredsstiller disse betingelser og kan derfor med godt resultat anvendes til den foreliggende opfindelses formål. Blandt sådanne faste materialer kan nævnes mineralkilder såsom formalede østersskaller, spiselige kornsorter og vegetabilske, marine eller animalske materialer, som findes i sædvanligt anvendt 25 animalsk foder, såsom majsmel, citrusmel, sojabønnemel, fiskemel, kødaffald, tørret fermentationsremanens og lignende.

Antibiotikum X-5108 kan blandes med ét eller flere af de ovenfor angivne anvendelige faste stoffer til en mask, pille eller en hvilken 30 som helst foretrukken form på en sædvanlig måde. F.eks. kan præparatet fremstilles ved findeling eller pulverisering af den aktive bestanddel og de inerte bestanddele under anvendelse af en hvilken som helst kommerciel mølle. Hvis fodermaterialet ikke er til stede, når der formales eller pulveriseres, kan det resulterende præparat 35 fordeles i et hvilket som helst kommercielt fodermateriale.

Den mængde antibiotikum X-5108, som er nødvendig til opnåelse af den ønskede stimulering af væksthastigheden og forøgelse af foder- 142191 26 effektiviteten, er kritisk, men kan variere inden for et foreskrevet område. Det foretrækkes pr. 100 vægtdele foder at anvende fra 0,0001 vægtdel til 0,01 vægtdel af det aktive materiale, som er antibiotikum X-5108 eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. Større 5 koncentrationer af antibiotikum X-5108 end 0,01 vægtdel pr. 100 vægtdele foder giver sædvanligvis ikke bedre resultater end 0,01 vægtdel pr. 100 vægtdele. Det er således ikke fordelagtigt at anvende mængder, som er større end 0,01 vægtdel aktiv bestanddel pr. 100 vægtdele foder. Ifølge en foretrukket udformning for den forelig-10 gende opfindelse er den vækstfremmende foderblanding et fjerkræ-suppleringsfoder, som pr. 100 vægtdele foder indeholder fra 0,0005 vægtdel til 0,0025 vægtdel af den aktive bestanddel antibiotikum X-5108.

15 En forblanding, som senere kan sættes til foderet, er som ovenfor nævnt en hensigtsmæssig anvendelse af det vækstfremmende stof og sikrer en god fordeling af den aktive bestanddel igennem foderet.

Den mængde antibiotikum X-5108, der findes i forblandingen, er ikke kritisk. Uden hensyn til mængden af antibiotikum X-5108 i for-20 blandingen opnås det ønskede formål ved anvendelse af en sådan mængde af forblandingen, som er i stand til at give et færdigt foder, der indeholder den ovenfor angivne effektive mængde antibiotikum X-5108. Forblandingen er en bekvem form til levering til foderfabrikanten eller fjerkræopdrætteren, som så kan blande en passende 25 mængde af forblandingen med tilgængeligt fjerkræfoder til fremstilling af et færdigt foder, som indeholder en effektiv mængde antibiotikum X-5108.

Opfindelsen belyses nærmere ved de følgende eksempler, hvor dele 30 er vægtdele, med mindre andet er angivet:

Eksempel 1.

35 Fermentation af Streptomyces sp. X-5108.

En suspension af sporer af Streptomyces sp. X-5108 fra en næringsagar, som var fyldt skråt i et reagensglas, podes til en 20 liters 27 142191

Pyrexkolbe, som indeholder 15 liter gennemluftet medium med følgende sammensætning: 1% sojabønnemel, 1% puddersukker, 0,25% majsstøbevand, 0,1% K2HP04, 0,1% CaCOg og 0,5% lardolie (som skumdæmpningsmiddel). Efter 4 døgns vækst under gennemluftning 5 ved 28°C overføres den tridagtige vækst til en 400 liters rustfri stålf ermen tor, som indeholder 240 liter medium med følgende sammensætning: 1% affedtet bomuldsfrømel (Proflo), 1% majsstivelse, 0,25% majsstøbevand-faststof, 0,1% CaCOg, 0,1% KgHPO^ samt lardolie som skumdæmpningsmiddel. Før inokulering indstilles mediets pH-værdi 10 på 6,8. Fermentoren gennemluftes, og væksten fortsættes i 5 døgn. Fermentorens indhold filtreres derefter ved hjælp af diatoméjord ("Hyflo Filter Cell")· Filtratets pH-værdi indstilles på 3,5, og filtratet ekstraheres med et halvt så stort rumfang butylacetat.

Den klarede ekstrakt koncentreres under reduceret tryk ved en 15 temperatur under 40°C til en brun sirup, som efter triturering med petroleumsether giver et fast stof, nemlig antibiotikum X-5108, som har en aktivitet på 120 enheder Bacillus E pr. mg.

20 Eksempel 2.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved chargevis ekstraktion med et opløsningsmiddel.

25 Den chargevise ekstraktion med et opløsningsmiddel udføres med 12.000 liters fermentationscharger, som har en aktivitet in vitro på ca. 130 enheder pr. ml over for B. simplex. Den filtrerede fermentationsvæske ekstraheres med butylacetat ved en pH-værdi på 7,5. Den organiske ekstrakt vaskes med vand og destilleres hurtigt 30 ved en temperatur under 50°C, og den resulterende vandfri opløsning tilsættes natriumdiethylmalonatreagens til indstilling af pH-værdien på 9,0. Det gule bundfald, som dannes, frafiltreres og vaskes med butylacetat. Det fordeles derefter mellem vand og butylacetat, og pH-værdien indstilles på 4. Den organiske fase fraskilles og behand-35 les som ovenfor angivet med den undtagelse, at der tilsættes na triumdiethylmalonatreagens indtil en pH-værdi på 8,5. Det resulterende bundfald gøres surt og ekstraheres med frisk butylacetat.

142191 28

Ekstrakten behandles med "Darco G 60", og natriumsaltet af antibiotikum X-5108 udfælder ved tilsætning af natriumdiethylmalonat til en pH-værdi på 8,0. Det på denne måde vundne gule natriumsalt vaskes og tørres, hvorefter det har en aktivitet in vitro på ca.

5 430 enheder pr. mg over for B. simplex. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan angives ved følgende forenklede flow sheet:

Flow sheet for isolering af antibiotikum X-5108.

10 _12000 liter fermentationsvæske, høstet efter 5-6 døgn _10400 liter filtreret fermentationsvæske, pH-værdi 7,5 trin 2 (om nødvendigt indstilles pH-værdien med H^PO^) 15 ekstraheres med 2400 liter butylacetat _2320 liter "1. butylacetat" trin 3 vaskes to gange med 100 liter vand, koncentreres hurtigt v 20 _320 liter "1. butylacetat-koncentrat" trin 4 der tilsættes natriumdiethylmalonatreagens til en pH-værdi på 9 (ca. 1 - 1,5 liter 1,7N), bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butylacetat

Y

25 _"1. bundfald" trin 5 opløses i 100 liter vand, pH-værdien indstilles på 4 med 15% HgPO^. Der ekstraheres to gange med butylacetat (80 og 40 liter)

Y

30 _112 liter "2. butylacetat" trin 6 vaskes to gange med 8 liter vand. Koncentreres hurtigt _16 liter 22. butylacetat-koncentrat" trin 7 pH-værdien indstilles på 8,5 med natrium die thylmalonat-35 reagens. Bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter >/ butylacetat 29 142191

Flow sheet fortsat _”2. bundfald11 trin 8 opløses i 80 liter vand, pH-værdien indstilles på 5 med 5 15% HgPO^. Der ekstraheres to gange med butylacetat \f (60 og 30 liter) _84 liter "3. butylacetat" trin 9 vaskes to gange med 8 liter vand. Koncentreres hurtigt 10 v __16 liter "3. butylacetat-koncentrat" trin 10 omrøres med 50 g "Darco G 60" i 1 time ved stuetemperatur filtreres og koncentreres hurtigt 15 _8 liter "4. butylacetat" trin 11 pH-værdien indstilles på 3,0 med natriumdiethylmalonat- reagens. Bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butylacetat og derefter med 4 liter petroleumsether (30 - 60°C) ^og tørres ved 56°C og 0,5 mm Hg i 36 timer 20 natriumsaltet af antibiotikum X-5108 hvilket er et gult amorft fast stof.

25 Eksempel 3.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved modstrømsfordeling.

Der anvendes 200 glas, rumfanget af den øvre fase er 40 ml, og 30 rumfanget af den nedre fase er 40 ml. Chargen er på 5 g antibiotikum X-5108, fremstillet ved ekstraktion med et opløsningsmiddel af den rå fermentationsvæske, opløst i 40 ml af den øvre fase.

Der benyttes en opløsningsmiddelblanding bestående af ethylacetat, isopropanol, vandig 0,1M sekundært natriumphosphatopløsning i 33 rumfangsforholdet 12:9:20. Der udføres 200 overføringer, hvor der er "top" ved 159 overføringer. Fordelingsforholdet er 3,88.

30 142191

Fordelingen udføres på følgende måde:

Fraktionerne 150 - 170 blandes og tilsættes 1-butanol til ekstraktion af antibiotiket til den organiske fase. Den vandige fase fraskilles, 5 og den organiske fase vaskes fire gange med vand. Derefter fjernes vandet fra den organiske fase ved azeotropisk destillation, og bundfaldet udfældes ved tilsætning af petroleumsether. Der vindes 3 g antibiotikum, som har en biologisk aktivitet på ca. det dobbelte af udgangsmaterialet.

10

Eksempel 4.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved chromatografi på Sephadex 15 LH-20.

En ethanolisk opløsning af 300 mg af den ved modstrømsfordeling på den ovenfor angivne måde rensede prøve af antibiotikum X-5108 indstilles på én pH-værdi på 8 - 9 med natriummethoxidopløsning 20 (i henhold til vådt indikatorpapir) og sættes på en Sephadex LH-20-kolonne (290 mm x 41 mm), som er ækvilibreret med 3A alkohol.

Kolonnen fremkaldes med 3A alkohol, og det meste af antibiotikumzonen kommer frem ved et effluentrumfang på 950 - 1200 ml. De følgende fraktioner indeholder en del farvede zoner med ubetydelig 25 biologisk aktivitet. De aktive fraktioner samles og inddampes til et lille rumfang, hvortil der sættes ether og petroleumsether til udfældning af antibiotiket. Det resulterende gule faste stof er natriumsaltet af antibiotikum X-5108, som kun giver én plet i henhold til tyndtlagschromatografisk analyse.

30 = 0,19 (silicagel F-254, fremkaldt med UV-lys) og = 0,29 (silicagel/kiselgur, fremkaldt bioautografisk).

35 31 142191

Eksempel 5.

Fremstilling af antibiotikum X-5108 ud fra dets natriumsalt.

5 0,464 g natriumsalt af antibiotikum X-5108, fremstillet ved chroma- tografi på Sephadex LH-20, opløses i 4,6 ml isvand, og der tilsættes 10 ml ethylacetat til dannelse af et tofasesystem. Til denne blanding, som haves i en skilletragt, sættes 1 ml opløsning af primært natriumphosphat (50 g NaHgPO^.HgO i 100 ml vand). Det op-10 rindeligt dannede bundfald opløses ved omrystning. Den vandige fase fraskilles, og den organiske fase vaskes fire gange med isvand, hver gang med ét rumfang, og dehydratiseres derefter ved azeotropisk destillation med ethanol. Koncentratet på 2 ml fortyndes med to rumfang ethylacetat, og der tilsættes dråbevis diethylether 15 indtil uklarhed og derefter 30 ml petroleumsether. Det resulterende bundfald fraskilles ved filtrering og tørres ved stuetemperatur, hvorved fås antibiotikum X-5108.

20 Eksempel 6.

Bestemmelse af den vækststimulerende effekt af antibiotikum X-5108.

Der fremstilles en grundfoderblanding med følgende sammensætning: 25

Bestanddele Vægtprocent

Formalet gul majs 56,075 Kød og benmel (50% protein) 4,000 30 Fiskemel (60% protein) 4,000

Sojabønnemel (50% protein) 28,000

Dehydratiseret alfalfa-mel 1,000

Animalsk fedt 4,000

Methionin 0,200 35 Fosf orit 0,250

Calciumcarbonat 1,200 lodsalt 0,250

Vitaminsupplement 1,000

Spormineralsupplement 0,025.

14219 1 32

Der sættes til denne foderblanding 50 mg antibiotikum X-5108 pr. kg foderblanding.

Den vækststimulerende effekt af antibiotikum X-5108 bestemmes 5 ved at lade fjerkræ æde ad libitum af den ovenfor angivne foderblanding, med den angivne tilsætning af antibiotikum X-5108. Forsøget udføres med én dag gamle "Comish Cross Sexed Broiler" kyllinger.

10 Der anvendes en gruppe pi 10 kyllinger til hvert forsøg (5 hanner og 5 hunner). De forskellige grupper har adgang til den foderblanding, som er tilsat antibiotikum. Der foretages randomiseret fordeling af forsøgene for at udligne faktorer såsom varme, lys og placering. Fuglene observeres i en periode på 2 uger, idet grup-15 pernes vægt bestemmes flere gange i perioden, og de individuelle vægte bestemmes efter 14 døgns forløb. Det registreres også, hvor meget foderblanding, der indtages, og forbedringen i foderblandingens effektivitet beregnes, sammenlignet med kontrolgruppen.

20 Der udføres samtidig forsøg med kontrolgrupper på ovenfor angivne måde med den undtagelse, at kyllingerne, som anvendes i kontrolgrupperne, spiser ad libitum af en foderblanding, som, bortset fra, at den ikke indeholder antibiotikum X-5108, indeholder de samme næringsbestanddele, som angivet ovenfor.

25

Den gennemsnitlige vægtforøgelse ved hver gruppe divideres med den gennemsnitlige vægtforøgelse ved kontrolgruppen, og kvotienten multipliceres med 100, hvilket giver den gennemsnitlige procentvise vægtforøgelse. Forøgelsen beregnes ved fra kyllingernes vægt efter 30 2 ugers forløb at subtrahere kyllingernes vægt på den første leve dag. Følgende formel kan opstilles:

Forsøgsgrs. gensnt. slutvægt - forsøgsgrs. gensnt. begyndelses vægt _ Kontrolgrs. gensnt. slutvægt - kontrolgrs. gensnt. begyndelsesvægt 35 den procentvise vægtforøgelse 100 ("gruppens" er forkortet til "grs.", og "gennemsnitlig" til "gensnt.").

33 142191

Resultatet af forsøget fremgår af tabel XII.

Tabel XII

5 Forsøg med Kontrolgruppe Gruppe, som får

Antibiotikum X-5108

Tilsætning af antibiotikum i 0 50 10 mg pr. kg foder Vægtforøgelse efter 2 ugers forløb, gennemsnit for 40 kyllinger, vægtforøgelse ± 15 standardafvigelse 154 ± 8 185 ± 12

Procentvis vægtforøgelse 100 120

Fodereffektivitet 1,55 1,39 20

Procentvis forbedret fodereffektivitet - +12

Det fremgår af tabel XII, at kyllinger, der fodres med en foder-25 blanding, som er tilsat 50 mg antibiotikum X-5108 pr. kg foder, udviser en forøget væksthastighed sammenlignet med en kontrolgruppe. Samtidig udnytter kyllingerne foderet mere effektivt, således som det fremgår af den 10%'s forbedring af fodereffektiviteten.

30

Eksempel 7.

Det i eksempel 6 angivne forsøg gentages flere gange med anven-35 delse af den samme grundfoderblanding som angivet i eksempel 6, idet dog indholdet af antibiotikum X-5108 varieres i de forskellige forsøg. Forsøgskyllingerne indgives en foderblanding indeholdende

Claims (4)

142191 5, 10 , 25 , 50 og 100 mg aktiv bestanddel pr. kg foderblanding. Forsøgene gentages for at bekræfte resultaterne. Der foretages fire forsøg med kontrolgrupper på 10 fugle, som indgives foderblandingen uden indhold af antibiotikum. Ved alle forsøgene bestemmes 5 væksthastigheden i løbet af en periode på 2 uger sammenlignet med en kontrolgruppe. Det bestemmes, hvor meget foder fuglene indtager, og forbedringen i fodereffektiviteten sammenlignet med kontrolgruppen beregnes. Resultaterne fremgår af tabel XIII. 10. tabel XIII er for de yderligere forsøg angivet de til tabel XII svarende værdier, idet dog standardafvigelsen ikke er angivet i tabel XIII, og der i tabel XIII er angivet, for mange fugle forsøgene omfatter.

15 Tabel XIII Mg an ti- Antal Vægt- Vægt- Foder- Forbed- biotikum fugle forø- forø- effekti- ring i pr. kg gelse gelse vitet % foder efter 2 i % uger 20------—- Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,54 Antibiotikum X-5108 50 24 175 117 1,37 +12 Kontrolgruppe 0 30 152 100 1,47 Antibiotikum X-5108 50 18 173 114 1,38 +7

25 Kontrolgruppe 0 30 146 100 1,59 Antibiotikum X-5108 25 18 180 123 1,37 +16 Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,51 Antibiotikum X-5108 5 18 183 123 1,39 +9 Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,54 2Q Antibiotikum X-5108 10 18 185 124 1,41 +13 Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,54 Antibiotikum X-5108 100 18 182 122 1,33 +14 Patentkrav. 35

1. Vækstfremmende fjerkræfoder, kendetegnet ved, at det ud over sædvanlige foderbestand-dele indeholder antibiotikum X-5108 eller et fysiologisk tolerabelt salt