RU1808007C - Способ получени антибиотика - Google Patents

Abstract

Использование: микробиологи  , получе- tnne полиэфирных антибиотиков, относ щихс  к кислотным полициклическим простым эфирам. Сущность изобретени : осуществл ют глубинное культивирование штамма Actlnomadura sp. ATCC 53708 в услови х аэрации и перемешивани  в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. Куль- туральную жидкость или отфильтрованный мицелий экстрагируют органическим растворителем . Продукт выдел ют в неочищенном или чистом виде или перевод т в фармацевтически приемлемую соль щелочного металла. 1 табл.

Description

Насто щее изобретение относитс  к но- полициклического простого эфира, имеюцым антибиотикам на основе кислотногощёго общую формулу

ОМе

0-Ме

МеО

Me ОМе

Me

fe

Me Me

в которой Me представл ет собой метиль- ную группу, имеющего абсолютное стерео- химическое строение, отраженное в формуле, к пригодным дл  фармацевтического использовани  катионным сол м указанных соединений, к пищевым композици м , включающим указанный антибиотик и предназначенным дл  домашней птицы, крупного рогатого скота или свиней, к их использованию в качестве противокок- цидальных средств дл  домашней птицы, при лечении или предотвращении дизентерии у свиней, или в качестве стимул тора

е

Me

Me ОН ф

роста крупного рогатого скота и свиней, к способу ферментации дл  их получени , и к микроорганизмам Aetlnomadura, которые продуцируют указанный антибиотик согласно указанному ферментационному способу.

Соединение (I) представл ет собой новое соединение р да антибиотиков, относ щихс  k кислотным полициклическим простым эфирам. Этот р д включает также такие широко известные агенты, как моне- з ин (Указатель фирмы Мерк, 10-е издание, Меркэнд Ко.Инкорпорейтед, Рэгуэй. Нью§

00

о о

si

СО

Джерси, 1983, № по указателю 6100), ниге- рицин (Указатель Мерк, № по указателю 6100), ласалоцид (Указатель Мерк № по указателю 6390) и салиномицин (Указатель Мерк,№ по указателю 8193). Этот вопрос освещен Уэстли, Полиэфирные антибиотики , т. 22, с. 177-223 (1977). Наиболее близким в структурном отношении аналогом указанного соединени   вл етс  портм цин, антибиотик независимо описанный Хэ- миллом с сотр. в патенте США № 4572822 и Кусакабе с сотр. в европейской патентной за вке 158179, Tetrahedron Letters, 28, 3357-3360 (1987), J.Antiblotics 40, 237-238 (1987). Это соединение обладает альфа-водородным атомом в тетрагидрофурановом кольце В, тогда как соединение согласно насто щему изобретению имеет альфа-ме- тильную группу. Указанные соединени  известны в качестве кокцидостатических средств, в качестве средств ускорени  роста - добавок к пище, и/или в качестве агентов, противодействующих развитию дизентерии у свиней.

Культура Actinomadura sp. ATCC 53708 (АТСС 53708) при ферментировании в аэробных услови х в водной среде продуцирует новый антибиотик типа кислотного полициклического простого эфира - соединение общей формулы (I), описанное выше.

Насто щее изобретение относитс  к указанному соединению формулы (f), включа  его пригодные дл  фармацевтического использовани  катионные соли, и к способу его получени , включающему ферментиро- вание указанных микроорганизмов Actinomadura sp. ATCC 53708 в водной питательной среде, включающей источник усваиваемого углерода и азота до образовани  извлечимого количества указанного соединени  формулы (I), предпочтительно в погруженных аэробных услови х. Дл  его использовани  в качестве противококци- дального агента., средства дл  предотвращени  или лечени  дизентерии у свиней и/или в качестве средства ускорени  роста, соединение (I) не об зательно выдел ть в практически чистом виде, напротив, его можно в альтернативном варианте, использовать в неочищенном виде, либо осажденным из смеси мицелием (с выделением из ферментативной среды фильтрованием), либо в твердой форме после сушки при распылении или замораживании всей ферментационной среды.

Указанные пригодные дл  фармацевтического применени  катионные соли включают (но не ограничиваютс ) соли натри , кали , кальци , аммони , NtN -дибензилэ- тилендиэминэ, N-метилглкжамина, (меглумина ) и диэтаноламина. Предпочтительными катионными сол ми  вл ютс  соли кали  и натри .

Культура, способна  продуцировать антибиотик в форме полициклического эфира согласно насто щему изобретению, отвечающего формуле (I). обозначаетс  Actinomadura, она помещена в Американской коллекции типов культур в Роквилле,

штат Мэриленд в качестве типовой культуры под номером АТСС 53708. Наличие депонированной культуры в Американской коллекции типов культур в Роквилле, Мэриленд, и возможность доступа к ней будут обеспече5 ны на прот жении всей продолжительности действи  патента, если патент по насто щей за вке будет выдан. Доступ к культуре обеспечен в соответствии с действием за вки под номерами 37 CFR 1.14 и 35 USC 122.

0 Все ограничени  дл  широкого использовани  депонированной культуры снимаютс  немедленно после выдачи соответствующего патента.

Указанна  культура была получена из

5 образца почвы, вз того в Тузле (Стамбул, Турци ), и идентифицирована в коллекции культур Пфайзер Инкорпорейтед под номером N 777-1. Ее описание и классификаци  обеспечены д-ром Д.Х.Хуангом.

0 Обнаружено, что указанна  культура продуцирует тонкие нити грибницы (гифы) акти- номицетов, воздушный мицелий, на котором продуцируютс  цепочхи коротких спор, и неразделенный субстратный мице5 лий. Результаты полного анализа клеток указывают на то, что данный микроорганизм принадлежит к роду Actinomadura.

Культуру идентифицируют в соответствии с описанным ниже способом.

0 Экстракт дрожжей - солодовый экстракт агар-агар (среда /sp# 2, Дифко) рост хороший, кремообразна  масса (2са) с п тнами , имеющими цвет от темно-серого до черного (серии близкого к черному цвету - 5

5 дюймов (127 мм), 5 мл), высока , с мора ини- стой поверхностью, воздушный мицелий от отсутстви  до редкого, бесцветный, обратна  поверхность кремова  - от палевого до желтого цвета (2са, 2еа) с черными (серии

0 близкого к серому цвету 5 мл) п тнами, растворимый пигмент отсутствует.

Овс ной агар-агар (среда /sp# 3, Дифко ) - рост средний, кремообразна  масса (2са), средней высоты, гладка , воздушный

5 мицелий от отсутстви  до редкого, бесцвет- . ный, обратна  поверхность кремова  - (2са), крем растворимого пигмента (2са).

Неорганические соли - крахмальный агар-агар (среда /sp# 4. Дифко) - рост, плохой , кремообразна  масса (2са). тонка .

гладка , воздушный мицелий.от отсутстви  до редкого, бесцветный, обратна  поверхность кремова  - (2са), растворимый пигмент отсутствует.

Глицерино-аспарагиновый агар-агар (среда /sp# 5. Дифко) - рост от плохого до среднего, кремообразна  масса (2са), тонка , гладка , воздушный мицелий отсутствует , обратна  поверхность кремова  - (2са), растворимый пигмент отсутствует.

Сахарозный агар-агар по Чапеку (среда #1, Уоксман, Актиномицеты, т.2 стр.328, 1961) - рост от умеренного до хорошего, кремообразна  масса (2са), умеренно высока , гладка , воздушный мицелий отсутствует , обратна  поверхность кремова  - (2са), растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозо-аспарагиновый агар-агар (среда #2, Уоксман, Актиномицеты, т.2 стр. 328, 1961) - рост умеренный, кремообразна  масса (2са), от тонкой до умеренно высокой , от гладкой.до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  - (2са), растворимый пигмент отсутствует.

Тирозиновый агар по Гордону и Смиту (Гордон и Смит, J. Bacteriol. 69, 147-150, 1955) - рост от умеренного до хорошего, кремообразна  масса (2са) от слегка подн той до.умеренно высокой, от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует , обратна  поверхность кремообразной массы (2са), растворимый пигмент палево- желтый.

Агар-агар с кальциевой солью  блочной кислоты (Уоксман, Bacteriol Rev., 21, 1-29, 1957) - рост незначительный, кремообразна  масса (2са), тонка , гладка , воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  (2са), растворимый пигмент отсутствует .

Казеиновый агар-агар (Гордон и Смит, указанна  выше стать ) - рост хороший, кремообразна  масса (2са), высока , от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  - палево-желта  (2са), растворимый пигмент желтый (2 да).

Агар-агар по Беннету (Уоксман, указанна  выше стать , среда # 30) - рост хороший , кремообразна  масса (2са) высока , от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  - палево-желта  (2са, 2еа), растворимый пигмент желтый (2еа).

Агар-агар по Эмерсону (указанна  выше стать , среда #28, с. 331)- рост умеренный, кремообразна  масса палево-желтого цвета (2 са, 2 еа), высока , морщиниста , воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  - желта  (2 ic), растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар-агар (указанна  выше стать , среда # 14, с. 330) -- рост от

плохого до умеренного, кремообразна  масса (2 са) от тонкой до слегка возвышенной, воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  -(2са), растворимый пигмент отсутствует.

0 Желатиновый агар-агар (Гордон и Мим, J.Bacteriol, 73, 15-27, 1957) - рост хороший, кремообразна  масса (2 са), высока , морщиниста -; воздушный мицелий отсутствует, обратна  поверхность кремова  - палево5 желта  (2 са, 2 еа), растворимый пигмент желтого цвета (2 еа).

Крахмальный агар-агар (указанна  выше стать ) - рост хороший, кремообразна  масса (2 са), высока , морщиниста , воздуш0 ный мицелий отсутстует, обратна  поверхность кремова  - палево-желта  (2 са, 2 еа). растворимый пигмент отсутствует,

Картофельно-мррковный агар-агар (Ле- . шевалье, Lab.Clin. Med., 71, 934-944, 1968,

5 но с использованием только 30 г картофел , . 2,5 г моркови и 20 г агар-агара) - рост от плохого до умеренного, практически белый (почти серые серии 2 Ьа), тонкий, гладкий, воздушный мицелий незначителен или отсутствует , бесцветный, обратна  поверх0 ность от бесцветной до кремовой (2 са), растворимый пигмент отсутствует.

Водный агар.-агар (2%) - рост плохой, кр емообразна  масса 2 са, тонкий, гладкий, воздушный мицелий отсутствует или незна5 чителен, бесцветный, обратна  поверхность кремова  (2 са), растворимый пигмент отсутствует .

Минеральна  среда 1 по Гаузе (Гаузе с сотр. Проблемы классификации антагони0 стических актиномицетов англ, издание, с. 13, 1957) - рост от плохого до умеренного, кремообразна  масса(2 са), тонка , гладка , воздушный мицелий отсутствует или незначителен , обратна  поверхность кремова  (2

5 са), растворимый пигмент отсутствует.

Органическа  среда 2 по Гаузе (указанный выше источник) - рост хороший, кремообразна  масса (2 са), высока , морщиниста , воздушный мицелий отсутст0 вует, обратна  поверхность кремова  - палево-желта . (2 са, 2 еа), растворимый пигмент отсутствует.„

Морфологические свойства. Морфологические свойства наблюдают 3 недели по5 еле начала инкубировани  на питательной среде из неорганических солей - крахмало- вого агар-агара, воздушный мицелий бесцветный , цвет от белого до кремового, цепочки спор пр мые, искривленные или

крюкообразные. содержат от 2 до 9 спор на цепочку, споры глобул рные, овальной или эллиптической формы, диаметром 0,8-1,4 мкм или размером 1,1-1,8x0,8-1,2 мкм, гладкие (по данным электронной сканирующей микроскопии). .

Биохимические свойства. Мелатин не продуцируетс , сероводород не продуцируетс , хселатин разжижаетс , крахмал не гид- ролизуетс , нитрат не восстанавливаетс  до нитрита, не наблюдаетс  ни роста, ни разложени  целлюлозной питательной среды по Йенсену или Ливайну и Шенлайну, свертывание и пептонизацм  молока не наблюдаетс , положительна  ферментаци  казеина, отрицательна  ферментаци  тирозина , отрицательна  ферментаци  соли кальци   блочной кислоты. Использование карбогидратов; используютс  глюкоза, ара- биноза, фруктоза, маннит, рамноза, сахароза , ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоза, крахмал и тре- алоза, не используютс  инозитол, рафино- за, дульситол , эритритол, галактоза, лактоза, манноза, мелезитоза, мелибрза, альфа-метил-глюкозид, салицин, сорбит и сорбоза.

Прочие положительные результаты тестов включают использование ацетатов и пм- руватов, гидролиз эсулмна и разложение ксантина и гипоксантина. Перечисленные ниже тесты дают отрицательные результаты: на использование бензоатов, цитратов, декстрина, лактатов, солей  блочной кислоты , солей слизневой кислоты, оксалатов, фе- нола, припионатов и сукцин атов, разложение аденина и тирозина и гидролиз гиппурата.

Температурные соотношени 

28°С37°С 45°С

ХорошийХороший Хороший

рострост рост

Анализ совокупности клеток.

Гидролизат совокупности клеток содержит мезо-диаминопимеловую кислоту, глюкозу , галактозу, мадурозу, маннозу и рибозу.

Культура N 777-1 характеризуетв  кремовым субстратным мицелием, коротким бесцветным воздушным мицелием, короткими цепочками спор пр мой, искривленной или крюкообразной формы и спорами с гладкой поверхностью. Используютс  глюкоза , арабиноза, фруктоза, маннит, рамоза, сахароза, ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоэа, крахмал, тре- лоза, ацетаты и пируваты. Разлагаютс  ксантин, гипоксантин и эксулин. Анализ

гидролизата совокупности клеток свидетельствует о наличии мезодиаминопимено- вой кислоты и мадуразы. Таким образом, культура N 777-1 принадлежит к роду

Actinomadura в соответствии с данным Г.Ле- шевалье определением.

На основе приведенных выше данных уместно рассматривать культуру N 777-1 в качестве члена рода Actinomadura и припи0 сать ей наименование Actinomadura sp. Данна  культура депонирована в Американской коллекции типов Культур под номером АТСС 53708.

Обладающее свойствами антибиотика

5 соединение формулы (I) согласно насто щему изобретению легко продуцируетс  указанной культурой Actinomadura в результате выращивани  последней при температуре в пределах от примерно 24 до

0 примерно 36°С в услови х погружени  при перемешивании и аэрации среды, состо - щей-из источников карбогидратов, таких как сахар, крахмал, глицерин; органических азотсодержащих соединений, таких как со5 еэа .мука, касаминовые кислоты, дрожжевой экстракт; среды дл  роста, например растворимые зерновые фракции, рыбна  мука, мука из сем н хлопчатника; минеральных солей, содержащих следовые количест0 ва таких элементов, как железо, кобальт, медь, цинк, и др, и карбоната каль ци  или фосфатов в качестве буферных агентов. После завершени  выращивани  антибиотик может быть легко экстрагирован из пита5 тельного бульона посредством органического растворител , например н-бутанола, метилизобутилкетона, или хлороформа при рН в диапазоне от 4,0 до 8,0 посредством фильтровани  мицели , который содержит

0 осажденный антибиотик (фильтрат при этом отбрасывают), или в результате непосредственной сушки при распылении или при охлаждении питательного бульона. В альтернативном варианте мицелий или вы5 сушенный бульон в целом экстрагируют одним из перечисленых выше органических растворителей. Затем очищенное соединение , обладающее свойствами антибиотика, при желании выдел ют из органического

0 экстракта с использованием стандартных методов концентрированна, соле- или кис- лотообразовани , хроматографии, осаждени  и/или кристаллизации - в соответствии с приведенными ниже примерами.

5 В соответствии с обычными способами ферментации вначале получают инокулум посредством разрушени  растительных клеток, с выращиванием его в подход щей среде, из срезов или сосудов Ру. инокулиро- ванных Actinomadura sp. ATCC 53708. Пол/чаемые при этом растительные клетки в свою очередь используют дл  инокулирова- ни  колб дл  встр хивани  или емкостей дл  инокулировани , которые также содержат подход щую среду дл  роста. В альтернативном варианте емкости дл  инокулирова- ни  инокулируют из колб дл  встр хивани . После соответствующего периода выращивани  (обычно от 120,до 144 ч пребывани  во встр хиваемых колбах и от 168 до 196 ч пребывани  в емкост х дл  инокулирова- ни ), фермент, также содержащий подход щую среду дл  роста, инокулируют в асептических услови х с растительным питательным бульоном из колб дл  встр хивани  или емкостей дл  инокулировани . После завершени  выращивани  (обычно продолжающеес  120-196 ч) антибиотик выдел ют по желанию в очищенном или неочищенном виде с использованием того или иного способа из числа перечисленных выше или с использованием специфических способов, описанных ниже в примерах.

Соединение формулы (I) подвергают испытани м in vitro на наличие бактерицидной активности с использованием стандартных способов, в соответствии с которыми измер ют минимальную ингибиру- ющую концентрацию (МИК) по отношению к одному или нескольким микроорганиз- мам, выраженную в мкг/мл. Подобна  методика рекомендована, в частности, в соответствии с результатами совместных международных исследований по чувствительности антибиотиков (Эриксон и Шер- рис, Acta Pathologica et Microbiologia Sqandinav., Supp. 217, Section B, 64-68 (1971), согласно которой используетс  агар- агарова  мозгова  сердечна  выт жка (ВН1) и устройства дл  реплликации инокула, Пробирки с препаратом, выращиваемым в тече- ние ночи, подвергают 100-кратному разбавлению дл  использовани  в качестве стандартного инокул та (от 20000 до 100000 клеток в примерно 20 мл помещают на поверхность агар-агара, 29 мл. агар-агара ВН1/чашку). Дл  проведени  испытани  берут примерно двукратные разбавлени  испытуемого соединени  при начальной концентрации испытуемого соединени , равной 200 мкг/мл. При рассмотрении результатов после выдерживани  культуры в течение 18 ч при 37°С единичные колонии не принимают во внимание. Способность воздействи  на микроорганизм (МИК) дл  данного испытуемого микроорганизма представл ет собой минимальную концентрацию соединени , при которой наблюдаетс  полное ингибирование роста при наблюдении невооруженным глазом. Как и

в случае прочих полициклических простых эфиров. обладающих свойствами антибио- тиков, соединени  согласно насто щему изобретению формулы (I) обычно демонст- рируют грамположительную противобакте- рийную активность, а также активность против Treponema hyodysenter iae (агент, вызывающий дизентерию у свиней, о чем свидетельствует материал, приведенный в

0 таблице).

Данные по эффективности соединений формулы (I) и их солей против кокцидозных инфекционных заболеваний цыпл т получают согласно описанному ниже способу.

5 Группам по 3-4 цыпл т породы белый леггорн возрастом 10 сут дают питание в виде пюре, содержащее равномерно распределенное в нем соединение формулы (I) или его соли натри  и/или кали . После выдержива0 ни  птиц на указанном рационе в течение 24 ч каждому из цыпл т инокулируют через рот оциты конкретных видов испытуемых микроорганизмов рода Eimeria. Другим группам из 3-5 цыпл т в возрасте 10 сут

5 дают аналогичную пищу в виде пюре, не содержащую соединений формулы (I) или их солей. Их также инфицируют спуст  24 ч, эти птицы служат в качестве контрольной зараженной группы. Еще одной группе из 3-5

0 цыпл т в возрасте 10 суток дают аналогичную пищу в виде пюре без антибиотиков, и птиц не подвергают заражению кокцидо- зом. Эта группа служит в качестве контрольной по нормальным услови м. Результаты

5 проведённой обработки оценивают спуст  5 сут в случае заражени  E.acervulina и спуст  6 су.т дл  прочих видов.

. Критерий, используемый дл  измерени  противококцидозной активности, соответ0 ствует оценке поражени  по шкале от 0 до 4 дл  E.tenella по способу Дж.Э.Линча, Новый способ первичной оценки противококцидозной активности, Am. J. Vet. Res. 22, 324- 326, 1961, по шкале от 0 до 3 дл  всех

5 остальных видов в соответствии с методикой оценки, разработанной Дж.Джонсоном и У.Г.Рейдом, Методика определени  снижени  степени поражени  при использовании противококцидозных средств при

0 проведении экспериментов на цыпл тах в клетках, Ext. Parasit, 28, 30-36, 1970.

Активность определ ют посредством делени  оценки поражени  дл  каждой из групп, прошедших обработку, на аналогич5 ную оценку поражени  дл  инфицированной контрольной группы. В соответствии с указанным испытанием соединение формулы (I) и его катионные соли обладают отличной активностью по отношению к разновидност м Eimeria tenella. Eimeria

acervullna, Elmeria maxima, Eimeria drunettl, Elmerla necatrix при заражении домашней птицы в случае, когда их ввод т в пюреоб- разную пищу дл  цыпл т в количестве примерно от 0,1 до примерно 25 м.д. Так, например, по отношению к чувствительной разновидности Eimeria tenella соединени  формулы (I) про вл ют 100% контрол  поражени  при столь малых дозах, как, например , 5 м.д.

Изобретение иллюстрируетс  приведенными ниже примерами. Следует однако понимать, что изобретение не ограничиваетс  конкретными детал ми указанных примеров .

Пример 1. Ферментаци  Actinomadura sp. ATCC 53708. Выделение соединени  формулы (I) в виде его соли натри .

Микроорганизм Actinomadura вначале выращивают в результате инокулировани  твердой среды на срезах или в емкости Ру

С

г/л

Церелоза10 Соева  мука 10 Тверда  ферментационна  фракций кукурузы 5 Кукурузный крахмал 10

Хлорид натри  Хлорид кобальта Хлорид кальци 

100 мл среды помещают в колбу дл  встр хивани  на 300 мл и стериализуют при 120°С и давлении 15 фунт/кв.дюйм (примерно 0,1 кг/кв.см) в течение 30 мин. После охлаждени  среду инокулируют суспензией растительных клеток, полученную из срезов указанной выше культуры Actinomadura. Колбы встр хивают при 28°С на устройстве, имеющем амплитуду от 1,5 до 2,5 дюймов (от 37 до 64 мм) и скорость вращени  150-200 об/мин в течение 5-7 сут.

Одновременно получают в 5-литровых емкост х по 3 л одной из указанных выше сред С или IDY ТТ или указанной ниже среды: UKI-2г/л Церелоза 45 Соева  мука 10 Жидка  фракци 

варки кукурузы10 Хлорид кобальта 0,002 Сульфат магни  0,10 Карбонат кальцит 3 Сульфат марганца 0,10 Сульфат двухва- лентного железа 0,10

культурой АТСС 53708 с использованием среды N 172 по нормам АТСС, получение и нормы расхода приведены ниже (в г/л). Глюкоза10

Растворимый крахмал 20 Дрожжевой экс- тракт 5 Ферментативный

гидролизат казеина1 Карбонат кальци  1 Дистиллированна  вода до 1000 мл, рН довод т до 7,0

посредством КОН, добавл ют агар-агар 30

Среду в колбах дл  встр хивани  получают в соответствии с любым из приведен- ных ниже составов:

К среде добавл ют 1 мл средства против

IDYTT

г/л

Церелоза-10 Кукурузный крахмал 5 Жидка  фракци  варки кукурузы 5 Ферментативный гидролизат казеина 5

Хлорид кобальта Карбонат кальци 

0,002

3

образовани  пены (полипропиленгликоль 32000, содержащий 10 мас.% окиси этилена ), емкости закрывают и стерилизуют при 120°С и давлении 15 фунт/кв. дюйм в течение 45 мин. Затем среду в емкост х инокулируют содержимым одной колбы дл  встр хивани  (примерно 3% инокулума), ферментируют втечение 120-168 ч при 30°С, перемешивают при скорости 1700 об/мин при количестве воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в минуту.

После завершени  ферментации (по данным антибиотического теста против B.Subtilis АТСС 6633) ферментационные устройства останавливают и фильтруют их содержимое через диатомитовую землю при имеющемс  рН. Осадок на фильтре перевод т во взвесь в метаноле, концентрируют в вакууме, разбавл ют 2-3 объемами воды и экстрагируют дважды порци ми от 1/3 до 1/2 объемами либо метилизобутилкетона, либо н-бутанола. Слой растворител  отдел ют от водной фазы посредством отсасывани  или центрифугировани , взбалтываюти концентрируют в вакууме, получа  антибиотик формулы (I) в неочищенной форме в виде в зкого масла.

Биологическую активность питательного бульона и последующих выделенных фракций можно исследовать с использованием чувствительных штаммов Bacillus subtllls ATCC 6633 или Staphylococcus aureus ATCC 6538. Компоненты питательного бульона и выделенных фракций могут быть визуализированы с использованием пластинок с силикагелем CF Анальтек и этилацетата в качестве элюента. Про вленные пластины опрыскивают ванилиновым реагентом (3 г ванилина в 75 мл этзнола и 25 мл 85%-ной фосфорной кислоты) и нагревают до 80°С. Обладающий свойствами антибиотика продукт формулы (I) про вл етс  в виде пурпурного п тна. Про вленные пластины дл  тонкослойной хроматографии могут быть также покрыты агар-агаром, в который помещены культуры Bacillus subtllis или Staphylococcus aureus, к которым добавл ют 2,3,5-трифенил-2Н-тетразо- лилхлорида (моногидрат), и инкубируют при 37°С в течение 16 ч дл  визуализации антибиотика (белые п тна на розоватом фоне).

Крупномасштабный эксперимент в больших емкост х дл  ферментации осуществл ют посредством получени  продукта в колбах дл  встр хивани , содержащих 0,7л среды С1 или-IDY ТТ. Инокулум из указанных колб ферментируют в течение 5-7°сут при 28°С и используют полученный иноку- лум дл  инокулировани  емкостей дл  фер- ментации объемом 200 или 6000 л, содержащих 100 или 4000 л среды UKI-2 соответственно. Примерно 1 л инокулума используют дл  инокул ции каждой емкости . После ферментации в течение 7-10 сут получают готовый продукт.

Весь питательный бульон в меньших по размеру ферментаторах экстрагируют 50 л метилизобутилкетона при имеющемс  рН, Органический экстракт концентрируют в вакууме в циклон-аппарате и вакуумном испарителе с получением масла. 1у1асло затем дважды хроматографируют на колонке с силикагелем (гексан). В первой колонке элюи- рование осуществл ют этилацетатом, а во второй - смесью 1:1 хлороформ - ацетон. Фракции, содержащие продукт, идентифицируют тонкослойной хроматографией с использованием описанного выше способа. Активные фракции после второй колонки с силикагелем вновь хроматографируют на флорисиле, использу  дл  элюировани  смесь хлороформа и метанола 19:1. Фракции , содержащие продукт, объедин ют, встр хивают с разбавленной фосфорной

кислотой, затем с двухосновным фосфатным буфером дл  получени  соли натри , сушат над сульфатом натри , разгон ют и кристаллизуют остаток из эфира, получа  в

результате соль натри  соединени  формулы (I) в количестве 915 кг, температура плавлени  245-2490С,.(альфа),0 (, метанол).

Результаты анализа из расчета на

C45H 70idNa.

Рассчитано. %: С 62,47; Н 8,97, Найдено, %: С 62,89; Н 9,22. Спектр ЯМР-С-13 (хим. сдвиги в м.д, в дейтерохлороформе с указанием числа

атомов водорода данного типа): 182,8-ОН. 110,0-ОН, 106,0-ОН; 99,1-IH; 87.2-1H; 86,9- ОН; 86,2-1 Н; 86,2-ОН; 84,8-1 Н; 83,4-ЧЖ; 82,6-1 Н; 80,2-1 Н; 78,6-1 Н; 75,2-1 Н; 74,8-1 Н; 74,6-1 Н; 66,4-1 Н; 60,3-ЗН; 57,9-ЗН; 56,9-ЗН;

44,5-1 Н; 39,0-1 Н; 36,9-1 Н; 36,8-2Н; 25.9-2Н;

35.4-2Н; 35.2-2Н; 35,1-1 Н; 35,0-1Н; 31,3-2Н;

30.9-2Н; 30,5-1 Н; 28,2-ЗН; 27.1-2Н; 26.1-2Н;

25,0-ЗН; 21,0-ЗН; 18,3-ЗН; 16,7-ЗН; 15,3-ЗН;

13,4-ЗН; 13,1-ЗН; 11.2-2Н; 10,7-ЗН; 10,6-ЗН.

Работа с использованием больших фер- ментизационных емкостей проводитс  с экстрагированием всего питательного бульона (примерно 4000 л) 1800 л метилизобутилкетона , отделением растворител  в экстракторе Подбельн ка и концентрирова- нием в вакууме с удалением растворител  и получением сиропообразной массы. Концентрат дважды растирают с равным объемом неразбавленного метанола, отдел ют нерастворимое в метаноле масло, а мета- нольную фракцию концентрируют в вакууме с -получением сиропообразной массы. Указанную массу дважды экстрагируют гексаном , а объединенные экстракты в гексане - ацетонитрилом. Ацетонитрильную фракцию сохран ют дл  дальнейшего извлечени  продукта. Гексан концентрируют в вакууме и хроматографируют на колонке с силикагелем по част м. Продукт десорбируют из си- ликагел  на воронку с фильтром вначале гексаном, затем хлористым метиленом, этилацетатом , и наконец ацетоном, Активные фракции, которые содержатс , в элюатах в

хлористом метилене и этилацетате, раствор ют в гексане и промывают подкисленной водой, после чего экстрагируют 1%-ным раствором N-метил-О-глюкамина в воде. Водную фазу подсаливают хлоридом натри 

и экстрагируют 2 равными по объему порци ми этилацетата. Органические слои объедин ют , обрабатывают активированным углем, фильтруют, промывают фосфатным буфером с рН 9,0, сушат над сульфатом натри , кон центрируют в вакууме и кристаллизуют из эфира, получа  50,8 г соли натри , идентичной с продуктом, полученным в результате менее масштабной ферментации.

Пример 2. Соединение формулы (I) в форме свободной кислоты.

Соединение формулы (I), Обладающее свойствами антибиотика в форме свободной кислоты, получают в результате интен-- сивного встр хивани  в делительной коронке раствора соли натри  в хлороформе с равными объемами сол ной кислоты при рН 2. Фазы раздел ют, промывают фазу хлороформа водой и разгон ют в вакууме, получа  свободную кислоту, имеющую тем- пературу плавлени  87-90°С (альфа) 6,9°С(, метанол).

Результаты анализа из расчета на 0,5 НаО.

Рассчитано, %: С 63,48; Н 9,34.

Найдено, %: С 63,35; Н 9,53.

Пример 3. Соединение формулы (I) (соль натри ).

Свободную кислоту, полученную в предшествующем примере (45 мг), раствор ют в 100 мл хлороформа. К раствору добавл ют раствор карбоната натри  (0,5 г) в воде (100 мл) и Помещают полученную смесь в делительную воронку, после чего интенсивно встр хивают в течение нескольких минут. Слой в хлороформе раздел ют, а водный слой промывают свежим хлороформом. Объединенные экстракты в хлороформе сушат над сульфатом натри , фильтруют и разгон ют в вакууме, получа  41 мг соли натри , температура плавлени  230-235°С.

Результаты анализа из расчета на

C45H770l/jNa. .

Рассчитано, %: С 62,47, Н 8,97.

Найдено, %: С 62,20; Н 9,14.

хОМе Me

заключающийс  в том, что осуществл ют глубинное культивирование штамма Actinomaclura sp. ATCC 53708 в услови х аэрации и перемешивани  в питательной среде, содержащей источкики углерода, азота и минеральные соли, с последующей

Пример 4. Соединение формулы (I) (соль рубиди ).

Дл  получени  соли рубиди  соединени  формулы (I) 30 мг свободной кислоты раствор ют в 50 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавл ют раствор 35 мг карбоната рубиди  в 251ил воды и перемешивают полученную смесь в течение 2 ч. Органическую фазу отдел ют и экстрагируют водный слой равным объемом хлороформа . Объединенные экстракты в хлороформе разгон ют, получа  твердый белый остаток. Соль рубиди  перекристаллизовывают в результате медленного испарени  из эфира и определ ют структуру полученных кристаллов методом рентгеноструктурного анализа (д-р Дж. Бординер).;

Пример 5; Соединение формулы (I) (соль кали ).

Дл  получени  соли кали  соединени  формулы (I) 130 мг свободной кислоты раствор ют в 100 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавл ют раствор 100 мг карбоната кали  в 100 мл воды и перемешивают полученную смесь в течение нескольких минут , после чего помещают ее в делительную воронку и интенсивно встр хивают в течение нескольких минут. Органическую фазу отдел ют и разгрн ют в вакууме, получа  соединение формулы (I) в виде белого порошка, температура 255-260°С, (аль- фа),6° (, хлороформ).

Результаты анализа из расчета на

С45Н77Р14К.

Рассчитано, %: С 61,34, Н 8,81. Найдено, %: С 60,91, Н 8,83.

Формул а изобретени 

Способ получени  антибиотика формуэкстракцией органическим растворителем всей культуральной жидкости или отфильтрованного мицели  и выделением целевого продукта, который при необходимости перевод т в фармацевтически приемлемую щелочно-металлическую соль.

Исследовани  in vitro антибактериальной активности соединени  формулы (I)

Редактор Л.Волкова

Техред М.Моргентал

Заказ 1394Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., 4/5

Корректор П.Гереши