RU1808007C - Способ получени антибиотика - Google Patents
Способ получени антибиотикаInfo
- Publication number
- RU1808007C RU1808007C SU904830753A SU4830753A RU1808007C RU 1808007 C RU1808007 C RU 1808007C SU 904830753 A SU904830753 A SU 904830753A SU 4830753 A SU4830753 A SU 4830753A RU 1808007 C RU1808007 C RU 1808007C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- agar
- medium
- growth
- compound
- mycelium
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: микробиологи , получе- tnne полиэфирных антибиотиков, относ щихс к кислотным полициклическим простым эфирам. Сущность изобретени : осуществл ют глубинное культивирование штамма Actlnomadura sp. ATCC 53708 в услови х аэрации и перемешивани в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. Куль- туральную жидкость или отфильтрованный мицелий экстрагируют органическим растворителем . Продукт выдел ют в неочищенном или чистом виде или перевод т в фармацевтически приемлемую соль щелочного металла. 1 табл.
Description
Насто щее изобретение относитс к но- полициклического простого эфира, имеюцым антибиотикам на основе кислотногощёго общую формулу
ОМе
0-Ме
МеО
Me ОМе
Me
fe
Me Me
в которой Me представл ет собой метиль- ную группу, имеющего абсолютное стерео- химическое строение, отраженное в формуле, к пригодным дл фармацевтического использовани катионным сол м указанных соединений, к пищевым композици м , включающим указанный антибиотик и предназначенным дл домашней птицы, крупного рогатого скота или свиней, к их использованию в качестве противокок- цидальных средств дл домашней птицы, при лечении или предотвращении дизентерии у свиней, или в качестве стимул тора
е
Me
Me ОН ф
роста крупного рогатого скота и свиней, к способу ферментации дл их получени , и к микроорганизмам Aetlnomadura, которые продуцируют указанный антибиотик согласно указанному ферментационному способу.
Соединение (I) представл ет собой новое соединение р да антибиотиков, относ щихс k кислотным полициклическим простым эфирам. Этот р д включает также такие широко известные агенты, как моне- з ин (Указатель фирмы Мерк, 10-е издание, Меркэнд Ко.Инкорпорейтед, Рэгуэй. Нью§
00
о о
si
СО
Джерси, 1983, № по указателю 6100), ниге- рицин (Указатель Мерк, № по указателю 6100), ласалоцид (Указатель Мерк № по указателю 6390) и салиномицин (Указатель Мерк,№ по указателю 8193). Этот вопрос освещен Уэстли, Полиэфирные антибиотики , т. 22, с. 177-223 (1977). Наиболее близким в структурном отношении аналогом указанного соединени вл етс портм цин, антибиотик независимо описанный Хэ- миллом с сотр. в патенте США № 4572822 и Кусакабе с сотр. в европейской патентной за вке 158179, Tetrahedron Letters, 28, 3357-3360 (1987), J.Antiblotics 40, 237-238 (1987). Это соединение обладает альфа-водородным атомом в тетрагидрофурановом кольце В, тогда как соединение согласно насто щему изобретению имеет альфа-ме- тильную группу. Указанные соединени известны в качестве кокцидостатических средств, в качестве средств ускорени роста - добавок к пище, и/или в качестве агентов, противодействующих развитию дизентерии у свиней.
Культура Actinomadura sp. ATCC 53708 (АТСС 53708) при ферментировании в аэробных услови х в водной среде продуцирует новый антибиотик типа кислотного полициклического простого эфира - соединение общей формулы (I), описанное выше.
Насто щее изобретение относитс к указанному соединению формулы (f), включа его пригодные дл фармацевтического использовани катионные соли, и к способу его получени , включающему ферментиро- вание указанных микроорганизмов Actinomadura sp. ATCC 53708 в водной питательной среде, включающей источник усваиваемого углерода и азота до образовани извлечимого количества указанного соединени формулы (I), предпочтительно в погруженных аэробных услови х. Дл его использовани в качестве противококци- дального агента., средства дл предотвращени или лечени дизентерии у свиней и/или в качестве средства ускорени роста, соединение (I) не об зательно выдел ть в практически чистом виде, напротив, его можно в альтернативном варианте, использовать в неочищенном виде, либо осажденным из смеси мицелием (с выделением из ферментативной среды фильтрованием), либо в твердой форме после сушки при распылении или замораживании всей ферментационной среды.
Указанные пригодные дл фармацевтического применени катионные соли включают (но не ограничиваютс ) соли натри , кали , кальци , аммони , NtN -дибензилэ- тилендиэминэ, N-метилглкжамина, (меглумина ) и диэтаноламина. Предпочтительными катионными сол ми вл ютс соли кали и натри .
Культура, способна продуцировать антибиотик в форме полициклического эфира согласно насто щему изобретению, отвечающего формуле (I). обозначаетс Actinomadura, она помещена в Американской коллекции типов культур в Роквилле,
штат Мэриленд в качестве типовой культуры под номером АТСС 53708. Наличие депонированной культуры в Американской коллекции типов культур в Роквилле, Мэриленд, и возможность доступа к ней будут обеспече5 ны на прот жении всей продолжительности действи патента, если патент по насто щей за вке будет выдан. Доступ к культуре обеспечен в соответствии с действием за вки под номерами 37 CFR 1.14 и 35 USC 122.
0 Все ограничени дл широкого использовани депонированной культуры снимаютс немедленно после выдачи соответствующего патента.
Указанна культура была получена из
5 образца почвы, вз того в Тузле (Стамбул, Турци ), и идентифицирована в коллекции культур Пфайзер Инкорпорейтед под номером N 777-1. Ее описание и классификаци обеспечены д-ром Д.Х.Хуангом.
0 Обнаружено, что указанна культура продуцирует тонкие нити грибницы (гифы) акти- номицетов, воздушный мицелий, на котором продуцируютс цепочхи коротких спор, и неразделенный субстратный мице5 лий. Результаты полного анализа клеток указывают на то, что данный микроорганизм принадлежит к роду Actinomadura.
Культуру идентифицируют в соответствии с описанным ниже способом.
0 Экстракт дрожжей - солодовый экстракт агар-агар (среда /sp# 2, Дифко) рост хороший, кремообразна масса (2са) с п тнами , имеющими цвет от темно-серого до черного (серии близкого к черному цвету - 5
5 дюймов (127 мм), 5 мл), высока , с мора ини- стой поверхностью, воздушный мицелий от отсутстви до редкого, бесцветный, обратна поверхность кремова - от палевого до желтого цвета (2са, 2еа) с черными (серии
0 близкого к серому цвету 5 мл) п тнами, растворимый пигмент отсутствует.
Овс ной агар-агар (среда /sp# 3, Дифко ) - рост средний, кремообразна масса (2са), средней высоты, гладка , воздушный
5 мицелий от отсутстви до редкого, бесцвет- . ный, обратна поверхность кремова - (2са), крем растворимого пигмента (2са).
Неорганические соли - крахмальный агар-агар (среда /sp# 4. Дифко) - рост, плохой , кремообразна масса (2са). тонка .
гладка , воздушный мицелий.от отсутстви до редкого, бесцветный, обратна поверхность кремова - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Глицерино-аспарагиновый агар-агар (среда /sp# 5. Дифко) - рост от плохого до среднего, кремообразна масса (2са), тонка , гладка , воздушный мицелий отсутствует , обратна поверхность кремова - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Сахарозный агар-агар по Чапеку (среда #1, Уоксман, Актиномицеты, т.2 стр.328, 1961) - рост от умеренного до хорошего, кремообразна масса (2са), умеренно высока , гладка , воздушный мицелий отсутствует , обратна поверхность кремова - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Глюкозо-аспарагиновый агар-агар (среда #2, Уоксман, Актиномицеты, т.2 стр. 328, 1961) - рост умеренный, кремообразна масса (2са), от тонкой до умеренно высокой , от гладкой.до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова - (2са), растворимый пигмент отсутствует.
Тирозиновый агар по Гордону и Смиту (Гордон и Смит, J. Bacteriol. 69, 147-150, 1955) - рост от умеренного до хорошего, кремообразна масса (2са) от слегка подн той до.умеренно высокой, от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует , обратна поверхность кремообразной массы (2са), растворимый пигмент палево- желтый.
Агар-агар с кальциевой солью блочной кислоты (Уоксман, Bacteriol Rev., 21, 1-29, 1957) - рост незначительный, кремообразна масса (2са), тонка , гладка , воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова (2са), растворимый пигмент отсутствует .
Казеиновый агар-агар (Гордон и Смит, указанна выше стать ) - рост хороший, кремообразна масса (2са), высока , от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова - палево-желта (2са), растворимый пигмент желтый (2 да).
Агар-агар по Беннету (Уоксман, указанна выше стать , среда # 30) - рост хороший , кремообразна масса (2са) высока , от гладкой до морщинистой, воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова - палево-желта (2са, 2еа), растворимый пигмент желтый (2еа).
Агар-агар по Эмерсону (указанна выше стать , среда #28, с. 331)- рост умеренный, кремообразна масса палево-желтого цвета (2 са, 2 еа), высока , морщиниста , воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова - желта (2 ic), растворимый пигмент отсутствует.
Питательный агар-агар (указанна выше стать , среда # 14, с. 330) -- рост от
плохого до умеренного, кремообразна масса (2 са) от тонкой до слегка возвышенной, воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова -(2са), растворимый пигмент отсутствует.
0 Желатиновый агар-агар (Гордон и Мим, J.Bacteriol, 73, 15-27, 1957) - рост хороший, кремообразна масса (2 са), высока , морщиниста -; воздушный мицелий отсутствует, обратна поверхность кремова - палево5 желта (2 са, 2 еа), растворимый пигмент желтого цвета (2 еа).
Крахмальный агар-агар (указанна выше стать ) - рост хороший, кремообразна масса (2 са), высока , морщиниста , воздуш0 ный мицелий отсутстует, обратна поверхность кремова - палево-желта (2 са, 2 еа). растворимый пигмент отсутствует,
Картофельно-мррковный агар-агар (Ле- . шевалье, Lab.Clin. Med., 71, 934-944, 1968,
5 но с использованием только 30 г картофел , . 2,5 г моркови и 20 г агар-агара) - рост от плохого до умеренного, практически белый (почти серые серии 2 Ьа), тонкий, гладкий, воздушный мицелий незначителен или отсутствует , бесцветный, обратна поверх0 ность от бесцветной до кремовой (2 са), растворимый пигмент отсутствует.
Водный агар.-агар (2%) - рост плохой, кр емообразна масса 2 са, тонкий, гладкий, воздушный мицелий отсутствует или незна5 чителен, бесцветный, обратна поверхность кремова (2 са), растворимый пигмент отсутствует .
Минеральна среда 1 по Гаузе (Гаузе с сотр. Проблемы классификации антагони0 стических актиномицетов англ, издание, с. 13, 1957) - рост от плохого до умеренного, кремообразна масса(2 са), тонка , гладка , воздушный мицелий отсутствует или незначителен , обратна поверхность кремова (2
5 са), растворимый пигмент отсутствует.
Органическа среда 2 по Гаузе (указанный выше источник) - рост хороший, кремообразна масса (2 са), высока , морщиниста , воздушный мицелий отсутст0 вует, обратна поверхность кремова - палево-желта . (2 са, 2 еа), растворимый пигмент отсутствует.„
Морфологические свойства. Морфологические свойства наблюдают 3 недели по5 еле начала инкубировани на питательной среде из неорганических солей - крахмало- вого агар-агара, воздушный мицелий бесцветный , цвет от белого до кремового, цепочки спор пр мые, искривленные или
крюкообразные. содержат от 2 до 9 спор на цепочку, споры глобул рные, овальной или эллиптической формы, диаметром 0,8-1,4 мкм или размером 1,1-1,8x0,8-1,2 мкм, гладкие (по данным электронной сканирующей микроскопии). .
Биохимические свойства. Мелатин не продуцируетс , сероводород не продуцируетс , хселатин разжижаетс , крахмал не гид- ролизуетс , нитрат не восстанавливаетс до нитрита, не наблюдаетс ни роста, ни разложени целлюлозной питательной среды по Йенсену или Ливайну и Шенлайну, свертывание и пептонизацм молока не наблюдаетс , положительна ферментаци казеина, отрицательна ферментаци тирозина , отрицательна ферментаци соли кальци блочной кислоты. Использование карбогидратов; используютс глюкоза, ара- биноза, фруктоза, маннит, рамноза, сахароза , ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоза, крахмал и тре- алоза, не используютс инозитол, рафино- за, дульситол , эритритол, галактоза, лактоза, манноза, мелезитоза, мелибрза, альфа-метил-глюкозид, салицин, сорбит и сорбоза.
Прочие положительные результаты тестов включают использование ацетатов и пм- руватов, гидролиз эсулмна и разложение ксантина и гипоксантина. Перечисленные ниже тесты дают отрицательные результаты: на использование бензоатов, цитратов, декстрина, лактатов, солей блочной кислоты , солей слизневой кислоты, оксалатов, фе- нола, припионатов и сукцин атов, разложение аденина и тирозина и гидролиз гиппурата.
Температурные соотношени
28°С37°С 45°С
ХорошийХороший Хороший
рострост рост
Анализ совокупности клеток.
Гидролизат совокупности клеток содержит мезо-диаминопимеловую кислоту, глюкозу , галактозу, мадурозу, маннозу и рибозу.
Культура N 777-1 характеризуетв кремовым субстратным мицелием, коротким бесцветным воздушным мицелием, короткими цепочками спор пр мой, искривленной или крюкообразной формы и спорами с гладкой поверхностью. Используютс глюкоза , арабиноза, фруктоза, маннит, рамоза, сахароза, ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоэа, крахмал, тре- лоза, ацетаты и пируваты. Разлагаютс ксантин, гипоксантин и эксулин. Анализ
гидролизата совокупности клеток свидетельствует о наличии мезодиаминопимено- вой кислоты и мадуразы. Таким образом, культура N 777-1 принадлежит к роду
Actinomadura в соответствии с данным Г.Ле- шевалье определением.
На основе приведенных выше данных уместно рассматривать культуру N 777-1 в качестве члена рода Actinomadura и припи0 сать ей наименование Actinomadura sp. Данна культура депонирована в Американской коллекции типов Культур под номером АТСС 53708.
Обладающее свойствами антибиотика
5 соединение формулы (I) согласно насто щему изобретению легко продуцируетс указанной культурой Actinomadura в результате выращивани последней при температуре в пределах от примерно 24 до
0 примерно 36°С в услови х погружени при перемешивании и аэрации среды, состо - щей-из источников карбогидратов, таких как сахар, крахмал, глицерин; органических азотсодержащих соединений, таких как со5 еэа .мука, касаминовые кислоты, дрожжевой экстракт; среды дл роста, например растворимые зерновые фракции, рыбна мука, мука из сем н хлопчатника; минеральных солей, содержащих следовые количест0 ва таких элементов, как железо, кобальт, медь, цинк, и др, и карбоната каль ци или фосфатов в качестве буферных агентов. После завершени выращивани антибиотик может быть легко экстрагирован из пита5 тельного бульона посредством органического растворител , например н-бутанола, метилизобутилкетона, или хлороформа при рН в диапазоне от 4,0 до 8,0 посредством фильтровани мицели , который содержит
0 осажденный антибиотик (фильтрат при этом отбрасывают), или в результате непосредственной сушки при распылении или при охлаждении питательного бульона. В альтернативном варианте мицелий или вы5 сушенный бульон в целом экстрагируют одним из перечисленых выше органических растворителей. Затем очищенное соединение , обладающее свойствами антибиотика, при желании выдел ют из органического
0 экстракта с использованием стандартных методов концентрированна, соле- или кис- лотообразовани , хроматографии, осаждени и/или кристаллизации - в соответствии с приведенными ниже примерами.
5 В соответствии с обычными способами ферментации вначале получают инокулум посредством разрушени растительных клеток, с выращиванием его в подход щей среде, из срезов или сосудов Ру. инокулиро- ванных Actinomadura sp. ATCC 53708. Пол/чаемые при этом растительные клетки в свою очередь используют дл инокулирова- ни колб дл встр хивани или емкостей дл инокулировани , которые также содержат подход щую среду дл роста. В альтернативном варианте емкости дл инокулирова- ни инокулируют из колб дл встр хивани . После соответствующего периода выращивани (обычно от 120,до 144 ч пребывани во встр хиваемых колбах и от 168 до 196 ч пребывани в емкост х дл инокулирова- ни ), фермент, также содержащий подход щую среду дл роста, инокулируют в асептических услови х с растительным питательным бульоном из колб дл встр хивани или емкостей дл инокулировани . После завершени выращивани (обычно продолжающеес 120-196 ч) антибиотик выдел ют по желанию в очищенном или неочищенном виде с использованием того или иного способа из числа перечисленных выше или с использованием специфических способов, описанных ниже в примерах.
Соединение формулы (I) подвергают испытани м in vitro на наличие бактерицидной активности с использованием стандартных способов, в соответствии с которыми измер ют минимальную ингибиру- ющую концентрацию (МИК) по отношению к одному или нескольким микроорганиз- мам, выраженную в мкг/мл. Подобна методика рекомендована, в частности, в соответствии с результатами совместных международных исследований по чувствительности антибиотиков (Эриксон и Шер- рис, Acta Pathologica et Microbiologia Sqandinav., Supp. 217, Section B, 64-68 (1971), согласно которой используетс агар- агарова мозгова сердечна выт жка (ВН1) и устройства дл реплликации инокула, Пробирки с препаратом, выращиваемым в тече- ние ночи, подвергают 100-кратному разбавлению дл использовани в качестве стандартного инокул та (от 20000 до 100000 клеток в примерно 20 мл помещают на поверхность агар-агара, 29 мл. агар-агара ВН1/чашку). Дл проведени испытани берут примерно двукратные разбавлени испытуемого соединени при начальной концентрации испытуемого соединени , равной 200 мкг/мл. При рассмотрении результатов после выдерживани культуры в течение 18 ч при 37°С единичные колонии не принимают во внимание. Способность воздействи на микроорганизм (МИК) дл данного испытуемого микроорганизма представл ет собой минимальную концентрацию соединени , при которой наблюдаетс полное ингибирование роста при наблюдении невооруженным глазом. Как и
в случае прочих полициклических простых эфиров. обладающих свойствами антибио- тиков, соединени согласно насто щему изобретению формулы (I) обычно демонст- рируют грамположительную противобакте- рийную активность, а также активность против Treponema hyodysenter iae (агент, вызывающий дизентерию у свиней, о чем свидетельствует материал, приведенный в
0 таблице).
Данные по эффективности соединений формулы (I) и их солей против кокцидозных инфекционных заболеваний цыпл т получают согласно описанному ниже способу.
5 Группам по 3-4 цыпл т породы белый леггорн возрастом 10 сут дают питание в виде пюре, содержащее равномерно распределенное в нем соединение формулы (I) или его соли натри и/или кали . После выдержива0 ни птиц на указанном рационе в течение 24 ч каждому из цыпл т инокулируют через рот оциты конкретных видов испытуемых микроорганизмов рода Eimeria. Другим группам из 3-5 цыпл т в возрасте 10 сут
5 дают аналогичную пищу в виде пюре, не содержащую соединений формулы (I) или их солей. Их также инфицируют спуст 24 ч, эти птицы служат в качестве контрольной зараженной группы. Еще одной группе из 3-5
0 цыпл т в возрасте 10 суток дают аналогичную пищу в виде пюре без антибиотиков, и птиц не подвергают заражению кокцидо- зом. Эта группа служит в качестве контрольной по нормальным услови м. Результаты
5 проведённой обработки оценивают спуст 5 сут в случае заражени E.acervulina и спуст 6 су.т дл прочих видов.
. Критерий, используемый дл измерени противококцидозной активности, соответ0 ствует оценке поражени по шкале от 0 до 4 дл E.tenella по способу Дж.Э.Линча, Новый способ первичной оценки противококцидозной активности, Am. J. Vet. Res. 22, 324- 326, 1961, по шкале от 0 до 3 дл всех
5 остальных видов в соответствии с методикой оценки, разработанной Дж.Джонсоном и У.Г.Рейдом, Методика определени снижени степени поражени при использовании противококцидозных средств при
0 проведении экспериментов на цыпл тах в клетках, Ext. Parasit, 28, 30-36, 1970.
Активность определ ют посредством делени оценки поражени дл каждой из групп, прошедших обработку, на аналогич5 ную оценку поражени дл инфицированной контрольной группы. В соответствии с указанным испытанием соединение формулы (I) и его катионные соли обладают отличной активностью по отношению к разновидност м Eimeria tenella. Eimeria
acervullna, Elmeria maxima, Eimeria drunettl, Elmerla necatrix при заражении домашней птицы в случае, когда их ввод т в пюреоб- разную пищу дл цыпл т в количестве примерно от 0,1 до примерно 25 м.д. Так, например, по отношению к чувствительной разновидности Eimeria tenella соединени формулы (I) про вл ют 100% контрол поражени при столь малых дозах, как, например , 5 м.д.
Изобретение иллюстрируетс приведенными ниже примерами. Следует однако понимать, что изобретение не ограничиваетс конкретными детал ми указанных примеров .
Пример 1. Ферментаци Actinomadura sp. ATCC 53708. Выделение соединени формулы (I) в виде его соли натри .
Микроорганизм Actinomadura вначале выращивают в результате инокулировани твердой среды на срезах или в емкости Ру
С
г/л
Церелоза10 Соева мука 10 Тверда ферментационна фракций кукурузы 5 Кукурузный крахмал 10
Хлорид натри Хлорид кобальта Хлорид кальци
100 мл среды помещают в колбу дл встр хивани на 300 мл и стериализуют при 120°С и давлении 15 фунт/кв.дюйм (примерно 0,1 кг/кв.см) в течение 30 мин. После охлаждени среду инокулируют суспензией растительных клеток, полученную из срезов указанной выше культуры Actinomadura. Колбы встр хивают при 28°С на устройстве, имеющем амплитуду от 1,5 до 2,5 дюймов (от 37 до 64 мм) и скорость вращени 150-200 об/мин в течение 5-7 сут.
Одновременно получают в 5-литровых емкост х по 3 л одной из указанных выше сред С или IDY ТТ или указанной ниже среды: UKI-2г/л Церелоза 45 Соева мука 10 Жидка фракци
варки кукурузы10 Хлорид кобальта 0,002 Сульфат магни 0,10 Карбонат кальцит 3 Сульфат марганца 0,10 Сульфат двухва- лентного железа 0,10
культурой АТСС 53708 с использованием среды N 172 по нормам АТСС, получение и нормы расхода приведены ниже (в г/л). Глюкоза10
Растворимый крахмал 20 Дрожжевой экс- тракт 5 Ферментативный
гидролизат казеина1 Карбонат кальци 1 Дистиллированна вода до 1000 мл, рН довод т до 7,0
посредством КОН, добавл ют агар-агар 30
Среду в колбах дл встр хивани получают в соответствии с любым из приведен- ных ниже составов:
К среде добавл ют 1 мл средства против
IDYTT
г/л
Церелоза-10 Кукурузный крахмал 5 Жидка фракци варки кукурузы 5 Ферментативный гидролизат казеина 5
Хлорид кобальта Карбонат кальци
0,002
3
образовани пены (полипропиленгликоль 32000, содержащий 10 мас.% окиси этилена ), емкости закрывают и стерилизуют при 120°С и давлении 15 фунт/кв. дюйм в течение 45 мин. Затем среду в емкост х инокулируют содержимым одной колбы дл встр хивани (примерно 3% инокулума), ферментируют втечение 120-168 ч при 30°С, перемешивают при скорости 1700 об/мин при количестве воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в минуту.
После завершени ферментации (по данным антибиотического теста против B.Subtilis АТСС 6633) ферментационные устройства останавливают и фильтруют их содержимое через диатомитовую землю при имеющемс рН. Осадок на фильтре перевод т во взвесь в метаноле, концентрируют в вакууме, разбавл ют 2-3 объемами воды и экстрагируют дважды порци ми от 1/3 до 1/2 объемами либо метилизобутилкетона, либо н-бутанола. Слой растворител отдел ют от водной фазы посредством отсасывани или центрифугировани , взбалтываюти концентрируют в вакууме, получа антибиотик формулы (I) в неочищенной форме в виде в зкого масла.
Биологическую активность питательного бульона и последующих выделенных фракций можно исследовать с использованием чувствительных штаммов Bacillus subtllls ATCC 6633 или Staphylococcus aureus ATCC 6538. Компоненты питательного бульона и выделенных фракций могут быть визуализированы с использованием пластинок с силикагелем CF Анальтек и этилацетата в качестве элюента. Про вленные пластины опрыскивают ванилиновым реагентом (3 г ванилина в 75 мл этзнола и 25 мл 85%-ной фосфорной кислоты) и нагревают до 80°С. Обладающий свойствами антибиотика продукт формулы (I) про вл етс в виде пурпурного п тна. Про вленные пластины дл тонкослойной хроматографии могут быть также покрыты агар-агаром, в который помещены культуры Bacillus subtllis или Staphylococcus aureus, к которым добавл ют 2,3,5-трифенил-2Н-тетразо- лилхлорида (моногидрат), и инкубируют при 37°С в течение 16 ч дл визуализации антибиотика (белые п тна на розоватом фоне).
Крупномасштабный эксперимент в больших емкост х дл ферментации осуществл ют посредством получени продукта в колбах дл встр хивани , содержащих 0,7л среды С1 или-IDY ТТ. Инокулум из указанных колб ферментируют в течение 5-7°сут при 28°С и используют полученный иноку- лум дл инокулировани емкостей дл фер- ментации объемом 200 или 6000 л, содержащих 100 или 4000 л среды UKI-2 соответственно. Примерно 1 л инокулума используют дл инокул ции каждой емкости . После ферментации в течение 7-10 сут получают готовый продукт.
Весь питательный бульон в меньших по размеру ферментаторах экстрагируют 50 л метилизобутилкетона при имеющемс рН, Органический экстракт концентрируют в вакууме в циклон-аппарате и вакуумном испарителе с получением масла. 1у1асло затем дважды хроматографируют на колонке с силикагелем (гексан). В первой колонке элюи- рование осуществл ют этилацетатом, а во второй - смесью 1:1 хлороформ - ацетон. Фракции, содержащие продукт, идентифицируют тонкослойной хроматографией с использованием описанного выше способа. Активные фракции после второй колонки с силикагелем вновь хроматографируют на флорисиле, использу дл элюировани смесь хлороформа и метанола 19:1. Фракции , содержащие продукт, объедин ют, встр хивают с разбавленной фосфорной
кислотой, затем с двухосновным фосфатным буфером дл получени соли натри , сушат над сульфатом натри , разгон ют и кристаллизуют остаток из эфира, получа в
результате соль натри соединени формулы (I) в количестве 915 кг, температура плавлени 245-2490С,.(альфа),0 (, метанол).
Результаты анализа из расчета на
C45H 70idNa.
Рассчитано. %: С 62,47; Н 8,97, Найдено, %: С 62,89; Н 9,22. Спектр ЯМР-С-13 (хим. сдвиги в м.д, в дейтерохлороформе с указанием числа
атомов водорода данного типа): 182,8-ОН. 110,0-ОН, 106,0-ОН; 99,1-IH; 87.2-1H; 86,9- ОН; 86,2-1 Н; 86,2-ОН; 84,8-1 Н; 83,4-ЧЖ; 82,6-1 Н; 80,2-1 Н; 78,6-1 Н; 75,2-1 Н; 74,8-1 Н; 74,6-1 Н; 66,4-1 Н; 60,3-ЗН; 57,9-ЗН; 56,9-ЗН;
44,5-1 Н; 39,0-1 Н; 36,9-1 Н; 36,8-2Н; 25.9-2Н;
35.4-2Н; 35.2-2Н; 35,1-1 Н; 35,0-1Н; 31,3-2Н;
30.9-2Н; 30,5-1 Н; 28,2-ЗН; 27.1-2Н; 26.1-2Н;
25,0-ЗН; 21,0-ЗН; 18,3-ЗН; 16,7-ЗН; 15,3-ЗН;
13,4-ЗН; 13,1-ЗН; 11.2-2Н; 10,7-ЗН; 10,6-ЗН.
Работа с использованием больших фер- ментизационных емкостей проводитс с экстрагированием всего питательного бульона (примерно 4000 л) 1800 л метилизобутилкетона , отделением растворител в экстракторе Подбельн ка и концентрирова- нием в вакууме с удалением растворител и получением сиропообразной массы. Концентрат дважды растирают с равным объемом неразбавленного метанола, отдел ют нерастворимое в метаноле масло, а мета- нольную фракцию концентрируют в вакууме с -получением сиропообразной массы. Указанную массу дважды экстрагируют гексаном , а объединенные экстракты в гексане - ацетонитрилом. Ацетонитрильную фракцию сохран ют дл дальнейшего извлечени продукта. Гексан концентрируют в вакууме и хроматографируют на колонке с силикагелем по част м. Продукт десорбируют из си- ликагел на воронку с фильтром вначале гексаном, затем хлористым метиленом, этилацетатом , и наконец ацетоном, Активные фракции, которые содержатс , в элюатах в
хлористом метилене и этилацетате, раствор ют в гексане и промывают подкисленной водой, после чего экстрагируют 1%-ным раствором N-метил-О-глюкамина в воде. Водную фазу подсаливают хлоридом натри
и экстрагируют 2 равными по объему порци ми этилацетата. Органические слои объедин ют , обрабатывают активированным углем, фильтруют, промывают фосфатным буфером с рН 9,0, сушат над сульфатом натри , кон центрируют в вакууме и кристаллизуют из эфира, получа 50,8 г соли натри , идентичной с продуктом, полученным в результате менее масштабной ферментации.
Пример 2. Соединение формулы (I) в форме свободной кислоты.
Соединение формулы (I), Обладающее свойствами антибиотика в форме свободной кислоты, получают в результате интен-- сивного встр хивани в делительной коронке раствора соли натри в хлороформе с равными объемами сол ной кислоты при рН 2. Фазы раздел ют, промывают фазу хлороформа водой и разгон ют в вакууме, получа свободную кислоту, имеющую тем- пературу плавлени 87-90°С (альфа) 6,9°С(, метанол).
Результаты анализа из расчета на 0,5 НаО.
Рассчитано, %: С 63,48; Н 9,34.
Найдено, %: С 63,35; Н 9,53.
Пример 3. Соединение формулы (I) (соль натри ).
Свободную кислоту, полученную в предшествующем примере (45 мг), раствор ют в 100 мл хлороформа. К раствору добавл ют раствор карбоната натри (0,5 г) в воде (100 мл) и Помещают полученную смесь в делительную воронку, после чего интенсивно встр хивают в течение нескольких минут. Слой в хлороформе раздел ют, а водный слой промывают свежим хлороформом. Объединенные экстракты в хлороформе сушат над сульфатом натри , фильтруют и разгон ют в вакууме, получа 41 мг соли натри , температура плавлени 230-235°С.
Результаты анализа из расчета на
C45H770l/jNa. .
Рассчитано, %: С 62,47, Н 8,97.
Найдено, %: С 62,20; Н 9,14.
хОМе Me
заключающийс в том, что осуществл ют глубинное культивирование штамма Actinomaclura sp. ATCC 53708 в услови х аэрации и перемешивани в питательной среде, содержащей источкики углерода, азота и минеральные соли, с последующей
Пример 4. Соединение формулы (I) (соль рубиди ).
Дл получени соли рубиди соединени формулы (I) 30 мг свободной кислоты раствор ют в 50 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавл ют раствор 35 мг карбоната рубиди в 251ил воды и перемешивают полученную смесь в течение 2 ч. Органическую фазу отдел ют и экстрагируют водный слой равным объемом хлороформа . Объединенные экстракты в хлороформе разгон ют, получа твердый белый остаток. Соль рубиди перекристаллизовывают в результате медленного испарени из эфира и определ ют структуру полученных кристаллов методом рентгеноструктурного анализа (д-р Дж. Бординер).;
Пример 5; Соединение формулы (I) (соль кали ).
Дл получени соли кали соединени формулы (I) 130 мг свободной кислоты раствор ют в 100 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавл ют раствор 100 мг карбоната кали в 100 мл воды и перемешивают полученную смесь в течение нескольких минут , после чего помещают ее в делительную воронку и интенсивно встр хивают в течение нескольких минут. Органическую фазу отдел ют и разгрн ют в вакууме, получа соединение формулы (I) в виде белого порошка, температура 255-260°С, (аль- фа),6° (, хлороформ).
Результаты анализа из расчета на
С45Н77Р14К.
Рассчитано, %: С 61,34, Н 8,81. Найдено, %: С 60,91, Н 8,83.
Формул а изобретени
Способ получени антибиотика формуэкстракцией органическим растворителем всей культуральной жидкости или отфильтрованного мицели и выделением целевого продукта, который при необходимости перевод т в фармацевтически приемлемую щелочно-металлическую соль.
Исследовани in vitro антибактериальной активности соединени формулы (I)
Редактор Л.Волкова
Техред М.Моргентал
Заказ 1394Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., 4/5
Корректор П.Гереши
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904830753A RU1808007C (ru) | 1988-02-08 | 1990-08-07 | Способ получени антибиотика |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/US1988/000358 WO1989006963A1 (en) | 1988-02-08 | 1988-02-08 | Acidic polycyclic ether antibiotic having anticoccidial and growth promotant activity |
SU904830753A RU1808007C (ru) | 1988-02-08 | 1990-08-07 | Способ получени антибиотика |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1808007C true RU1808007C (ru) | 1993-04-07 |
Family
ID=26666235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904830753A RU1808007C (ru) | 1988-02-08 | 1990-08-07 | Способ получени антибиотика |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1808007C (ru) |
-
1990
- 1990-08-07 RU SU904830753A patent/RU1808007C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Аналогов в научно-технической и патентной литературе не вы влено. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0132082B1 (en) | Antibiotic/antitumor compounds and their production | |
US4407946A (en) | Process for producing antibiotic X-14868A | |
EP0185456A2 (en) | CL-1577D and CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use | |
FI92411C (fi) | Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi | |
US4543334A (en) | Streptomyces capable of producing neutral macrolide antibacterial agents | |
RU1808007C (ru) | Способ получени антибиотика | |
CA1340204C (en) | Microbiological process for making uk-61,689 and microorganisms useful therefor | |
US5064855A (en) | Acid polycyclic ether antibiotic | |
US4908316A (en) | Streptomyces sp. N664-30 which produces an ionophore antibacterial agent | |
JPS6235755B2 (ru) | ||
US4751317A (en) | Inophore antibacterial agent from streptomyces | |
CA1198386A (en) | ANTIBACTERIAL AGENTS LL-C23024.beta. AND IOTA AND MICROORGANISM ACTINOMADURA YUMAENSE NRRL 12515 | |
US5418152A (en) | Acidic polycyclic ether antibiotic | |
US4920050A (en) | Acidic polycyclic ether antibiotic | |
US5478735A (en) | Process for producing acidic polycyclic ether antibiotic having anticoccidial and growth promant activity with Actinomadura | |
HU189578B (en) | Process for preparing narasin | |
DK145581B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum c-14919-e-1 og-e-2 | |
WO1990007510A1 (en) | Polyether antibiotic mi215-nf3, production thereof, and drug for treating fowl coccidiosis | |
CA2033483A1 (en) | Polyether antibiotic mi215-nf3 substance, production process thereof, and agent for control of chicken coccidiosis |