DK145581B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum c-14919-e-1 og-e-2 - Google Patents

Description

1 145581

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil ukendte antibiotika betegnet antibiotikum C-14919-E-1 og -E-2.

Ved indsamling af bl.a. jordprøver og undersøgelse af de fra disse prøver isolerede mikroorganismer for antibiotika har det vist sig, at mikroorganismer tilhørende en hidtil ukendt art af slægten Nocardia ved dyrkning i et egnet næringsmedium er i stand til at danne ovennævnte hidtil ukendte antibiotika.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker en mikroorganisme, som hører til den art, hvortil stammen Nocardia nr. C-14919 hører, i et dyrkningsmedium og udvinder det dannede antibiotikum C-14919-E-1 og/eller -E-2 fra dyrkningsmediet og, om ønsket, omdanner det dannede antibiotikum C-14919-E-2 til antibiotikumet C-14919-E-1 ved at underkaste antibiotikumet C-14919-E-2 en oxidation.

Mikroorganismen Nocardia C-14919 (IFO 13723), som er isoleret, er en af de foretrukne mikroorganismer, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

A) Mikrobiologiske karakteristika af stamme nr. C-14919.

De mikrobiologiske karakteristika af stamme nr. C-14919 blev undersøgt analogt med fremgangsmåderne ifølge Schirling & Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology lf[, 313-340 (1966)). Resultaterne af dyrkning ved 28°C i 21 dage er som følger: 1) Morfologiske karakteristika.

Det vegetative mycelium er veludviklet og forgrenet både på agar og i flydende medier. Mange af hyferne måler 0,8 til 1,2 ym i diameter, og hyferne er fragmenterede afhængigt af dyrkningsbetingelserne.

2 145581

Stammen giver god -vækst på forskellige taksonomiske medier, med luftmyceliet ovenpå det vegetative mycelium, idet den danner coremialig-nende legemer (50-200 /«/m x 200-1500/im), hvorpå luft væksten finder sted. Mange af luftmycelierne er tugtede eller lige, og en løs spirallignende form findes ved enkelte lejligheder. Mikroskopisk undersøgelse af ældre kulturer viser, at den konidielignende form kun i få tilfælde optræder i kæder, medens cellesuspensionerne, der opnås fra overfladen af sådanne kulturer, ved iagttagelse under mikroskop, ses at indeholde forlængede ellipsoide (0,8-1,2 x 357-6>7/^m) og ellipsoide (0,8 x 1,2 x 1,0-2,0 ^m) legemer, der ligner konidier.

Elektronmikroskopiske undersøgelser viser, at disse legemer har glatte overflader.

2) Celletestanddelene.

Stammen tlev inokkuleret i et modificeret ISP nr. 1 medium og dyrket ved 28°C i 66 til 90 timer under omrystning, hvorefter cellerne tlev opsamlet og skyllet. Ved metoden ifølge B. Becker et al. (Applied Microtiology 12, 421 (1964)) og metoden ifølge M.P. lechevalier et al. (Journal of Latoratory and Clinical Medicine 71¾ 934 (1968)) tlev de ovennævnte celler undersøgt for diaminopimelinsyre og sukkersammensætning. Pø r s tnævnte viste sig at være meso-formen, og der fandtes pletter, som svarede til galactose og aratinose.

3) Karakteristika på taksonomiske medier.

Stammen giver forholdsvis god vækst på forskellige medier, idet det vegetative mycelium er farveløst til tleggult i de indledende dyrkningsfaser og lyst gultrunt til gultrunt i de senere faser. Endvidere dannes der i det væsentlige ingen opløselige pigmenter i de taksonomiske medier, der anvendes til den foreliggende stamme. Luftmyceliet er pulveragtigt og vokser moderat, og det er hvidt til gult eller lyst gultrunt.

Stammens karakteristika i forskellige taksonomiske medier er angivet i tatel 1.

3 145581 gabel 1.

Dyrknings karakteristika af stamme nr. C-14-919 på taksonomiske medier.

(A) Sucrose-nitrat-agar Vækst (G): Dårlig, farveløs til lysegul

Luftmycelium (AM): Intet

Opløseligt Intet pigment (SP): (B) Glycerol-nitrat-agar G: Dårlig, farveløs til lysegul; coremialignen- legemer dannes.

AM: Sparsomt, "Lt Ivory" (2ca) SP: Intet (C) Glucose-asparagin-agar G: Moderat, farveløs til "Brite Yellow" (3na); coremialignende legemer dannes.

AM: Sparsomt, hvidt til "Lt Ivory" (2ca) SP: Intet (D) Glycerol-asparagin-agar G: Moderat, hvid til lys orangegul; coremia lignende legemer dannes.

AM: Sparsomt, "Lt. Ivory" (2ca) SP: Intet (E) Stivelsesagar G: Moderat, "Lt Ivory" (2ca) til "Lt.Wheat" (2ea); coremialignende legemer dannes.

AM: Eigeligt, "Lt Ivory” (2ca) SP: Intet (P) Næringsagar G: Moderat, "Colonial Yellow" (2ga) til "Brite Maize" (31a); coremialignende legemer dannes.

AM: Moderat, hvidt til "Pearl Pink" (3ca) SP: Intet 4 145581 /\ / \ (G) Calciummalatagar G: Moderat, lysegul til "Colonial Yellow" (2ga); coremialignende legemer dannes AM: Moderat, lysegult til gult SP: Intet

Andre karakteristika: calciumopløsende (H) Gærekstrakt-maltekstrakt-agar G: Moderat, "Amber" (3nc) ; coremialignende legemer dannes.

AM: Moderat, lividt SP: Intet

Cl) Havremelagar G: Moderat, "Amber" (3nc) til "Brite Yellow" (3na) ; coremialignende legemer dannes.

AM: Mo derat, lys egult SP: Intet (J) Tyrosinagar G: Moderat, "Amber" (31c) ; coremialignende legemer dannes.

AM: Sparsomt, lysegult SP: Intet (K) Kartoffelflager G: Moderat, "Lt Amber" (3ic) ; coremialignende legemer dannes.

AM: Intet SP: Plagerne bliver blegt gulligbrune (I) Pepton-gasrekstrakt-^em-agar G: Moderat, lys gulbrun til lys orangegul AM: Intet SP: Intet

Parvekodeme svarer til Color Harmony Manual, 4th ed. (Container Corporation of America, 1958).

5 145581 4) fysiologiske karakteristika.

De fysiologiske karakteristika af stammen er vist i tabel 2. Tempera-tur område for vækst: 12 til 38°C. Temperaturområdet, hvori der optræder god luftmyceliumvækst på agar (ISP nr. 2) er 20 til 32°C.

Tabel 2. De fysiologiske karakteristika af stamme nr. C-14919·

Temperaturområde for vækst: 12-38°0

Temperaturområde for sporulation: 20-28°C

Gelatinesmeltning: Positiv

Hydrolyse af stivelse: Positiv

Reduktion af nitrater: Positiv

Peptonisering af mælk: Positiv

Koagulering af mælk: Tvivlsom positiv

Dekomposition af kasein: Positiv

Produktion af melanoide pigmenter:

Negativ (pepton-gærekstrakt-jem-agar)

Negativ (tyrosinagar)

Dekomposition af tyrosin: Positiv

Dekomposition af xanthin: Negativ

Dekomposition af hypoxanthin: Negativ

Tolerance overfor lysozym: Positiv

Tolerance overfor natriumchlorid: 2% 5) Udnyttelse af forskellige carbonkilder.

Udnyttelsen af forskellige carbonkilder undersøgtes under anvendelse af et medium beskrevet af Pridham og Gottlieb (Journal of Bacteriology 107 (1948)). Det resulterende spektrum er vist i tabel 3·

Tabel 3« Udnyttelsen af carbonkilder af stamme nr. C-14919·

Carbonkilde Vækst Carbonkilde Vækst D-Xylose + Raffinose i 1-Arabinose - Melibiose + D-Glucose ++ i-Inositol D-Galactose ++ D-Sorbitol 6 145581

Tabel 3 forts.

Carbonkilde Vækst Carbonkilde Vækst D-Fructose +++ D-Mannitol + L-Rhamnose i Glycerol + D-Mannose + Opløselig stivelse +

Sucrose ++ Kontrol lactose -

Maltose -

Trehalose +

Fodnote: +++: Frodig vækst ++: God vækst +: Vækst Dårlig vækst -: Ingen vækst 6) Indre karakteristika.

Cellerne samles ved den tidligere i 2) beskrevne fremgangsmåde» og DM'et isoleres analogt med fremgangsmåden ifølge J. Murmar et al. (Journal of Molecular Biology, vol. 3, 208, 1961). G-C-Indholdet i DM'et viser sig at være ca. 71 molprocent.

Gram-farvning af denne stammes vegetative mycelium giver en positiv reaktion.

De ovenstående karakteristika af stamme nr. C-14-919 sammenlignes med beskrivelserne i S.A. Waksman's "The Actinomycetes Vol. 2" (The Williams and Wilkins Co., 1961); R.E. Buchanan og E.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed.", 1974-,og anoden litteratur. Da denne stamme formodes at tilhøre gruppe III i slægten Docardia, og da man ikke fandt arter med de hidtil beskrevne karakteristika blandt de kendte arter, konkluderede man, at det var en ny mikroorganisme art.

Den foreliggende stamme nr. C-14-919 er deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Japan,under FERM-P nr. 3991; hos Institute for Fermentation,

Osaka (IFO), Japan, under accessionsnummeret IFO 13723 eg hos The 7 145581

American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A., under accessionsnummeret ATCC 31280.

Stamme nr. C-14919, der som netop nævnt er en ny art af slægten Nocardia, er, ligesom mikroorganismer generelt, tilbøjelig til at undergå variationer og mutationer, enten spontant eller under påvirkning af et mutagen. De varianter af stammen, der er opnåelige ved bestråling af forældrene med røntgenstråler, gammastråler, ultraviolet lys og lign. ved enkelcelleisolation, ved dyrkning på medier indeholdende forskellige kemikalier eller ved andre mutagene behandlinger, såvel som de mutanter, der opnås spontant fra for-ældrestammen, og hvis egenskaber i det væsentlige ikke afviger fra ovennævnte karakteristika, og som stadig er i stand til at udvikle C-14919-E-1 og/eller -E-2 uforandret, kan udnyttes i den omhandlede fremgangsmåde. Hvis stamme nr. C-14919 eksempelvis underkastes forskellige mutagene behandlinger, dannes mutanter, der producerer opløselige pigmenter fra lysegule til lys gulbrune eller brune, mutanter, hvis substratmycelier er farveløse eller gulliggrønne eller orangerøde, mutanter, der producerer rigeligt hvidt mycelium eller slet intet mycelium, eller mutanter, hvis hyfer er tilbøjelige til fragmentering.

Dyrkningsmediet, der anvendes i praksis i den foreliggende fremgangsmåde, kan være ethvert flydende eller fast medium, hvis det blot indeholder næringsstoffer, som stammen kan udnytte, skønt et flydende medium er foretrukket til stor-produktion. Mediet skal indeholde carbon- og nitrogenkilder, som stamme nr. C-14919 kan assimilere og fordøje, uorganisk stof og spornæringsstoffer. Som eksempler på disse carbonkilder kan nævnes glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, stivelse, glycerol, mannitol, sorbitol og fedtstoffer og olier (f.eks. sojabønneolie, svinefedt og kyllingefedt). Nitrogenkilderne kan f.eks. være kødekstrakt, gærekstrakt, tørgær, sojabønnemel, majsstøbevand, pepton, bomuldsfrømel, udnyttet melasse, urinstof og ammoniumsalte (f.eks. ammoniumsulfat, ammoniumchlorid, ammoniumnitrat og ammoniumacetat). Mediet kan yderligere indeholde salte af natrium, kalium, calcium, magnesium og lign., metalsalte af jern, mangan, zink, cobalt, nikkel og lign. og salte af organiske syrer, såsom acetater og propionater. Endvidere kan mediet indeholde forskellige tilsatte aminosyrer (f.eks. glutaminsyre, asparaginsyre, 8 145581 alanin, lys in, methionin og prolin), peptider (f.eks. dipeptider og tripeptider), vitaminer (f.eks. B-^, B2, nicotinsyre, B-^ og C) og nucleinsyrer (f.eks. purin, pyrimidin og de tilsvarende derivater). Til indstilling af mediets pH-værdi kan der tilsættes en uorganisk eller organisk syre, en alkali, en puffer eller lignende. Passende mængder olier og fedstoffer, overfladeaktive stoffer og lign. kan også tilsættes som antiskummidler.

Dyrkningen kan gennemføres stationært, under omrystning, aerolit sub-merst og ved andre dyrkningsmetoder.Til stor-produktion foretrækkes selvfølgelig submers aerob dyrkning. Medens dyrkningsbetin-gelserne naturligvis afhænger af mediets tilstand og sammensætning, den anvendte stamme, dyrkningsmetoden og andre faktorer, foretrækkes det normalt at udføre inkubationen ved 20 til 32°0 med et begyndel-ses-pH nær neutralpunktet. Særlig ønskelig er en temperatur på 23 til 26°C i et mellemliggende dyrkningstrin med et hegyndelses-pH på 6,0 til Da inkubationstiden også er variabel alt efter de nævnte faktorer, er det tilrådeligt at fortsætte inkubationen, indtil titeren af det ønskede antibiotiske produkt er maksimal. I tilfælde af dyrkning under omrystning eller aerob submers dyrkning i flydende medium. er den nødvendige tid normalt fra ca. 72 til 192 timer.

Det egnede pH til produktion af antibiotikaerne er nær neutralpunktet, idet det optimale område er pH 6,5 til pH 7»0. Udbyttet kan forøges ved at indstille mediets pH vinder dyrkningen, ved tilsætning af en syre eller en alkali eller ved at vælge en egnet mediumsammensætning. Således forøges udbyttet af antibiotikaerne betydeligt, når en af mediets bestanddele, de uorganiske phosphater, tilsættes i større mængde end nødvendigt til stammens vækst, d.v.s. 1000 til y000 ppm., eller når visse assimilerbare kulhydrater, der let danner syrer, f.eks. glucose og mannitol, anvendes som carbonkilder, og der udvælges passende nitrogenkilder.

Antibiotikaerne C-14919-E-1 og -E-2, der således udvikles af den foreliggende stamme, optræder normalt ekstracellulært, men der er tilfælde, hvori cellerne indeholder ca. 10-30% af det totale antibiotikaudbytte. Styrkebestemmelsen af de antibiotiske midler kan udføres ved cylindermetoden eller papirdiscmetoden, under anvendelse af Candida albicans IE0 0583 som testorganisme og TSA (Trypticase- 9 145581 soja-agar, BBL) som testmedium.

Antibiotikaerne optræder både i filtratet og i cellerne,der kan opnås fra den dyrkede næringsvæske. Således filtreres eller centrifugeres næringsvæsken til udvinding af cellerne og filtratet eller supernatan-ten hver for sig. Styrken i filtratet testes direkte og i cellerne, efter at disse er omrørt med det samme volumen 70%'s acetone-vand som filtratet ved 20°C i en time. Testmetoden er en af de ovenfor beskrevne, og testorganismen er Candida albicans.

Da C-14-919-E-1 og -E-2,som produceres i fermentationsnæringsvæsken er lipofile og neutrale stoffer, kan de nemt udvindes ved de adskillelses- og rensningsmetoder, der normalt 'anvendes til 'udvinding af sådanne mikrobielle metaboliter. Der kan f.eks. anvendes en metode, som udnytter forskellen i opløselighed mellem antibiotikumet og urenheden, et middel, der udnytter forskellen i adsorptiv affinitet mellem antibiotikumet og urenheden til forskellige adsorbenser, såsom aktivt kul, makroporøse ikke-ioniske harpikser, silicagel og aluminiumoxid, eller en metode til fjernelse af urenhederne ved hjælp af ionbytterharpikser. Disse metoder kan anvendes enkeltvis, i passende kombinationer eller anvendes flere gange. Da C-14-919-E-1 og -E-2 som førnævnt optræder i både filtratet og cellerne,kan enhver af de følgende metoder anvendes.(1) Den dyrkede næringsvæske som sådan ekstraheres inden fraskillelse af cellerne med et opløsningsmiddel eller (2) cellerne og filtratet eller supematanten, der opnås ved filtrering eller centrifugering, ekstraheres hver for sig med opløsningsmidler.

Når cellerne og filtratet ekstraheres hver for sig, kan følgende metode med fordel anvendes. Som egnede opløsningsmidler til ekstraktion fra filtratet kan nævnes organiske opløsningsmidler, der er ikke-blandbare med vand, såsom fedtsyreestere, f.eks. ethylacetat og amylacetat; alkoholer, f.eks. butanol; halogenerede carbonhydrider, f.eks. chloroform,og ketoner, f.eks. methylisobutylketon. Ekstraktionen udføres i nærheden af neutralpunktet og udføres fortrinsvis med etbylacetat fra næringsvæsken, der forinden er indstillet til pH 7·

Efter at ekstrakten er vasket med vand og koncentreret, opnås C-14-919-E-2 som rå krystaller. Filtratet, der er tilbage efter fra-'· skillelse af disse rå krystaller, er rigt på E-l.

10 145581

Ekstraktionen fra cellerne kan udføres under anvendelse af en blanding af vand og et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom en blanding af vand og en lavere alkohol (f.eks. methanol eller ethanol) eller en blanding af vand og en keton (f.eks. acetone eller methylethylketon.) eller ved hjælp af et med vand ikke-bland-bart organisk opløsningsmiddel, såsom et halogeneret carbonhydrid (f.eks. methylendichlorid). Det er imidlertid fordelagtigt at anvende 70%' s acetone-vand. Således genfortyndes cellerne med det samme volumen 70%'s acetone-vand som det tilsvarende filtrat, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 3 timer. Yed denne fremgangsmåde ekstra-heres alt det C-14-919-E-1 og -E-2, der findes i cellerne.

Opløsningsmiddelekstrakterne samles,og opløsningsmidlet, f.eks. acetone, fjernes under reduceret tryk. Den vandige opløsning ekstra-heres med ethylacetat ligesom filtratet,og opløsningsmiddellaget vaskes med vand og koncentreres under reduceret tryk. fil koncentratet sættes hexan eller lignende til fældning af de aktive komponenter.

En blanding af C-14919-E-1 og -E-2 kan således opnås ved centrifugering eller filtrering. Adskillelse af blandingen i komponenterne kan udføres ved adsorptionskromatografi på forskellige adsorbenser. Til dette formål kan anvendes forskellige bærere, der almindeligvis anvendes til adsorption af antibiotiske stoffer. E.eks. kan nævnes adsorberende harpikser, silicagel og aluminiumoxid. Til eluering af antibiotikaerne fra sådanne adsorberende harpikser gøres der brug af en blanding af vand og et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom- en lavere alkohol eller lavere keton. Som lavere alkohol kan nævnes methanol, ethanol, propanol og butanol, og den lavere keton kan f.eks. være acetone eller methylethylketon. Estere, såsom ethylacetat, kan også anvendes. En typisk fremgangsmåde kan være som følger: Råproduktet opløses i 4-0%'s methanol-vand og adsorberes på en søjle af "Diaion HP-10", som er en porøs styren-divinylbenzen-copolymer uden funktionelle grupper og med hydrofob overfladekarakter. Søjlen vaskes først med 40%'s methanol-vand, og elueringen udføres derefter med 60%1 s methanol-vand, hvorved C-14919-E-2-fraktio-nen opnås. Eluering med 90%'s methanol-vand giver C-14919-E-l-frak-tionen. Hver fraktion koncentreres under reduceret tryk og henstår efter tilsætning af methanol. Denne fremgangsmåde giver krystaller af C-14919-E-1 og krystaller af C-14919-E-2 fra de tilsvarende fraktioner. Hvis silicagel anvendes som adsorbent, kan elueringen startes under anvendelse af et ikke-polært opløsningsmiddel med gradvis 11 U 5581 tilsætning af et polært opløsningsmiddel/ f.eks. methanol, hvorved C-14919-E-1 og -E-2 elueres. Krystallerne af C-14919-E-1 omkrystalliseres fra ethylacetat, methanol, vandig methanol eller lignende, og C-14919-E-2 kan også omkrystalliseres fra lignende opløsningsmidler.

C-14919-E-1 og -E-2, der således kan opnås, kan omdannes til hinanden ved reversibel oxidationsreduktion. Således giver reduktion af C-14919-E-1 med et reduktionsmiddel (f.eks. et hydrosulfit, ascorbin-syre, NaBH^ og zink med eddikesyre) C-14919-E-2, medens oxidation af 0-14919-E-2 med et oxidationsmiddel (f.eks. ferrichlorid, salpetersyre, AgOg, MnOg og luft) .giver C-14919-E-1.

De fysiske og kemiske egenskaber af de nye antibiotika C-14919-E-1-og -E-2-krystaller, der opnås på den ovennævnte måde,er som følger (tabel 4).

Tabel 4. --- _C-14919-E-1__0-14919-E-2_ 1) Smp. 187°C (dekomp.) 148°C (dekomp.) 2) Udseende Gule krystaller Bleggule.krystaller (nåle eller prismer) (nåle eller prismer) 3) Opløselig- Uopløseligt i: Uopløseligt i: hed petroleumsether, petroleumsether, hexan, vand. hexan.

Tungtopløseligt i: Tungtopløseligt i: diethylether, diethylether, benzen, benzen, vand, chloroform.

Opløseligt i: Opløseligt i: ethylacetat, ethylacetat, butanol, chloroform, butanol, methylisobutylketon, metbylisobutylketon, ethanol, acetone, ethanol, acetone, . methanol, methanol.

Letopløseligt i: Letopløseligt i: dimethylsulfoxid dimethylsulfoxid 4) Surt, neutralt eller Et neutralt stof Et neutralt stof basisk _12 _ 1 AS 581 (Dabei 4 forts.__C-14919-E-1__0-14919-33-2_ 5) Elementær- G 65,31, 65,05, 64,85 C 62,32, 62,07 analyse % H ?j58j 7,62 H 8,58, 8,43 3ST 5,01, 4,95, 5,01 N 4,82, 4,78 O 21,37, 22,83, 22,45 O 20,81, 20,81 6) Empirisk ^30-32^42-48^2^8-9 ^30-32^44-50^2^8-9#x^2^ i orme1 7) Ultraviolet absorptionsspektrum ^ Me0H-M01(9:1) (nm) (E^) max 274(455), 240(sb), 255(295) 397(43) 308(sb) λΗβ0Η(ι»)(Ε« ) max lem/ 274(455), 240(sb), 255(290) 397(43) e 308(sb) i MeOH*MaOH(9:1) (nm) (E^ ) 'max 236(585), 265(500), 236(505), 265(420), 550(56) 550(50) 8) Infrarødt Eig. 1 Eig. 2 , absorptions- Dominerende toppe Dominerende toppe (cm” )

spektrum / -L

(KBr) (cm > 3430, 3340, 2950, 3480, 3250, 2980, 1685, 2910, 1740, 1692, 1625, 1598, 1472, 1390, 1660, 1645, 1605, 1370, 1315, 1207, 1090, I5OO, 1375, 1315, 1065, 1042, 1030 1120, 1100, 1085, 1060, 1025 9) SaK£ing [“1§5° - 350° ± 10“ ♦ 62° ± 4° (c = 0,5, methanol) (c = 0,5, methanol) 10) Earve- ffegativ: Negativ: reaktio- ainbydr inr e akt i on, ninhydrinr eaktion, ner Ehrlichreaktion, Ehr lichr e aktion, peptidreaktion, peptidreaktion og magne s iumac etatre a- magnesiumacetatreagens gens og 1%'s jern- Pn_·.

chlorid-1%’ s ferri- ±Osrcxv.

cyanid-(l:l)-reagens 1%'s jemchlorid-1%'s ferri- cyanid-(l:l)-reagens (blåt) 13 145581

Tabel 4 forts. _0-14919-E-l__C-149l9~E-2_ 10) Farve- Kaliumpermanganatreagens, Kaliumpermanganatreagens, reaktio- affarvet affarvet ner___

Antal Antal 11) Nuclear- pro- <f pro- magnetisk (ppm) J(Hz) toner (ppm) J(Hz) toner

s?ektSS~ °’63 d 6’3 3H °’63 d 7 3H

(100 MHz) 0,9^ cL 6,5 3H 0,82 d 7 3H

suSoxif1* °’96 4 6-5 3H °’89 4 7 5H

1.4 s 3H 1,16 s 3H

1,88 s 3H 1,55 m 1,4—

1,*8 m 1,83 s 3H

2,2- 2,1- 2,4· m 2,2 m 3,0- 3.2 m 2,65 m 3,23 s 3H 2,86 m

3.27 s 3H 3,13 s 3H

3,43 s 3H 3,24 s 3H

3.3 m 3,2 m

4.5 s IH 3,39 s 3H

5.21 d 10 IH 4-,54 d 5 IH

5.28 d IH 4,64 d 8 IH

5,59 dd 8,10 IH 5,02 d 8 IH

6.22 t 11 IH 5,21 d 10 IH

6,32 s (forsvin- IH 5,86 t 10 IH

tilsæt-^ 5,9δ s-lignende IH

ning af 6,23 s (forsvin- IH

DgO) der ved

6,41 d 2 IH SirS

6,81 d 2 IH H20) 6,95 a il ih 6,35 a 2,5 ih

9.3 s (forsvin- IH 6,45 d 2,5 IH

SaSins 7,51 - αΠΙ1η- IH

ai B2°) tSaSkg af D^O) 8,64- s (do.) IH ’

8,85 s (do.) .IH

__14 _145581

Tabel 4 forts. C-14919-E-1__C-14919-E-2__ 12) Stabilitet Stuetemperatur: Stuetemperatur: stabilt i neutrale stabilt under neutrale og svagt sure opløs- og svagt sure betingel- ainger; ser; ustabilt i basisk ustabilt under basiske opløsning. betingelser.

30°C, en time: ustabilt. 80°C, en time: ustabilt.

13) Tyndtlags-kromatogra-fi

Adsorbens:

Silicagel "Spot Pilm"

Chloroform-metbanol (9:1) 0,85 0,50

Chloroform- metbanol (19:1) 0,77 0,22

Ethylacetat- acetone (9:1) 0,80 0,50

Ethylacetat- - metbanol (9:1) 0,85 0,78 __i_.__

Antimikrobiel aktivitet.

De antimikrobielle aktiviteter af antibiotikaerne C-14919-E-1 og -E-2 blev testet ved seriefortyndingsmetoden under anvendelse af trypticase-soja-agar (BBL), gluc o senærings agar og glycerolnæringsagar som testmedier (tabel 5)· Desuden bestemtes aktiviteterne mod Tetrahymena pyriformis V ved seriefortyndingsmetoden under anvendelse af testmediet (20 g Proteose-pepton, 1 g gærekstrakt, 2 g glucose, 1000 ml destilleret vand, 10 ml 1 M phosphatpuffer (pH 7i0)).

Tabel 5·

Testorganisme I IFO nr. | ·°--^2-1=ί.[, Ρ-1^Βτ2,,Ζ

___moUx/xi) mo(/iK/mV

^Escherichia c o li- K-12 3301 >100 >100

Proteus vulgaris 3045 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa . 3080 >100 >100

Salmonella typhimurium 12529 >100 >100 15 145581

Tabel 5 forts.

C-14919-E-1 C-14919-E-2 .

Testorganisme_g0 M0( g/ml) MlCf e/,l) ålcaligenes faecalis ljlll > 100 100

Serratia marcescens 3046 > 100 > 100

Bacillus pumilus 3813 30 100

Bacillus subtilis 6633 3134 50 100

Bacillus subtilis PCI219 3513 100 > 100

Bacillus cereus 3514 >100 >100

Bacillus megaterium 12108 50 50

Bacillus brevis 3331 50 50

Staphylococcus aureus 209P 12732 >100 >100

Sarcina lutea 3232 50 50

Micrococcus flavus 3242 50 50

Candida albicans 0583 25 6,25 ** Candida tropicalis 1400 >100 >100

Candida pseudotropicalis 0617 100 100

Candida utilis 0619 > 100 > 100

Candida parapsilosis 1396 50 2$

Candida krusei 1395 >100 >100

Candida albicans 0583 50 25

Cryptococcus neoformans 0410 >100 >100

Saccharomyces cerevisiae 0209 100 100

Microsporum canis 7863 >100 > 100

Microsporum cookei 8303 > 100 > 100

Aspergillus niger 4066 100 100

Trychophyton rubrum 5^67 >100 >100

Hormodendrum pedrosoi 6071 > 100 > 100

Penicillium chrysogenum 4626 50 ' 25 *** Mycobacterium avium >100 >100

Mycobacterium phlei > 100 > 100 **** Tetrahymena pyriformis W 10 10

Podnote: Medium * Trypticase-sojaagar ** Glue osenærings agar * ** Glycerolnæringsagar * ** * Proteose-pepton-opløsning 16 145581

Toksicitet.

LD50 'bestemt ved intraperitoneal administrering af C-14919-E-1 og -E-2 i en akut-toksicitetstest under anvendelse af mus som forsøgsdyr, er som følger: C-14919-E-1 50-100 mg/kg C-14919-E-2 25-100 mg/kg

Som det kan ses af det antimikrobielle spektrum i tabel 5i viser C-14919-E-1 og -E-2 aktivitet mod gram-positive "bakterier, svampe og gærsvampe. Antibiotikaerne kan derfor anvendes som germicider eller desinfektionsmidler mod patogene "bakterier eller svampe af samme arter som testorganismerne.

Antitumoraktivitet.

Den terapeutiske aktivitet (intraperitonealt administreret i efter hinanden følgende dage) af C-14919-E-1 og -E-2 mod P388-leukemi hos g mus (1 x 10 celler/dyr, mus, intraperitonealt transplanteret) "blev undersøgt. Antitumoraktiviteten udtrykt som levetidsforøgelse var 144% ved en dosis på 5 mg/kg/dag.

Da antihiotikaerne 0-14919-E-l og -E-2 således har en levetidsforøgende virkning på tumorbærende pattedyr (f.eks. mus), forventes de at være nyttige som antitumormidler.

Ved formulering af det foreliggende antibiotikum 0-14919-E-l eller -E-2 i en vandig opløsning indeholdende 10 til lOO^g/ml vandig ethanol (f.eks. indeholdende 3% ethanol), kan det anvendes til desinfektion af fuglebure, laboratorieudstyr, bænder m.m.

De følgende eksempler skal yderligere belyse den omhandlede fremgangsmåde. I eksemplerne er dele vægtdele og procent vægtprocent, med mindre andet er angivet.

Eksempel 1.

Stamme ur.- 0-14919 (ATOO 51280, IEO 13723, EERM-P nr. 3991) inokule- 17 145581 res på tyrosinagarmedium og inkuberes derefter ved 28°C i 240 timer. Det veludviklede mycelium suspenderes i en 0,6%'s opløsning af natriumglut amat og opbevares i et køleskab. En portion på 1 volumendel af myceliesuspensionen anvendes til at inokulere en 2000 volumendeles fermentor indeholdende 500 volumendele af et podningskulturmedium (20 dele glucose, 5° dele opløselig stivelse, 10 dele majsstøbevand, 10 dele sojabønnemel, 5 dele pepton, 3 dele natrium-chlorid og 5 dele calciumcarbonat/1000 volumendele vand, pH 7,0).

Det inokulerede medium inkuberes i en frem- og tilbagegående rystemaskine ved 28°C i 48 timer. Denne kultur (500 volumendele) anvendes til inokulering af en 50000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 30000 volumendele af et podningskulturmedium. Dyrkningen af denne podningskultur udføres under de følgende betingelser: temperatur 28°C, tilførsel af 30000 volumendele luft pr. minut, 280 omdr./min.

(1/2 DT), indre tryk 1 kg/cm^, 48 timer. 10000 volumendele af den resulterende prekultur anvendes til podning af en 200000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 100000 volumendele af et fermentationsmedium (5% glycerol, 2% majsstøbevand, 2% gærekstrakt, 2% EiyPO^, 0,5% Mg012 og 0,1% OaCOj, pH 6,5), som er steriliseret. Den indledende fermentationsfase sammenføres under følgende betingelser: temperatur 28°0, tilførsel af 100000 volumendele luft pr. minut, 180 omdr./

O

min. (1/2 DT), indre tryk 1 kg/cm , 24 timer, hvorved mikroorganismerne vokser godt. Derefter udføres dyrkningen i yderligere 114 timer under de samme betingelser som ovenfor, bortset fra, at inkubationstemperaturen er 24°C og omrøringshastigheden 200 omdr./min. (1/2 DT). Derefter skilles myceliet fra filtratet ved filtrering. Filtratet indeholder 380^g/ml aktivt stof, medens titeren i myceliet er 90/«.g/ cellerne i en del af næringsvæsken. Styrkebestemmelserne udføres ved cylindermetoden eller papirdiscmetoden under anvendelse af Candida albicans IEO 0583 som testorganisme og C-14919-E-1 som standardtestmateriale.

Eksempel 2.

De i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåder gentages op til podningskulturtrinet. Derefter udføres dyrkningen i en 200000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 100000 volumendele af et fermentationsmedium (5$ mannitol, 3% tørgær, 0,5% MgC^ og 0,1% CaCO^, pH 6 5), som var steriliseret. Den indledende dyrkningsfase gennemføres ved 18 145581 26°C, tilledning af 100000 volumendele luft pr. minut, 180 omdr./min. (1/2 DT) og indre tryk 1 kg/cm i 18 timer. Derefter fortsættes dyrkningen i yderligere 106 timer ved 24°C og 200 omdr./min. (1/2 DT) og i øvrigt under de samme betingelser som ovenfor. Efter denne dyrkningstid er aktiviteten af filtratet 310^ g/ml og af cellerne 100/<;g/ cellerne i 1 ml næringsvæske.

Eksempel 3«

Den i eksempel 1 opnåede dyrkningsvæske (95000 volumendele) blandes godt med 2000 dele “Hyflo-Supercel". Blandingen filtreres på en filterpresse, hvorved der opnås 85000 volumendele filtrat og 31000 dele fugtige celler. Filtratet (85000 volumendele) ekstraberes med 30000 volumendele ethylacetat under omrøring, og denne fremgangsmåde gentages to gange. Ethylacetatlagene samles, vaskes to gange med 3OOO0 . volumendeles portioner vand, tørres ved tilsætning af 500 dele vandfrit natriumsulfat og koncentreres til 200 volumendele under reduceret tryk. Koncentratet henstår i kølerum, og de rå krystaller af C-14919-E-2 udvindes ved filtrering (8,2 dele). Filtratet koncentreres yderligere til 50 volumendele, efterfulgt af tilsætning af 300 volumendele petroleumsether. Det resulterende bundfald udvindes ved filtrering.

De resulterende rå krystaller (38 dele) opløses i 50 volumendele methanol, og efter tilsætning af 5 cLele silicagel (0,05-0,2 mm) destilleres methanolet af under reduceret tryk. Remanensen anbringes på toppen af en søjle af 500 volumendele silicagel (samme som ovenfor). Søjlen vaskes med 500 volumendele hexan, og elueringen udføres med 1000 volumendele hexan-ethy 1 acetat (1:1), 1000 volumendele ethylacetat og 1000 volumendele ethylacetat-methanol (30:1), idet eluatet opsamles i 100 volumendeles fraktioner.C-14919-E-1 elueres fra søjlen i fraktionerne nr. 13 til nr. 16, medens C-14919-E-2 elueres i fraktionerne nr. 21 til nr. 23· C-14919-E-1-fraktionerne (400 volumendele) samles og koncentreres og henstår efter tilsætning af 80%' s vandig methanol i kølerum. De resulterende krystaller opsamles ved filtrering. Denne fremgangsmåde giver 10 dele krystaller. C-14919-E-2-fraktionerne (300 volumendele) samles også, og de koncentreres til 100 volumendele og henstår i kølerum. Krystallerne opsamles og tørres. Ved denne fremgangsmåde opnås et udbytte på 6,8 dele C-14919-E-2-krystaller.

19 145581 31000 dele af de fugtige celler ekstraheres. særskilt to gange med 40000 volumendeles portioner af 70%'s acetone-vand, og de resulterende ekstrakter samles og koncentreres under reduceret tryk til fjernelse af acetonet. Den vandige ekstrakt fortyndes med vand til 30000 volu-mendele og sendes.gennem en forberedt søjle af 1000 volumendele "Diaion HP-10", hvorved den aktive komponent adsorberes. Søjlen vaskes med 2000 volumendele vand og 2000 volumendele 40%'s methanol-vand i den nævnte rækkefølge og elueres derefter med 2500 volumendele 60%' s -methanol-vand og 2500 volumendele 90%' s methanol-vand i den nævnte rækkefølge. Eluatet opsamles i 250 volumendeles fraktioner,og fraktionerne nr. 3 og 4 samles, koncentreres tinder reduceret tryk og henstår i kølerum. De resulterende rå krystaller af 0-14919-E-2 opsamles ved . filtrering og tørres (1,8 dele). Fraktionerne nr. 13, 14 og 15 samles, koncentreres under reduceret tryk og henstår efter tilsætning af 80%'s methanol-vand i kølerum. De resulterende rå krystaller af C-14919-E-1 opsamles ved filtrering og tørres (5,8 dele).

Eksempel 4.

Det i eksempel 3 opnåede filtrat (85000 volumendele) ekstraheres to gange med 30000 volumendeles portioner af ethylacetat som i eksempel 3, og ethylacetatlagene samles, vaskes med 30000 volumendele vand og koncentreres under reduceret tryk til 500 volumendele. Til koncentratet sættes 4000 volumendele methanol, efterfulgt af 4000'volumendele vand og 3000 volumendele hexan. Efter omrøring skilles det nederste lag fra. Til det nederste lag sættes en opløsning af 20 dele ferri-chlorid i 8000 volumendele vand, og under lejlighedsvis omrøring henstår blandingen ved stuetemperatur i 5 timer, hvorefter den afkøles.

De resulterende rå krystaller af C-14919-E-1 opsamles ved filtrering og tørres (18 dele). Filtratet ekstraheres yderligere med 5000 volumendele ethylacetat. Ethylacetatopløsningen vaskes med vand og koncentreres. Yed tilsætning af petroleumsether til koncentratet opnås 13 dele råt C-14919-E-1 som et pulver. Det rå pulver kromatograferes som i eksempel 3 på en søjle (2000 volumendele) af silicagel (0,05 til 0,2 mm) under anvendelse af de nævnte opløsningsmidler. Yed den ovennævnte fremgangsmåde opnås 7,2 dele rå C-14919-E-l-krystaller.

20 145581

Eksempel 5« C-14919-E-l-krystaller (0,400 dele), der opnås i eksempel 3 og 4 opløses i 40 volumendele ethylacetat, og i en 100 volumendeles skilletragt tilsættes 30 volumendele vand. Derefter omrystes opløsningen intenst med 0,500 dele natriumhydrosulfit (NagSgO^). Blandingen henstår, og det nederste lag kasseres. Derefter omrystes det øverste lag godt med 30 volumendele vand og 0,500 dele natriumhydrosulfit .Det nederste lag kasseres,og ethylacetatlaget vaskes godt med vand og tørres ved tilsætning af vandfrit natriumsulfat. Efter tørring koncentreres ethylacetatlaget til tørhed under reduceret tryk ved lav temperatur. Remanensen opløses ved tilsætning af 10 volumendele methanol og filtreres. Efter tilsætning af 40 volumendele vand henstår filtratet i kølerum. De resulterende C-l4919-E-2-krystaller opsamles ved filtrering og tørres. Smp. 147-148°C (dekomp.).

Eksempel 6.

C-149l9-E-2-krystaller (0,400 dele), der opnås i eksempel 3? opløses i 60 volumendele methanol, hvorefter der tilsættes 32 volumendele af en 1%' s vandig opløsning af ferrichlorid. Blandingen henstår ved stuetemperatur i en time, og de resulterende C-14919-E-l-krystaller opsamles ved filtrering, vaskes med 20%'s methanol-vand og tørres. Smp. 186-187°0 (dekomp.).

Eksempel 7.

De rå krystaller af C-14919-E-1 (4 dele), der opnås ifølge eksempel 3» opløses i 600 volumendele methanol, og efter filtrering tilsættes 200 volumendele vand. Blandingen henstår i kølerum, og de resulterende rensede krystaller af C-14919-E-1 opsamles ved filtrering og tørres (2,8 dele). Smp. 187-188°C (dekomp.).

3,5 cLele af de rå C-14919-E-2-krystaller, der opnås ved fremgangsmåden i eksempel 3» opløses på lignende måde i 100 volumendele methanol, og efter filtrering tilsættes 500 volumendele vand. Blandingen afkøles, og de resulterende rensede krystaller af C-14919-E-2 opsamles ved filtrering (2,1 dele). Smp. 148°0 (dekomp.).