FI92411C - Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi - Google Patents

Description

924 ; 1

Menetelmå polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi

Keksinnon tausta

Tamå keksinto koskee menetelmaa polysyklisen eet-5 teriantibiootin valmistamiseksi, jolla on kaava OMe •k / V^Me OMe \-o 10 Me, JL 55e ·»*

MeO ' s " ¥ M f i I 1/—^ Me J—, Me I Η I -Me ho’c^A^oAo^ s-L· \~x"u

I IH Μ ° H ° HO 0 Me OH

Me Me HH

(T) 15 jossa Me = CH3 tai sen farmaseuttisesti hyvåksyttåvan ka-tionisen suolan valmistamiseksi. Yhdisteen absoluuttinen stereokemia on esitetyn mukainen. Yhdiste (I) on kaytto-kelpoinen ravintoaineseoksissa siipikarjaa, karjaa tai si-20 koja vårten ja antikokkidiaalisena aineena siipikarjalla, sikojen dysenterian hoidossa tai ehkaisyssa tai kasvua edistavana aineena karjalla tai sioilla. Keksinto koskee myos Actinomadura sp. -mikro-organismia ATCC 53708, joka tuottaa mainittua antibioottia keksinnon mukaisessa fer-25 mentaatiomenetelmassa.

Yhdiste (I) on happamien polysyklisten eetterien antibioottiryhman uusi jasen. Tahan ryhmåan kuuluu sellai-sia tunnettuja aineita kuin monensiini (The Merck Index, 10. painos, Merck and Co., Inc., Rahway, N. J., 1983, mo-30 nografia nro 6100), nigerisiini (loc. cit., monografia nro 6390), narasiini (loc. cit., monografia nro 6271), lasa-losidi (loc. cit., monografia nro 5204) ja salinomysiini (loc. cit., monografia nro 8193). Aiheesta on esittånyt katsauksen Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. 35 Microbiol., vol. 22, ss. 177 - 223 (1977). Nyt kysymykses- 2 g o '" 1 7 L -f ; i så olevaa yhdistettå rouistuttaa rakenteeltaan låhimmin portmisiini, antibiootti, jonka ovat itsenåisesti esit-taneet Hamill et al., US-patentti 4 582 822, ja Kusakabe et al., EP-patenttihakemus 158 179; Tetrahedron Letters, 5 vol. 28, ss. 3357 - 3360 (1987); J. Antibiotics, vol. 40, ss. 237 - 238 (1987). Viimeksi mainitussa yhdisteesså on alfa-vety tetrahydrofuraanin B-renkaassa, jossa nyt kysy-myksesså olevassa yhdisteesså on alfa-metyyliryhmå. Nåmå yhdisteet tunnetaan yleisesti kokkidiostaattisina aineina, 10 kasvua ediståvinå rehun lisåainina ja/tai aineina, jotka ovat hyodyllisiå sikojen dysenteriaa vastaan.

Keksinnon yhteenveto

Kun fermentoidaan mikro-organismin Actinomadura sp, ATCC 53708, viljelmåå aerobisissa olosuhteissa vesipitoi-15 sessa ravintoalustassa, se tuottaa uutta hapan polysykli-nen eetteriantibioottia, yhdistetta, joka on edellå anne-tun kaavan (I) mukainen.

Tåmå keksinto koskee menetelmåå kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyvåksyttåvån kationi-20 sen suolan valmistamiseksi. Keksinnon mukaiselle menetel-målle on tunnusomaista, ettå Actinomadura sp. ATCC 53708:a fermentoidaan vedenalaisissa aerobisissa olosuhteissa ve-sipitoisessa ravintoalustassa, joka sisåltåå assimiloitu-van hiili- ja typpi- låhteen, kunnes talteen otettavissa 25 oleva måårå mainittua yhdistetta on muodostunut. Antikok-kidiaalisena aineena, sikojen dysenterian ehkaisysså tai hoidossa ja/tai kasvua ediståvånå aineena kåyttoå vårten yhdistetta (I) ei vålttåmåttå eroteta fermentaatiosta ja eristetå huomattavan puhtaassa muodossa, vaan se kåytetåån 30 vaihtoehtoisesti raa'assa muodossa, joko saostetussa muodossa sekoitettuna huovaston kanssa (otettuna talteen suo-dattamalla fermentaatioliuos) tai kuiva-aineena, joka on saatu suihku- tai pakastekuivaamalla koko fermentaatioliuos.

3

G C 4 Λ Λ y £. *τ ; I

Mainittuja farmaseuttisesti hyvåksyttåviå kationi-sia suoloja ovat, ilmoitettuihin rajoittumatta, natriumin, kaliumin, kalsiumin, ammoniakin, N,N'-dibentsyylieteenidi-amiinin, N-metyyliglukamiinin (meglumiinin) ja dietanoli- 5 amiinin suolat. Edullisimpina kationisina suoloina pide- taan kalium- ja natriumsuoloja.

Kåyttoå vårten voidaan muodostaa ravintoaineseok-sia, yhta karjaa tai sikoja vårten, joka seos sisåltåå kaavan (I) mukaista yhdistettå måårånå, joka on tehokas 10 karjan tai sikojen kasvun ediståmiseksi ja/tai ravinnon hyodyksikåyton parantamiseksi tai dysenterian ehkaisemi-seksi tai hoitamiseksi sioilla, ja toista siipikarjaa vårten, joka seos sisaltaa kaavan (I) mukaista yhdistetta maarana, joka on tehokas kokkidiaali-infektion torjumisek-15 si siipikarjassa.

Yhdiste (I) on lisaksi kayttokelpoinen menetelmassa kasvun edistamiseksi ja/tai ravinnon hyodyksikåyton tehok-kuuden lisaamiseksi sioilla tai karjalla, joka menetelma kasittaa kasvua edistavån tai ravinnon hyodyksikåyton te-20 hokkuutta lisååvån måårån kaavan (I) mukaista yhdistetta antamisen sioille tai karjalle, erityisesti ravintoaine-seoksen muodossa; menetelmassa dysenterian ehkåisemiseksi tai hoitamiseksi sioilla, joka menetelma kåsittåå kaavan (I) mukaisen yhdisteen antamisen sioille måårånå, joka on 25 tehokas dysenterian ehkåisemisesså tai hoitamisessa sioil la; ja menetelmåsså kokkidiaali-infektioiden torjumiseksi siipikarjaassa, joka menetelmå kåsittåå antikokkidiaali-sesti tehokkaan måårån kaavan (I) mukaista yhdistettå antamisen siipikarjaile, erityisesti ravintoaineseoksen muo-30 dossa.

Lopuksi tåmå keksinto koskee mikro-organismia Ac-tinomadura sp. ATCC 53708 ja sen biologisesti puhdasta viljelmåå, joka kykenee tuottamaan kaavan (I) mukaista yhdistettå talteen otettavissa oleva måårå suoritettaessa 35 fermentaatiokasvatus vesipitoisessa ravintoalustassa, joka 3 ^ ^ ί 1 4 sisåltaa hiilen ja typen assimiloituvia lahteita; inukaan lukien viljelma pakastekuivatussa muodossa.

Keksinnon yksityiskohtainen kuvaus

ViljelmaIle, joka kykenee tuottamaan kaavan (I) mu-5 kaista polysyklinen eetteri -antibioottia, on annettu ni-mitys Actinomadura sp., ja se on talletettu kokoelmaan The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, tyyppiviljelmana talletusnumerolla ATCC 53708. Taataan ta-man viljelmatalletuksen pysyvyys kokoelmassa The American 10 Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ja oleminen yleison helposti saatavissa patentin koko voimassaoloajan siina tapauksessa, etta patentti myonnetaan.

Tama uusi viljelma on peråisin maanaytteesta, jo-ka on kerattty Tuzlassa, Istanbulissa, Turkissa, ja se on 15 identifioitu toiminimen Pfizer Inc. viljelmakokoelmassa N777-l:na. Sen kuvauksen ja luokittelun suoritti tri L. H. Huang. Taman viljelman todettiin tuottavan mitoiltaan ka-peita sadesienten (actinomycetes) hyyfeja, ilmahuovaston, jonka paålle muodostuu lyhyita itioketjuja, ja ei-katko-20 naisen substraattihuovaston. Kokonaisten solujen analyy-sien tulokset osoittavat lisaksi, etta se kuuluu sukuun Actinomadura.

Mikro-organismin vinopintaviljelma siirrostettiin ATCC 172 -liemeen ja sita kasvatettiin neljan påivan ajan * 25 28 °C:ssa ravistelijassa. Sita sentrifugoitiin sitten 20 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa steriililla tislatulla vedella ja siirrostettiin kasvualustoille, joita kaytetaan tavallisesti ryhrnan Actinomycetales jasenien identifioin-tiin.

30 Viljelmia inkuboitiin 28 °C:ssa ja tulokset luet- tiin vaihtelevina aikoina, mutta tavallisimmin neljåntois-ta paivan kuluttua. Varit kuvattiin kayttaen yleista ter-minologiaa, mutta tarkat varit maaritettiin vertaamalla teoksen The Color Harmony Manual, neljas painos, varilius-35 koihin. Kokonaisten solujen aminohappo- ja sokerianalyysi

II

924',1 5 menetelmat ovat niita, jotka on kuvattu julkaisuissa Becker et al., Appl. Microbiol., vol. 12, ss. 421 - 423 (1964) ja Staneck et al., Appl. Microbiol, vol. 28, ss. 226 -231 (1974) ja Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., 5 vol. 71, ss. 934 -944 (1968), vastaavasti.

Viljelmå identifioitiin seuraavasti: Hiivauute-mallasuuteagar (ISP #2 -elatusaine,

Difco)

Kasvu hyvaa, kermanvarista (2 ca) , jossa oli tum-10 manharmaista mustiin olevia (vasemmanpuolinen harmaa sarja 5 ih, 5 ml) pisteita, kohottunutta, poimuntunutta; ilma-huovastoa ei ollenkaan tai niukasti, varitonta; kaantopuo-li kermanvarisesta vaalean kellertåvåan (2 ca, 2 ea), jossa mustia (vasemmanpuolinen harmaa sarja 5 ml) pisteita; 15 ei liukenevaa pigmenttia.

Kaurajauho-agar (ISP #3 -elatusaine, Difco)

Kasvu kohtalaista, kermanvarista (2 ca) , lievasti kohottunutta, sileaa; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, varitonta; kaantopuoli kermanvarista (2 ca) ; liu-20 koinen pigmentti kermanvarista (2 ca).

Epaorgaaniset suolat -tarkkelys-agar (ISP #4 -elatusaine, Difco)

Kasvu heikkoa, kermanvarista (2 ca) , ohutta, sileaa; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, varitonta; 25 kaantopuoli kermanvarista (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttia .

Glyseroli -asparagiini-agar (ISP #5 -elatusaine,

Difco)

Kasvu heikosta kohtalaiseen, kermanvarista (2 ca) , 30 ohutta, sileaa, ei ilmahuovastoa; kaantopuoli kermanvarista (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiM.

Czapek -sakkaroosi-agar (Waksman, "The Actinomy-cetes", V. 2, elatusaine #1, s. 328, 1961)

Kasvu kohtalaisesta hyvaån, kermanvarista (2 ca) , 35 kohtalaisen kohottunutta, sileaa, ei ilmahuovastoa; kaån- 6 Q O -i '· -i y h \ i topuoli kermanvåristå (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttiå.

Glukoosi -asparagiini-agar (ibid., elatusaine #2)

Kasvu kohtalaista, kermanvårista (2 ca), ohuesta kohtalaisen kohottuneeseen, sileåstå poimuntuneeseen, ei 5 ilmahuovastoa; kååntopuoli kermanvårinen (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttiå.

Gordonin ja Smithin tyrosiini-agar (Gordon ja Smith, J. Bacteriol. 69: 147 - 150, 1955)

Kasvu kohtalaisesta hyvåån, kermanvårista (2 ca) , 10 lievåsti kohottuneesta kohtalaisen kohottuneeseen, sileåstå poimuntuneeseen, ei ilmahuovastoa; kååntopuoli kermanvårinen (2 ca) ; liukeneva pigmentti vaalean kellertåvåå (2 ea) .

Kalsiummalaatti-agar (Waksman, Batriol. Rev. 21, 15 1 - 29, 1957)

Kasvu heikkoa, kermanvårista (2 ca) , ohutta, si-leåå; ei ilmahuovastoa, kååntopuoli kermanvårinen (2 ca), ei liukenevaa pigmenttiå.

Kaseiini-agar (Gordon ja Smith, ibid.) 2 0 Kasvu hyvåå, kermanvårista (2 ca) , kohottunutta, sileåstå poimuntuneeseen, ei ilmahuovastoa; kååntopuoli vaalean kellertåvå (2 ea); kellertåvå (2 ga) liukeneva pigmentti.

Bennettin agar (Waksman, loc. cit., elatusaine #30, 25 s. 331)

Kasvu hyvåå, kermanvåristå (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kååntopuoli kermanvåri-sestå kalpean kellertåvåån (2 ca, 2 ea) ; liukeneva pigmentti vaalean kellertåvå (2 ea).

30 Emersonin agar (ibid., elatusaine #28, s. 331)

Kasvu kohtalaista, kermanvårisestå vaalean kellertåvåån (2 ca, 2ea), kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kååntopuoli kellertåvå (2 ic) ; ei liukenevaa pigmenttiå.

II

ο Γ' 4 .· Λ '>< +; 1 7

Ravinto-agar (ibid., elatusaine #14, s. 330)

Kasvu heikosta kohtalaiseen, kermanvåristå (2 ca) , ohuesta lievasti kohollaan olevaan, ei ilmahuovastoa; kååntopuoli kermanvarinen (2 ca) ; ei liukenevaa pigment-5 tia.

Gelatiini-agar (Gordon ja Mihm, J. Bacteriol. 73, 15 - 27, 1957)

Kasvu hyvaa, kermanvarista (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kaantopuoli kermanvari-10 sestå vaalean kellertavåån (2 ca, 2 ea); liukeneva pig-mentti vaalean kellertåvå (2 ea).

Tårkkelys-agar (ibid.)

Kasvu hyvåå, kermanvarista (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kaantopuoli kermanvåri-15 sestå vaalean kellertåvåån oleva (2 ca, 2 ea) ; ei liukenevaa pigmenttiå.

Perunaporkkana-agar (Lechevalier, Lab. Clin. Med., 71, 934 - 944, 1968, mutta kåytetty ainoastaan 30 g peru-noita, 2,5 g porkkanoita ja 20 g agaria) 20 Kasvu heikosta kohtalaiseen, likaisen valkoista (vasemmanpuoleinen harmaa sarja 2 ba), ohutta, sileåå; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, våritontå; kåån-tdpuoli vårittomåstå kermanvåriseen oleva (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiå.

25 Vesijohtovesi-agar (2 %)

Kasvu heikkoa, kermanvåristå (2 ca) , ohutta, sileåå; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, våritontå; kååntopuoli vårittomåstå kermanvåriseen (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttiå.

30 Gauzen kivennåiselatusaine 1 (Gauze et al., Prob lems in the Classification of Antagonistic Actinomycetes, englantilainen painos, s. 13, 1957)

Kasvu heikosta kohtalaiseen, kermanvåristå (2 ca) , ohutta, sileåå; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, 35 våritontå; kååntopuoli kermanvårinen (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiå.

β 924'; 1

Gauzen orgaaninen elatusaine 2 (ibid.)

Kasvu hyvåa, kermanvaristå (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kååntbpuoli kermanvåri-sestå vaalean kellertavåån (2 ca, 2 ea) ; ei liukenevaa 5 pigmenttiå.

Morfologiset ominaisuudet

Morfologisia ominaisuuksia havaittiin kolmen viikon inkuboinnin jålkeen epaorgaaniset suolat/tarkkelys-agaril-la: ilmahuovasto variton, valkeasta kermanvåriseen; itio-10 ketjut suoria, kaarevia tai koukistuneita, kahdesta yhdek- såån itiota itioketjua kohden; itiot pallomaisia, soikeas-ta elliptiseen, lapimitta 0,8 - 1,4 mikronia tai 1,1 - 1,8 x 0,8 - 1,2 mikronia; sileitå, minka paljasti pyyhkåisy-elektronimikroskopia.

15 Biokemialliset ominaisuudet

Melaniinia ei muodostu; rikkivetya ei muodostu; gelatiini nesteytyy; ei hydrolysoi tårkkelysta; ei pelkis-ta nitraattia nitriitiksi; ei kasvua eika hajotusta Jense-nin eika myoskaan Levinen ja Schoenleinin selluloosalie-20 messa; ei maidon koagulointia eika peptonisointia; kaseii-nin hajotus positiivinen; tyrosiinin hajotus negatiivinen; kalsiummalaatin hajotus negatiivinen. Hiilihydraattien kaytto: kayttaa glukoosia, arabinoosia, fruktoosia, manni-tolia, ramnoosia, sakkaroosia, ksyloosia, adonitolia, sel-25 lobioosia, glyserolia, maltoosia, riboosia, tarkkelysta ja trehaloosia; ei kayta inositolia, raffinoosia, dulsitolia, erytritolia, galaktoosia, laktoosia, mannoosia, meletsi-toosia, melibioosia, alfa-metyyli-D-glukosidia, salisii-nia, sorbitolia eika sorboosia.

30 Muita positiivisia testeja olivat asetaatin ja py- ruvaatin hyodyksikåytto; esuliinin hydrolyysi; ja ksantii-nin ja hypoksantiinin hajotus. Seuraavat testit olivat ne-gatiivisia: bentsoaatin, sitraatin, dekstriinin, laktaa-tin, malaatin, mukaatin, oksalaatin, fenolin, propionaatin 35 ja sukkinaatin kaytto; adeniinin ja tyrosiinin hajotus, ja hippuraatin hydrolyysi.

II

9 9 2 4 1

Suhtautuminen lampotilaan 21 °C 28 °C 37 °C 45 °C kasvu kasvu kasvu kasvu hyvaa hyvaa hyvaa hyvaa 5

Koko soluja koskevia analyyseja

Kokonaisten solujen hydrolysaatit sisalsivat meso-diaminopimeliinihappoa, glukoosia, galaktoosia, maduroo-sia, mannoosia ja riboosia.

10 Viljelmalle N777-1 on tunnusomaista kermanvarinen substraattihuovasto; lyhyt variton ilmahuovasto; lyhyet itioketjut, jotka ovat suoria, kaarevia tai koukistuneita; ja itiot, joiden pinta on silea. Se kaytti glukoosia, ara-binoosia, fruktoosia, mannitolia, ramnoosia, sakkaroosia, 15 ksyloosia, adonitolia, sellobioosia, glyserolia, maltoo-sia, riboosia, tarkkelystå, trehaloosia, asetaattia ja pyruvaattia. Se hajoitti ksantiinia, hypoksantiinia ja eskuliinia. Kokonaisten solujen hydrolysaatit osoittavat mesodiaminopimeliinihapon ja maduroosin lasnaolon. Viljel-20 ma N777-1 kuuluu siten sukuun Actinomodura, kuten on maa-ritellyt H. Lechevalier.

Tunnettuja Actinomadura-lajeja, joilla esiintyy samankaltainen kermanvarinen substraattihuovasto ja/tai samanlaisia biokemiallisia ominaisuuksia, ovat A. cremea 25 subsp. rifamycini, A. madurae subsp. simaoensis ja A. rou-tienii. Viljelma N777-1 eroaa A. cremea subsp. rifamycini siten, etta omaa sileåt itiot, ei pelkista nitraattia, ei kåyta raffinoosia ja kayttåa arabinoosia ja ramnoosia.

Viljelma N777-1 eroaa A. madurae subsp. simaoensis 30 siten, etta omaa pikemminkin kermanvarisen kuin varitto-måsta oranssinruskeaan olevan substraattihuovaston, pikemminkin varittoman kuin varittomasta vaaleanpuna-valkeaan olevan ilmahuovaston, ei pelkista nitraattia, ei hajota tyrosiinia ja kykenee hajottamaan ksantiinia. A. rou-35 tieniin verrattuna se eroaa siten, etta silta puuttuvat 10 924':1 pseudoitiopesåkkeet; se ei hydrolysoi tSrkkelysta; se ei koaguloi maitoa ja kykenee kayttåmåan mannitolia, fruktoo-sia ja glyserolia.

Viljelmå N777-1 muistuttaa A. alboluteaa useimmissa 5 biokemiallisissa testeisså, mutta eroaa viimeksi mainitus-ta siten, ettå ei hydrolysoi tårkkelystå, ei koaguloi mai-toa, omaa substraattihuovaston, joka on kermanvarinen pi-kemmin kuin ruskeasta tummanruskeaan, ja itioketjut ovat pikemmin lyhyita kuin pitkia.

10 Ylla esitettyjen tietojen perusteella viljelmåa N777-1 pidetåan suvun Actinomadura jasenena ja siitå kay-tetaån nimitysta Actinomadura sp. Se on talletettu kokoel-maan The American Type Culture Collection talletusnumerol-la ATCC 53708.

15 Tassa kuvattua polysyklista eetteriantibioottia I

tuottaa kysymyksessa oleva Actinomadura sp. helposti kas-vatettaessa sitå låmpotilassa noin 24 - noin 36 °C veden-alaisissa olosuhteissa sekoittaen ja ilmastaen ravinto-alustoissa, jotka kasittavat sellaisia hiilihydraattien 20 lahteitå kuin esimerkiksi sokereita, tårkkelyksia, glyserolia, orgaanisia typpiyhdisteitå, kuten esimerkiksi soi-jajauhoa, kasaminohappoja, hiivauutetta; kasvuaineita, kuten esimerkiksi viljan liukenevia aineita, kalajauhoa, puuvillansiemenjauhoa; kivennaissuoloja, jotka sisaltSvat 25 sellaisia hivenaineita kuin esimerkiksi rautaa, kobolttia, kuparia, sinkkia jne., ja kalsiumkarbonaattia tai fosfaat-teja puskuriaineina. Sen jalkeen kun kasvatus on suoritet-tu loppuun, antibiootti otetaan helposti talteen uuttamal-la koko kasvuliemi sellaisilla orgaanisilla liuottimilla 30 kuin esimerkiksi n-butanoli, metyyli-isobutyyliketoni tai kloroformi pH-alueilla 4,0 - 8,0; suodattamalla erilleen huovasto, joka sisaltaH saostuneen antibiootin, jolloin suodos heitetaan pois; tai yksinkertaisesti suihkukuivaa-malla tai pakastekuivaamalla koko kasvuliemi. Vaihtoehtoi-35 sesti huovastoa tai koko kuivattua kasvulienta uutetaan

II

11 7 1 4 i 1 jollakin mainituista orgaanlsista liuottimista. Puhdistet-tu antibioottiyhdiste eristetåån haluttaessa orgaanisesta uutteesta kayttaen yleisia konsentroinnin, suolan tai va-paan hapon muodostuksen, kromatografian, saostamisen ja/-5 tai kiteyttåmisen menetelmiå, kuten alla on valaistu esi-merkeillå.

Suoritettaessa fermentointi tavanomaisesti valmis-tetaan ensin siirrostusmateriaali kaapimalla vegetatiivi-sia soluja, jotka kasvavat sopivalla kasvualustalla, vino-10 pintaviljelmistå tai Roux-pulloista, joihin on siirrostet-tu Actinomadura sp. ATCC 53708:a. Tulokseksi saadut vege-tatiiviset solut kaytetåån vuorostaan sellaisiin ravistus-pulloihin tai siirrostusmateriaalisåilioihin siirrostami-seen, jotka myos sisåltåvåt sopivaa kasvualustaa. Vaihto-15 ehtoisesti siirrostusmateriaalisailioihin siirrostetaan ravistuspulloista. Sopivan kasvatusajan jalkeen (yleensa 12 0 - 144 tuntia ravistuspulloissa ja 168 - 196 tuntia siirrostusmateriaalisailioissa), fermentoriin, joka myos sisaltåa sopivaa kasvualustaa, siirrostetaan aseptisissa 20 olosuhteissa vegetatiivista kasvulientå ravistuspulloista tai siirrostusmateriaalisailioista. Kasvatuksen loppuun suorittamisen jalkeen (yleensa noin 120 - 196 tuntia), antibioottiyhdiste otetaan talteen raa'assa tai puhtaassa muodossa, kuten halutaan, kayttaen jotakin ylla yleisesti 25 kuvatuista menetelmista tai niitå erityisia menetelmiå, joita on valaistu alla esimerkeillå.

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen in vitro -bakteerin-vastainen aktiivisuus testataan kayttaen yleisia menetelmiå, joissa mitataan pienimmåt eståvåt konsentraatiot 30 (MIC) , ilmaistuna /ig/ml, yhtå tai useampaa mikro-organis- mia vastaan. Yksi sellainen menetelmå on se, jota on suo-siteltu tutkimuksessa International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericcson ja Sherris, Acta. Pathologica et Microbiologia Scandinav., Supp. 217, kappa-35 le B: 64 - 68 [1971]) ja jossa kåytetåån aivo-sydåninfuu- 12 ;· ·'· .: · 1 / c 'T i ! sio (BHI) -agaria ja siirrostusmateriaalientoisintamislai-tetta. Yon ajan kasvatetut putket laimennetaan 100-kertai-sesti kåytettaviksi standardi-siirrostusmateriaalina (20000 - 100 000 solua noin 0,002 ml:ssa sijoitetaan agar-5 pinnalle; 20 ml BHI-agaria/malja). Kåytetaån kahtatoista koeyhdisteen kaksinkertaista laimennosta, jolloin koelaa-keaineen alkukonsentraatio on 200 /ig/ml. Yksittaiset pe-såkkeet jåtetåan huomioon ottamatta, kun levyt luetaan 18 tunnin inkuboinnin jålkeen 37 °C:ssa. Koeorganismin herk-10 kyys (MIC) maaritellåån pienimpanå yhdisteen konsentraa-tiona, joka kykenee aikaansaamaan kasvun tåydellisen esty-misen arvosteltuna paljaalla silmålla. Muiden polysyklinen eetteri -antibioottien tavoin tama kaavan (I) mukainen yhdiste osoittaa tyypillisesti gram-positiivisten baktee-15 rien vastaista aktiivisuutta samoin kuin myos aktiivisuut-ta lajia Treponema hyodysenteriae vastaan (sian dysenterian aiheuttaja), kuten on esitetty taulukossa (I).

Taulukko I

20 Kaavan (I) mukaisen yhdisteen in vitro -bakteerinvastainen aktiivisuus

Oroanismi Kanta nro MIC, uq/ml

Clostridium perfringens 10A006 0,39 25 10A009 0,20

Actinomyces pyogenes 14D002 0,39 14D008 0,39 14D011 0,39

Treponema hyodysenteriae 94A001 0,20 30 94A002 0,20 94A007 0,20

Tietoja kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja sen suolo-jen tehokkuudesta kokkidiaali-infektioita vastaan kananpo-35 jilla saadaan seuraavan menetelman avulla. Ryhmille, jois- n J Λ ^ · 1 13 ' ‘ 4 1 ' sa on 3 - 5 kymmenen påivån ikåistå patogeeneistå vapaata valkeaa leghorn-kukonpoikaa, syotetåån soseruokavaliota, joka sisåltåå yhdistetta (I) tai sen natrium- ja/tai ka-liumsuolaa tasaisesti dispergoituna siihen. Sen jalkeen 5 kun kukin kukonpoika on ollut tåmån ruoka-annoksen varassa 24 tunnin ajan, siihen istutetaan suun kautta testattavan Eimeia-lajin ookystia. Toisille ryhmille, joissa on 3 - 5 kymmenen paivan ikåistå kukonpoikaa, syotetåan samanlaista soseruokavaliota ilman yhdistetta (I) tai sen suoloja. Ne 10 infektoidaan myos 24 tunnin kuluttua ja ne toimivat tar-tunnan saaneina kontrolleina. Vielå yhdelle toiselle ryh-målle, jossa on 3 - 5 kymmenen påivån ikåistå kukonpoikaa, syotetåan samaa soseruokavaliuota ilman antibioottia ja niitå ei infektoida kokkidioilla. Nåmå toimivat normaalei-15 na kontrolleina. Kåsittelyn tulokset arvioidaan viiden påivån kuluttua E. acervulinan tapauksessa ja kuuden påivån kuluttua kaikkien muiden osalta.

Kriteerit, joita kåytetåån antikokkidiaalisen ak-tiivisuuden mittaamiseen, kåsittåvåt vauriopisteet 0-4 20 E. tenellan tapauksessa J. E. Lynchin mukaan, MA New

Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity”, Am. J. Vet. Res., 22, 324 -326, 1961; ja 0 - 3 muiden lajien tapauksessa, kåyttåen perustana muunnelmaa arvoste-lujårjestelmåstå, jonka ovat suunnitelleet J. Johnson ja 25 W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks”, Exp. Parasit., 28, 30 - 36, 1970. Aktiivisuus mitataan jakamal-la kunkin kåsitellyn ryhmån vauriopistemåårå tartunnan saaneen kontrollin vauriopistemåårållå. Tåsså testisså 30 yhdiste (I) ja sen kationiset suolat osoittavat erinomais-ta aktiivisuutta Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti ja E. necatrix -infektioita vastaan siipi-karjassa, kun niitå sisållytetåån kananpoikien soseruoka-valioon pitoisuuksina noin 1,0 - 25 miljoonasosaa. Esimer-35 kiksi herkkåå E. tenellaa vastaan kaavan (I) mukainen yh- 14 ^24'; 1 diste osoitti vaurioiden 100 % torjuntaa niin alhaisina annoksina kuin 5 miljoonasosaa.

Kysymyksesså oleva kaavan (I) mukainen yhdiste on myos yleenså hyodyllinen yhdistelmånå eråiden muiden tun-5 nettujen antikokkidiaalisten aineiden kanssa, kuten esi-merkiksi nikarbatsiinin, 4,4'-dinitrokarbanilidin tai sellaisen naftaleeniamiinin kuin ovat mååritelleet Hamill et al., edellå mainittu US-patentti 4 582 822.

Kokkidioosin ehkåisemiseksi tai torjumiseksi siipi-10 karjassa kaavan (I) mukaista yhdistetta annetaan siipikar-jalle suun kautta sopivassa kantaja-aineessa. Sopivasti sisållytetåån laake yksinkertaisesti juomaveteen tai sii-pikarjan rehuun, niin ettå terapeuttinen annos ainetta tulee nautituksi paivittåisen veden tai siipikarjan ravin-15 toannoksen mukana. Aine voidaan mitata suoraan juomaveteen, edullisesti nestemåisen konsentraatin muodossa, tai lisata suoraan rehuun sellaisenaan tai esisekoitteen tai konsentraatin muodossa. Tavallisesti kaytetaån esisekoi-tetta tai konsentraattia, jossa on terapeuttinen aine kan-20 taja-aineessa, aineen sisallyttamiseen rehuun. Terapeuttinen aine voi olla olennaisesti puhtaassa muodossa (esim. vapaa happo tai sen farmaseuttisesti hyvåksyttåva suola), sellaisessa analysoidussa raa'assa muodossa kuin esimer-kiksi marka tai kuiva huovasto tai kuivattu koko kasvulie-’ 25 mi. Sopivat kantaja-aineet ovat nestemaisia tai kiinteita, tarpeen mukaan, kuten esimerkiksi vesi, erilaiset jauhot; esimerkiksi soxjaoljyjauho, pellavansiemenoljyjauho, mais-sintahkajauho, ja sellaiset kivennåisseokset, joita ylei-sesti kaytetaån siipikarjan rehuissa. Erityisen tehokas 30 kantaja-aine on siipikarjan rehu itse; toisin sanoen pieni osa siipikarjan rehusta. Kantaja-aine helpottaa aktiivis-ten aineiden tasaista jakautumista valmiiseen rehuun, jon-ka kanssa esisekoite sekoitetaan. Tåmå on tårkeåå, koska tarvitaan ainoastaan pieniå osuuksia kysymyksesså olevia 35 tehokkaita aineita. On tårkeåå, ettå yhdiste sekoitetaan

II

15 .924'; 1 perinpohjaisesti esisekoitteeseen ja sen jalkeen rehuun. Tata vårten aine voidaan dispergoida tai liuottaa sellai-seen sopivaan oljymaiseen vehikkeliin kuin esimerkiksi soijaoljy, maissioljy, puuvillansiemenoljy ja vastaavat 5 tai haihtuvaan orgaaniseen liuottimeen ja sitten sekoittaa kantaja-aineen kanssa. On selvaa, etta aktiivisen aineen osuudet konsentraatissa voivat vaihdella suuresti, koska aineen måårå valmiissa rehussa voidaan saataa sekoittamal-la sopiva osuus esisekoitetta rehun kanssa terapeuttisen 10 aineen halutun tason aikaansaamiseksi.

Suurtehoisia konsentraatteja sekoittaa rehun val-mistaja sellaisen proteiinipitoisen kantaja-aineen kanssa kuin esimerkiksi soijaoljyjauho ja muut jauhot, kuten ylla on kuvattu, vakevien tåydennysvalmisteiden aikaansaamisek-15 si, jotka ovat sopivia suoraan syotettaviksi siipikarjal-le. Sellaisissa tapauksissa siipikarjan annetaan nauttia tavallista ruokavaliuota. Vaihtoehtoisesti sellaisia våke-via taydennysvalmisteita lisataan suoraan siipikarjan rehuun, niin etta aikaansaadaan tasapuolisesti ravitseva 20 valmis rehu, joka sisaltaa terapeuttisesti tehokkaan pi-toisuuden yhta tai useampaa kaavan (I) mukaista yhdistet-ta. Seokset sekoitetaan perinpohjaisesti kayttåen yleisia menetelmia, kuten esimerkiksi kaksikuorisessa sekoittimes-sa, homogeenisuuden takaamiseksi.

25 Siipikarjaile kåytettaesså tassa kuvatun yhdisteen kayttdtasot vaihtelevat eri olosuhteissa. Jatkuva matalan tason laakinta kasvuvaiheen aikana; toisin sanoen ensim-maisen 5-12 viikon aikana kananpojilla, on tehokas eh-kaiseva toimenpide. Todettujen infektioiden hoidossa voi-30 daan tarvita suurempia maaria infektion voittamiseksi. Yhdisteen (I) kayttotaso rehussa on yleensa valilta noin 1,0 - 25 miljoonasosaa, edullisesti valilta noin 2,5 - 12,5 miljoonasosaa. Juomavedessa annettaessa taso on sel-lainen, joka aikaansaa saman paivittaisen laakeannoksen 35 laskettuna keskimåaraisen paivittaisen rehunkulutuksen ja

2 L. Η , I

16 keskimååråisen påivittåisen vedenkulutuksen painosuhteen avulla.

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja sen suolojen ak-tiivisuus kasvun ediståmisesså ja/tai ravinnon hyodyksi-5 kåyton tehokkuuden lisååmisesså sioilla ja karjalla voi-daan mitata suoraan syottåmållå elåinten koeryhinille eri-laisia yhdisteen (I) tai sen suolan tasoja rehussa. Vaih-toehtoisesti esitetaan GB-patenttijulkaisussa 1 197 826 yksityiskohtaisesti in vitro -potsimenetelmå rehuissa ole-10 vien antibioottien arviointia vårten.

Kåytettåesså sikojen dysenterian ehkaisyssa tai hoidossa tai kasvun edistamisessa ja/tai ravinnon hyodyk-sikåyton tehokkuuden lisaamisessa karjalla tai sioilla kaavan (I) mukainen yhdiste tai sen suola annetaan edulli-15 sesti rehun lisaaineena. Rehut valmistetaan noudattaen menetelmiå, jotka vastaavat tåysin yllå siipikarjan rehun valmistusta vårten yksityiskohtaisesti selostettuja mene-telmia, huolehtien samalla tavoin sellaisten rehujen ai-kaansaamisesta, joissa terapeuttinen aine on tasaisesti 20 dispergoituna. Yhdisteen (I) kayttotaso karjan tai sikojen rehussa on yleensa valilta noin 0,25 - 25 miljoonasosaa. Marehtijbille voidaan kaavan (I) mukainen yhdiste my6s antaa suun kautta suuren pillerin muodossa, joka såilyy rumenoretikulaarisessa pussissa vapauttaen terapeuttista 25 ainetta suurin piirtein muuttumattomalla nopeudella pitki- tetyn ajan, esim. 4-8 viikon, kuluessa, tarjoten annok-sen, joka vastaa tåysin yllå olevaa påivittåistå annosta rehussa, toisin sanoen: 30 keskimååråinen påivittåinen annos milligrammoina = (0,25 - 25) x keskimååråinen påivittåinen rehun miljoonasosaa kulutus kg:ina.

II

17 il. 4 i 1

Esimerkki sellaisesta kontrolloidusti vapauttavasta pilleristå on Cardinalin esittåmå, ks. US-patentti 4 601 893.

Tåtå keksintoå valaistaan seuraavien esimerkkien 5 avulla. Tulisi kuitenkin olla selvåå, etta keksinto ei rajoitu naiden esimerkkien erityisiin yksityiskohtiin.

Esimerkki 1

Actinoroadura sp. ATCC 53708:n fermentointi

Yhdisteen (I) eriståminen natriumsuolana 10 Lajia Actinomadura sp. kasvatettiin aluksi siirros- tamalla kiintealle kasvualustalle vinopinnoille tai Roux-pulloihin ATCC 53708 -viljelmaa, kayttaen ATCC-ravinto-alustaa nro 172, joka oli valmistettu seuraavasti ja omasi seuraavan koostumuksen.

15 arammaa/1itra glukoosi 10 liukoinen tarkkelys 20 hiivauute 5 kaseiinin entsymaattinen hydro- 1 20 lysaatti kalsiumkarbonaatti 1 tislattu vesi 1000 ml:aan asti; pH 7,0 KOH:n avulla; lisaa agar 20 25 Silla valin valmistettiin ravistuspulloja kayttaen jompaa kumpaa seuraavista ravintoalustoista: 18 iiA : 1 C' qrammaa/litra JDYTT qrammaa/litra sereloosi 10 sereloosi 10 soijajauho 10 maissitarkkelys 5 maissin fermen- 5 maissinliotus- 5 5 taatiokuiva-aine neste maissitarkkelys 10 kaseiinin entsy- 5 maattinen hydro-lysaatti natriumklorid! 5 kobolttikloridi 0,002 10 kobolttikloridi 0,002 kalsiumkarbonaati 3 kalsiumkarbonaatti 1 100 ml elatusainetta jaettiin 300 ml:n ravistuspul-loihin ja steriloitiin 120 °C:ssa paineessa 15 psi 30 mi-15 nuutin ajan. Jaahdyttamisen jalkeen ravintoalustaan siir-rostettiin vegetatiivinen solususpensio, joka oli kaavittu edella mainitusta Actinomadura sp. -vinopintaviljelmåsta. Pulloja ravistettiin 28 °C:ssa ravistelijassa, jonka siir-tyma oli 3,8 - 6,4 cm ja nopeus 150 - 200 kierrosta minuu-20 tissa (CPM),5-7 påivån ajan.

Silla valin valmistettiin 5 litran fermentointias-tioita, jotka sisalsivat 3 litraa jompaa kumpaa edella olevista C'- tai JDYTT-ravintoalustoista tai seuraavaa ravintoalustaa: 25 UKl-2 qrammaa/litra sereloosi 45 soijajauho 10 maissinliotusneste 10 kobolttikloridi 0,002 30 magnesiumsulfaatti 0,10 kalsiumkarbonaatti 3 mangaanisulfaatti 0,10 ferrisulfaatti 0,10

II

19 ,,· : . 1 S il *·* , !

Lisattiin vaahdonestoainetta (polypropeeniglyko-li P2000, joka sisalsi 10 % eteenioksidia painon mukaan, 1 ml) ja astiat suljettiin ja steriloitiin 120 °C:ssa ja paineessa 15 psi .45 minuutin ajan. Astioihin siirrostet-5 tiin sitten yksi ravistuspullollinen (noin 3 % siirrostus-materiaalia), fermentointia suoritettiin 120 - 168 tunnin ajan 30 °C:ssa, sekoittaen nopeudella 1700 kierrosta minu-tissa (RPM) ja kayttaen ilman nopeutta yksi tilavuus ilmaa nesteen tilavuutta kohden minuutissa.

10 Kun fermentointi oli suoritettu loppuun (B. subti lis ATCC 6633:a vastaan suoritetun antibioottilevykokeen perusteella), fermentorit pysåytettiin ja suodatettiin luonnollisessa pH:ssa piimaan avulla. Suodatuskakku sekoi-tettiin lietteeksi metanoliin, konsentroitiin tyhjosså, 15 laimennettiin 2-3 tilavuudella vettå ja uutettiin sitten 2 X 1/3 - 1/2 tilavuudella joko metyyli-isobutyyliketonia tai n-butanolia. Liuotinkerros erotettiin vesifaasista imun tai sentrifugoinnin avulla, kuplitettiin ja konsentroitiin tyhjossa, jolloin saatiin kaavan (I) mukainen an-20 tibiootti raa'assa muodossa paksuna oljyna.

Kasvuliemen ja myohempien talteenottovirtojen bio-aktiivisuutta voidaan seurata kayttaen herkkaa Bacillus subtilis ATCC 6633- tai Staphylococcus aureus ATCC 6538-kantaa. Kasvuliemesså ja talteenottovirroissa olevat kom-25 ponentit voidaan tehda silminnahtaviksi kåyttamålla

Analtech -piidioksidi GF -levyja ja eluenttina etyyliase-taattia. Kehitetyt levyt suihkutetaan vanilliinireagens-silla (3 g vanilliinia seoksessa, jossa on 75 ml etanolia ja 25 ml 85 % fosforihappoa) ja kuumennetaan 80 °C:seen.

30 Kaavan (I) mukainen antibioottituote nayttaytyy purppuran-varisena taplana. Kehitetty ohutkerroskromatografialevy voidaan myos paallystaa agarilla, johon on siirrostettu joko bakteeria S. aureus tai B. subtilis ja johon on li-satty 2,3,5-trifenyyli-2H-tetratsoliumkloridimonohydraat-35 tia, ja inkuboida 37 °C:ssa 16 tunnin ajan antibiootin vi- 20 - · Λ > L *+ . ! sualisoimiseksi (valkeita tapliå vaaleanpunaista taustaa vasten).

Laajentaminen suuriin fermentointiastioihin suori-tettiin valmistamalla ravistuspulloja, jotka sisalsivat 5 0,7 litraa C'- tai JDYTT-ravintoalustaa. Ravistuspullo- siirrostusmateriaalia kasvatettiin 5-7 paivan ajan 28 -°C:ssa ja se kaytettiin siirrostuksen suorittamiseen 200 tai 6000 litran fermentointiastiaan, joka sisalsi vastaa-vasti 100 tai 4000 litraa UKl-2-ravintoalustaa. Suunnil-10 leen yksi litra siirrostusmateriaalia kaytettiin kuhunkin sailioon. Sen jålkeen kun fermentoinnit olivat jatkuneet 7 - 10 paivan ajan, ne otettiin talteen.

Pienemmån fermentointieran koko lienta uutettiin 50 litralla metyyli-isobutyyliketonia luonnollisessa pH-15 arvossa. Orgaaninen uute konsentroitiin tyhjossa sykloni-tislauslaitteessa ja kiertohaihduttimessa oljyksi. Tama oljy kromatografoitiin kaksi kertaa kayttaen 500 g pylvas-laatua olevaa silikageeliå, joka oli lietetty heksaaniin. Ensiramainen pylvås kehitettiin etyyliasetaatilla ja toinen 20 1:l-seoksella CHCl3:asetoni. Tuotetta sisaltavat fraktiot identifioitiin ohutkerroskromatografian avulla kayttaen edellå kuvattua roenetelmåa. Toisesta silikageelipylvaastå saadut aktiiviset fraktiot kromatografoitiin lopuksi kayttaen florisilia ja eluenttina 19:l-seosta CHC13:CH30H. Tuo-25 tetta sisaltavat fraktiot yhdistettiin, niitå ravistettiin laimean H3P04:n kanssa ja sitten dinatriumortofosfaattipus-kuriliuoksen kanssa natriumsuolan muodostamiseksi, kuivat-tiin Na2S04:n avulla, haihdutettiin ja jaånnos kiteytettiin eetterista kaavan (I) mukaisen yhdisteen natriumsuolan 30 eristamiseksi, 915 mg; sp. 245 - 249 °C, [α]ρ = -19,0° (c = 1, CH3OH) .

Analyysi laskettuna koostumukselle C45H77014Na: C 62,47; H 8,97 Saatu: C 62,89; H 9,22.

35 C13-NMR [kemiallinen siirtyma (mil joonasosia)

II

21 r) 2 Η ; 1 CDCl3:ssa ja vetyjen lukumåårå suluissa] 182,8 (O), 110,0 (0) , 106,0 (0), 99,1 (1), 87,2 (1), 86,9 (O), 86,2 (0), 84.8 (1), 83,4 (O), 82,6 (1), 80,2 (1), 78,5 (1), 75,2 (1) , 74,8 (1), 74,6 (1), 66,4 (1), 60,3 (3), 57,9 (3), 5 56,9 (3), 44,5 (1), 39,0 (1), 36,9 (1), 36,8 (2), 35,9 (2) , 35,4 (2), 35,2 (2), 35,1 (1), 35,0 (1), 31,3 (2), 30.9 (2), 30,5 (1), 28,2 (3), 27,1 (2), 26,1 (2), 25,0 (3) , 21,0 (3), 18,3 (3), 16,7 (3), 15,3 (3), 13,4 (3), 13,1 (3), 11,2 (3), 10,7 (3) ja 10,6 (3).

10

Suuren såilion fermentoinnin koko kasvuliemen jat-kokåsittely suoritettiin uuttamalla kaikki suunnilleen 4000 litraa kasvulientå 1800 litralla metyyli-isobutyyli-ketonia, erottamalla liuotin Podbielnack-uuttolaitteen 15 avulla ja konsentroimalla liuotin ohueksi siirapiksi tyh-jbsså. Konsentraattia hierrettiin 2 kertaa yhtå suuren tilavuuden kanssa laimentamatonta metanolia, erotettiin metanoliin liukenexnattomasta oljystå ja metanolijåånnos konsentroitiin tyhjosså siirapiksi. Viimeksi mainittua 20 uutettiin 2X heksaanilla ja yhdistettyå heksaania uutet-tiin asetonitriilillå. Asetonitriili såilytettiin myohem-påå talteenottoa vårten. Heksaani konsentroitiin sitten tyhjosså ja panoskroinatografoitiin sitten kåyttåen silika-geeliå. Silikageeliå desorboitiin suodatussuppilossa ensin 25 heksaanilla, sitten metyleenikloridilla, etyyliasetaatilla ja lopuksi asetonilla. Aktiiviset fraktiot, jotka olivat CH2Cl2-ja etyyliasetaattieluaateissa, konsentroitiin, liuo-tettiin heksaaniin ja pestiin happamalla vedellå ja uutettiin sitten 1 % N-metyyli-D-glukamiinilla vedesså. Vesi-30 faasi suolattiin natriumkloridilla ja uutettiin 2X yhtå suurella tilavuudella etyyliasetaattia. Orgaaniset kerrok-set yhdistettiin, kåsiteltiin aktiivihiilellå, suodatet-tiin, pestiin pH-arvon 9,0 omaavalla natriumfosfaattipus-kuriliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatin avulla, kon-35 sentroitiin tyhjosså ja kiteytettiin eetteristå, jolloin 22 ο ο 4 ·' 1 S L. "Λ . ! saatiin 50,8 g natriumsuolaa, joka oli identtistå pienem-man mittakaavan fermentoinnin tuotteen kanssa.

Esimerkki 2

Yhdiste (I) vapaan hapon muodossa 5 Kaavan (I) mukaisen antibiootin vapaa happomuoto valmistettiin ravistamalla voimakkaasti natriumsuolan klorof ormiliuosta yhta suuren tilavuuden kanssa kloorivety-happoa pH-arvossa 2 erotussuppilossa. Faasit erotettiin ja kloroformikerros pestiin vedellå ja haihdutettiin sitten 10 tyhjosså, jolloin saatiin vapaa happo: sp. 87 - 90 °C; [afå = “6,9° (c = 1, metanoli).

Analyysi laskettuna koostumukselle C45H780i4.0,5H20: C 63,43; H 9,34

Saatu: C 63,35; H 9,53.

15 Esimerkki 3

Yhdisteen (I) natriumsuola

Edella olevan esimerkin vapaata happoa (45 mg) liuotettiin 100 ml:aan kloroformia. Liuos, jossa oli nat-riumkarbonaattia (0,5 g) vedessa (100 ml), lisattiin ja 20 tulokseksi saatu seos pantiin sitten erotussuppiloon ja ravistettiin voimakkaasti usean minuutin ajan. Kloroformikerros erotettiin ja vesikerros pestiin uudella klorofor-milla. Yhdistetyt kloroformiuutteet kuivattiin natriumsul-faatin avulla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saa-25 tiin 41 mg natriumsuolaa; sp. 230 - 235 °C.

Analyysi laskettuna koostumukselle C^H^O^Na: C 62,47; H 8,97 Saatu: C 62,20; H 9,14.

Esimerkki 4 30 Yhdisteen (I) rubidiumsuola

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen rubidiumsuolan val-mistamiseksi vapaata happoa (30 mg) liuotettiin 50 ml:aan kloroformia. Rubidiumkarbonaattia (35 mg 25 ml:ssa vetta) lisattiin kloroformiin ja seosta sekoitettiin 2 tunnin 35 ajan. Orgaaninen faasi erotettiin ja vesikerrosta uutet-tiin yhta suurella tilavuudella kloroformia. Yhdistetyt

II

23 92411 kloroformiuutteet haihdutettiin, jolloin saatiin valkea kiinteå aine. Rubidiumsuola uudelleenkiteytettiin hitaasti haihduttamalla eetteristå ja tulokseksi saaduille kiteille suoritti rontgensaderakennemaarityksen tri J. Bordner.

5 Esimerkki 5

Yhdisteen (I) kaliumsuola

Kaavan (I) mukaisen antibioottiyhdisteen kalium-suolan valmistamiseksi vapaata happoa liuotettiin 130 mg 100 ml:aan kloroformia. Lisåttiin K2C03 (100 mg) 100 ml:ssa 10 H20 ja tulokseksi saatua seosta sekoitettiin usean minuutin ajan ja se pantiin sitten erotussuppiloon ja ravistettiin voimakkaasti usean minuutin ajan. Orgaaninen faasi erotet-tiin ja haihdutettiin tyhjossa, jolloin saatiin yhdiste (I) valkeana jauheena; sp. 255 - 260 °C, [α]ρ = -19,6° 15 (c = 1, kloroformi).

Analyysi laskettuna koostumukselle C^H^OmK: C 61,34; H 8,81 Saatu: C 60,91; H 8,83.

Claims (5)

1. Menetelma polysyklisen eetteriantibiootin val-mistamiseksi, jolla on kaava

5 OMe / 8M* Me I jMe Q \ Me Me MeO ' = .. T uf

10. I IΓ—λ Me f—i Me I-. H i—» / Me ΗΟ’ε-^Λγ^οΛο^ν Xfs L I" 0 H °m i ° «O ° Me OH 15 jossa Me = CH3, tai sen farmaseuttisesti hyvaksyttavan ka-tionisen suolan valmistamiseksi, tunnettu siita, etta Actinomadura sp. ATCC 53708:a fermentoidaan vedenala-isissa aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravinto-alustassa, joka sisaltaa assimiloituvan hiili- ja typpi- 20 låhteen, kunnes talteen otettavissa oleva maarå mainittua yhdistetta on muodostunut.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta patenttivaatimuksessa 1 esi-tetyn kaavan mukainen yhdiste eristetaån natrium- tai ka- 25 liumsuolan muodossa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta patenttivaatimuksessa 1 esi-tetyn kaavan mukainen yhdiste erotetaan fermentointiliuok-sesta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå patenttivaatimuksessa 1 esi-tetyn kaavan mukainen yhdiste otetaan saostetussa muodossa talteen seoksena, joka sisaltaa huovaston, suodattamalla fermentointiliuos.

5. Actinomadura sp. ATCC 53708. II::