KR970010603B1 - 신규 항진균성 항생물질과 이를 생산하는 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 이를 이용한 신규 항진균성 항생물질의 제조방법 - Google Patents
신규 항진균성 항생물질과 이를 생산하는 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 이를 이용한 신규 항진균성 항생물질의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용없음
Description
제 1 도는 바실러스 속(Bacillus sp.) SY-414 균주의 전자 현미경 사진이고,
제 2 도는 본 발명 균주가 형성하는 포자의 전자 현미경 사진이며,
제 3 도는 배양 시간에 따른 본 발명 균주의 생육과 항생물질의 생산량을 나타낸 그래프이고,
제 4 도는 배양 온도에 따른 항생물질의 생산량을 나타낸 그래프이며,
제 5 도는 초기 pH에 따른 항생물질의 생산량을 나타낸 그래프이고,
제 6 도는 도열병균의 NB배지와 YS배지에서의 항생물질 생산량을 나타낸 그래프이며,
제 7 도는 문고병균의 NB배지와 YS배지에서의 항생물질 생산량을 나타낸 그래프이고,
제 8 도는 도열병균에 대한 본 발명 항생물질의 저지환 사진이며,
제 9 도는 문고병균에 대한 본 발명 항생물질의 저지환 사진이고,
제 10 도는 실시예 4에서 얻은 본 발명 항생물질의 결정 사진이며,
제 11 도는 실시예 4에서 얻은 항생물질의 UV스펙트럼이고,
제 12 도는 실시예 4에서 얻은 항생물질의 IR스펙트럼이고,
제 13 도는 실시예 4에서 얻은 항생물질의1H NMR스펙트럼이며,
제 14 도는 실시예 4에서 연은 항생물질의13C NMR스펙트럼이고,
제 15 도는 실시예 4에서 얻은 항생물질의 매스 스펙트럼이다.
* 도면의 구요 부분에 대한 부호의 설명
a : 도열병균 b : 문고병균
c : 건조 세포 중량 d : pH
e : YS배치 f : NB배지
g : 저지환 크기
본 발명은 하기 일반식(I)로 표현되는 신규 항진균성 항생물질, 이를 생산하는 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) 및 이를 이용한 신규 항진균성 항생물질의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 속에서R1, R2및 R3는 같거나 다른 것으로 -H, -OH, Cl∼C6의 알킬기, C5∼C20의 알릴기 또는 C2∼C6의 알킬렌기이고, l, m 및 n은 각각 1∼3의 정수이다.
항생물질에 관한 연구는 1929년 플레밍(Fleming)에 의해 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대하여 생육을 저지하는 페니실리움 느타툼(Penicillium notatum)의 항균 작용이 발견된 이후 활발히 진행되었고 이에 따라 여러 병원성 미생물에 유효한 각종의 항생물질이 개발되었다.
그동안 병원 세균과 같은 원시핵 세포에 대하여 항균 활성을 갖는 항생물질은 연구가 많이 진행되어 왔지만 진균증과 같은 진핵세포에 효과가 있는 항생물질에 대해서는 현재까지 그다지 만족할만한 성과를 이루지 못하였다. 인체 및 식물체에 대한 병원성 곰팡이 감염의 치료 및 방제를 위한 항진균성 항생물질에 대한 연구는, 1950년 엘리자베스(Elizabeth)와 브라운(Brown)에 의하여 칸디다 알비 칸스(Candida albicans), 사입토코커스 네오포만스(Cyptococcus neoformans) 등에 활성을 나타내는 핀지시딘(fungicidin) 이라는 물질을 분리하면서부터 시작되었다. 그 후에 페니실리움 그리세오풀범(Penicillium griseofulvum)으로부터 분리한 그리세오물빈(griseofulvin)이 식물병원균에 효과가 있는 농약으로 발견되었고, 골드(Gold) 등에 의하여 효모에 대하여 항균 활성이 있는 암포테리신 B(amphotericin B)가 보고되었다.
또한, 아리마(Arima) 등에 의하여 슈도모나스 피로시니아(Pseudomonas pyrrocinia)가 생산하고 독성이 적으며, 효모와 그람 양성 미생물에 대하여 활성을 갖는 피롤니트린(pyrrolnitrin)이 발견되었으며, 이소노(Isono) 등은 벼의 질병을 일으키는 곰팡이에 활성이 있으며 인축, 물고기 및 농작물에 대하여 약해 작용이 거의 없는 폴리옥신(polyoxin)을 개발하였다.
벼의 도열병 방제 항생물질로서는 1965년 우메자와(Umezawa) 등에 의하여 도열병균에 대하여 방제 효과뿐만 아니라 치료 효과를 나타내며 벼의 체내에 침투 이행이 잘 되는 카주가마이신(kasugamycin)이 발견되었고, 이와사(Iwasa) 등에 의하여 벼의 문고병에 예방 및 치료의 두 작용을 나타내는 발리다마이신(validamycin)이 개발되어 실용화되었다.
그 이후 곰팡이나 효모에 활성을 나타내며 저독성인 아클레아신(aculeacin), 벼의 도열병 발병 균주에 대하여 활성을 나타내는 리포펩틴(lipopeptin), 네오펩틴(neopeptin) 등이 발견되었으며 필라펜토스 펀자이(filamentous fungi) 특히 트리코파이톤 러브림(Trichophyton rubrum)에 대하여 낮은 최소생육 저지농도 값을 갖는 마이코버실린(mycoversilin) 이 발견되었다.
새로운 뉴콜레오시드(nucleoside) 항생물질로서는 마이크로모노스포라(Micromonospora)가 생산하며 벼의 문고병에 대하여 뛰어난 효과를 나타내는 다피라마이신(dapiramicin)이 개발되었다. 이 외에 알보펩틴 A(albopeptin A), 펜지신(fengycin), 옥타코사마이신(octacosamicin) 등 여러 종류의 항진균성 항생물질이 개발되었다.
이 중에서 농약용 항생물질의 사용 목적으로 현재 공업화되어 있는 것은 카주가마이신(kasugamycin), 발리다마이신(validamycin) 및 폴리옥신(polyoxin) 등이 있으며 국내에도 많은 양이 수입되어 사용되고 있다.
한편, 국내에서는 벼 도열병균, 회색곰팡이 병균, 무좀균 및 캔디다균 등에 효과가 있으며, 특히 벼의 도열병에 대하여 활성을 나타내는 항진균성 항생물질이 분리되었고(김시관, 김창환, 1989. Acetoxycyclo heximide의 생리활성 및 그 생산균주. 한국산업미생물학회지 17 ; 307∼312), 그람 양성세균 및 식물 병원성 곰팡이에 항균활성을 나타내는 염기성 메크롤라이드(macrolide) 항생물질이 개발되었다.(김성욱, 이지우, 이상환, 복성해. 1991. 토양으로부터 분리한 항진균성 활성을 나타내는 세균의 동정과 그 생물활성 한국산업 미생물학회지 19 ; 337∼342).
현재 많이 사용되고 있는 유기합성계 농약은 잔류 농약이 토양으로 유입, 농약 중독 등의 부작용이 발생되고 있는 실정이다. 특히, 농약 중독의 경우에는 해마다 많은 사람이 생명을 잃고 있으며, 생태계 파괴까지도 유발되고 있어서 환경오염 문제와 더불어 농약의 잔류 독성 문제는 커다란 사회 문제로 부각되고 있다. 따라서 디클로로디페닐트리클로로에탄(dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)), 벤젠 헥사클로라이드(ben-zene hexachloride(BHC)), 염화 제2수은(HgCl2), 페르밤(ferbam), 지람(ziram) 및 에디펜(edifen(EDPS제)) 등 기존의 많은 유기합성계 농약들은 암유발 가능성 또는 잔류독성 등의 문제점이 있어 사용이 제한되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 독성이 없어 환경오염을 유발하지 않고, 인체에 해가 없으며 항진균 효과가 우수한 신규 항진균성 항생물질 및 이의 유도체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 목적의 항생물질을 생산하는 신규 바실러스(Bacillus sp.) 이생물 및 이를 이용한 항진균성 항생물질의 생산방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규 항진균성 항생물질을 유효 성분으로 하는 제약 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적뿐만 아니라 용이하게 표출될 수 있는 또 다른 목적을 달성하기 위하며, 본 발명에서는 식물류 진균 특히, 벼의 도열병 및 문고병균에 대한 항균능이 높은 신규 바실러스 속 미생물을 토양으로부터 분리 동정하여 YS배지에서 진탕당배양하고, 배양액을 원심분리한 후 배양상등액을 에틸 아세테이토(Ethyl ace-tate)로 추출하였다. 용배층을 모아 용매를 제거하여 농축활성 부분을 얻고, 이를 모아 메탄올에 용해시켜 실리카켈 컬럼 크로마토그라피를 행하였다. 메탄올을 제거한 후, 디클로로메탄 : 메탄올(1:5) 혼합액에 용해시켜 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피를 행하고 용출 용매를 제거한 후 활성부분을 모았다. 물에 용해시켜 동결건조시켜 독성이 없고 항진균성이 우수하며 저렴한 비용으로 제조할 수 있는 분말상태의 항생물질을 얻었다.
본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 항진균성 항생물질(이하, 트리헥소신(Trihexocin)''이라 칭함은 하기 일반식(I)로 표현된다.
상기 식에서, R1, R2및 R3는 같거나 다른 것으로 수소, -OH, Cl∼C6의 알킬기, C5∼C20의 알릴기 또는 C2∼C6의 알킬렌기이고, l, m 및 n은 각각 1∼3의 정수이다.
본 발명의 항생물질은 침상의 모양이며, 전반적으로 모든 용매계에서 낮은 Rf값을 갖고, 정색반응 결과 알칼리성 KMnOH4, 10% 황산 및 요오드에 양성 반응을 나타내는 것으로 보아 당을 화학 구조상에 포함함을 할 수 있으며, 융점은 127∼128℃이었다.1HNMR 분석 결과 당구조를 갖는 물질임이 판명되었으며,13C NMR 분석 결과 일반적으로 7.2δ 근처에서 공명하는 방향족 고리의 흡수 파장이 존재하지 않아 방향족 화합물을 함유하고 있지 않은 점 등을 종합 분석하여 검색한 결과, 본 발명의 항생물질은 신규 물질임이 판명되어, 이를 트리헥소신(Trihexocin)이라 명명하였다.
트리헥소신은 벼의 도열병, 문고병 발병균에 대하여 50∼100㎍/ml에서 활성이 나타났으며, 그람(Gram)양성균, 그람 음성균 및 효모에 대하여는 환성을 나타내지 않았고, 곰팡이에 대해서만 활성을 나타내었으며, 도열병 및 문고병 발병균에 대해서는 pH 6∼8에서 안정하였으나, 도열병 발병균에 대해서는 pH 5에서 68%, pH 10에서 70%의 활성을 나타내었다. 트리헥소신의 PH 안정성은 도열병, 문고병 발병균에 대해서 pH 5에서 0%, pH 9, 10에서 각각 82%, 0%의 활성을 나타내었고, 전체적으로 볼 때 산에는 불안정하지만 알칼리에는 비교적 안정하였다.
또한, 도열병 및 문고병 발병균에 대한 활성이 30∼40℃에서는 안정하였으나, 도열병 발병균에 대해서는 50℃, 60℃에서 각각 80%, 60%의 활성을 나타내었고, 문고병 발병균에 대해서는 50℃에서 70%의 활성을 나타내었으나, 60℃ 이상에서는 활성이 실활되었다.
본 발명의 항진균성 항생물질인 트리헥소신은 당구조를 갖는 물질이지만, 생리활성을 갖는 이의 유도체 및 염을 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자라면 용이하게 얻을 수 있는 것이다.
또한, 트리헥소신은 바실러스 속(Bacillus sp.) SY-414(KCCM-10043)으로부터 생산되며, 이의 생산 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
춘천시 근교에서 채취한 토양을 증류수에 현탁하여 평판배양하여 균주를 분리하고, NB 액체배지(육즙(meat ext.) 0.3%, 펩톤(peptone) 0.5%)에 백금이로 균주를 1회 접종하고, 30℃에서 3일동안 진탕배양하였다. 배양액을 12,000×g에서 20분간 원심분리 후 피리큘라리아 오라이제(Pyricularia oryzae) IFO 30517과 펠리큘라리아 필라멘토사(Pellicularia filamentosa) IFO 8985를 피검균으로 사용하여 페이퍼 디스크(paper disk)법으로 배양 상등액의 항균활성을 측정하였다. 분리균 중에서 두가지 피검균에 대하여 모두 활성을 나타내고 항균활성이 좋은 균주를 선별하여 동정한 결과, 바스실러스 리치니포르미스(Bacillus licheniforimis)와 유사하지만 신규 미생물임이 확인되어 이를 바실러스 속(Bacillus sp.) SY-414로 명명하고 한국종균협회에 1993년 9월 14일자로 기탁(기탁번호 KCCO-10043)하였다.
본 발명의 바실러스 속 SY-414 균주의 동정은 본 발명이 속하는 기슬 분야에서 통상적으로 행하는 일반적인 동정범에 따라 행하였으며, 동정 결과는 표 1∼5와 같다.
표 1. SY-414의 형태학적 특성
+: 양성 - : 음성
상기 표1 에 기재된 바와 같이 본 발명의 바실러스 속 SY-414 균주는 단간균이며 운동성이 있있고, 제 1 도 및 제 2 도에 도시된 바와 같이 바실러스 속 SY-414 균주는 1.5㎛×3.6㎛의 크기이었다. 바실러스 속 SY-414 균주가 형성하는 포자는 타원형이며 세포의 중심에 위치하고 포자당은 팽창되지 않은 상태이었다
표 2. 바실러스 속 SY-414 균주의 배양학적 특성
표 3. 바실러스 속 SY-414 균주의 생리학적 특성
+ : 양성 - : 음성
표 4. 바실러스 속 SY-414 균주의 당이용성
+ : 사용 - : 비사용
표 5. 바실러스 속 SY-414 균주의 당분해
+ : 양성 - : 음성
상기 표에 나타난 바와 같이 본 발명의 바실러스 속 SY-414 균주의 생육 온도 범위는 15-50℃이었고, 생육 pH 범위는 3-10이었으며, 염농도 6%까지 생육이 가능하였고, 카탈라제 양성, 옥시다제 음성 및 프로피오네이트 이용성을 나타내었으며 전분을 가수분해하였다. 또한, 당의 이용성 실험 결과 여러 가지 당 중에서 셀룰로오스를 제외한 모든 당을 균체의 생육에 이용하고, 당의 발효성 실험 결과 일부 당으로부터 산이 생성되었지만 가스는 모든 당으로부터 생성되지 않았다.
상기와 같이 분리 동정된 바실러스 속 SY-414 균주를 100ml. 삼각 플라스크에 20ml 분주한 영양 액체배지(Nutrient broth)에 백금이로 1회 접종한 후, 30℃에서 48-96시간 진탕배양하고, 정지기에 도달한 균주를 본 발명의 종균으로 사용하였다.
제 3 도는 영양 액체배지에서의 배양 시간에 따른 바실러스 속 SY-414 균주의 생육과 항생물질 생산을 나타낸 것으로 균체의 생육이 배양 시간 4일 이후에서 정지기에 도달하였으며, 항생물질 생산은 균체의 정지기인 4일을 경과하였을 때 최대를 나타내었고 4일 이후에는 점차 감소하였다.
본 발명의 바실러스 속 SY-414 균주의 항균활성 측정은 피검균으로 도열병균(Pyricularia oryzae IFO 30517) 및 문고병균(Pellicularia filamentosa IFO 8985)를 선택하여 아래와 같은 컵 방법(Cup method)으로 행한다.
즉, PDA 평판배지(Potato Dextrose Agar plate) 8ml를 멸균한 후 45℃ -50℃로 냉각하고, 냉각된 배지에 피검균 현탁액을 각각 0.2ml씩 접종하여 PDA 평판배지에 중 충한 후, 중층된 평단배지 표면에 컵(내경 6mm, 외경 8mm, 높이 10mm)을 올려놓고 분리균주의 배양상등액 0.3ml를 가하여 30℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 형성된 생육 저지환의 직경을 측정한다.
본 발명의 바실러스 속 SY-414 균주의 배양 온도에 따른 항생물질 생산을 검토하기 위하여 영양 액체배지 20ml에 중균배양액을 1.0%(V/V)되게 접종하고 각각 온도를 달리하여 96시간 진탕배양시킨 후 원심분리하여 배양 상등액의 항균활성을 측정한 결과, 30℃에서 항생물질 생산이 최대가 되었으며, 이의 결과를 제 4 도에 도시하였다.
한편, 본 발명의 바실러스 속 SY-414 균주의 항생물질 생산에 미치는 초기 pH의 영향을 검토하기 위하여 배지의 pH를 염산과 수산화나트륨으로 4에서 10까지 조절하고 종균 배양액을 1.0%씩 접종하여 30℃에서 96시간 진탕배양시킨 후 원심분리하며 배양 상등액의 항균활성을 측정한 결과, 초기 pH 8에서 항균활성이 가장 좋게 나타났으며, 이의 결과를 제 5 도에 도시하였다.
또한, 탄소원에 따른 항생물질의 생산을 검토하기 위하여 기본배지에 각종의 탄소원을 1.0%씩 첨가하고 종균 배양액을 1.0%씩 접종하며, 30℃에서 96시간 진탕배양시키고, 배양액을 원심분리하여 배양 상등액의 항균발성을 측정하였으며, 이의 결과를 표 6에 기재하였다.
표 6. 항생물질 생산에의 탄소원의 영향
상기 표 6에서 기재된 바와 같이 가용성 스타치를 첨가하였을 때 가장 좋은 항생물질 생산을 나타낸다. 이때 가용성 전분의 농도는 3%(W/V)가 생산에 가장 좋았다. 뿐만 아니라, 질소원에 따른 항생물질의 생산을 검토하기 위하여 기본 배지에 각종의 유기질소원과 무기질소원을 각각 1.0%(W/V)씩 첨가하고 종군 배양액을 1.0%씩 접종한 후, 30℃에서 96시간 동안 진탕배양하고, 배양액을 원심분리하여 상등액의 항균활성을 측정하였으며, 이의 결과를 표 7에 기재하였다.
표 7. 항생물질 생산에의 질소원 영향
상기 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이 비프 추출물을 포함한 모든 유기질소원들은 항생물질 생산에 좋은 효과를 나타낸 반면, KNO3를 포함한 모든 무기질소원들은 항생물질 생산에 효과가 없으며, 유기질소원 중 효모 추출물(yeast extract)를 첨가하였을 때 항생물질의 생산이 가장 현저하게 증가하였고, 효모 추출물은 0.8%(W/V) 첨가하는 것이 가장 적합하였다.
또한, 무기염류에 따른 항생물질의 생산을 검토하기 위하여 기본배지에 각종의 무기염류를 각각 0.1%씩 첨가하고, 종균 배양액을 1.0%(V/V)씩 접종한 후, 30℃에서 96시간 동안 진탕배양하고, 배양액을 원심분리하여 상등액의 항균활성을 측정하었으며, 이의 결과를 표 8에 기재하였다.
표 8. 항생물질 생산에의 무기염류 영향
상기 표 8에 기재된 바와 같이 KCl이 가장 생산에 좋있고 MgSO4ㆍ7H20ㆍ CaCl2ㆍ NaCl 등은 항생물질 생산에 별다른 영향을 미치지 못하였고, ZnSOㆍ7H2OㆍMnCl2ㆍ4H2Oㆍ FeCl3ㆍ6H2O 및 CoCl2ㆍ 6H2O의 금속염에 의하여는 항생물질의 생산이 현저하게 저해되었다. 항생물질 생산을 위한 KCl의 영향을 검토한 결과 0.2%(w/v)에서 항생물질 생산이 가장 높게 나타단다
상기와 같이 온도, pH 및 영양을 SY-414 최적의 조건으로 한 영양액을 YS배지라 칭한다.
항생물질 생산 최적배지인 YS배지와 NB배지(영양 액체배지 Nutrient broth) 이용하여 30℃에서 96시간 진탕배양하여 pH변화, 생육상태 및 항생물질의 생산량을 비교 검토한 결과, 제 6 도 및 제 7 도에 도시된 바와 같이 YS배지를 사용하여 30℃에서 바실러스 속 SY-414 균주를 배양하였을 때 균체의 생육은 3일 이후에 정지기에 도달하였으며 항생물질의 생산은 균체의 대수증식기인 2일이 경과한 후 3일째 최대가 되었다. NB배지와 YS배지에서의 항생물질 생산은 피검균 도열병균에 대해서 저지환의 크기가 14.2mm, 24.1mm로 나타났고, 항생물질 생산량은 NB배지보다 YS배지에서 배양하였을때 약 2배 정도 증가되었으며, YS배지에서 배양 중의 pH변화 범위는 1.0 이내로 비교적 일정하게 유지되었고, 항생물질 생산은 NB배지에서는 96시간, YS배지에서는 72시간에서 최대로 생산되어 생산 시간에 변화가 있다는 것을 할 수 있었다.
또한, NB배지와 YS배지에서의 항생물질 생산은 문고병균에 대해서 저지환의 크기가 11.2mm, 21.0mm로 나타나 항생물질 생산량을 NB배지보다 YS배지에서 배양하였을 때 약 2배 정도 증가되었다.
YS배지를 이용한 최적 배양 조건에서의 도열병과 문고병에 대한 저지환 크기는 제 8 도 및 제 9 도와 같다.
제 8 도 및 제 9 도에 도시된 바와 같이 본 발명의 SY-414 균주가 생산하는 도열병균에 대한 항생물질의 항균효과는 저지환이 약 18mm로 나타났으며 문고병균에 대한 항생물질의 항균효과는 저지환이 약 14mm로 나타났다.
상기와 같은 바실러스 속 SY-414(KCCM-10043)를 YS 액체배지에 접종하어 30℃에서 96시간 진탕배양한 다음, 배양액을 12,000×g에서 20분간 원심분리한 20l의 배양상등액을 동량의 에필 아세테이트(Ethyl acetate)로 추출한다.
용매층을 모아 회전증발기를 이용, 감압상태에서 용매를 제거하고 농축 활성부분을 모아 물에 용해시켜 동결건조한다.
동결건조된 분말을 메탄올(methanl : CH3OH)에 용해시키고, 용해액을 실리카겔 컬림 크로마토그라피(Silica gel column chromatography)에 충진하고 메탄올로 용출하여 감압상태에서 용배를 제거한 다음, 용매가 제거된 활성부분을 진공농축하고 물에 용해시켜 동결건조한다.
동결건조된 분말을 디클로로메탄(Dichloromethane, CH2Cl2)과 메탄올 1 : 5 혼합액에 용해시키고, 용해액을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피(Sephadex LH-20 column chromatography)에 충진하고, 디클로로메탄 : 메탄올(1 : 5) 혼합용액으로 용출하여 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 활성부분을 감압상태에서 진공농축시키고 물에 용해시켜 동결건조한다.
동결건조된 분말을 메탄올에 용해시켜 4℃에서 냉장 방치하여 결정성의 항생물질을 얻는다.
상술한 바와 같이 본 발명의 균주 바실러스 속(Bacillus sp.) SY-414를 배양하기 위한 탄소원으로는 가용성 전분(Soluble starch), 만니톨(Mannitol), 자일로오스(Xylose) 및 글루코오스(Glucose) 등이 사용될 수 있으며, 질소원으로는 육즙(Beef extract), 효모 추출액(Yeast extract), 펩톤(Peptone) 및 소이빈 밀(alf (Soybean meal) 등이 사용될 수 있고, 무기염류원으로는 염화나트륨(NaCl), 염화칼롬(KCI), 황산마그네슘( MgSO4) 및 인산칼륨(KH2PO4) 등이 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 균주를 이용하여 항생물질을 생산할 경우 가용성 전분(Soluble starch) 3%(W/V), 효모추출액(Yeast extract) 0.8%(W/V), 염화칼륨(KCl) 0.2%(W/V)을 사용한 배지에서 가장 생산성이 좋았으며, 배양조건은 25∼35℃에서 호기적으로 48∼96시간 배양하는 것이 적당하였다.
다음의 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 법주를 한정하는 것은 아니다
(실시예 1 ;)
(균주의 선별)
강원도 춘천시 근교에서 채취한 토양을 증류수에 일백금이 현탁시킨 후, NB평판배지(육즙 0.3%, 펩톤 0.5%, 한선 1.2%)에 도말하고 30℃에서 1∼2일 배양하여 균주를 분리하였다. 영양 액체배지(NB배지) 10ml에 분리한 균주를 백금이로 1회 접종하여 30℃에서 76시간 동인 진탕배양한 후, 배양액을 12,000×g에서 20분간 원심분리하고 파이리큐레리아 오라이제(Pyricularia oryzae) IFO 30517과 피리큐레리아 필라덴트사(Piricularia filamentosa) IFO 8985를 피검균으로 사용하며 배양 상등액의 항균 활성을 측정하고, 상기 두 균주에 가장 높은 항균 활성을 나타내는 바실러스 속(Bacillus sp.) SY-414를 얻었다.
(실시예 2 ;)
(종균 배양)
실시예 1에서 사용한 기본 액체배지(NB배지) 20ml를 넣은 100ml. 삼각 플라스크에 분리 균주를 백금이로 1회 접종한 후, 30℃에서 72시간 배양하여 정지기에 도달한 균주를 본 발명의 종균으로 사용하였다.
(실시예 3 ;)
(본배양)
가용성 전분(Soluole Starch) 3.0%, 호모추출액(yeast extract) 0.8% 및 염화칼륨(ICCL) 0.2%로 구성되는 YS배지 20l에 종균 배양액 200ml를 가하고 30℃, pH 8에서 72시간 동안 호기적 상태로 배양한 후, 12,000×g에서 20분동안 원심분리하여 배양상등액을 정제에 사용하였다.
(실시예 4 ;)
(정제)
실시예 3에서 얻은 배양상등액을 동량의 에틸 아세데이트로 추출한 다음, 용매층을 모아 회전증발기를 이용 감압상태에서 용매를 제거하고 농축 활성부분을 모아 물에 용해시켜 동결건조 후, 동결건조 분말을 메탄올에 용해하고 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 행한다. 메탄올로 용출하고 감압상태에서 용매를 제거한 다음 용매가 제거된 활성부분을 진공농축하고 물에 용해시켜 동결건조한다. 동결건조된 분말을 디클로로메탄(Dichloromethane. CH2Cl2)과 메탄올 1 : 5 혼합액에 용해시키고, 용해액을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피(Sephadex LH-20 column chromatography)에 충진하고, 디클로로멘탄 : 메탄올(1 : 5) 혼합 용액으로 용출하여 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 활성부분을 감압상태에서 진공농축시키고, 물에 용해시켜 동결건조한다.
동결건조된 분말을 메탄올에 용해시켜 4℃에서 냉장 방치하여 배양액 10l로부터 정제 트리헥소신 50mg을 얻었다. 정제된 트리헥소신의 결정 사진은 제 10 도에 나타내었다.
제조된 상기 항생물질을 물에 용해시켜서 n-부탄올 : 초산 : 물(n-BuOH: AcOH: H2O)(4: 1: 5) 혼합액을 용매로 하여 틴 레이어 크로마토그라피(thinlayer chromatography : TLC)를 행한다.
TLC를 행하여 UV(Ultra viloet) 조사하고, 알칼라인 과망간산 칼륨으로 발색시킨 결과 단일 스파트(Spot)임을 확인할 수 있었다.
또한, 제조된 트리헥소신 수용액을 tlc에 스파트하고 각각의 용매계를 사용하여 전개시킨 후 UV 일루미네이터(UV Illuminator UVGL-25, UVP)로 조사하거나 알칼라인 과망간산 칼륨을 분무하여 스파트를 관찰하여 Rf값을 조사한 결과는 표 9와 같다.
표 9. 항생물질의 TLC 특성
상기 표에서 나타나듯이 전반적으로 모든 용매계에서 실시예 4에서 얻은 항생물질의 Rf값은 낮았으며, 메탄올 : 물 : 초산(4 : 0.75 : 0.25)의 혼합용매에서 0.78의 Rf값을, 벤젠 부탄올 : 물(18 : 0.2 : 2)의 혼합용매에서는 0.86의 Rf값을 나타내었고, 또한 트리헥소신은 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 극성용매에서는 잘 용해되었으나 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 벤젠(Benzene), 헥산(Hexane) 등과 같은 비극성 용매에는 용해되지 않음을 알 수 있었다.
또한, 실시예 4에서 얻은 항생물질의 수용액을 tlc에 스파트하여 n-부탄올-초산-물(4 : 1 : 5) 용매계에서 전개시킨 후 각각의 발색 시약을 분무하거나 항생물질 수용액과 혼합하여 정색반응을 관찰한 결과, 표 10과 같은 정색반응을 나타내었다.
표 10 항생물질의 정색반응
+ : 양성 - : 음성
상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이 알칼라인 과망간산 칼륨, 10% 황산 및 요오드에 양성반응을 나타내어, 당을 화학 구조상에 포함하고 있는 것으로 확인되었다.
한편, 융점을 측정하기 위하여 융점측정기를 사용하여 온도를 1℃/min로 상승시키면서 융점을 측정한 결과, 융점 온도범위는 127∼128℃이었으며, 실시예 4에서 얻은 항생물질을 물에 용해시켜 UV/Vis 스펙트로포토미터(UV/Vis spectrophotometer, Perkin-Elmer UV 5525)를 사용하여 UV 흡수 스펙트럼을 측정한 결과 제 12 에 도시된 바와 같이 흡수대는 나타나지 않았다.
또한, 실시예 4에서 제조한 항생물질을 가압정제법(KBr)으로 IR 스펙트로포토미터(IR spectrophotometer : Perkin-Elmer 1430)을 사용하여, IR 스펙트럼을 측정한 결과, 제 12 도에 도시된 바와 같이 3650-2300cm-1및 2927cm-l, 1700cm-l, 1594cm-1및 1422cm-1등의 주요 작용기를 포함한 흡수대가 나타났다. NMR 스펙트로미터(NMR spectrometer)를 사용하여1H NMR,13C NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 제 13 도 및 제 14 도에 도시된 바와 같이1H NMR 스페트림에서는 7.25 근처에서 나타나는 방향족 화합물의 구조를 함유하지 않았고,13C NMR 스펙트럼에서는 70∼78PPm에서 나타나는 당물질의 시그널(signal)을 볼 수 있었다. 또한 트리헥소신을 아세틸화(acetylation)시킨 후 메스 스펙트로미터(Mass spectrometer)를 사용하며 매스 스펙트럼을 측정한 결과를 제 15 도에 도시하였다.
상기와 같은 결과들을 종합분석하여 본 결과 실시예 4에서 얻은 항생물질은 아래와 같이 표기된다.
상기에서, a는 CH2OH이며 b는 (OH)3, b'는 (OH)2이다.
즉, 실시예 4의 항생물질은 3개의 헥소스(hexose)로 구성된 삼당류의 물질이고 분자량은 504이었다.
본 발명의 항생물질의 농도에 따른 벼의 도열병 발병균에 대한 저지환의 크기는 각각의 항생물질 농도 50㎍/ml에서 9. 8mm, 100㎍/ml에서 14. 6mm, 200㎍/ml에서 19.5mm 및 400㎍/ml에서 23. 3mm 저지환을나타내며, 문고병 발병균에 대한 저지환의 크기는 각각의 항생물질 농도 100㎍/ml에서 12.3mm, 200㎍/ml에서 16.2mm 및 400㎍/ml에서 20.2mm의 저지환을 나타낸다.
본 발명의 항생물질의 생리학적 성질을 보기 위한 항균 스펙트럼은 각각의 피검균에 대하여 페이퍼 디스크 한천 확산법(Paper disc agar diffusion method)을 이용하여 아래와 같이 행한다.
세균과 칸디다의 경우에는 각 피검균 배양액 0.1ml를 소프트 아가(한천 0.8%(w/v))에 접종하여 오버레이한 평판배지를 제조하고, 곰팡이는 포자를 균일하게 현탁시킨 후 0.1ml를 PDA(potatod extrose agan)에 접종하여 오버레이한 평판배지를 제조한 다음, 제조된 평판배지에 본 발명의 항생물질 수용액(10O㎍/ml)을 적신 페이퍼 디스크(직경 8mm)를 놓아 30℃에서 24-48시간 배양하여 저지판의 생성 유무를 관같하였으며, 항균 스펙트럼을 표 11에 나타내었다.
표 11. 항생물질의 항균 스펙트럼
+: 양성 - : 음성
상기 표 11에 나타나듯이 그람 양성, 음성 세균 및 효모에 대하여는 활성을 나타내지 않으며 곰팡이에 대해서만 활성을 나타낸다.
본 발명의 항생물질의 활성에 미치는 pH의 영향을 보기 위하며 항생물질 수용액(100㎍/ml)의 0.05M의 구연산소다-염산 완충액(Sodium citrate-HCl buffer), 인산염칼륨 완충액(Potassium phosphate buffer), 수산화 암모늄-염화암모늄 완cnd액(Ammonium hydroxide-ammonium chloride buffer)에서 2시간 동안 처리한다.
처리한 항생물질 수용액을 컵에 가한 다음, 30℃에서 48시간 배양하여 생성된 저지환의 크기로 비교한 결과, 도열병균에 대하여 pH 6, 7, 8에서는 안정하였으나 pH 5에서는 68%, pH 10에서는 70% 활성을 나타내며, 문고병균에 대하여 pH 6, 7, 8에서 안정하나 pH 5에서 0%, pH 9, 10에서는 각각 82%, 0%의 활성을 나타내어 산에는 불안정하지만 알칼리에는 안정하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 항생물질의 활성에 미치는 온도의 영향을 보기 위하여 항생물질 수용액(100/'g/ml)을 30℃, 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃에서 1시간 동안 처리한 항생물질 수용액을 검에 가한 다음 48시간 배양하여 생성된 저지환의 크기를 비교한 결과, 도열병균에 대하여서 30℃, 40℃에서는 안정하나 50℃, 60℃에서는 각각 80%, 60%의 활성을 나타나며, 문고병균에 대해서는 30℃, 40℃에서는 도열병균과 유사하게 활성이 유지되나 50℃에서는 70%의 활성이 있으나 60℃ 이상에서는 실활된다.
또한, 본 발명의 항생물질의 항균력을 측정하기 위하여 벼를 화분에서 잎의 수가 3-4개 정도 될 때까지 생육시킨 후 일정 부위에 도열병 균 문고병균을 감염시키고, 벼에 도열병 및 문고병이 발병된 후 50㎍/ml, 100㎍/ml 농도의 항생물질을 도포 처리한 후 7일, 14일 동안 관찰하여 대조구와 비교, 벼의 생육상태를 관찰한 결과, 대조구와 비교하여 볼때, 도열병, 문고병 모두 항생물질 농도 50㎍/ml-100㎍/ml에서 활성이 나타났다.
한편, 본 발명의 항생물질의 독성을 실험하기 위하여 ICR 마우스(6주-8주령)를 각각 5마리씩 이용하여 복강내, 경구내에 항생물질(1mg/ml)을 투여하고 2주 동안 생존여부를 관찰한 결과 10마리 모두 100%의 생존율을 나타내어 독성이 없는 것으로 판단되었다.
본 발명의 항생물질은 단독 또는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 충전제 등을 혼합하여 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 항생물질을 유호 성분으로 하는 조성물을 제조하여 사용할 수 있다.
Claims (11)
- 하기 일반식(I)로 표현되는 신규 항진균성 항생물질.상기 식에서, R1, R2및 R3는 같거나 다른 것으로 수소, -OH, Cl∼G의 알킬기, C5∼C20의 알릴기 또는 C2∼C6의 알킬렌기이고, /, m 및 n은 각각 1∼3의 정수이다.
- 제1항에 있어서, R1, R2는 R3는 -OH이고,l은 3, m은 2, n은 3인 것을 특징으로 하는 항진균성 항생물질.
- 항진균성 활성을 갖는 신규 바실러스 속(BaCillus sp.) SY-414 미생물(KCCM-10043).
- 바실러스 속(Bacillus sp.) SY-414 균주를 애체배지에서 배양하고, 배양액을 원심분리하여 배양상등액을 에틸 아세데이트로 추출하고, 용매층을 모아 용매를 제거한 후, 용매가 제거된 농축 활성부분을 모아 용매에 용해시켜 컬럼 크로마토그라피를 행하고, 용매를 제거한 후 농축 활성부분을 용매에 용해시켜 또 다시 컬럼 크로마토그라피를 행하고, 활성부분을 모아 용매를 제거한 후 물에 용해시켜 동결건조하고, 얻어진 분말 상태의 항생물질을 용배에 용해시커 4℃ 냉장실에 방치시켜 결정화함을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 액체배지는 탄소원으로서 가용성 전분, 클루코오스, 자일로오스 또는 만니톨 중 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 액체배지는 질소원으로서 육즙, 효모 추출액, 펩톤 또는 소이빈 중1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 액체배지는 무기염류원으로서 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화칼륨 도는 인산칼륨 중 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 온도 25℃-35℃, 배지 pH 6-9, 호기적 조건하에서 48-96시간 진탕배양함을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 컬럼 크로마토그라피는 실리카겔 컬럼 크로마토그라피 및 세파덱스 LH-20 컬림 크로마토그라피인 것을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제9항에 있어서, 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 행할 때의 용매는 메탄올이고, 세파텍스 LH-20 컬럼 크로마토그라피를 행할 때의 용매는 디클로로메탄 : 메탄올(1 : 5) 혼합액인 것을 특징으로 하는 항진균성 항생물질의 생산 방법.
- 제1항의 항생물질을 유효 성분으로 하는 조성물.
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