CN1135238A - 抗真菌的新抗菌素和能产生上述抗菌素的芽孢杆菌属新菌种及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能产生抗真菌的抗菌素三己霉素(Trihexocin)的芽孢杆菌属新菌种SY-414及其产生方法。抗真菌的新抗菌素如通式(1)所示，其中每个R代表-H、-OH、-NH2、C1-C6烷基、C5-C20烯丙基、或C2-C6亚烷基，下标1、m或n为小于3的整数。上述抗真菌的抗菌素的生产方法如下：从土壤中分离出具有高度抗植物真菌活性的芽孢杆菌属新菌种(尤其是稻梨孢和丝核薄膜革菌)并进行了鉴定；将培养液离心处理，用乙酸乙酯提取上清液，收集有机层。蒸发处理活性部分，用甲醇溶解之，然后进行硅胶柱层析处理；蒸发处理活性部分，用二氯甲烷：甲醇(1∶5)混合液溶解并进行Sephadex LH-20柱层析处理。蒸发处理活性部分，用水溶解并冻干。将上面得到的粉状抗菌素溶于甲醇，在4℃条件下贮存，制备出晶状抗菌素三己霉素；三己霉素在50-100mg/ml的浓度下对被真菌感染的植物具有高度抗真菌活性。三己霉素由3个果糖单位组成，表现出无毒特性。

Description

抗真菌的新抗菌素和能产生上述抗菌素的 芽孢杆菌属新菌种及其生产方法
                       技术领域
本发明涉及如下通式(1)所示的抗真菌的新抗菌素、和能产生上述抗菌素的芽孢杆菌属新菌种及其产生方法。
Figure A9419379900041
其中每个R代表-H、-OH、-NH2、具有1-6个碳原子的烷基、具有5-20个碳原子的烯丙基或具有2-6个碳原子的亚烷基，下标l、m或n为小于3的整数。
                    背景技术
自1929年Fleming发现了能抑制金黄色葡萄球菌生长的特异青霉以后，对有关抗菌素的研究进展很快，已开发出抗致病性微生物的有效抗菌素。
一般来说，对抗原核细胞(如致病性微生物)的抗菌素的研究已有所进展，而对抗真核细胞(如真菌)的有效抗菌素的研究则进展不大。
对用于人及植物病害医治及预防的抗真菌的抗菌素的研究开始于Elizabeth和Brown。他们分离出了对白假丝酵母、新型隐球酵母具有抗真菌活性的制霉菌素。而后又发现了具有抗植物病原体活性的灰黄霉菌，而Gold等人则开发出了具有抗酵母的抗菌素效应的两性霉素B。Arima等人发现了吡咯尼群，其由对酵母和革兰瓦阳性细菌具有抑制活性且毒力很小的假单孢菌属P.pyrrocinia所产生。Isono等人发现了多氧菌素，其对造成稻类病害的真菌具有活性，但对人、兽类、鱼类和作物毒性甚小。
Umezawa等人1965年发现了春日霉素，它是一种抗造成稻胚病害真菌的抗菌素，对稻梨孢具有预防作用并容易被稻类作物吸收。Iwasa等人开发了有效霉素，其对丝核薄膜革菌具有预防作用。
后来，人们又开发出了能抑制真菌或酵母且毒性很低的阿库来菌素、对稻梨孢具有活性的lipopeptin和neopeptin，还有对丝状真菌具有高活性的mycoversilin。
作为新型核苷抗菌素的dapiramicin，由小单孢菌属菌种产生并对丝核薄膜革菌具有特效，同时开发出的还有albopeptin A、fengycin和octacosamicin。在上述抗菌素中，春日霉素、有效霉素和多氧霉素通常被用作农业抗菌素，但是这些抗菌素的生产成本太高而产生了经济问题。
合成性有机化合物已产生副作用，如造成农业污染以及残余化学剂渗入土壤中。在目前的研究中发现，土壤中的大部分合成性有机化合物的残余化学剂已造成农业杀虫剂污染。特别是由杀虫剂毒性引起的生态系统的破坏已引发了包括环境污染在内的许多严重的社会问题。因此，由于致癌的可能性和残余毒性的存在，多种合成性有机化合物一直被禁用作杀虫剂。
                    本发明的公开
本发明的目的在于提供新型抗真菌的新抗菌素及其衍生物，它们都具有优良的抗真菌活性并因其无毒而不会造成环境污染。
本发明的另一个目的是提供产生上述抗菌素的芽孢杆菌属新菌种以及抗菌素的生产方法。
本发明的再一个目的是提供含有作为有效成分的上述抗真菌的抗菌素的组合物。
为了达到其它目的，从土壤中分离出芽孢杆菌属新菌种，其对植物真菌(特别是稻梨孢和丝核薄膜革菌)具有高的抗菌素效果，并进行了鉴定。在YS培养基中对该菌种进行培养并进行离心处理。将上清液用乙酸乙酯进行提取。收集有机层并进行蒸发处理。将活性部分溶于甲醇中，随后用甲醇进行硅胶柱层折处理。除去甲醇并将残余物溶于二氯甲烷∶甲醇(1∶5)混合液中并进行SephadexLH-20柱层折。除去溶剂后，收集活性部分并溶于水中，进行冻干处理。最后得到具有优良抗真菌活性的粉状抗菌素。这样，本发明就成功地提供了一种非常简便而经济的新抗菌素的生产方法。
                   附图简述
图1为芽孢杆菌属菌种SY-414的电子显微镜照片。
图2为由所发明的芽孢杆菌属菌种SY-414形成的芽孢的电子显微镜照片。
图3代表依据培养时间的细胞生长和抗菌素生产。
图4代表依据培养温度的抗菌素生产。
图5代表依据初始pH的抗菌素生产。
图6代表NB及YS培养基中细胞生长和抗稻梨孢的抗菌素活性。
图7代表NB及YS培养基中的细胞生长和抗丝核薄膜革菌的抗菌素活性。
图8为抗稻梨孢的抑制区的照片。
图9为抗丝核薄膜革菌的抑制区的照片。
图10为在实施例4中得到的结晶抗菌素的显微照片。
图11为由实施例4中得到的抗菌素的紫外线光谱。
图12为由实施例4中得到的抗菌素的红外光谱。
图13为由实施例4中得到的抗菌素的1HNMR谱。
图14为由实施例4中得到的抗菌素的13CNMR谱。
图15为由实施例4中得到的抗菌素的质谱。
图16为由实施例4中得到的抗菌素的HPLC糖分析。
实施本发明的最佳方式
以下将详细阐述本发明的实施方案。
本发明的抗真菌的抗菌素(以下称为“Trihexocin”)代表下述通式(1)：
其中每个R代表-H、-OH、NH2、C1-C6烷基、C5-C20烯丙基、或C2-C6亚烷基、下标l、m或n为小于3的整数。
本发明的抗菌素表现为针状，在普通溶剂中显示出低Rf值，其熔点为127-128℃。当其与碱性高锰酸盐、10％的硫酸和碘发生阳性颜色反应(包括1H核磁共振分析)时，证实该新抗菌素含有糖部分。13C核磁共振分析表明其不含任何芳香化合物。从以上结果我们可以断定，本发明的抗菌素为新物质，将其命名为“三己霉素(Trihexocin)”。
本发明的三己霉素浓度为50-100mg/ml时对稻梨孢和丝核薄膜革菌具有活性，但是对革兰氏阳性和阴性细菌及酵母并无抗性。对稻梨孢的抗菌活性在pH6、7和8时是稳定的，但在pH5时活性为68％，在pH10时活性为70％。在pH6、7和8时，对丝核薄膜革菌的抗菌活性是稳定的，但在pH5时活性为0％，在pH9时活性为82％，在pH10时活性为0％。
另外，在30℃和40℃条件下对稻梨孢的抗菌活性是稳定的，但在50℃时活性为80％，在60℃时活性为60％。在30℃和40℃条件下对丝核薄膜革菌的抗菌活性是稳定的，但在50℃时活性为70％，在60℃以上条件下失效。
纵观上述结果，本发明中表现为抗真菌的抗菌素的三己霉素为一种含有糖组分的物质、其具有生物活性的衍生物及盐易于得到。
三己霉素是由芽孢杆菌属菌种SY-414(KCCM-10043)产生的，其生产方法详述如下。
从朝鲜江原道春川区采集土样，悬浮于蒸馏水中，在平板上进行培养，然后分离出微生物。
将所分离的菌株接种于营养肉汤(NB培养基：0.3％的肉膏、0.5％的胨)中，在30℃条件下培养3天。
将培养液以12,000xg离心处理20分钟，利用稻梨孢IFO30517和丝核薄膜革菌IFO8985作为试验微生物，以纸盘法检测出上清液的抗菌素活性。
选择出表现了对上述试验微生物具有最高活性的分离菌株，并进行了鉴定。
上述微生物与地衣形芽孢杆菌类似，但确定为一种新微生物，因而名命为芽孢杆菌属菌种SY-414，于1993年9月14日保藏于朝鲜培养物保藏基金会(KFCC)，保藏号为KCCM-10043。
利用通常使用的一般性鉴定方法鉴定了本发明的芽孢杆菌属菌种SY-414，结果见表1-5。
表1菌株SY-414的形态学特性。
形态细胞大小游动性革兰氏染色鞭毛孢子形态孢子位置孢子囊膨胀 杆状1.5μm×3.6μm阳性阳性阳性椭圆状中央阴性
如表1所示，本发明的芽孢杆菌属菌种SY-414为杆状，具游动性，细胞大小为1.5μm×3.6μm(如图1所示)。其孢子为椭圆状，位于中央位置(如图2所示)，孢子囊未膨胀。
表2菌株SY-414的培养特性
形状表面边缘隆起不透明性颜色光泽 环状光滑波浪状具脐状突起不透明米色闪光
    营养肉汤(30℃，1-2天)生长丰度，混浊，并具菌膜及沉淀
表3菌株SY414的生理特性
生长的温度范围生长的PH范围生长的NaCl耐受性过氧化氢酶氧化酶脲酶酯酶(Tween80)B-半乳糖苷酶精氨酸二水解酶苯丙氨酸脱氨基酶水解作用：淀粉酪蛋白纤维素七叶苷吲哚产生TSI琼脂上的H2S产生从蔗糖中的果聚糖形成从胨中的NH3产生从精氨酸中的NH3产生明胶液化作用柠檬酸的利用丙酸的利用甲基红试验优-普二氏反应硝酸盐还原作用反硝化作用 15-50℃3-10＜6％+-+-+--++-+--++++-+++++
对牛奶的作用：凝固胨化人血溶血作用氧化-发酵试验酪氨酸降解作用 -++发酵-
+：阳性                  -：阴性：
表4菌株SY-414的糖利用
    糖     利用
    阿拉伯糖纤维素二糖纤维素糊精果糖半乳糖甘油肌醇菊粉乳糖甘露醇甘露糖棉子糖可溶性淀粉山梨醇蔗糖     ++-+++++++++++++
+：利用                  -：未利用
表5菌株SY-414的糖发醇作用
    糖        酸    气体
    阿拉伯糖纤维素二糖纤维素糊精果糖半乳糖甘油肌醇菊粉乳糖甘露醇甘露糖棉子糖可溶性淀粉山梨醇蔗糖        -+--+-+---+++--+      ----------------
+：阳性              -：阴性
如上表中所示，芽孢杆菌属菌种SY-414的生长温度范围为15-50℃，PH范围为3-10，其可在高达6％的盐浓度下生长。SY-414表现为过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，可利用丙酸和水解淀粉。另外，如糖利用所示，除纤维素以外，SY-414可利用大多数糖类使微生物生长。如糖发酵所示，可从某些糖中产生酸，但所有糖中均不产生气体。
将芽孢杆菌属菌种SY-414接种于20ml的营养肉汤中，在30℃条件下培养48-96小时。在上述条件下制备出种子培养液。
图3代表依据在营养肉汤中培养时间的SY-414的生长及其抗菌素产生。经4天培养之后，SY-414的生长达到稳定状态，同时抗菌素产生达到最大值。4天培养以后产量减少。
为了检测芽孢杆菌属菌种SY-414的抗真菌活性，选用稻梨孢IFO30517和丝核薄膜革菌IFO8985作为试验微生物，利用杯溢法(cup method)来检测该抗菌素的活性。
将试验微生物平涂在PDA软琼脂平板上，如此制备出马铃薯葡糖琼脂(PDA)。将杯(内径6mm，外径8mm，高10mm)置于上述平板上，将培养上清液加入杯中。在30℃条件下对平板培养48-72小时，然后对抑制区进行测量。
为了检测SY-414因培养温度而引起的抗菌素产生，在20ml的营养肉汤中接种种子培养液(1.0％，V/V)，在各种温度下培养96小时。对上清液的活性进行测试。
图4代表抗菌素在30℃时的产生达到最大值。
为了检测SY-414在各种起始PH下的抗菌素产生，用HCl和NaOH调节培养基的PH。接种种子培养液(1.0％，V/V)，在30℃条件下培养96小时。
如图5所示，在起始pH8时活性达到最大值。
为了研究碳源对SY-414抗菌素产生的作用，将含有碳源(1.0％，W/V)的基本培养基在30℃条件下培养96小时。表6为抗菌素产生的结果。
表6碳源对抗菌素产生的作用
碳源         抑制区大小(mm)
   稻梨孢 丝核薄膜革菌
    对照糊精葡萄糖甘露醇蔗糖果糖乳糖棉子糖纤维素半乳糖麦芽糖可溶性淀粉木糖     14.011.214.315.513.914.213.713.814.013.513.216.514.1     12.88.012.513.511.512.311.311.89.710.012.014.012.2
如表6所示，在存在可溶性淀粉时抗菌素的产生最佳。淀粉的最适浓度为3.0％(W/V)。
为了检测氮源对SY-414抗菌素产生的作用，将有机和无机氮(1.0％，W/V)加入基本培养基中。接种种子培养液，在30℃条件下培养96小时，对上清液的抗菌素产生进行检测，结果见表7。
表7氮源对抗菌素产生的作用
氮源          抑制区大小(mm)
    稻梨孢  丝核薄膜革菌
    对照牛肉膏麦芽汁胨胰胨大豆粉酵母膏KNO3NaNO2NH4Cl(NH2)2CONH4NO3(NH4)2SO4     814.213.314.414.815.020.1888888     812.011.112.012.313.516.5888888
如表7所示，包括牛肉膏在内的有机氮源对抗菌素的产生是极有利的。当加入酵母膏时抗菌素的产生显著增加，而0.8％(W/V)的酵母膏为最适浓度。不过，所有的无机氮源对抗菌素的产生均无作用。
矿质源对SY-414抗菌素产生的作用也进行了研究。将矿质源(0.1％，W/V)加入，接种种子培养液，在30℃条件下培养96小时。对抗菌素产生进行测试，结果见表8。
表8矿质源对抗菌素产生的作用
矿质源          抑制区大小(mm)
    稻梨孢  丝核薄膜革菌
   对照BaCl2·2H2ONaClZnSO4·7H2OKClCuSO4·5H2OMgSO4·7H2OK2HPO4MnCl2·4H2OCaCl2FeCl3·6H2OCoCl2·6H2O     21.012.516.28.023.18.018.415.78.014.98.08.0     18.511.414.18.020.58.012.312.58.012.18.08.0
如表8所示，KCl为抗菌素产生的最佳矿质源。抗菌素产生受M9SO4·7H2O、CaCl2、NaCl、或K2HPO4影响不大。其它矿质对抗菌素产生无作用。KCl的最适浓度为0.2％(W/V)。芽孢杆菌属菌种SY-414抗菌素产生的上述最佳培养液被指定为“YS培养基”。
在YS和NB培养基中于30℃条件下对SY-414进行培养，对抗菌素的pH变化、生长和产生进行检测(见图6和图7)。
当在YS和NB培养基中培养SY-414时，在第3及第4天分别达到生长稳定期。在每个培养基中，在相同培养时间下抗菌素的产生达到了最大值。
YS培养基中的抗菌素产生二信于NB培养基，pH值的范围在1.0之间。
图8和图9表示在最佳培养条件下在YS培养基中抗稻梨孢及丝核薄膜革菌的抑制区的大小。
本发明中抗菌素的活性表现为：抗稻梨孢的抑制区为24mm，抗丝核薄膜革菌的抑制区为21mm。
如上所述，30℃条件下对YS培养基内的芽孢杆菌属菌种SY-414(KCCM-10043)培养96小时，然后以12,000xg离心处理20分钟，用等体积的乙酸乙酯提取上清液。
收集有机层并在减压条件下用旋转蒸发器将其除去。
收集浓缩的活性部分，溶于水中并进行冻干处理。
将上述冻干的粉末溶于甲醇，上硅胶柱并用甲醇洗脱。
真空浓缩活性部分，溶于水中并进行冻干处理。
将上述冻干的粉末溶于二氯甲烷∶甲醇(1∶5)混合液中，进行Sephadex LH-20柱层析处理。洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇(1∶5)混合液，除去溶剂。
将活性部分溶于水中，进行冻干处理。
将上述粉末溶于甲醇中，在4℃条件下贮存，随后得到结晶状抗菌素。
如上所述，对本发明的芽孢杆菌属菌种SY-414产生的抗菌素而言，可溶性淀粉，甘露醇、木糖和葡萄糖可用作碳源，而牛肉膏、酵母膏、胨和大豆粉可用作氮源。NaCl、KCl、MgSO4、和KH2PO4可用作矿质源。含3％可溶性淀粉、0.8％酵母膏和0.2％KCl的培养基为抗菌素生产的最佳培养基。最佳培养条件是25-35℃下震荡培养48-96小时。
下述实施例将详细论述本发明，但本发明并不仅局限于以下实施例。实施例1：筛选
将从朝鲜春川区采集的土样悬浮于蒸镏水中，平涂在营养平板上(牛肉膏0.3％、胨0.5％、琼脂1.2％)，在30℃条件下培养1-2天。
将上述分离出的微生物接种在10ml的营养肉汤中，在30℃条件下培养76小时，然后以12,000xg离心处理20分钟。对上清液活性进行检测。以稻梨孢IFO30517和丝核薄膜革菌IFO8985作为试验微生物。芽孢杆菌属菌种SY-414表现出抗这两种试验微生物的最高活性。实施例2：种子培养
在20ml营养肉汤中于30℃培养分离出的微生物72小时。将静止期的细胞用作本发明的种子。实施例3：发酵
向201的YS培养基(含3.0％的可溶性淀粉、0.8％的酵母膏和0.2％的KCl)中加入200ml种子培养物。在30℃条件下震荡发酵72小时。将培养液以12,000xg离心处理20分钟。将上清液用于纯化。实施例4：纯化
将由实施例3中得到的上清液用等体积的乙酸乙酯提取。收集有机层，在减压条件下进行蒸发处理。将残余物溶于水中并进行冻干处理。
将冻干的粉末溶于甲醇中并进行硅胶柱层析处理。用甲醇洗脱活性部分，然后真空浓缩。将浓缩物溶于水中并进行冻干处理。
将冻干的粉末溶于二氯甲烷∶甲醇(1∶5)混合物中，上Sephadex LH-20柱。除去溶剂，溶于水中并进行冻干处理。
将冻干的粉末溶于甲醇中，在4℃条件贮存。从201培养液中得到100mg纯化的三己霉素。图10为纯化的晶状三己霉素的照片实施例5：抗菌素的特性
将上述三己霉素溶于水中，利用n-BuOH∶AcOH∶H2O(4∶1∶5)作为展开剂，进行薄层层析(TLC)处理。通过碱性高锰酸钾反应显出单个斑点。
通过喷洒碱性高锰酸钾来检测TLC的三己霉素Rf值。
表9为本发明中抗菌素的Rf值。
表9抗菌素的Rf值
    溶剂体系     Rf值
C6H6∶EtOAc(1∶1)C6H6∶EtOAc∶MeOH(2∶2∶1)MeOH∶丙酮∶H2O(4∶2∶1)n-BuOH∶AcOH∶H2O(4∶1∶5上层相)n-BuOH∶AcOH∶H2O(3∶1∶1)CHCl3∶MeOH∶H2O(4∶1∶1.25)MeOH∶H2O∶AcOH(16∶3∶1)苯∶BuOH∶H2O(9∶1∶10)     0.000.000.800.150.340.000.780.86
如表9所示，在MeOH∶H2O∶AcOH(16∶3∶1)混合溶剂中Rf值为0.78，苯∶BuOH∶H2O(9∶1∶10)混合溶剂中Rf值为0.86。三己霉素充分溶于极性溶剂(如水、甲醇和乙醇)中，但不溶于非极性溶剂(如氯仿、苯和己烷)中。
通过喷洒溶剂观察到TLC中抗菌素呈现的班点状颜色反应。
表10为颜色反应的结果。
表10抗菌素的颜色反应
    颜色反应     结果
    碘茚三酮缩二脲埃尔利希反应坂口反应10％H2SO4碱性KMnO4氯化铁德拉根道夫试验     阳性阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性阴性
如表10所示，本发明的抗菌素表现出对碱性高锰酸钾、10％硫酸和碘的阳性反应。因此可以得出结论，该抗菌素在结构上含有糖的部分。
其熔点在127-128℃之间。将由实施例4中得到的抗菌素溶于水，利用紫外可见分光光度计检测以得到紫外吸收光谱。图11中并未显示出任何吸收带。通过红外分光光度计，在3650-3300-1、2970-1700cm-1、1594cm-1和1422cm-1处得到吸收带，如图12所示。在1HNMR谱中并未显示出靠近7.5ppm的芳香化合物的信号，而在13CNMR谱中则表现出70-78ppm处的糖的信号，如图13和图14所示。
另外，图15为三己霉素乙酰化作用后的质谱。由实施例4中得到的抗菌素的分子量为504。实施例6：抗菌素的水解作用
用0.1N的Hcl于110℃将由实施例4得到的抗菌素(10mg)水解10-12小时，在HPLC上对水解产物进行分析以鉴定糖类组分。如图16所示，抗菌素仅由果糖组成。因此将该抗菌素命名为三己霉素。
如上述结果所示，由实施例4得到的抗菌素被描述如下：
其中a为CH2OH；b为(OH)2；b’为(OH)1。实施例7：抗菌素的活性
抗菌素抗稻梨孢抑制区随浓度的变化：50mg/ml为9.8mm；100mg/ml为14.6mm，200mg/ml为19.5mm；400mg/ml为23.3mm；抗丝核薄膜革菌抑制区随浓度的变化：100mg/ml为12.3mm，200mg/ml为16.2mm，400mg/ml为20.2mm。
通过对试验微生物的下述纸盘琼脂扩散法来检测抗微生物谱，可观察到本发明的抗菌素活性。
在细菌和假丝酵母菌的情况下，在软琼脂(琼脂0.8％)中接种0.1ml的试验微生物并叠层培养。在真菌的情况下，对孢子进行均匀悬浮，在马铃薯葡糖琼脂(PDA)中接种0.1ml的悬浮液，并叠层培养。将纸盘(100mg/ml)置于平板上，在30℃下培养24-28小时，观察到抑制区的形成。表11为抗菌素的抗微生物谱。
本发明的抗菌素对革兰氏阳性和阴性细菌及酵母无作用，但对真菌具有活性。实施例8：抗菌素的稳定性。
为了观察本发明中抗菌素的pH稳定性，用0.05M的柠檬酸钠-HCl缓中液、磷酸钾缓冲液、氢氧化铵-氯从铵缓冲液处理抗菌素(100mg/ml)2小时
将抗菌素溶液加入杯中，在30℃下培养48小时，对抑制区的大小进行比较。
抗菌素在pH6-8时对稻梨孢和丝核薄膜革菌的活性是稳定的。
如上所述，在中性pH附近抗菌素的活性是稳定的。
为了检查本发明中抗菌素的温度稳定性，在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃条件下对抗菌素溶液(100mg/ml)处理1小时。将抗菌素溶液加入杯中，在30℃条件下培养48小时。对抑制区的大小进行测量。
在30-40℃条件下抗菌素对稻梨孢的活性是稳定的，而在50℃时活性为80％，60℃时活性为60％。在30℃-40℃条件下其对丝核薄膜革菌的活性是稳定的，而50℃时活性只有70％。实施例9：抗菌素的活体内试验素进行处理。与对照稻苗进行比较，观察抗菌素的作用7天和14天。在浓度为50-100mg/ml下受感染的稻苗生长良好。实施例10：抗菌素的毒性
为了检验本发明中抗菌素的毒性，利用腹膜内注射或口服给5只ICR小鼠(鼠龄：6-8周)施用抗菌素。两周之后，所有试验小鼠均存活，表明存活率为100％。这说明抗菌素并无毒性。
在本发明的领域之内，本发明的抗菌素可单独使用或与填料混合使用。可以生产出含有该抗菌素作为有效成分的组合物。

Claims (11)

1.下列通式(1)所示的抗真菌的新抗菌素
Figure A9419379900021
其中每个R代表-H、-OH、-NH2、C1-C6烷基、C5-C20烯丙基式C2-C6亚烷基、下标l、m或n为小于3的整数。
2.如权利要求1中定义的抗真菌的新抗菌素，其中在式(I)中，所有R基因为-OH，下标l、m和n分别为2、1和2。
3.具有抗真菌活性的芽孢杆菌属新菌种SY-414(KCCM-10043)。
4.如下所述生产抗真菌的抗菌素的方法：
在液体培养基中用震荡方法培养芽孢杆菌属菌种SY-414并离心；
用乙酸乙酯提取上清液，收集有机层并除去溶剂；
收集活性部分，除去溶剂、溶于溶剂中并进行第一次柱层析处理；
收集活性部分，除去溶剂，溶于溶剂中并进行第二次柱层析处理；
收集有机部分，除去溶剂，溶于水中并进行冻干处理；
溶于甲醇中，在4℃条件贮存，得到晶状抗菌素。
5.如权利要求4中定义的生产抗真菌的抗菌素的方法，其中液体培养基含有选自可溶性淀粉、葡萄糖、木糖或甘露醇中的一种或多种物质作为碳源。
6.如权利要求4中定义的生产抗真菌的抗菌素的方法，其中液体培养基含有选自牛肉膏、酵母膏、胨或大豆粉中的一种或多种物质作为氮源。
7.如权利要求4中定义的生产抗真菌的抗菌素的方法，其中液体培养基含有选自氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙或磷酸钾中的一种或多种物质作为矿质源。
8.如权利要求4中定义的生产抗真菌的抗菌素的方法，其中发酵条件为25-35℃、pH6-9，时间48-96小时。
9.如权利要求4中定义的生产抗真菌的抗菌素的方法，其中第一次层析为硅胶柱层析，第二次层析为Sephadex LH-20柱层析。
10.如权利要求9中所定义的生产抗真菌的抗菌素的方法，其中硅胶柱层析的溶剂为甲醇，而Sephadex LH-20柱层析的溶剂为二氯甲烷∶甲醇(1∶5)混合液。
11.含有权利要求1的抗菌素作为有效成分的组合物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1055310C (zh) * 1995-06-22 2000-08-09 华中农业大学 苏云金芽胞杆菌高毒力菌株ybt-1520及发酵工艺与产品
CN101473226B (zh) * 2005-08-02 2012-08-08 密苏里大学管委会 针对豆薯层锈菌和疣顶单胞锈菌的噬菌体展示植物防御肽

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100385152B1 (ko) * 2001-03-14 2003-05-23 씨제이 주식회사 카프레오마이신의 정제방법
KR100514430B1 (ko) * 2002-12-12 2005-09-14 대한민국 스클레로티니아 트리폴리오럼 bwc98-105 균주가 분비하는 클로버 제초활성 2차 대사산물 분리방법
EP2098536A1 (en) 2008-03-05 2009-09-09 4-Antibody AG Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins
CN110954625A (zh) * 2019-12-21 2020-04-03 潍坊科技学院 一种土壤中抗生素残留检测方法
JP2022094481A (ja) * 2020-12-15 2022-06-27 大阪瓦斯株式会社 ヒドロキシアルカン酸結晶の製造方法及びヒドロキシアルカン酸の結晶多形体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3885655T2 (de) * 1987-05-30 1994-06-16 Kaken Pharma Co Ltd Antibiotikum 6270B, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Anticoccidiosemittel und Futterzusatz.
HU203789B (en) * 1988-02-08 1991-09-30 Pfizer Process for producing polycyclic acidic ether-type antibiotica of anticoccidial and growth-stimulating activity
DD270542A1 (de) * 1988-04-12 1989-08-02 Adw Ddr Verfahren zur herstellung von 26-desoxylaidlomycin
US5278053A (en) * 1991-09-16 1994-01-11 Eli Lilly And Company Method of producing a polyether antibiotic from actinomadura fibrosa sp. nov. NRRL 18348 and actinomadura sp. NRRL 18880

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1055310C (zh) * 1995-06-22 2000-08-09 华中农业大学 苏云金芽胞杆菌高毒力菌株ybt-1520及发酵工艺与产品
CN101473226B (zh) * 2005-08-02 2012-08-08 密苏里大学管委会 针对豆薯层锈菌和疣顶单胞锈菌的噬菌体展示植物防御肽

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