DD270542A1 - Verfahren zur herstellung von 26-desoxylaidlomycin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 26-Desoxylaidlomycin, das als Hauptprodukt eines Polyethergemisches bestehend des weiteren aus Laidlomycin auftritt, und das als Kokzidiostatikum und Pansenfermoregulator fuer die Therapie tierischen Parasitenerkrankungen sowie fuer die Tiermast von potentiellem Nutzen ist. Die Erfindung verfolgt das Ziel, das Antibiotikum 26-Desoxylaidlomycin in einem effektiven Prozess als Reinprodukt herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem der Mikroorganismus Streptoverticillium olivoreticuli IMET 43 861 auf einem komplexen Medium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganischen Salzen unter submersen Kultivierungsbedingungen angezogen, 26-Desoxylaidlomycin zunaechst zusammen mit dem aehnlichen Antibiotikum Laidlomycin aus dem Myzel mittels organischer Loesungsmittel extrahiert und anschliessend mit chromatographischen Verfahren bis zur Homogenitaet gereinigt wird.

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polyether-Antibiotikums, 26-Desoxylaidlomycin, das als Futtermittelzusatz (Ergotropikum) sowie bei der Behandlung tierischer Parasitenerkrankungen in der Tierproduktion von potentiellem Nutzen ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Streptomyceten und andere Vertreter der Actinomycetales-Familie bilden eine Reihe von Polyetherantibiutika (Carboxy.'säureionophore), von denen einige, so zum Beispiel Monensin A, Salinomycin, Lasalocid, Nigericin, Maduramycin, wogen ihrer Wirkung auf tierische Parasiten (Kokzidien) und wegen ihres guten ergotropen Effektes auf das Wachstum mono- und polygastrischer Tiere Anwendung gefunden haben (J.W. WESTLEY. Adv. Appl. Microbiol. 22,1977,177-223; J.W. WESTLEY, Antibiotics IV, Biosynthesis [J.W. Ed. CORCORAN], Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, New York, 1981, 41-73; J.W. WESTLEY, Polyether Antibiotics, Vol. I, Biology, Marcel Dekker Inc, 1983). Hauptanwendungsgebiete dieser Antibiotika sind die Geflügel- und die Rinderhaltung. Weiterhin wurden für Polyetherantibiotika cardiovaskuläre Effekte und antibiotische Wirkungen gegen Mykoplasmen, Viren, Schadpilze, Nematoden und Leberegel beschrieben.

Die bisher bekannten und in der Praxis eingesetzten Polyetherantibiotika weisen Nachteile auf, wie geringe therapeutische Breite bei der Anwendung und hohe Toxizität für Nulztiere und Pflegepersonal.

Das durch Streptomyces eurocidicus subspec. asterocidicus gebildete Laidlomycin ist bisher nicht in die Anwendung gelangt, da es hinsichtlich der Toxizität gegenüber Monensin A keine Vorteile aufweist (J. W. WESTLEY, 1983, a. a. 0.).

Ziel dar Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein neues Polyetherantibiotikum, bezeichnet als 26-Desoxylaidlomycin, bereitzustellen, das al» Ergotropikum sowie als Chemctherapeutikum tierischer, durch Kokzidien verursachter Erkrankungen von potentiellem Nutzen iut.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren zu beschreiben, .nit dessen Hilfe ein neues Polyetherantibiotikum unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus auf fermentativem Wege unter Verwendung eines billigen Nährmediums gewonnen werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus der Art Streptoverticillium olivoreticuli, vorzugsweise der Stamm Streptoverticillium olivoreticuli AM 33375, unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Medium mit an sich bekönnten Kohlenstoff- und Stickstoffquollen, wie Glucose, Stärke bzw. Sojamehl, und mit an sich bekannten Mineralsalzzusätzen zum Medium submers kultiviert wird. Der Mikroorganismus AM 33375 ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR - 6900, Jena, Beutenbergstr. 11, unter der Registriernummer IMET 43861 hinterlegt worden.

Die Kultivierung und Erhaltung des eingesetzten Mikroorganismus der Art Streploverticillium olivoreticuli und hierbei insbesondere des Stammes IMET 43861 wird wie folgt vorgenommen:

In Glucose/Gelatine (5%ig) lyophüisierte Myzelfragmente werden auf Agrarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nfhrmedien eingeimpft, und das entstandene Myzel wird an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 20°C

und 38⁰C, vorzugsweise 26⁰C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einem pH-Wert kultiviert, der zu Beginn der Fermentation zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt. Als Kohlenstoff- und Stickstoffquelien können die in der Fermentationsindustrie üblichen Einsatzstoffe verwendet werden. Die Fermentation des eingesetzten Stammes der Art Streptoverticillium clivoreticuli kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentoren bzw. VeA-Tanks durchgeführt werden.

Der im Myzel vorhandene Antibiotikum-Anteil wird durch Methanol extrahiert, darüber hinaus werden geringere Mengen des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat bei pH 4,0 durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, z. B. CHCI₃, gewonnen. Die Extrakte werden im Vakuum bei 40 ⁰C bis 60 °C bis nahe zur Trockne eingeengt und in wenig Methanol aufgenommen. Anschließend erfolgt die säulenchromatographische Trennung des Extraktgemisches unter Verwendung von organophilen Dextrangelen und Methanol als Laufmittel. Die durch ihre antibakterielle Aktivität gegenüber dem Testkeim Bncillus subtilis ATCC 6633 im Agrarplatten-Diffusionstest sowie durch ihre orangerote (Laidlomycin, I) bzw. gelbe Anfärbung (26-Desoxylaidlomycin, als freie Säure [II] bzw. Na-SaIz [Ul]) mit 3% Vanillin in konzentrierter H₂SO₄ erkenntlichen Polyether-enthaltenden Fraktionen werden zusammengegeben, eingeengt und der Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (0,063 mm bis 0,2 mm) unter Verwendung von CHCl3/MeOH (97:3, v/v) unterworfen. Dabei werden in der Reihenfolge ihrer Elution gewonnen:

- Laidlomycin (Na-SaIz, I), (Hauptkomponente des Gemisches),

- in geringen Anteilen, 26-Desoxylaidlomycin (II) als freie Säure und

- 26-Desoxylaidlomycin (Na-SaIz, III).

Reines kristallines 26-Desoxylaidlomycin wird in Form des Natriumsalzes III durch präparative Dünnschichtchromatographie

(Kieselgel 60; Benzen/Aceton, 3:5, v/v) und Chromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von Aceton als

Laufmittel erhalten und nachfolgend aus Metb wo\ umkristallisiert. Die freie Säure (II) des 26-Desoxylaidlomycins läßt sich durch Schütteln der Lösung in CHCI₃ mit einer wäßrigen 0.5 M Lösung von Na₂CO₃ vollständig in das Natriumsalz (III) umwandeln. Die auf diesem Wege erhaltene neue Substanz, das reine 26-Desoxylaidlomycin (III), ist durch folgende physikochemische Charakteristika gekennzeichnet: Eigenschaften: Nadeiförmige Kristalle, Schmelzpunkt 194⁰C bis 196°C Summenformel (MS): C₃₇Hj₁O_nNa(M ⁺ -CO₂,-C₂H₅CO₂, (EI-MS;: m/z 587.3986 gef.; 587.3950 ber. f. C₃₃H₆₈O₇Na) Molekulargewicht: 704 Charakteristische MS-Fragmentpeaks: (JEOL. JMS-D100): m/z 603; 519; 477; 433; 393; 375; 291). IR-Spektrum (cm¹): 870, 900, 945, 975,1 010,1 015,1 050,1 080,1 105,1 180,1 230,1 240,1 355,1 375,1 400,1 450,1 575, ! 730.

2 880, 2 930, 2 9bO, 2 970, 3 350-3 600 (in KBr) Ri-Werte (Kieselgel

60; Fertigplatten): 0.45 (Benzen/Aceton, 3:5; v/v); 0.35 (CHCI₃/MeOH; 9:1; v/v).

Tabelle 1 zeigt die antimikrobielle Aktivität von 26-Desoxylaidlomycin (III) im Vergleich zu Laidlomycin (I) bei Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testkeim.

NMR-Spektrometrie (Varian XLAA 400, in CHCI₃): Tabelle 2 gibt die Zuordnung der Signale des 100 MHz-13C-Spektrums von IM wieder.

Abb. 2 zeigt das Protonenspektrum des 26-Desoxylaidlomycin-Na (III) (400 MHz)., Abb. 3 das 100 MHz "CNMRSpektrum. Die Ergebnisse der kokzidiostatischen Wirksamkeitsprüfung von III (In-vitro-Test, intraallantoisch infizierte Hühnerembryonen mit Eimeria tenella Stamm WCAM-P20) sind in Tabelle 3 enthalten

Die Vorteile der Erfindung werden wie folgt gesehen:

- Gegenüber der chemisch verwandten Polyethersubstanz Ldidlomycin (I), die koproduziert wird, weist 26-Desoxylaidlomycin (III, Abb. 1) eine höhere Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien auf.

- Gegenüber bereits kommerziell hergestellten Kokzidiostatika wie z. B. Monensin A ist bei vergleichbarer kokzidiostatischer Aktivität die EmbryotoxizitSt um mehr als den Faktor 10 vermindert.

- Der im Myzel enthaltene Folyetherkomplex, bestehend aus 26-Desoxylaidlomycin und Laidlomycin, kann durch Trocknen des aus Fermentationsansätzen gewonnenen feuchten Myzelrückstandes fixiert und in Form des Myzelpulvers zur Anwendung als Kokzidiostatikum gebracht werden.

AusführunQsbeispiele An zwei Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden. Beispiel 1: An Erde lyophil getrocknete Myzelfragmento Q^s Stammes Streptoverticillium olivo^roticuli IMET 43861 d'enen zur Beimpfung von Agarmedien folgender Zusammensetzung (g/l):

a) Glucose 8; Ammoniumtartrat 4; KH₂PO₄ 2; NaCI 5; MgSO₄. 7 H₂O 1; CaCI₂ 0.2; MnSO₄. 7 H₂O 0.01; Agar 15; pH 6,5 bis 7,0

b) Glucose 8; Ammoniumtartrat 4; NaCI 5; MgSO₄. 7 H₂O 1; CaCI₂ 0.2; MnSO₄. 7 H₂O 0 01; Agar 15; pH 6,5 bis 7,0 Inokulumkulturen werden durch Einsaaz von Myzelstücken der Agarkultur oder von gefriergetrockneten I lyzelien als Stammkultur in ein Medium folgender Zusammensetzung erhalten (g/l):

Saccharose 3; Dextrin 15; Harnstoff 0.1; Bactopepton 5; Hefeextrakt 1; NaCI 0.5; KH₂PO,0.5; FeSO₄. 7 H₂OO-OI; Agar 15; pH (nach

dem Sterilisieren) 6,8 bis 6,9.

Nach 48stündiger Bebrütung der Vorkultur in 500 ml-Steilbrustflaschen (80 ml Inhalt, 25¹C, Rundschwingtisch, 180 UpM) wird eine

stufenweise Maßstabvergrößerung durch Übertragung von Kulturproben in 5 I-Steilbrus!flaschen und jeweils weitere 24 Stunden

Bebrütung bei 27 ⁰C durchgeführt. Tür die Kultivierung in 500 ml· Steilbrustflaschen oder in Fermentoren wird ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet

(g/l): Glucose 20; Hafermehl 20; Fleischextratk 3; NaCI 3; CaCO₃ 3; Fe₂ (SO₄) 0.4; MnCI₂.4 H₂O 0.6; pH 6,0 (nach dem Sterilisieren).

Die Belüftung erfolgt mit steriler Luft (1:1). Die Fermentationszeit beträgt 96 Stunden bis 144 Stunden und die Rührgaschwindigkeit

in Fermenioren 280 UpM. Eine Schaumbildung kann in an sich bekannter Weise durch Zusatz kleiner Mengen an Pclypropylenglykolkontrolliert werden.

Nach Beendigung der Fermentation wird das Myzel durch Separatoren abgetrennt. Aus 20I-Fermentationslösung werden so 0.4 kg bis 1.0 kg Fauchtmyzel erholten, das in 51 Methanol über Nacht bai Räumtemperatur belassen wird. Nach dem Absaugen vom extrahierten Myzel wird der Methanolextrakt im Vakuum bis nahe zur Trockne (Restfeuchte vorhanden) eingeengt. Das Kulturfiltrat wird mit CHCI₃ (51) extrahiert und der beim Einengen des CHCI₃-Extraktes erhaltene Rückstand ist mit dem Rückstard der Myzelextraktion zu vereinigen.

Der Rückstand der vereinigten Extrakte wird in wenig Methanol gelöst und am eine Säule, gefüllt mit organophilem Dextrangel in Methanol, aufgegeben (1 m x 0.5 m) und mit Methanol eluiert. Bioaktive Fraktionen, nachweisbar durch die antibiotische Aktivität gegenüber Bacillus subtilis ATCC 6633 sowie durch die orangerote bis gelbe Anfärbung beim Tüpfeln auf Kieselgelfolien nach Besprühen mit 9iner 3%igen Lösung von Vanillin in konz. H,SO₄, werden zusammengegeben und eingeengt (Ausbeute 0.4 g). Das so erhaltene Rohprodukt wird des weiteren auf eine Säule, gefüllt mit Kieselgel 60 in CHCI₃/MeOH (97:3, v/v), aufgegeben und mit dem gleichen Solvens eluiert. Dabei erscheinen der Reihe nach im Eluat Laidlomycin (I), 26-Desoxylaidlomycin (NaSaIz, III) und i-i geringen Mengen die freie Säure II, die jeweils durch dünnLchichtchromatographischen Nachweis (Kieselgelfolien, Benzen/Aceton 3:5-6:2, v/v; Besprühen mit 3% Vanillin in konz. H₂SO₄) erkannt werden (Ausbeute III: 100 mg; 1:40 mg). Die Feinreinigung der Fraktion des 26-Desoxylaidlomycin-Na (III) und die Abtrennung von geringen Mengen an I sowie von anderen Verunreinigungen erfolgt durch präparative Dünnschichtchromatographie an KieselgRl 60 unter Verwendung von Benzen/Aceton (6:3, v/v) als Laufmittel. Die das Polyetherantibiotikum III enthaltende Zone wird mit Aceton eluiert und das Eluat zur Trockne eingeengt. Anschließend wird das Produkt in wenig Aceton gelöst und auf eine Säule, gefüllt mit organophilem Dextrangel in Aceton (15 cm x 0,5 cm), aufgegeben und mit Aceton eluiert (Ausbeute 50 mg). Das Produkt wird in wenig CHCI₃ gelöst und durch tropfenweise Zugabe von Methanol zum Auskristaüisieren gebracht (4"C).

Beispiel 2

Das nach Beendigung der Fermentation des Stammes Streptovarticillium olivoraticuli IMET 43861 erhaltene Myzel (siehe Beispiel 1) wird unter scnonenden Bedingungen (Ringstromtrockner u. ä.) bei 60⁰C getrocknet. Dabei wird aus 20 I Fermentationsvolumen etwa 0,2 kg Trockenmyzel mit einem Gehalt an Polyether (I, III und II) von insgesamt 300 mg und einem relativen Anteil von Laidlomycin (I) zu 26-Desoxylaidlomycin (Il und III) von 1:2 erhalten.

Tabelle 1 Ί Antimikrobielle Aktivität von 2ß-Desoxyleidlomyein (III) (Hemmzonendurchmesser im Agarplatten-Diffusionstesi, Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testkeim; in Klammern die für Laidlomycin ermittelten Werte.)

Konzentration	Hemmzonendurchmesser (mm)	SA-Agarme·
(pg/Stanzloch)	SA-Agarme-	dium
	dium	+350 mM KCL
		38
2.5	43	35
1.25	40	32 (24)
0.62	39 (34)	28(16)
0.31	35(31)	23(0)
0.15	32 (26)	16(0)
0.08	27(0)	Spuren (0)
0.015	21(0)

Tabelle 2: 100 MH;. "C-NMR-Signale von 26-Desoxylaidlomycin-Na (III) und deren Zuordnungen (in CHCI₃; chemische Verschiebung in ppm)

Atom	I-	Chemische Verschiebung	Multiplizität
	!.	181.860	S
	B	42.650	d
	7	75.753	d
8	37.782	d
9	66.144	d
10	35.134	d
11	70.940	d
12	34.074	t
13	107.935	S
14	38.821	t
15	33.401	t
16	85.117	S
17	82.141	d
18	26.824	t
19	30.925	t
20	84.273	S
21	86.857	d
22	34.402	d
23	32.652	t
24	78.186	d
25	73.975	d
26	33.059	d
27	36.254	t
28	40.491	d
29	97.750	S
30	28.423	q
31	17.231	q
32	17.512	q
33	15.455	q
34	23.474	q
35	25.879	q
36	10.064	q
37	10.278	q
15.952	q
173.541	S
27.8d2	t
9.347	q

ο Singulett; d Dublett; t Terzett; q Quartett

Tabelle 3: Ergebnisse der Testung von 26-Desoxylaidlomycin auf kokzidiostatische Aktivität gegen Eimeria tenella. Stamm WCAMP20, in intraallantoiscl· infizierten Hühnerembryonen

Konzentration im Test	Gruppen	Letalität	Letalität	Testergebnis
(pg/Embryo)	stärke	,m Experi	der Kon
		ment	trollgruppe
1. Akute Toxizität
200	10	10%	_
100	10	0%	_
33	10	0%	-	LD50 > 200 pg
10	10	0%	-
2. Kokzidiostase
10	*,9	0%	97%	+ + +
1	19	79%	97%	-

+ + + = ρ < 0,001 (Vierfeldertest nach FISHER)

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von 26-Desoxylaidlomycin auf mikrobiologischem Wege gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Streptoverticillium olivoreticuli AM 33375 (IMET 43861) unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 20⁰C bis 30⁰C für die Deuer von 2 Tagen bis 6 Tagen bei einem pH-Wert, der zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt, kultiviert wird und 26-Desoxylaidlomycin aus dem Myzel isoliert und gereinigt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das im feuchten Myzel gespeicherte 26-Desoxylaidlomycin mit lipophilen organischen Lösungsmitteln extrahiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß das im feuchten Myzel gespeicherte 26-Desoxylaidlomycin mit Methanol extrahiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß 26-Dexoxylaidlomycin durch an sich bekannte chromatographische Verfahren in reiner Form gewonnen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß 26-Dexoxylaidlomycin zusammen mit Laidlomycin als Myzeladsorbat durch Trocknen des auf fermentativem Wege erhaltenen Myzels erhalten wird.