DE2751260A1 - Antibiotikum 890 a tief 9 - Google Patents

Description

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15935

HERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Antibiotikum 890 A_g

R098?1 /Π868

15935 t 275126Q

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum MSD 890A« und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze (im folgenden als Antibiotikum 890Aq bezeichnet), die sowohl gegenüber gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien aktiv sind. Das Antibiotikum wird durch Züchten bzw. Wachsen von Species von Streptomyces auf geeigneten Fermentationsmedien hergestellt.

Die Entdeckung· der bemerkenswerten antibiotisehen Eigenschaften von Penicillin hat auf diesem Gebiet ein großes Interesse stimuliert. Dadurch wurden viele andere, wertvolle antibiotische Substanzen gefunden. Im allgemeinen umfaßt die antibakterielle Aktivität von jedem dieser Antibiotika nicht bestimmte, klinisch wichtige pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige hauptsächlich nur gegen gram-positiven Arten von Bakterien aktiv. Die aufgetretene Resistenz bei der weitverbreiteten Verwendung vorhandener Antibiotika bei der Behandlung bakterieller Infektionen hat bewirkt, daß ein ernstes Resistenzproblem entstanden ist.

Die Nachteile der bekannten Antibiotika haben somit eine weitere Forschung nach anderen Antibiotika stimuliert, die gegenüber einem großen Bereich von Pathogenen wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum bzw. antibiotisches Mittel. Sie betrifft eine neue antibiotische Verbindung, die in der vorliegenden Anmeldung als 890Aq bezeichnet wird. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum in verdünnter Form, als rohes Konzentrat und in reiner Form.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und nützliches Antibiotikum zu schaffen, das bei der Inhibierung des Wachstums verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hochwirksam ist. Erfindungs-

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gemäß soll ein Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotischen Verbindung durch Fermentation eines Nährmediums mit Species von Streptomyces geschaffen werden.

Die neue erfindungsgemäße antibiotische Verbindung wird durch Wachstum bei kontrollierten Bedingungen eines neuen Stamms von Streptomyces flavogriseus erzeugt.

Auf Grundlage ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen wurde der Stamm des bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismus als zu den Species Streptomyces flavogriseus gehörig identifiziert und wurde in der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc. Rahway, N.J., als MA-4638 bezeichnet. Seine Kultur wurde permanent ohne Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der Culture Collection of the Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt. Sie ist unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11 020 verfügbar.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 bildet das Antibiotikum 890Aq, das in im wesentlichen reiner Form aus der Fermentationsbrühe isoliert wird.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus MA-4638 werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie - Sporenträger verzweigt, gerade bis gekrümmte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Retten sind nicht länger als 10 Sporen. Die Sporen sind sphärisch bis oval -0,9/U χ 1,2/U (97Ox).

Kultureigenschaften Hafermehlagar (ISP Medium 3)

Vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun, gekräuselt;

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Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Mittelgrau;

lösliches Pigment - keins;
Czapek Dox Agar (Saccharose-Nitratagar)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun gesäumt mit Dunkelbraun;

Luftmycelium - mittelgrau, samtartig;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums; Eialbuminagar "

vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun;

Luftmycelium - mittelgrau, vermischt mit gelblichem Grau (2dc) und grauem Gelb (2db);

lösliches Pigment - hellgelblich Dunkelgelb; Glyceriifc-Asparaginagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun; Luftmycelium - samtartig, hellgrau mit gelblichem Ton(2dc);

lösliches Pigment - helles Dunkelgelb; Anorganisches Salze-Stärke-Agar (ISP Medium 4)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-grünlich-gelblich-dunkelgelb;

Luftmycelium - samtartig, mittelgrau mit gelbem Ton (3fe);

lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb; Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun; Luftmycelium - dunkelgrau, vermischt mit hellerem Grau;

lösliches Pigment - keines;
Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP Medium 2) vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun;

Luftmycelium - samtartig, dunkelgrau gesäumt mit hellerem Grau;

lösliches Pigment » keines;
Magermilchagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - spärlich, weißlich;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums; Hydrolyse von Casein - gut;

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Lackmusmilch

vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb;

Luftmycelium - keines; Farbe - purpur; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Pepto-

nisierung; Alkalischwerden; Magermilch

vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb;

Luftmycelium - keines;

lösliches Pigment - hellbraun; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden; Nährtyroslnagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun;

Luftmycelium - dunkelgrau gesäumt mit gräulichem Weiß;

lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums;

Zersetzung von Tyrosin - positiv; Pepton-Eisen-Hefeextraktagar vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

Luftmycelium - weißlich, mäßig;

lösliches Pigment - keines;

Melanin - keines;

H₂S-BiIdUUg - negativ; Nähragar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-helles gräuliches Braun;

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Dunkelgrau;

lösliches Pigment - keines; Nährstärkeagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau;

Luftmycelium- mittelgrau;

lösliches Pigment - keines;

Stärkehydrolyse - gut; Nährgelatineagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau;

Luftmycelium - gräulich-weiß;

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lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - gut;
Kartoffelstück

vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmycelium - mittel- bis dunkelgrau;

lösliches Pigment - keines;
Loeffler¹S Blutserum

vegetatives Wachstum - creme-gefärbt; Luftmycelium- keines;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung - keine;
Gelatinestich

vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmycelium - keines;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - vollständig.

Alle obigen Bestimmungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubation bei 28⁰C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Edition (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 wird weiterhin auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlenhydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck werden die Mikroorganismen auf synthetischem Grundmedium (Pridham und Gottlieb), das 1# Kohlenhydrat enthält, bei 28⁰C drei Wochen gezüchtet. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Verwertbarkeit dieser Kohlenhydratquellen durch Streptomyces flavogriseus MA-4638 aufgeführt; + bedeutet Wachstum; + bedeutet schlechtes oder fragliches Wachstum; und - bedeutet

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kein Wachstum im Vergleich mit einer negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle).

Tabelle I Glucose + Malltose + Arabinose + Mannit + Cellulose - Mannose + Fructose · + Raffinose Inosit - Rhamnose + Lactose + Saccharose +

Xylose +

Die Stärke des Wachstums bei Änderungen der Temperatur und der Sauerstoffbedarf der Mikroorganismus sind wie folgt:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar) 28°C - gutes vegetatives Wachstum und Luftwachstum; 37°C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen; 5O°C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar)

aerob.

Die Erfindung ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen beschränkt, die das obige Wachstum und die mikroskopischen Eigenschaften vollständig erfüllen. Diese sind nur zur Erläuterung aufgeführt«. Die Verwendung von Mutanten, die aus den beschriebenen Organismen durch verschiedene Mittel bzw. Verfahren, wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Bakteriophageneinwirkung u.a., erhalten werden, ist gewünscht und beabsichtigt.

890Aq wird während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen von geeigneten, wäßrigen Nährmedien gebildet, die mit einem Stamm des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind. Wäßrige Medien, wie solche, die für die Her-

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stellung anderer Antibiotika verwendet werden, sind für die Herstellung von 89OAq geeignet. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, die von den Mikroorganismen assimilierbar sind.

Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.a., und Stärken, wie Dextrin oder Körner bzw. Granulat, z.B. von Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl u.a., verwendet werden, entweder allein oder zusammen mit einer Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff in dem Nährmedium. Die Menge an Kohlenhydrat variiert normalerweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.%, bezogen auf das Medium. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vereinigt werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen beispielsweise Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweichflüssigkeit, lösliche Stoffe, die bei der Branntweinherstellung anfallen, bzw. Schlempen o.a. Die bevorzugte Quelle sind lösliche Stoffe von der Branntweinbrennerei bzw. Schlempen. Die Stickstoffquellen werden entweder allein oder im Gemisch in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.%, bezogen auf das wäßrige Medium, verwendet.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die zu den Kulturmedien zugegeben werden können, sind die üblicherweise verwendeten Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben. Weiterhin umfaßt werden ebenfalls Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für eine große Vielzahl von Medien, die verwendet

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werden können, und sollen nicht als Beschränkung dienen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C durchgeführt. Für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 23 bis 28°C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert des für das Züchten der Stämme von Streptomyces flavogriseus-Kulturen und die Erzeugung von Antibiotikum 890A_Q verwendeten Nährmediums kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Obgleich das neue Antibiotikum 890A_Q sowohl mit Oberflächenais auch mit eingetauchten Kulturen gezüchtet werden kann, ist es bevorzugt, die Fermentation in eingetauchtem Zustand durchzuführen.

Eine Fermentation in kleinem Haßstab des Antibiotikums wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit einer Kultur, die das Antibiotikum bildet, inokuliert und nach dem Übertragen in das Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 24°C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen läßt.

Die Fermentation wird in einem sterilisierten Kolben des Nährmediums über eine oder mehrere Stufen der Impfmaterialentwicklung initiiert. Das für die Impfstufe verwendete Nährmedium kann irgendein geeignetes Gemisch aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 28⁰C während eines Tages oder bis das Wachstum ausreicht geschüttelt, und ein Teil des entstehenden Wachstums wird zur Inokulierung entweder eines Impfmaterials der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impfkolben für das Zwischenstadium werden, wenn sie verwendet werden, in im wesentlichen der gleichen Art entwickelt, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts von

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der letzten Impfstufe wird zur Inokulierung des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden bei konstanter Temperatur mehrere Tage geschüttelt und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Inhalt des Kolbens zentrifugiert oder filtriert.

Für die Arbeit in großem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und einer Einrichtung zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in dem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei Temperaturen bis zu etwa 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfmaterial der produzierenden Kultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit von beispielsweise 1 bis 6 Tagen ablaufen, während man das Nährmedium bewegt bzw. rührt und/oder belüftet und die Temperatur bei etwa 22 bis 26°C hält. Dieses Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890Aq ist besonders zur Herstellung großer Mengen an Antibiotikum geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums 890A₉

Antibiotikum 890Ag ist eine saure Verbindung, die in Richtung auf den positiven Pol bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert wandert. Bei einem Gradienten von 50 V/cm in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, wandert das Antibiotikum in 30 min 8,0 cm, verglichen mit einer Wanderung von 4,0 cm für 890A^. Das Dinatriumsalz ist ein weißes oder leicht gelbes Pulver, lyophilisiert aus einer wäßrigen Lösung. Bei sauren Bedingungen in wäßriger Losung ist das Antibiotikum in freier Säureform instabil. Das Antibiotikum wird daher normalerweise in gebundener Form als Salz oder anderes Derivat, das stabiler ist, festgestellt.

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Das Dinatriumsalz des Antibiotikums 890Ag besitzt ein Absorptionsmaximum bei 308 und 228 nm und ein Minimum bei 262 nm bei neutralem pH-Wert in Wasser. Für die am stärksten gereinigte Zubereitung beträgt das A₃₀₈A₂₆₀-Verhältnis 2,05; das A_30Q/A₂₂₀-Verhältnis 1,17; und das A₃₀₈/A_22Q-Verhältnis 1,05. Mehr als 9396 der Absorption bei 308 nm werden durch Umsetzung mit Hydroxylamin bei neutralem pH-Wert ausgelöscht. Nach der Umsetzung mit Hydroxylamin nimmt die Absorption bei 260 nm zu, und das Verhältnis der Zunahme bei 260 nm zu der Abnahme bei 308 nm beträgt etwa 0,30. Die Umsetzung mit Hydroxylamin, die von der A₃₀₈-AbXIaIuBe bei den in der Sektion "Hydroxylamine Reaction" beschriebenen Bedingungen folgt, ist offensichtlich erster Ordnung mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur von 25 bis 50 see.

Bestimmt gegenüber einem Standard von Antibiotikum 890A₁, besitzt das Antibiotikum 890A_Q 82 Einheiten/HAEA^g-Einheit. HAEA₃₀₈ wird auf Seite 24 der Sektion "Hydroxylamin -reaktion" beschrieben.

In Tabelle II sind die 100 MHz Signale des kernmagnetischen Resonanzspektrums von 890A_Q in D₂O bei 10°C aufgeführt. Chemische Verschiebungen werden in ppm, bezogen auf HOD, bei 4,706 und 32°C gegeben, und die Kupplungskonstanten werden in Hertz aufgeführt.

Tabelle II

CH₃CH 1,55 (3H, D, 6 Hz)

CH₃CO 2,12 (3H, S)

C₆-H 3,91 (1H, D,D;J₆_₅=5,5 Hz;J₆_q_S9 Hz)

C₅-H 4,36 (1H, M)

Cq-H ~j 5 (teilweise überlagert von der HOD-Linie)

^C(1)"^H2 ³'^{14 (1H}» ^D»°i¹⁸»^{2 +} 9»^{8 Hz}>

-S-CH=CH-N 6,10 (1H, D, 13,9 Hz) und 7,19 (1H, D, 13,9 Hz)

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Das Massenspektrum von TMSi-890Ag zeichnet sich durch die in Tabelle III aufgeführten Fragmente aus.

Tabelle III

m/e 84

227 298/9 339 340 366 456

Antibiotikum 890A_g besitzt die folgende Molekülstruktur

Antibiotikum 890A_g zeichnet sich weiter durch die folgenden antibiotischen Spektrumprofile aus.

Der Versuch zur Bestimmung der antibiotischen Spektrumprofile des Antibiotikums 890Ag wird durch Anwendung eines 0,015 ml Tröpfchens aus einer 20/Ug/ml wäßrigen Lösung des Antibiotikums auf die Oberfläche einer 100 χ 15 nun Petrischale, die 5 ml geimpftes Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthält und die bei 25⁰C inkubiert wird, durchgeführt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser in mm der Inhibierungszone bzw. Hemmzone, werden in Tabelle IV aufgeführt.

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Organismus Hemmzone Durchmesser, mm Bacillus sp. MB Nr. 633 38 Proteus vulgaris MB Nr. 1012 26 Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 979 O Serratia marcescens ATCC 890 21 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 30 Bacillus subtilis ATCC 6633 38 Sarcina lutea ATCC 9341 30 Staphylococcus aureus MB Nr. 698 20 Streptococcus faecalis MB Nr. 753 0 Alcaligenes faecalis ATCC 213 29 Bruceila bronchiseptica ATCC 4617 16 Salmonella gallinarum MB Nr. 1287 34 Vibrio percolans ATCC 8461 32 Xanthomonas vesicatoria MB Nr. 815 28 Proteus vulgaris ATCC 21100 35 Escherichia coli MB Nr. 1418 30 Pseudomonas stutzeri ATCC 11607 10 Klebsiella pneumoniae MB Nr. 1264 24 Aerobacter aerogenes MB Nr. 835 25 Erwinia atroseptica AT(X 4446 30 Pseudomonas aeruginosa HB Nr.2824 0 Corynebacterium pseudodiph.ATCC 9742 19 Escherichia coli ATCC 9637 26 Streptococcus iaecium MB Nr. 2820 10

Streptococcus agalactiae MB Nr.2875 29 Vibrio percolans MB Nr.2566(res.ceph C) 21

Proteus vulgaris MB Nr.2112 (Episom) 34 Proteus mirabilis MB Nr. 3126 27

Vibrio percolans ATCC 8461 + 2x1O⁵ u/ml 19 Penicillinase

Vibrio percolans ATCC 6461 + ß-Lactamase 32 von Enterobacter clacae MB 2646

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Antibiotikum 89OAq ist gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien wirksam und ist ein potenter Inhibitor von bakteriellen ß-Lactamasen und kann in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden. 890Aq kann allein oder zusammen mit anderen antibakteriellen Arzneimitteln für die Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien, z.B. Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Salmonella schottmuelleri, verursacht werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann ebenfalls zusammen mit ß-Lactarn-Antibiotika, die gegenüber ß-Lactamasen empfindlich sind, zur Potenzierung der Wirkung solcher ß-Lactam-Antibiotika durch Inhibierung der Lactamase-Aktivität verwendet werden und ermöglicht somit eine verlängerte Lebensdauer der Antibiotika.

Ein Gemisch aus Antibiotikum 890Aq mit einem lactamase-empfindlichen ß-Lactarn-Antibiotikum wird wirksamer bei der Behandlung von Infektionen mit ß-Lactamase erzeugenden Bakterien sein als die gleiche Menge an ß-lactamase-empfindlichen Antibiotika allein.

Antibiotikum 890A_Q kann als Zusatzstoffe zu Tierfutter, zur Konservierung von Futter- und Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Es kann in wäßrigen Zubereitungen in Mengen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/ Million Teile Lösung zur Zerstörung und Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Gegenständen bzw. Einrichtungen und als Bakterizid bei industriellen Anwendungen verwendet werden.

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Antibiotikum 890Ag kann in pharmazeutischen Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit einem oder mehreren Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharma· kologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

Das Antibiotikum kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Die für die Verabreichung verwendeten Verfahren können irgendwelche Verfahren sein, die dem Fachmann geläufig sind oder die dem beschriebenen Antibiotikum angepaßt werden können.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können zusätzlich zu einem Träger andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Mittel zur Regulierung der Viskosität oder Geschmacksmittel, enthalten, Mittel, die gut bekannt sind und üblicherweise verwendet werden.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Geflügel, Kühen bzw. Rindern, Schafen, Schweinen u.a., können die Zubereitungen z.B. als intramammare Zubereitung entweder in langwirkenden oder schnell abgebenden Grundstoffen verwendet werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in großem Ausmaß von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Frequenz der Verabreichung ab. Der parenterale Weg ist für generalisierte Infektionen bevorzugt. Der orale Weg ist für intestinale Infektionen bevorzugt.

Bei der Behandlung bakterieller Infektionen bei Menschen bzw. Lebewesen können die erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit einem ß-lactamase-empfindlichen Antibiotikum oral oder parenteral nach an sich bekannten Verfahren für die Anti-

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biotikumverabreichung verabreicht werden. Das Antibiotikum 89OAq kann in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag verabreicht werden. Bevorzugt wird es in Mengen von etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt in unterteilten Dosiseinheiten, z.B. drei bis vier Mal täglich, verabreicht. Es kann in Dosiseinheiten verabreicht werden, die z.B. 100, 330, 400 oder 1000 mg aktiven Bestandteil mit geeigneten physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten werden in Form flüssiger Präparationen, wie Lösungen oder Suspensionen,oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vorliegen. Die optimale Dosis wird bei einem gegebenen Fall von der Art und der Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen. Kleinere Dosen werden bei der Kinderheilkunde verwendet werden; alle diese Einstellungen sind dem Fachmann geläufig.

Gegenstand der Erfindung sind auch die nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze von 890Aq, z.B. die pharmakologisch annehmbaren Salze, die mit anorganischen und organischen Basen gebildet werden, beispielsweise die Metallsalze, die sich von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden ableiten, Carbonate oder Bicarbonate, wie solche, die sich von«Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium ableiten, und Salze, die sich von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie Monoalkylamine, Dialkylamine, Trialkylamine, niedrig-Alkanolamine, Di-niedrig-alkanolamine, niedrig-Alkylendiamine, N,N-Diaralkyl-niedrig-alkylendiamine, Aralkylamine, Amino-subst.-niedrig-Alkanole, N,N-Di-niedrig-alkylamino-subst.-niedrigalkanole, Amino-polyamino- und Guanidino-subst.-niedrigalkansäuren und Stickstoff enthaltende heterocyclische Amine, ableiten. Beispiele sind Salze, die sich von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Ben-

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zylamin, Äthylendiamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Theophyllin, N-Methylglucamin u.a. ableiten.

Die Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können direkt aus dem Fermentationsmedium unter Verwendung geeigneter Eluierungsmittel während der Ionenaustauschchromatographie isoliert werden oder sie können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Disalze, wie das Dinatriumsalz, durch Behandlung von 2 Äquiv. Natriumhydroxid mit 1 Hol des Produktes (I) in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Gemischte Salze mit einwertigen Kationen können durch Vermischen von 1 Hol einer einwertigen Base mit 1 Hol des Produktes (I) plus 1 Äquiv. einer anderen Base hergestellt werden. Alternativ können monobasische Salze durch Behandlung von 1 Äquiv. einer Base mit einem einwertigen Kation mit 1 Hol des Produktes (I) hergestellt werden. Salze können ebenfalls durch Behandlung von 1 Hol des Produktes mit 1 Hol einer Base mit einem zweiwertigen Kation hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Salze sind pharmakologisch annehmbare, nichttoxische Derivate, die als aktiver Bestandteil in einer geeigneten pharmazeutischen Dosiseinheitsform verwendet werden können. Sie können ebenfalls mit anderen Arzneimitteln unter Erzeugung von Zubereitungen mit einem breiten Aktivitätsspektrum kombiniert werden.

Die Fermentationsbrühen, die das erfindungsgemäß hergestellte Antibiotikum 890Aq enthalten, besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 2 bis 170 Einheiten/ml bei der Analyse entsprechend dem Scheiben-Diffusions-Assay unter Verwendung von Vibrio percolans (ATCC 8461). Das in diesen FermentationsbrUhen enthaltene Antibiotikum 890Aq kann nach einer Reihe von Verfahren gewonnen und gereinigt werden. Bei einem derartigen

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Verfahren wird das Antibiotikum 09OAg an einem stark basischen Anionenaustauschharz adsorbiert. Beispiele solcher stark basischen Anionenaustauschharze sind solche, die eine Styrol-Divinylbenzol-Matrix enthalten, z.B. das Polystyrolharz Dowex 1x2 mit quaternären Ammoniumgruppen am Kern (hergestellt von Dow Chemical Co., Midland, Michigan), im ChIoridzyklus. Andere Beispiele dieser Klassen sind stark basische Austauschharze einschließlich der folgenden: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 und A-114 (hergestellt von Chemical Process Co., Redwood City, California); Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA 410. Alternativ kann ein schwach basisches Anionenaustauschharz, wie Amberlite IRA-68, verwendet werden.(Amberlite-Harze werden von Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5» Pennsylvania, hergestellt)

Das adsorbierte Antibiotikum wird leicht von dem Anionenaustauschharz mit Salzlösungen in 80%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat kann weiter nach anderen Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das Eluat kann gereinigt werden, indem man es konzentriert und durch eine Säule leitet, die mit einem Polystyrol, nichtpolares, hydrophobes, vernetztes Divinylbenzolpolymer, wie XAD-1, 2 und 4, oder Polyacrylamidharzen, wie XAD-7 und 8, gefüllt ist. XAD-2 ist bevorzugt. (XAD-1, 2, 4, 7 und 8 werden von Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia, Pennsylvania, hergestellt).

Ein Verfahren zur Herstellung von weiter gereinigtem Antibiotikum 890Ag ist die Verwendung der Gelfiltration durch Polyacrylamidgel mit einer Porengröße, die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 1800 ausschließt, wie Bio-Gel P-2 (hergestellt von Bio^#Rad, Richmond, California). Andere Gele, wie Sephadex G-10, können ebenfalls für die Entsalzung verwendet werden.

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Das bevorzugte Verfahren, gemäß dem das Antibiotikum 890Ag in hoher Reinheit aus einer Brühe erhalten werden kann, besteht darin, daß man die Brühe zur Entfernung der Feststoffe zentrifugiert oder filtriert, das Filtrat an einem Anionenaustauschharz, wie Dowex-1 χ 2 im Chloridzyklus mit 3%igem NaCl in 80#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol adsorbiert und eluiert. Dadurch werden die Antibiotika sowohl konzentriert als auch teilweise gereinigt. Anschließend wird über eine Säule mit geeignet präpariertem XAD-2 geleitet, das die Antibiotika verzögert und dadurch das Dowex-1 χ 2-Eluat reinigt und entsalzt. Die mit 890Aq angereicherten Fraktionen werden gesammelt und weiter gereinigt. Die Chromatographie an einem Dowex-1 χ 2 minus 400 mesh Harz (-0,037 mm) mit der Elution durch NaCl und/oder NH^Cl in 80#igem wäßrigem Methanol ergibt ein Produkt, das von den meisten UV absorbierenden Verunreinigungen frei ist (das NH^Cl wird verwendet, um in dem Eluierungsmittel eine gewisse Pufferkapazität zu erhalten). Das 8?0Ag wird von anderen Antibiotika bei diesem Verfahren abgetrennt. Durch eine Entsalzung an Bio-GeI P-2 oder Sephadex G-10 in 50#igem Methanol wird die Hauptmenge des Salzes, das bei der Dowex-1 χ 2-Chromatographie eingeführt wurde, entfernt.

Die restlichen Verunreinigungen können durch einen weiteren Chromatographiezyklus an Dowex-1 χ 2, minus 400 mesh (-0,037 mm), und Eluierung mit einer Lösung, die Natriumchlorid und 50#iges Methanol enthält, und anschließende Entsalzung verringert werden.

Bei der Reinigung durch Säulenchromatographie werden im allgemeinen nur solche Fraktionen eluierten Volumens, die Antibiotikum in einer Menge enthalten, das mindestens 30% rein ist, als reinste Fraktionen für die weitere Reinigung vereinigt. Die Kriterien für die Reinigung sind die Verhältnisse Bioaktivität/A₂₂Q ^{oder A}308^^A260 "¹^ ^HAEA308^^A220 ^und

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bei Entsalzungsverfahren die Leitfähigkeit. Bei jeder Chromatographiestufe werden &220* ^260' ^A308 ^{und die} Bioaktivitat geeigneter Fraktionen gemessen. Sofern möglich, wird HAEiU₀₃ ebenfalls gemessen und beim Entsalzen werden die Leitfähigkeiten gemessen. Die Kriterien für die Entscheidung, welche Fraktionen für die nachfolgenden Verfahren vereinigt werden, können etwas eingestellt werden, so daß man eine höhere Ausbeute auf Kosten der Reinheit erhält oder umgekehrt, so daß man eine höhere Reinheit auf Kosten der Ausbeute erhält.

Beim Arbeiten im Labormaßstab (weniger als 20 1 Probenvolumen) werden alle Chromatographiestufen, mit Ausnahme der XAD-2-Chromatographie, in einem Kühlraum bei 2 bis 5°C durchgeführt. Die XAD-2-Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der pH-Wert der zu lagernden Antibiotika-Lösungen wird auf 7 bis 8 durch sorgfältige Zugabe verdünnter NaOH- oder HCl-Lösungen eingestellt. Wäßrige Lösungen werden in einem Kühlschrank oder, bevorzugt, in Eis-Wasser aufbewahrt, und 50- bis 80%ige Methanollösungen werden bei -20 bis -60°C aufbewahrt.

Bei Reinigungsstufen vor der XAD-2-Chromatographie werden die Lösungen im allgemeinen auf 25/UM in EDTA durch Zugabe von i/4000stel Volumen einer Lösung aus 0,1M Na₂ EDTA eingestellt, die durch Zugabe von Natriumhydroxid (0,1 M "neutrales EDTA") auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde.

Ein Fließschema für das Reinigungsverfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890Aq ist in Fig. 1 dargestellt.

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15935

Figur lung des Reinigungsverfahrens für

Antibiotikum 89OA,

1.Kühlen

2.Zentrifugieren

3.Zugabe v.EDTA

Zentrifugierte Brühe 1.Adsorbierten an Dowex-1x2

(Cl")(50-100 mesh=O,297-

0,149 mm)
2.Waschen mit 0,15M NaCl + 0,01M tris-HCl+25/uM EDTA

in 5096 MeOH '

3«Waschen mit Wasser 4.Eluieren mit 396 NaCl+0,01M tris-HCl,pH 7,+0,25/uM neutr.

EDTA in 8096 Methanoi

Dowex-1x2 (50-100 mesh 8MH

Eluat

1.Konzentrieren
2.Adsorbieren an XAD-2 _3.Eluieren mit Wasser

XAD-2 Eluat 1.Konzentrierten der 890Aq enthaltenden Fraktionen

2.Verdünnen mit MeOH

3.Adsorb.an Dowex-1x4(Cl~) (-400 mesh = -0,037 mm)

4.Eluieren mit 0,26M NaCl+ 0,005M NHaC1+0,00005M NH* in 8096 Methanol ^J

Dowex-1x4 Eluat 890A₉ 1.Verdünnen mit Wasser

2. Adsorb. an Dowex-1 x2 (Cl~)

(-400 mesh=-O,O37 mm) 3.Eluieren mit 0,30M NaCl + 0,005M NH/.C1 + 0,001M NHx

in 5096 Methanol

Dowex-1x2(-400 mesh;
Eluat

1.Konzentrieren

2.Zugabe von 1 VoI MeOH

3.Adsorb.an Bio-Gel P-2( in

5096 MeOH)
4.Eluieren mit 0,2mM NH_x in

5096 MeOH ³

Bio-Gel P-Z Eluat

1. Konzentrieren

2. Lyophilisieren

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Assay-Verfahren für Antibiotikum 890Ag

I. Bioassay

Ein Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890A₁ wird als Standard verwendet. Antibiotikum 890A₁ wird entsprechend dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt.

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml sterilisiertem Medium, das 8 g/l Difco Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält, "Nährbrühe-Hefeextrakt" (im folgenden als NBYE bezeichnet), suspendiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschütte!vorrichtung bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wird zur Inokulation der Oberfläche von Schrägkulturen, die 1,5% Agar in NBYE enthalten, verwendet. Die inokulierten Schrägkulturen werden über Nacht
einem Eisschrank gelagert.

kulturen werden über Nacht bei 28°C inkubiert und dann in

Die gekühlten Schrägkulturen,die aus einer einzigen, lyophilisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen von ihrer Herstellung an folgendermaßen verwendet: Eine Öse von Inokulum aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, das in einem 250 ml Erlenmeyerkolben enthalten ist, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die 50% Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt. Ein 33,2 ml Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 NBYE, das 15 g Agar enthält und bei 46⁰C gehalten wird, zugegeben. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 5 ml pro Schale, gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4⁰C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

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Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm (1/2") werden in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und auf den Agar gelegt. Alternativ können die Scheiben durch Aufpipettieren von 1/10 ml Lösung auf die trockene Scheibe beladen werden, und dann kann die Scheibe auf den Agar gelegt werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach einer geeigneten Inkubation (12 bis 24 h bei 25°C) gemessen. Gegebenenfalls erfolgen.Verdünnungen der Lösungen, die untersucht werden sollen, mit 0,05 H Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 "Kaliumphosphatpuffer" (im folgenden als KPB bezeichnet) oder mit entionisiertem Wasser.

Die Wirksamkeiten bzw. Potenzen werden folgendermaßen berechnet. Eine Neigung wird bestimmt, indem man die Zonendurchmesser einer Lösung des Antibiotikums 890Aq und einer vierfachen Verdünnung (in KPB) dieser Lösung mißt. Zwei Scheiben mit jeder Konzentration werden auf einer einzigen Platte analysiert, und die durchschnittliche Zonengröße bei jeder Konzentration wird bestimmt. Die Neigung ist gleich der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrößen. Die Wirksamkeiten bzw. Potenzen werden nach der Formel berechnet:

Potenz (Einheiten/ml) = /

I [D-D ] log 2 V^ Neigung^ (Potenz des Standard) χ Verdünnung χ 10

worin D der durchschnittliche Durchmesser der von der Unbekannten gebildeten Zonen, D_fl der durchschnittliche Durchmesser der Standardzonen und "Verdünnung¹¹ der Grad, mit der die Unbekannte vor der Analyse verdünnt wurde, bedeuten. Wird kein Standard verwendet, nimmt man an, daß D_ 0,25 mm beträgt und die (Potenz des Standard) wird als 1 Einheit/ml angenommen, bestimmt an Vibrio percolans ATCC 8461. Reines 890 A₁ wird so definiert, daß es eine Wirksamkeit von 250 Einheiten pro Hydroxylamin-verschwindbare Absorptionseinheit bei 300 nm ergibt, wenn es als Standard verwendet wird.

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II. Analysen- bzw. Assayverfahren für die Bestimmung der "890 Assay-Einheiten"

Ein an sich bekanntes Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt. Eine Kultur von Vibrio percolana ATCC 8461 wird in einem Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann wird auf eine Dichte von 60% Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2 ml Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 Medium zugegeben, das ein Nähragar plus 0,2# Hefeextrakt enthält und bei 46°C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird auf 100 χ 15 nun Kunststoff-Petrischalen, 10 ml pro Schale, gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Die Konzentration an Cephaloridin, die äquivalent zu 1 Einheit/ml 890A₁ ist, wird durch Analyse an Platten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, die jedoch 5 ml inokuliertes Medium/Platte enthalten, folgendermaßen bestimmt. Vier Konzentrationen an Cephaloridin werden als Standard verwendet - 3,12, 6,25, 12,5 und 25 mcg/ml mit 12,5 mcg/ml als Vergleichslösung. Die Zonendurchmesser auf einer 5 ml Platte für den Standard sind wie folgt:

Konzentration (mcg/ml) Zonendurchmesser (mm)

3,12 16,8

6,25 22,3

12,5 25,0

25 29,6

Eine Einheit wird als die Menge an Antibiotikum/ml definiert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml Platte, wie in Teil I oben beschrieben, ergibt. Daher wird bei diesem Versuch eine Konzentration von 12,5 mcg/ml Cephaloridin äquivalent zu

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1 Einheit 890A₁ZmI angenommen. Da die Neigung der Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, werden die Berechnungen der Potenz der Probe unter Verwendung einer Neigung von 4,0 durchgeführt.

III. Hvdroxvlamin-Reaktion

Antibiotikum 890Aq reagiert mit Hydroxylamin und ergibt eine Substanz, bei der die Absorption bei 308 nm im wesentlichen verschwunden ist. Man erhält somit eine Grundlage für eine quantitative Analyse des Antibiotikums 890A_Q.

Die zu analysierende Lösung wird auf 0,05 M in Kaliumphosphat, pH 7,4 durch Zugabe von 1/20 Vol. einer Lösung, die 0,8 M K₂HPO^ und 0,2 M KH₂PO^ enthält, gebracht. 1/100 Vol. von 1 M Hydroxylamin-hydroChlorid wird zugegeben und die Absorption bei 308 nm wird in Intervallen von 1/2 bis 2 min gemessen. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Kinetische Werte erster Ordnung werden angenommen und die Halbwertszeit wird aus der Absorptionsabnahme während der ersten 10 min bestimmt. Aus dieser Halbwertszeit wird die Zeit geschätzt, bei der keine weitere Absorptionsabnahme beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen werden über diesen Zeitpunkt hinweg durchgeführt. Wenn man keine weitere Abnahme über diese Zeit beobachtet, wird die gesamte Absorptionsabnahme als "Hydroxylamin-verschwindbare Absorption bei 308 nm (HAEA,q₀)" genommen (wobei für die Verdünnungswirkung und die Absorption des Hydroxylamine korrigiert wird). Wenn man eine Absorptionsabnahme über diese Zeit beobachtet, wird die Rate der Hintergrundsabsorptionsabnahme berechnet, und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird für die Hintergrundsabnahme korrigiert, wobei man annimmt, daß die Hintergrundsabnahme mit der Zeit linear verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als HAEA,_0Q aufgezeichnet.

Die Anzahl der HAEA,₀₈-Einheiten ist gleich dem HAEA₃₀₈, multipliziert mit dem Volumen in ml.

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■2vb1260

In den folgenden Beispielen werden die Verfahren, gemäß denen die erfindungsgemäßen Produkte hergestellt werden, erläutert. Die Herstellung des Antibiotikums 890A₁ wird in

der DT-PS . (P 26 52 667.2 entsprechend

der US-Anmeldung mit der Ser.Nr. 634 300, eingereicht am 21. November 1975) unter den Namen von Cassidy et al beschrieben. Auf diese Patentschrift wird expressis verbis Bezug genommen.

Beispiel 1

Eine MA-4638 enthaltende Schrägkultur wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der mit Ablenkorganen versehen ist und 50 ml Medium A enthält, verwendet.

Medium A

Dextrose 10,0 g

Hefeautolysat (Ardamine⁺) 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer*"¹" 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml pH 6,5

⁺ Ardamine: Yeast Products, Inc.
⁺⁺ Phosphatpufferlösung:

91	,0	g
95	,0	S
1000	ml

destill.Wasser

Dieser Kolben wird bei 28°C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung mit einer Schwingungsamplitude von 5,08 cm (2 in) 2 Tage geschüttelt, bis das Wachstum zufriedenstellend ist. Nach 2 Tagen wird dieses Impfgut zur Inokulierung von drei 250 ml Erlenmeyerkolben, die 40 ml Medium B enthalten, unter Verwendung von 2 ml/Kolben (590 verwendet.

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80982 1 /0868

39 2/:>1260

15935
Medium B

Tomatenpaste bzw. -mark 20,Og

Gesamtweizen (gemahlen) 20,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,0 eingestellt

Diese Produktionskolben werden ebenfalls bei 28⁰C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung bis zu 4 Tagen geschüttelt, wobei während der Fermentation Analysenversuche durchgeführt wurden. Nach einem Alter von 3 Tagen wird ein aliquoter Teil der überstehenden Lösung aus der zentrifugierten Brühe für die Klassifizierung und Identifizierungsuntersuchung verwendet. Unter Verwendung von 0,63 cm (1/4 inch) Analysenscheiben auf Standardanalysenplatten ergibt diese Brühe eine 22 mm Hemmzone gegenüber Proteus vulgaris und eine 15 mm Hemmzone gegenüber Salmonella gallinarum. Die Bioautographie eines Elektrophoretogramms der zentrifugieren Brühe zeigt zwei Komponenten. Der sich schneller bewegende kleinere Flecken enthält 890A_g.

Beispiel 2

Fünfzehn gefrorene Ampullen, die 1 ml MA-4638-Kulturbrühe enthalten, werden langsam aufgetaut und der Inhalt wird aseptisch in fünfzehn 250 ml Erlenmeyerkolben mit dreifachen Umlenkelementen, die 50 ml C-Impfmedium enthalten, überführt. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen.

C-Medium

autolysierte Hefe (Ardamine⁺) 10,0 g

Glucose 10,0 g MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuff er"¹"* 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 6,5 eingestellt

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15935 =° ^Zb 1260

Ardamine: Yeast Products, Inc.

⁺⁺Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,Og

destill. Wasser 1000 ml

Die Impfkolben werden 20 bis 24 h bei 28⁰C + 1⁰C an einem 210 U/min Gyrotationsschüttler, 5,08 cm (2 inch) Schwingungsamplitude, geschüttelt. Die Brühe von den Impfkolben wird zur Inokulierung von Produktionskolben verwendet.

Die folgenden unterschiedlichen Produktionskolben, die D-Produktionsmedium enthalten, werden verwendet: sechs 2 1 Schüttelkolben ohne Ablenkelemente, die 150 ml Medium/Kolben enthalten, mit Baumwolle verschlossen; acht 2 1 Schüttelkolben mit drei Umlenkelementen, die 350 ml Medium/Kolben enthalten, mit Mullverschluß; und zweihundertfünfzig 250 ml Schüttelkolben ohne Ablenkelemente, die 40 ml Medium/Kolben enthalten, mit Baumwolle verschlossen. Die Gehalte an verwendetem Inokulum sind: 5 ml/150 ml Medium; 10 ml/350 ml Medium; und 1,5 ml/40 ml Medium.

D-Medium

Dextrin (CPC-modifizierte Stärke) 40,0 g Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 7,3 eingestellt.

Nach der Inokulation werden die Produktionskolben bei 25°+1°C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsarnplitude, während 3 Tagen geschüttelt. Die Kolben werden geerntet und der Inhalt wird vereinigt.

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Die Brtihe wird in 200 ml Teilen bei 11 000 U/min während 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen, insgesamt 9 1» gibt man 2 ml 0,1 M EDTA, und die überstehende Lösung wird auf eine Säule (8,2 χ 20 cm) von Dowex-1x2 (Cl"), 0,297 bis 0,149 mm (50 bis 100 mesh), aufgebracht, die zuvor mit 5 1 0,1 M HCl + 30 g/l NaCl in 80%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol und anschließend mit 5 1 entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Geschwindigkeit der Anwendung beträgt 10 bis 50 ml/min. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule mit 1 1 entionisiertem Wasser und anschließend mit 9 1 0,15 M NaCl + 0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25yuM neutral.EDTA in 50#igem wäßrigem Methanol gewaschen. Das Antibiotikum 890Aq wird dann mit 9 1 eines 30 g/l NaCl + 0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/UM neutr. EDTA in 80#igem wäßrigem Methanol in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 200 bis 900 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität nach der ATCC 8461 Analyse scheint in allen Fraktionen, 1 bis 19, aufzutreten, mit einem breiten Maximum bei den Fraktionen 6 bis 11, die sich von 1290 bis 3550 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 6 bis 14 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 190 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,4 ml 12M HCl von 7,6 auf 6,5 gebracht.

Das Konzentrat wird auf eine Säule (4,95 x 36 cm) aus XAD-2, die zuvor mit 4 1 von Je 60tfigem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 50 g/l NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde, angewendet. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule dreimal mit 10 ml entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit entionisiertem Wasser bei 15 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 100 bis 500 ml werden gesammelt. Diese Säule wird gewaschen und die Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die verdünnten Fraktionen werden unmittelbar mit Eis-Wasser gekühlt.

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15935 ^3a 2's 1260

Die antibiotische Aktivität nach der ATCC 8461-Analyse tritt in den Fraktionen 4 bis 12 auf, die sich von 450 bis 2345 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 5 bis 8, die sich von 600 bis 1245 ml eluiertem Volumen erstrecken, besitzen die höchsten Verhältnisse an HAEA2q^/Ä22o ^un(^ ^wer~ den dementsprechend für die weitere Reinigung vereinigt. Die gesammelten Fraktionen besitzen insgesamt 607 HAEA^₀A-EInheiten.

Die vereinigten Fraktionen 5 bis 8 werden bei vermindertem Druck auf 40 ml konzentriert, und das Konzentrat wird mit 160 ml Methanol verdünnt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt, und die Lösung wird dann auf eine Säule, 2,2 χ 40 cm, aus Dowex-1x4(Cl~), minus 400 mesh (-0,037 mm), die zuvor mit 2 1 0,1 M HCl + 30 g/l NaCl in 80%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol und dann mit 1 1 8O96igem Methanol gewaschen wurde, aufgebracht. Die Rate der Anwendung der Probe beträgt 2 ml/min. Nach der Anwendung wird die Säule mit 50 ml 80%igem Methanol gewaschen und mit 0,26 M NaCl + 0,01 M NH^Cl + 0,0002 M NH, in 80%igem Methanol bei 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität nach der ATCC 8461-Analyse tritt in den Fraktionen.87 bis 280 auf. Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A_g tritt in den Fraktionen 231 bis 275 auf, die maximale Aktivität tritt in der Fraktion 250 auf. Die Fraktionen 231 bis 275 werden vereinigt und ergeben die 890Ag-Dowex-Charge.

Die 890Ag-Dowex-Charge (vereinigte Fraktionen 231 bis 275) wird mit 1600 ml entionisiertem Wasser verdünnt und auf eine Säule (2,2 χ 42 cm) aus Dowex-1x2(Cl"), minus 400 mesh (-0,037 mm), bei 2 ml/min aufgebracht. Nach der Anwendung wird die Säule mit 50 ml 50?&gem (Vol/Vol) Methanol gewaschen und mit 3,4 1 0,30 M NaCl + 0,010 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₅ in 50#igem Methanol und anschließend mit 2 1 0,30 M

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NaCl +0,01 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in 60#igem Methanol bei

2 ml/min eluiert. Fraktionen von 9,5 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak bei 305 nm tritt in den Fraktionen 385 bis 440 mit einem Maximum bei der Fraktion 410 auf. Die Fraktionen 400 bis 425 besitzen die höchsten ^A305/^A260~ Verhältnisse und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten I60 A^cEinheiten, von denen 147 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 5,5 ml konzentriert. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 30/ul 1M NaOH auf 7,1 eingestellt, und 5,5 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird dann auf eine Säule (2,2 χ 69 cm) aus Sephadex G-10 angewendet, die zuvor mit 2 1 0,05 mM NH₃ in 50%igem (Vol/Vol) Methanol gewaschen wurde. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule mit 0,05 mM NH₃ in 50#igem Methanol, bei 1 ml/min, eluiert. Fraktionen von 2,95 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak bei 307 nm tritt bei den Fraktionen 69 bis 85 mit einem Maximum bei den Fraktionen 77 bis 78 auf. Leitfähigkeitsmessungen einzelner Fraktionen zeigen, daß der Hauptabsorptionspeak bei 307 nm etwas nach dem SaIzpeak eluiert. Die Fraktionen 74 bis 82, die 68 ten mit einem Verhältnis von ^(wApfin ^{von 1} »⁸⁰ werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf

3 ml konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 χ 45 cm) aus Dowex-50 χ 2 (Na⁺), 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm), angewandt, die zuvor mit 2 1 10~* M NaOH in entionisiertem Wasser und anschließend mit 100 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule zweimal mit 2 ml entionisiertem Wasser

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gespült und dann mit entionisiertem Wasser bei 4 ml/min eluiert. Fraktionen von 3,95 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak bei 307 nm tritt bei den Fraktionen 38 bis 48 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 und auf. Die Fraktionen 42, 43 und 44 haben die höchsten A^Qy/AppQ-Verhältnisse ^und werden für die LyophilisJsrung gesammelt. Der.pH-Wert der vereinigten Fraktionen wird durch Zugabe von 2,2 /ul 0,1 M NaOH von 5,8 auf 7,0 eingestellt und 2,5 ml werden entfernt. Die restlichen 9»4 ml werden bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert und 10 ml DpO werden zugegeben. Die Konzentration auf 1 ml und die Zugabe von 10 ml DpO werden wiederholt und die Endkonzentration wird erreicht. 1 ml des Konzentrats wird gefroren und lyophilisiert. Man erhält 20 mg Feststoffe, wovon etwa 18 mg NaCl sind, geschätzt durch die Leitfähigkeit.

Beispiel 3

Zwei gefrorene Ampullen, die je 1 ml MA-4638-Kulturbrühe enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird aseptisch in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben mit drei Ablenkelementen, die je 50 ml C-Impfmedium enthalten, gegeben. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen.

C-Medium

autolysierte Hefe (Ardamine⁺) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird durch Zugabe von NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 6,5 eingestellt

⁺ Ardamine: Yeast Products, Inc.

⁺⁺ Phosphatpufferlösung: KH2PO4 91,0 g

Na2HP0A 95,Og destill„Wasser 1000 ml

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Die Impfkolben werden 20 bis 24 h bei 28°+1°C auf einer 210 ü/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude (2 inch), geschüttelt. Der Inhalt wird gesammelt und zur Inokulierung der Produktionskolben verwendet.

Zehn 2 1 Schüttelkolben mit Ablenkelementen, die je 300 ml D-Produktionsmedium enthalten, werden mit 10 ml/Kolben der Brühe von dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit einem Mullverschluß bedeckt.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH vor der Behandlung im Autoklaven auf 7,3 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24°+1°C unter Schütteln auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, 3 Tage inkubiert. Die Kolben werden geerntet, der Inhalt wird vereinigt und die Brühe wird auf ihre Aktivität geprüft.

Erntealter (h) 72

pH-Wert 6,5

890 Assay (Einheiten/ml) 30,45

2 1 der gesamten Brühe aus den obigen KR-Produktionskolben werden in 200 ml Teilen bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1,7 1 überstehende Lösung mit einem pH-Wert von 6,8.

Die überstehende Lösung wird auf eine Dowex-1x2(Cl")-Säule, 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm), Schichtdimension 3,9 cm χ 25 cm, bei einer Strömungsrate von 5 bis 10 ml/min

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angewendet. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser und anschließend mit 2 1 0,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 0,25/uM neutr. EDTA in 50%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol gewaschen.

Das Produkt wird dann mit 30 g/l NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/uM EDTA in 80%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol bei einer Strömungsrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität tritt in den Fraktionen 5 bis 180 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 70 auf. Die Fraktionen 12 bis 105 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert. Der pH-Wert wird mit 1 M HCl auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 χ 55 cm) aus XAD-2 angewendet, die mit 2,5 1 von je 60#igem (Vol/Vol) wäßrigem Aceton, entionisiß rtem Wasser und 5% NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Säule wird mit 3 χ 5 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült und mit entionisiertem Wasser bei 10 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität tritt in den Fraktionen 32 bis 270 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 bis 62 auf. Die gesamte Bioaktivität, die eluiert wird, beträgt 2596 der Aktivität der ursprünglichen Brühe. Die Fraktionen 40 bis 240 werden vereinigt und die gelagerten vereinigten Fraktionen 12 bis 34 aus der XAD-2-Säule von Beispiel 1 zugegeben. Die gesamten vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert; sie enthalten 120 HAEA₅₀^-Einheiten.

Das Konzentrat wird mit 200 ml Methanol verdünnt und bei 2 ml/min auf eine Säule (2,15 x 40 cm) aus Dowex-1x4, -400 mesh (-0,037 mm), aufgebracht, die zuvor mit 2 1 von 30 g/l NaCl in 80%xgem wäßrigem Methanol und 1 1 80%igem wäßrigem Methanol

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gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule mit 100 ml 80#lgem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol gewaschen und mit 2,5 1 0,22 M NaCl + 0,01 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in 80#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol und anschließend mit 3 1 0,31 M NaCl + 0,01 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in 80#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol eluiert. Die Strömungsrate beträgt 2 ml/min. Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890Aq wird an der Dowex-1x4-Säule abgetrennt und in den Fraktionen 280 bis 350 eluiert, bestimmt durch Analyse an ATCC 8461.

Die Dowex-1x4-Fraktionen 307 bis 338 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 7,6 ml konzentriert. 30 /ul

I M NaOH werden zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 bis 7,5 zugegeben. Das Konzentrat wird mit 7,6 ml Methanol verdünnt, und die Lösung wird zur Entfernung des Salzniederschlags znetrifugiert. Die überstehende Lösung wird bei vermindertem Druck auf 4 ml konzentriert, und zu diesem Konzentrat gibt man 6 ml Methanol. Der Salzniederschlag kann sich absetzen und die überstehende Lösung wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) aus Sephadex G-10 pipettiert, die zuvor mit 10 ml 1 M NH₃ in wäßrigem Methanol und anschließend mit 1 1 0,0001 M NH₃ in 80tfigem Methanol gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule dreimal mit 1 ml 0,0001 M NH₃ in eotfigem Methanol gespült und mit 400 ml des gleichen Lösungsmittels mit einer Strömungsrate von 1 ml/min gewaschen. Die Säule wird dann mit 0,00005 M NH₃ in 50#igem wäßrigem Methanol bei einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt, wobei man vom Beginn der ersten Anwendung des 50#igen Methanoleluats zählt.

Ein Absorptionspeak bei 305 nm tritt bei den Fraktionen 9 bis 22 mit einem Maximum bei der Fraktion 12 auf. Die Fraktionen

II bis 17 werden vereinigt; sie enthalten 17 A_3Oe-Einheiten, von denen 9,1 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

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15935 3S 2/51260

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert, mit 99,796 D₂O auf 10 ml verdünnt und dann bei vermindertem Druck auf 1,5 ml konzentriert, gefroren und lyophilisiert. Das entstehende, weiße Pulver, das das Produkt 890Aq und mehr als 5 mg Natriumchlorid enthält, wird NMR-spektroskopisch analysiert.

Beispiel 4

Antibiotikum ₁

Ein Rohr bzw. eine Ampulle aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces glavogriseus MA-4600 NRRL 8140 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium ε der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium E

Hefeextrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

■^Phosphatpuffer: KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyerkolbens mit drei Ablenkelementen, der 54 ml Impfmedium C der folgenden Zusammensetzung enthält, verwendet.

Medium C

autolysierte Hefe (Ardamine⁺) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2 ml

destilliertes Wasser 1000 ml der pfr-Wert wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

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⁺ Ardamine: Yeast Products, Corp.

⁺⁺Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄ 91,Og

Na₂HPO₄ 95,0 g

destill_rWasser 1000 ml

Der Impfkolben wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen und 30 h bei 28°+1°C auf einer 220 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkelemente, die je 40 ml Produktionsmedium F enthalten, werden mit 1 ml/Kolben der Brühe von dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Watte bzw. Baumwolle verschlossen.

Medium F

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl₂.6H₂O 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 28°+1°C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, 3 Tage geschüttelt. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegenüber Vibrio percolans ATCC 8461-Standardassayplatten unter Verwendung von 1,27 cm Analysenscheiben, die in zentrifugierte Fermentationsbrühenproben eingetaucht wurden, untersucht. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt .

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Stunden nach der Entnahme 72

pH-Wert 6,4

Vibrio percolans

(1/100 Verdünnung) Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

Die gesamte Brühe wird in 200 ml Teilen in Polycarbonatflaschen 15 min bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Potenz von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutr. EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an einer Dowex-1x2 (Cl~), 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm)-Säule, Schichtdimensionen 3,8 χ 22 cm, in einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 1 1 entionisiertem Wasser, enthaltend 50 g Natriumchlorid, 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25/UM neutr. EDTA bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt. Antibiotikum 890A^ tritt in den Fraktionen 13 bis 81 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33 auf, wenn man vom Beginn der ersten Anwendung des Salzeluats an zählt. Die Fraktionen 24 bis 41, die die höchsten Biopotenz/A₂₂₀-Verhältnisse besitzen, werden für die weitere Behandlung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder *\7% der angewendeten Bioaktivität,

Das Dowex-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, und der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3 x 36 cm, aufgebracht, die zuvor mit je 2 1 60%igem Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

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Die antibiotische Aktivität tritt in den Fraktionen 6 bis 14 auf, die sich von 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens erstrecken. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf» die sich von 370 bis 590 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens entsprechen, besitzen die höchsten HAEA,_oo/A2₂o~^Ver" hältnisse und werden für die weitere Behandlung vereinigt. Diese Fraktionen enthalten 36 600 Einheiten; dies entspricht 12696 der offensichtlich angewandten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert und das Konzentrat wird auf eine Säule aus Dowex-1x4 (Cl"), -400 mesh (-0,037 mm), Schichtdimension 2,2 χ 41 cm, in einer Strömungsrate von 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 3 1 0,07 M NaCl + 0,005 M NH^Cl + 0,0001 M NH₃ in entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend bei der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁ tritt in den Fraktionen 181 bis 217 mit einem Maximum bei der Fraktion 198 auf. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16/Ul 1 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Bio-Gel P-2, 200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm), Schichtdimension 2,15 x 70 cm, aufgebracht, mit 3x1 Bl entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser bei 0,96 ml/ min eluiert. Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁ tritt bei den Fraktionen 24 bis 44 mit einem Maximum bei den Fraktionen 33

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80 98 21/0868

15935 fa 2/51260

\ind 34 auf. Die Fraktionen 27 bis 38, die die höchsten ^A300^245"^{Verhältnisse besitzen}» werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen haben insgesamt 72 A,₀₀-Einheiten.

Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3_fO ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10/ul 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Ampullen mit GlasSchraubverschluß lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890A₁; dies entspricht 35,8 A₃₀₀-Einheiten.

Ende der Beschreibung.

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Claims (5)

1. 'Γ "^r ■ ''\

   Patentansprüche

   1, Verbindung der folgenden Struktur

   CH₃-CH _

   S CH=CH-NH-C-C

   COOH

   oder ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.
2. 2. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur OSO3H
3. 3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung 890A_Q, dadurch gekennzeichnet, daß man einen 890Ag liefernden Stamm von Streptomyces flavogriseus in wäßrigem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter eingetauchten, aeroben Bedingungen kultiviert und das Antibiotikum gewinnt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der kultivierte Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 11 020 ist.
5. 5. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine antibakteriell wirksame Menge der Verbindung der folgenden Struktur

   B09821/0I568 OBIQ₁NALINSPECtED

   15935

   -CH=CH-NH-C-CH.

   OOH

   oder ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze und einen nichttoxischen» pharmazeutisch annehmbaren Träger für sie enthält.

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