DE2805724A1 - Das antibiotikum desacetyl-dihydro 890a tief 9 - Google Patents

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF ^ DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER Patentanwälte

2 8 π S 7 2 4

München,

'10,FEBRUAR 1978

Postanschrift / Postal Address Postfach 860109. 8000 München

Pienzenauerstraße 28 Telefon 98 32 22 Telegramme: Chemindus München Telex: (0) 523992

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MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Das Antibiotikum Desacetyl-dihydro 890Ag

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(L

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Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Desacetyl-dihydro 890Aq, das sowohl gegenüber grampositiven als auch gramnegativen Bakterien aktiv ist und das durch Behandlung von Dihydro 890Aq mit einer N~Acetyl-890Ag-amidohydrolase erzeugt wird, die durch einen BodenmikroOrganismus gebildet wird, der durch Anreicherungsverfahren isoliert wird. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, gemäß dem Dihydro 890Ag enzymatisch deacetyliert wird.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat ein großes Interesse auf diesem Gebiet stimuliert, das zum Auffinden vieler anderer, wertvoller, antibiotischer Substanzen geführt hat, wie anderer Penicilline, Streptomycin, Bacitracin, Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine u.a. Im allgemeinen umfaßt die antibakterielle Aktivität 3edes dieser Antibiotika nicht bestimmte, klinische, pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige hauptsächlich aktiv gegenüber nur grampositiven Arten von Bakterien. Die erlangte Resistenz im Verlauf der weitverbreiteten Verwendung der vorhandenen Antibiotika bei der Behandlung bakterieller Infektionen hat bewirkt, daß ein ernstes Resistenzproblem entstanden ist.

Die Nachteile der bekannten Antibiotika haben daher die weitere Forschung stimuliert, mit dem Ziel, andere Antibiotika zu finden, die gegenüber einem großen Bereich Pathogener wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Die Erfindung betrifft ein neues antibiotiscb.es Mittel. Die Erfindung betrifft insbesondere eine neue antibiotische Erfindung, die in der vorliegenden Anmeldung als Desacetyldlhydro 890A_q bezeichnet wird. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum in verdünnten Formen, als Rohkonzentrate und in reinen Formen.

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Der vorliegenden Erfindung liegt das Ziel zugrunde, ein neues und nützliches Antibiotikum zu schaffen, das bei der Inhibierung des Wachstums verschiedener gramnegativer und grampositiver Mikroorganismen hoch aktiv ist. Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen, antibiotischen Substanz durch enzymatische Deacetylierung der Verbindung Dihydro 890Aq geschaffen werden.

Die neue erfindungsgemäße antibiotische Verbindung wird durch Hydrolyse der N-Acetylgruppe von Dihydro 890Aq unter Verwendung von Amidohydrolase, die die N-Acetylgruppe hydrolysieren kann, hergestellt. Eine geeignete Quelle für eine Amidohydrolase mit dieser Fähigkeit ist Amidohydrolase liefernde Stämme von dem Mikroorganismus Protaminobacter ruber. Das besondere Enzym, das von Protaminobacter ruber gebildet wird, ist N-Acetyl-dihydro-egOAo-amidohydrolase, ein Mitglied der SubGruppe von Enzymen, die als E.C.3.5.1 entsprechend der Enzymnomenklatur bezeichnet werden, die von der International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry empfohlen wird.

Der Mikroorganismus, der das Deacetylierungsverfahren durchführen kann, wurde aus einer Bodenprobe isoliert und aufgrund taxonomischer Untersuchungen wurde er als solcher identifiziert, der zu der Species Protaminobacter ruber gehört, und er wurde als MB-3528 in der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc. Rahway, New Jersey, bezeichnet. Eine seiner Kulturen wurde unbeschränkt in der Culture Collection der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and .. Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, permanent hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer NRRL B-8143 erhalten.

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Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Protaminobacter ruber IJRRL B-8143 wie auch seine Kohlenstoff- und Stickstoffausnutzung bzw. -verwendung und biochemischen Reaktionen sind wie folgt.

Morphologie

Die Zellen sind stabförmig mit abgerundeten Enden, 0,9 bis 1,2 χ 2,3 bis 4,6 Mikron, sie treten einzeln oder in Paaren auf. 24 und 48 Stunden-Zellen verfärben gramnegative Bakterien mit einem körnigen Aussehen. Die Körnchen, insbesondere die polaren Körnchen, verfärben sich mit Sudan Black B schwarz. Die Zellen sind bei 28°C bewegungsfähig, aber die Motilität ist bei 37⁰C fraglich.
Kulturei genschaften

Nähragarkolonien sind zuerst dünn, punktförmig (punctiform), semi-transparent und farblos; sie werden dann etwas konvex, opak, glatt, mit vollständigem Rand, etwas trocken in der Konsistenz und sind rosa bis rosarot pigmentiert.

Die Nährbrühenkulturen sind einheitlich trüb ohne Häutchen.

Die Pigmentproduktion hängt nicht vom Licht oder den geprüften Temperaturen (28 und 37°C) ab. Das Pigment ist in Aceton löslich, aber unlöslich in Wasser oder Chloroform.

Das Wachstum auf Nähragar und Gehirn-Herz-Infusionsagar unter aeroben Bedingungen ist etwas langsam, aber gut bei 28⁰C. Das Wachstum ist mäßig bis gut, aber langsamer bei 37°C. Bei 50° C findet kein Wachstum statt.

Verwendung von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen

Unter Verwendung eines Grundsalzmediums mit Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle ist das Wachstum gut mit Arabinose, mäßig mit Xylose und schlecht mit Dextrose, Fructose, Mannose, Rham-

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nose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Cellulose, Inosit und Mannit.

N-Acetyläthanolamin kann als einzige Kohlenstoff- und Stickstoff quelle verwendet werden.

Aus Dextrose oder Lactose wird in OF Grundmedium (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) unter aeroben oder anaeroben Bedingungen keine Säure oder Gas gebildet.·

Biochemische Reaktionen

Die biochemischen Reaktionen beruhen auf Standardverfahren, wie sie in Manual of Microbiological Methods, herausgegeben von der Society of American Bacteriologists, McGraw Hill Book Co., New York, 1957, beschrieben werden.

Catalase - positiv

Oxidase - negativ

Stärke wird nicht hydrolysiert Casein wird nicht hydrolysiert Gelatine wird nicht verflüssigt

Lackmusmilch bleibt in der Konsistenz unverändert, wird jedoch nach 7 Tagen etwas alkalisch

Indol - negativ

H₂S - negativ

Nitrate werden nicht reduziert Urease - positiv

Lysin- und Ornithin-decarboxylase - negativ.

ist die Bezeichnung, die dem Antibiotikum der Struktur

OSO₃H ;

S-CH=CHNH-C-CH,

'iOOH

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zugeordnet wird. 890Aq, seine Beschreibung und Verfahren zu seiner Herstellung werden in der Anmeldung P 27 51 260.3", eingereicht am 16.11.1977, (entsprechend der US Ser.Nr.742 957 vom 17. November 1976) beschrieben.

Das neue erfindungsgemäße Antibiotikum Desacetyl-dihydro 890A_g besitzt die Strukturformel

und wird durch enzymatische Hydrolyse von Dihydro 890Aq unter Verwendung einer in Species des Genus Protaminobacter vorhandenen Amidohydrolase hergestellt.

Das neue erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Spaltung der N-Acetylgruppe der Verbindung der Struktur

OSO₃H

COOH

und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung mit einer Amidohydrolase innigst behandelt, die die N-Acetylgruppe hydrolysieren kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insbesondere die N-Deacetylierung von Dihydro 890A_q durch inniges Behandeln dieser Verbindung mit der Amidohydrolase N-Acetyl-dihydro-SgOAg-amidohydrolase.

Eine unerwartete Homologie zwischen N-Acetyläthanolamin und . 890Aq besteht, wobei Extrakte von Mikroorganismen mit dem Enzym N-Acetyläthanolamin-amidohydrolase in vielen Fällen fähig sind, Dihydro 890Aq zu hydrolysieren.

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Die Verbindung 890Aq wird durch Fermentation der Brühe mit dem Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus erzeugt.

Aufgrund ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen wurde der Stamm des bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismus als zu der Species Streptomyces flavogriseus gehörend identifiziert und mit MA-4638 in der Culture Collection von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., bezeichnet. Eine seiner Kulturen wurde permanent ohne Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit in der Culture Collection der Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agridulture, Peoria, 111., hinterlegt und ist öffentlich unter der Nummer NRRL 11 020 zugänglich.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 erzeugt das Antibiotikum 890Aq, das in im wesentlii
tionsbrühe isoliert wird.

890Aq, das in im wesentlichen reiner Form aus der Fermenta-

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus MA-4638 werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie

Die Sporenträger sind verzweigt, geradkettig bis gebogene Ketten aus Sporen, die Büschel bilden. Die Ketten sind länger als 10 Sporen. Die Sporen sind sphärisch bis oval 0,9/u χ 1,2/U (970x) _χ

Kultureigenschaften
Hafermehlagar (ISP Medium 3)

vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun, gekräuselt

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Mittelgrau lösliches Pigment - keins

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Czapek Dox-Agar (Saccharose-Uitrat-Agar) vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun gesäumt mit Dunkelbraun Luftmycelium - mittelgrau, samtartig lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums

Eialbuminagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun

Luftmycelium - mittelgrau, gemischt mit gelblichem Grau (2dc) und gräulichem Gelb (2db)

lösliches Pigment - hellgelblich dunkelgelb Glycerin-Asparaginagar vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun Luftmycelium - samtartig, hellgrau mit gelblichem Ton(2dc)

lösliches Pigment - helles Dunkelgelb Anorganische Salze-Stärkeagar (ISP Medium 4) vegetatives Wachstum - umgekehrt-grünlich-gelblich-dunkelgelb Luftmycelium - samtartig, mittelgrau mit gelbem Ton (3fe)

lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun Luftmycelium - dunkelgrau, gemischt mit hellerem Grau

lösliches Pigment - keins Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Medium 2) vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun Luftmycelium- samtartig, dunkelgrau gesäumt mit hellerem Grau

lösliches Pigment - keines Magermilchagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb Luftmycelium - spärlich, weißlich lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums

Hydrolyse von Casein - gut Lackmusmilch

vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb Luftmycelium - keins Farbe - purpur

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Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden

Magermilch

vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb Luftmycelium - keins lösliches Pigment - hellbraun .*

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden

Nährtyrosinagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun Luftmycelium - dunkelgrau gesäumt mit gräulichem Weiß lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums

Zersetzung von Tyrosin - positiv Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar vegetatives Wachstum - dunkelgelb Luftmycelium - weißlich, mäßig lösliches Pigment - keins Melanin - keins

H₂S-Bildung - negativ Nähragar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-hellgräulich Braun Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Dunkelgrau

lösliches Pigment - keines Nährstärkeagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau Luftmycelium - mittelgrau lösliches Pigment - keins

Stärkehydrolyse - gut Nährgelatineagar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau Luftmycelium - gräulich-weiß lösliches Pigment - keins

Verflüssigung von Gelatine - gut Kartoffelzapfen

vegetatives Wachstum - dunkelgelb

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Luftmycelium - mittel- bis dunkelgrau

lösliches Pigment - keins
Loeffler's Blutserum

vegetatives Wachstum - cremefarben Luftmycelium - keins

lösliches Pigment - keins

VeifLüssigung - keine
Gelatinestich :

vegetatives Wachstum - dunkelgelb

Luftmycelium - keins

lösliches Pigment - keins

Verflüssigung der Gelatine - vollständig.

Alle obigen Bestimmungen bzw. Ablesungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubationszeit bei 28°C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien war etwas neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die Farbbezeichnungen, die in der Beschreibung verwendet wurden, erfolgten entsprechend der Definition des Color Harmony Manual, 4. Edition (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus wurde ebenfalls auf seine Fähigkeit geprüft, verschiedene Kohlenhydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus auf einem synthetischen Grundmedium (Pridham und Gottlied), das Λ% Kohlenhydrat enthält, 3 Wochen bei 28°C gezüchtet. Der pH-Wert der bei dieser Untersuchung verwendeten Medien war etwa neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Verwertbarkeit dieser Kohlenhydratquellen durch Streptomyces flavogriseus MA-4638 aufgeführt, wobei + Wachstum, + schlechtes oder fragliches Wachstum und - kein Wachstum bedeuten, verglichen mit der negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle).

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Tabelle I

Glucose + Maltose +

Arabinose + Mannit +

Cellulose - Mannose +

Fructose + Raffinose

Inosit - Rhamhose +

Lactose + Saccharose +

Xylose + ;

Die Wachstumsmenge mit Änderungen in der Temperatur und des Sauerstoffbedarfs durch den Mikroorganismus ist wie folgt:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar) 28⁰C - gutes vegetatives und Luftwachstum 37°C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 5O°C - kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar)

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen beschränkt, die den obigen Wachstums- und mikroskopischen Eigenschaften voll entsprechen, die zur Erläuterung angegeben wurden. Sie soll die Verwendung von Mutanten mitumfassen, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Mittel, wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, StickstoffIost, Bakteriophageneinwirkung u.a., erzeugt werden.

890Aq wird während der aeroben Fermentation,bei kontrollierten Bedingungen, geeigneter, wäßriger Nährmedien, die mit einem Stamm des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind, gebildet. Wäßrige Medien, wie solche, die für die Bildung anderer Antibiotika verwendet werden können, sind für die Bildung von 890Aq geeignet. Solche Medien enthalten Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind.

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Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.a., und Stärken, wie Dextrin, oder solche als Körner, wie z.B. Hafer, Roggen, Mais- bzw. Getreidestärke, Mais- "bzw. Getreidemehl u.a., entweder allein oder im Gemisch als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die Menge an Kohlenhydrat variiert normalerweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.% des Mediums. Solche Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vereinigt werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen z.B. Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweichflüssigkeit bzw. -quellwasser, Schlempen bzw. lösliche Stoffe der Branntweinherstellung u.a., wobei die bevorzugte Quelle Schlempen bzw. lösliche Stoffe der Branntweinherstellung sind. Die Stickstoffquellen, entweder allein oder im Gemisch, werden in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.5ό, bezogen auf das wäßrige Medium, verwendet.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Carbonat- oder ähnliche Ionen ergeben. Ebenfalls umfaßt werden Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien dienen nur zur Erläuterung einer Vielzahl von Medien, die verwendet werden können, und sollen keine Beschränkung darstellen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C durchgeführt. Für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 23 bis 28⁰C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert der für das Wachstum

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der Stämme der Streptomyces flavogriseus-Kultur und zur Erzeugung des Antibiotikums 890Aq geeigneten Medien kann von etwa 6,0 Ms 8,0 variieren.

Obgleich das Antibiotikum 890Aq sowohl in Oberflächen- als auch in eingetauchten Kulturen erzeugt wird, ist es bevorzugt, die Fermentation in eingetauchtem Zustand durchzuführen.

Die Fermentation des Antibiotikums in kleinem Maßstab wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der Antibiotikum liefernden Kultur inokuliert und nach der Übertragung in das Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 24°C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen läßt.

Die Fermentation wird in einem sterilisierten Kolben des Nährmediums über eine oder mehrere Stufen der Impfkeimmaterialentwicklung durchgeführt. Das Nährmedium, das für die Impfstufe verwendet wird, kann irgendeine geeignete Kombination aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 28°C einen Tag oder bis das Wachstum ausreicht geschüttelt, und ein Teil des entstehenden Wachstums wird zur Inokulation entweder eines Impfmaterials der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impf kolben der Zwischenstufen werden, wenn sie verwendet werden, auf im wesentlichen gleiche Weise entwickelt, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts von der letzten Impfstufe wird zur Inokulation des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt und gegen Ende der Inkubationszeit werden die Kolbeninhalte zentrifugiert oder filtriert.

Für das Arbeiten in großem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und einer Einrichtung zum Belüften des Fermen-

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tationsmediums ausgerüstet sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in dem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei Temperaturen bis zu etwa 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezogenen Impfmaterial der Produktionskultur inokuliert, und die Fermenta- tion kann während einer Zeit, wie z.B. 1 bis 6 Tage, unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Halten der Temperatur bei etwa 22 bis 26°C ablaufen. Dieses Verfahren zur Erzeugung von Antibiotikum 89OAq ist besonders für die Herstellung großer Mengen des Antibiotikums geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums

Das Antibiotikum 890Ag ist eine saure Verbindung, die in Richtung auf den positiven Pol bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert wandert. Bei einem Gradienten von 50 V/cm in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7»1, wandert das Antibiotikum 8,0 cm in 30 min, verglichen mit einer Wanderung von 4,0 cm für 890A₁. Das Dinatriumsalz ist ein weißes oder hellgelbes Pulver nach der Lyophilisierung aus wäßriger Lösung. Bei sauren Bedingungen in wäßriger Lösung ist das Antibiotikum in der freien Säureform instabil. Das Antibiotikum wird daher normalerweise in gebundener Form als Salz oder in Form anderer Derivate, die stabiler sind, vorliegen.

Das Dinatriumsalz des Antibiotikums 890Ag besitzt Absorptionsmaxima bei 308 und 228 nm und ein Minimum bei 262 nm bei neutralem pH-Wert in Wasser. Für die am besten gereinigte Zubereitung beträgt das A^_O8/A_26o-Verhältnis 2,05, das A,_Q8/ A₂₂₀-Verhältnis 1,17 und das A₃₀₈/A₂₂₈-Verhältnis 1,05. Mehr als 93% der Absorption bei 308 nm können durch Umsetzung mit Hydroxylamin bei neutralem pH-Wert ausgelöscht bzw. beseitigt werden. Nach der Reaktion mit Hydroxylamin nimmt die Absorption bei 260 nm zu, und das Verhältnis der Zunahme bei 260 nm zu der Abnahme bei 308 nm beträgt etwa 0,30. Die Reaktion mit

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Hydroxylamin, gefolgt von der A₃₀₃- Abnahme unter den Bedingungen, die in dem Teil mit der Überschrift "Hydroxylamin-Reaktion" beschrieben werden, ist offensichtlich erster Ordnung mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur von 25 bis 50 Sekunden.

Gemessen gegenüber einem Standard des Antibiotikums 890A₁, besitzt das Antibiotikum 890A_Q 82 Einheiten/HAEA,₀₈-Einheit. HAEA₃₀₈ wird in dem Abschnitt "Hydroxylamin-Reak-ti on¹.' beschrieben.

In Tabelle II sind die 100 MHz kernmagnetischen spektralen Resonanzsignale von 890Aq in D₂O bei 10°C angegeben. Die chemischen Verlagerungen werden in ppm, bezogen auf HOD bei 4,70Sund bei 32°C, angegeben, und die Kupplungskonstanten werden in Hertz aufgeführt.

Tabelle II

CH₃CH 1,55 (3H, D, 6Hz) CH₃CO 2,12 (3H, S) C₆-H 3,91 (1H, D,D; J₆_₅=5,5 Hz, J"₆_₈=9 Hz) C₅-H 4,36 (1H, M) C₈-H f 5 (teilweise bedeckt durch die HOD-Linie) ^C(1)-^H2 ³'^{14 (1H}» ^D»^D;¹⁸»^{2 +} 9,8 Hz)

-S-CH=CH-N 6,10 (1H, D, 13,9 Hz) und 7,19(1H, D, 13,9 Hz).

Das Massenspektrum von TMSi-890Ag wird durch die in Tabelle III gezeigten Fragmente charakterisiert.

Tabelle III

m/e 84

227 298/9 339 340 366 456

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Das Antibiotikum 89OAg besitzt die folgende molekulare Struktur

-CH=CH-NH-C-CE-

(I)

COOH

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird die ungesättigte Seitenkette von 890Aq während oder vor der Umsetzung des Enzyms, N-Acetyl-dihydro-SgOAg-amidohydrolase, reduziert.

Die ungesättigte Seitenkette von 890Ag kann nach irgendeinem an sich gut bekannten Verfahren reduziert werden. Die Reduktion der 890Ag-Seitenkette führt zu der Verbindung Dihydro der folgenden Struktur

0SO₃H

0OH

Die Verbindung Dihydro 890Ag deacetyliert erfindungsgemäß und ergibt die neue Verbindung Desacetyl-dihydro 890Ag.

Die erfindungsgemäße Verbindung Desacetyl-dihydro 890Ag ist ein wertvolles Antibiotikum gegenüber verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien und findet dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung. Die erfindungsgemäße Verbindung kann als antibakterielles Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch grampositive oder gramnegative Bakterien verursacht werden, z.B. " gegenüber empfindlichen Stämmen von Staphylococcus aureus, Proteis mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

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Enterobacter cloacae und Pseudomonas aeruginosa. Das erfindungsgemäße antibakterielle Material kann weiterhin als Zusatzstoff zu Tierfutter bzw. Tierfutterzusätzen, zur Konservierung von Futter und Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Beispielsweise kann es in wäßrigen Zusammensetzungen in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung zur Zerstörung und Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Vorrichtungen und Einrichtungen und als Bakterizid bei industriellen Anwendungen, z.B. bei Anstrichmitteln auf Viassergrundlage und in dem Weißwasser von Papiermühlen, zur Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum kann in irgendeiner der Vielzahl pharmazeutischer Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden. Als Beispiel des ersteren kann man ein Amino-cyclitol-Antibiotikum, wie Gentamicin, gleichzeitig verabreichen, um irgendeine Chance minimal zu halten, daß resistente Organismen zurückbleiben. Als Beispiel des letzteren kann man Diphenoxylat und Atropin in Dosisformen vermischen, die für die Therapie der Gastroenteritis bestimmt sind. Das Antibiotikum kann in Kapselform oder in Form von Tabletten, Pulvern oder flüssigen Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Es kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Dosiseinheitszubereitungsform vorliegen, und sie können übliche Arzneimittelträgerstoffe, wie Bindemittel, z.B. Sirup, Akaziengummi, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon;

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Füllstoffe, z.B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Schmiermittel, z.B. Magnesiumstearat, Talk, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Desintegrationsmittel, z.B. Kartoffelstärke, oder annehmbare Benetzungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können nach an sich bekannten Verfahren beschichtet seih. Orale, flüssige Präparationen können in Form wäßriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups, Elixieren usw. vorliegen oder sie können als Trockenprodukt für die Rekonstitution mit Wasser oder anderen geeigneten Trägern vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Zubereitungen können an sich bekannte Zusatzstoffe, wie Suspensionsmittel, z.B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte genießbare Fette; Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akaziengummi; nichtwäßrige Träger, die genießbare Öle umfassen können, z.B. Mandelöl, fraktioniertes Cocosnußöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konservierungsstoffe, z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure, enthalten. Die Suppositorien werden an sich bekannte Suppositoryengrundstoffe, z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.

Zubereitungen für die Injektion können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in Behältern mit mehrfachen Dosen mit zugegebenem Konservierungsstoff vorliegen. Die Zubereitungen können in Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen und können Zubereitungshilfsmittel, wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform für die Rekonstitution mit einem geeigneten Träger, 2.B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.

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Die Zubereitungen können ebenfalls in geeigneten Formen für die Absorption durch die Schleimhautmembranen der Nase und des Rachens oder der Bronchialgewebe vorliegen, und sie können zweckdienlich in Form von Pulvern oder flüssigen Sprays oder Inhalationsmitteln, Lutschbonbons, Anstrichmitteln für den Rachen, usw. vorliegen. Für die Medikation der Augen oder Ohren können die Zubereitungen als individuelle Kapseln in flüssiger oder semi-fester Form vorliegen oder sie können als Tropfen usw. verwendet werden. Zubereitungen für topische Anwendungen können in hydrophoben oder hydrophilen Grundstoffen, wie in Form von Salben, Cremes, Lotionen, Anstrichmitteln, Pulvern usw., vorliegen.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können zusätzlich zu dem Träger andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskosxtätseinstellungsmittel oder Aroma- bzw. Geschmacksmittel u.a., enthalten.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Geflügel bzw. Küken, Kühen, Schafen, Schweinen u.a., können die Zubereitungen beispielsweise als intramammare Zubereitungen in entweder langwirkenden oder schnell freisetzenden Grundstoffen formuliert werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in starkem Ausmaß von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Frequenz der Verabreichung ab. Bei generalisierten Infektionen ist der parenterale und bei intestinalen Infektionen der orale Weg bevorzugt.

Bei der Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oral oder parenteral nach an sich bekannten Verfahren für die Antibiotikumverab-

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reichung in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und
bevorzugt etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt in unterteilten Dosen, z.B. drei- bis viermal täglich, verabreicht. Sie können in Dosiseinheiten verabreicht werden, die 25, 250, 330, 400
oder 1000 mg aktiven Bestandteil mit geeigneten, physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die
Dosiseinheiten liegen in Form flüssiger Zubereitungen, wie
als Lösungen oder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis wird in einem gegebenen Fall natürlich von der Art und Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen, und kleinere Dosen werden bei Kindern bzw. Säuglingen verwendet. Alle diese Einstellungen sind dem Fachmann geläufig.

Assay- bzw. Analyseverfahren für das Antibiotikum 890Aq
I. Bioassay (Bioanalyse)

Ein Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890A₁ wird als Standard verwendet. Antibiotikum 890A₁ wird nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Die Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltenden Platten werden
wie folgt hergestellt.

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461
wird in 15 ml eines sterilisierten Mediums suspendiert, das
8 g/l Difco Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem
Wasser, "Nährbrühe-Hefeextrakt" (nachstehend als NBYE bezeichnet) , enthält. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wird zur Inokulierung der Oberfläche von Schrägkulturen verwendet, die" 1i5# Agar in NBYE enthalten, und die inokulierten Schrägkulturen \ 'erden über Nacht bei 28⁰C inkubiert und dann in einem
Eisschrank gelagert.

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Die aus einer einzigen lyopMlisierten Kultur hergestellten, gekühlten Schrägkulturen werden bis zu 4 Wochen seit ihrer Herstellung wie folgt verwendet. Eine Öse Inokulura von der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, der in einem 250 ml ErIenmeyerkolben enthalten ist, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28⁰C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die 50^5 Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt. Ein 33»2 ml-Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 NBYE gegeben, der 15 g Agar enthält und bei 46°C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 5 ml/Schale, gegossen, abgekühlt und bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm werden in die zu analysierende Lösung getaucht und auf das Agar gesetzt. Alternativ können die Scheiben durch Pipettieren von 1/10 ml der Lösung auf eine trockene Scheiben und Setzen der Scheibe auf das Agar beschickt bzw. beladen werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach einer geeigneten Inkubation (12 bis 24 h bei 25°C) bestimmt. Gegebenenfalls erfolgen Verdünnungen der zu analysierenden Lösungen in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, "Kaliumphosphatpuffer " (im folgenden als KPB bezeichnet), oder in entionisiertem Wasser.

Die Berechnungen der Potenzen bzw. Wirksamkeiten erfolgen wie folgt: Eine Neigung wird bestimmt, indem man die Zonendurchmesser einer Lösung des Antibiotikums 890Ag und einer vierfachen Verdünnung (in KPB) dieser Lösung) mißt. Zwei Scheiben von jeder Konzentration werden auf einer einzigen Platte analysiert und die durchschnittliche Zonengröße bei jeder Konzentration wird bestimmt. Die Neigung entspricht der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrößen. Die Potenzen werden gemäß der folgenden Formel berechnet:

- 20 809833/0988

TM-

15 976

Potenz(Einheiten/ml) =

[D-D₅] log 2

Neigung

(Potenz des Standard^ χ Verdünnung χ 10. Darin bedeuten: D der durchschnittliche Durchmesser der von der unbekannten Verbindung gebildeten Zonen; D der durchschnittliche Durchmesser der Standardzonen, und "Verdünnung" den Grad, auf den die unbekannte Verbindung vor der Analyse verdünnt wurde. Wird kein Standard verwendet, wird D als 25 mm angenommen und (Potenz des Standards) wird als 1 Einheit/ml angenommen,bestimmt an Vibrio percolans ATCC 8461. Reines 890A₁ wird so definiert, daß es eine Potenz von 250 Einheiten/durch Hydroxylamin auslöschbare Absorptionseinheit bei 300 nm besitzt, wenn es als Standard verwendet wird.

II. Assay- bzw. Analyseverfahren für die Bestimmung der "890 Assayeinheiten"

Ein an sich bekanntes Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden wie folgt hergestellt: Eine Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte von 60$iger Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2 ml-Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 Medium zugegeben, das Nähragar plus O,2# Hefeextrakt enthält und bei 46°C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird auf 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, " gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

- 21 -

809833/0989

Die Konzentration an Cephaloridin, die äquivalent zu 1 Einheit/ml 890A₁ ist, wird durch Analyse an den, wie oben beschrieben hergestellten Platten, die jedoch 5 ml inokuliertes Medium/Platte enthalten, wie folgt bestimmt: Vier Konzentrationen an Cephaloridin ergeben den Standard - 3,12, 6,25, 12,5 und 25 mcg/ml, wobei 12,5 mcg/ml als Vergleichs- bzw. Referenzlösung dienen. Die Zonendurchmesser auf einer 5 ml-Platte für den Standard sind wie folgt:

Konzentration (mcg/ml) Zonnendurchmesser(mra)

3,12 16,8

6,25 22,3

12,5 25,0

25 29,6

Eine Einheit wird als die Menge an Antibiotikum/ml definiert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml-Platte, wie in Teil I oben beschrieben, ergibt. Bei dieser Analyse wird daher eine Konzentration von 12,5 mcg/ml Cephaloridin als äquivalent zu 1 Einheit 890A₁/ml angesehen. Da die Neigung der Linie für Cephaloridin A-,0 beträgt, erfolgen die Berechnungen der Potenz der Probe unter Verwendung einer Neigung von 4,0.

III. Hydroxylamin-Reaktion

Das Antibiotikum 890Ag reagiert mit Hydroxylamin und ergibt eine Substanz mit einer stark verringerten Absorption bei 300 nm. Dies ermöglicht eine Grundlage für die quantitative Analyse des Antibiotikums 890Aq.

Die zu analysierende Lösung wird auf 0,05 M in Kaliumphosphat, pH 7,4, durch Zugabe von 1/20 Vol. einer Lösung, die 0,8 M K₂HPO^ und 0,2 M KH₂PO^ enthält, gebracht. Dann wird 1/100 Vol. von 1 M Hydroxylamin-hydrochlorid zugegeben, und die Absorption wird bei 308 nm in Intervallen von 1/2 bis 2 min gemessen. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Man nimmt kinetische Werte erster Ordnung an, und die Halbwerts-

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15 976

zeit wird aus der Absorptionsabnähme während der ersten 10 min geschätzt. Aus dieser Halbwertszeit wird die Zeit bestimmt, nach der keine weitere Absorptionsabnahme beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen werden über diese Zeit hinaus fortgeführt. Beobachtet man nach dieser Zeit keine weitere Abnahme, so wird die gesamte Absorptionsabnahme (mit Korrektur für den Verdünnungseffekt und die Absorption des Hydroxylamins) als "Hydroxylamin auslöschbare Absorption bei 308 nm (HAEA^₀₈)" genommen. Beobachtet man .nach dieser Zeit eine Absorptionsabnahme, so wird die Rate der Hintergrundsabsorptionsabnahme berechnet, und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird für die Hintergrundsabnahme korrigiert, wobei man annimmt, daß die Hintergrundsabnahme im Verlauf der Zeit linear verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als aufgezeichnet.

Die Zahl der HAEA^g-Einheiten ist gleich HAEA₃₀₈, multipliziert mit dem Volumen in ml.

In den folgenden Beispielen werden die erfindungsgemäßen Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung erläutert.

Beispiel 1

Verfahren zur Isolierung von N-Acetyl-dihydro-SSOAq-amido-

hydrolase liefernden Organismen

Eine 1%ige (Gew./Vol.) Suspension aus fruchtbarem Rasenboden wird hergestellt, indem man 1 g Rasenboden in 100 ml steriler Phosphatpuffer-Salz-Lösung suspendiert, wobei die Phosphatpuffer-Salz-Lösung die folgende Zusammensetzung besitzt:

Phosphatpuffer-Salz-Lösung

NaCl 8,8 g

1 M Phosphatpuffer, pH 7,5⁺ 10 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

- 23 -

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⁺ 1 M Phosphatpuffer, pH 7,5: 16 ml 1 M KH₂PO₄ werden mit 84 ml 1 M K₂HPO₄ vermischt. Der pH-¥ert des Phosphatpuffers wird durch Zugabe geringer Mengen von entweder 1 M KHpPO₄ oder 1 M K₂HPO₄ auf 7,5 eingestellt.

Aliquote Teile dieser 1?6igen Stock- bzw. Vorratsbodensuspension werden zur Herstellung von 1o-, 100- und lOOOfachen Verdünnungen verwendet.

1 ml-Teile der Stocksuspension oder 1 ml-Teile der 10-, 100- und lOOOfachen Verdünnungen werden zu 2 ml-Teilen steriler, 1,0%iger Agarlösungen bei 48⁰C gegeben. Die Gemische werden schnell über die Oberfläche steriler Petrischalen mit einem Durchmesser von 85 mm, die 20 ml Medium A enthalten, gegossen. Medium A besitzt die folgende Zusammensetzung:

Medium A

KH₂PO₄ 3,0 g

K₂HPO₄ 7,0 g

MgSO₄ 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml

N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird auf das 1Ofache in Wasser verdünnt und gegenüber einer Membran sterilisiert. Diese Lösung wird nach der Behandlung im Autoklaven zugegeben.
Für feste Medien; 20 g Agar werden zugegeben. Die Petrischalen werden 18 Tage bei 28°C inkubiert. Gut isolierte Kolonien werden herausgenommen und auf Medium B ausgestrichen. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B

Tomatenmark bzw. -paste 40 g gemahlenes Hafermehl 15 g destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 6 eingestellt.

- 24 -

Für feste Medien; 20 g Agar werden zugegeben.

Einzelne Klonen werden ausgewählt und 2 Tage bei 28°C auf Schrägkulturen von Medium B gezüchtet.

Ein Teil des Wachstums der Schrägkulturen wird zur Inokulation eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml Medium A enthält; eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml ergänztes Medium B enthält (ergänzt nach der Behandlung im Autoklaven mit 0,4 ml einer gegenüber einer Membran sterilisierten Lösung aus N-Acetyläthanolamin, mit Wasser auf das 1Ofache verdünnt); und eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml Medium C enthält, verwendet. Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Dextrose 20 g

Pharmamedia 8 g

Maisquellwasser(nasse Basis) 5 g

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH oder HCl auf 7 eingestellt N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird in Wasser auf das 1Ofache verdünnt und gegenüber einer Membran sterilisiert. Diese Lösung wird nach der Behandlung im Autoklaven zugegeben.

Die Koben werden 4 Tage bei 28°C auf einer 220 U/min (5,08 cm Schwingungsamplitude) Schüttelvorrichtung geschüttelt. Ein 30 ml-Teil aus jedem Kolben wird 15 min bei 8000 U/min zentrifugiert. Der überstehende Teil wird entfernt, wobei nur so viel zurückgelassen wird, daß sich eine dicke Suspension aus Zellen und Medienfeststoffen bilden kann. Die Hälfte der Suspension wird der Ultraschallzerreißung unter Verwendung eines Branson Instrument Modell LS-75 Sonifiers mit einer 1,27 cm Sonde unterworfen. Die Eingangsleistung wird auf die Stellung

- 25 -

ß09833/0988

15 976 *^J

Nr. 4 gesetzt, und vier aufeinanderfolgende 15 sec-Zyklen von Bestrahlung bzw. Beschallung werden verwendet, während die Suspension in Eis-Wasser während und zwischen der Zerreißung gekühlt wird. Zur Prüfung auf die Anwesenheit von N-Acetyl-dihydro-890Ag-amidohydrolase--Aktivität wird ein 10/ul-Teil des Sonikats mit 25/u! einer Dihydro 890Ag-Lösung, die 500/Ug/ml enthält, vermischt. Vergleichsproben, die Antibiotikum und Puffer allein enthalten, und mit Ultraschall behandelte Zellen und Puffer ohne Antibiotikum werden ebenfalls geprüft. Nach der Inkubation über Nacht bei 28°C werden 10/ul-Mengen auf Schleicher und Schuell Nr. 2043-Papier aufgebracht. Unter Verwendung eines 0,03 M Kaliumphosphatpuffers, pH 7*1» wird ein Spannungsgradient von 50 V/cm während 30 min angelegt. Das Papier wird auf Staphylococcus aureus ATCC 6538P-Platten gelegt und 18 h bei 37°C inkubiert.

Die Analysenplatten werden wie folgt hergestellt. Ein Übernachtwachstum des Assayorganismus, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, in Nährbrühe plus 0,2# Hefeextrakt \7ird mit Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt auf eine Suspension verdünnt, die eine Durchlässigkeit von 60% bei einer Wellenlänge von 660 nm zeigt. Diese Suspension wird zu Difco Nähragar, ergänzt mit 2,0 g/l Difco Hefeextrakt,bei 47 bis 48°C unter Herstellung einer Zusammensetzung gegeben, die 33,2 ml Suspension/l Agar enthält. 40 ml dieser Suspension werden in 22,5 cm χ 22,5 cm Petrischalen gegossen, und diese Schalen werden gekühlt und bei 4°C bis zu ihrer Verwendung (maximal 5 Tage) gehalten.

Der unveränderte bioaktive Dihydro 890AqFleck migriert 8 cm in Richtung auf den positiven Pol. Ein neuer .bioaktiver Fleck, bedingt durch Desacetyl-dihydro 890A_q, wird festgestellt und er migriert 4 cm in Richtung auf den positiven Pol. Kontrollinkubationsgemische von Antibiotikum plus Puffer und Zellsonikat plus Puffer ergeben kein bioaktives Material, das 4 cm in Richtung auf den positiven Pol migriert.

- 26 809833/0988

15 976
Beispiel

28Ü5724 2>o

Zwei gefrorene Ampullen, die je 1 ml MA-4638 Kulturbrühe enthalten, werden langsam aufgetaut und der Inhalt wird aseptisch in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben mit dreifachen Ablenkorganen, die je 50 ml Impfmedium .C enthalten, gegeben. Die Kolben werden mit Baumwolle bzw. tfatte verschlossen.

Medium C

Autolysierte Hefe (Ardamine)⁺ . 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird vor der Behandlung im Autoklaven mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

⁺ Ardamine: Yeast Products, Inc.

⁺⁺ Phosphatpufferlösung:

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destill.Wasser 1000 ml

Die Impfkolben werden 20 bis 24 h bei 28+1⁰C auf einer 210 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5»08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt. Die Inhalte werden vereinigt und zur Inolulierung der Produktionskolben verwendet.

Zehn 2 1-Schüttelkolben mit Ablenkorganen, die ^e 300 ml Produktionsmedium D enthalten, mit 10 ml/Kolben der Brühe aus den Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Mullstopfen verschlossen.

Medium D

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

- 27 «09833/0988

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird vor der Behandlung im Autoklaven mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24+1⁰C 3 Tage unter Schütteln auf einer 210 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) inkubiert. Die Kolben werden geerntet, die Inhalte werden vereinigt und die Brühe wird auf ihre Aktivität untersucht.

Erntealter (h) 72

pH-Wert 6,5

890 Assay (Einheiten/ml) 30,45

2 1 der gesamten Brühe aus den obigen KR-Produktionskolben werden in 200 ml-Teilen bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1,7 1 eines überstehenden Materials mit einem pH-Wert von 6,8.

Das überstehende Material wird auf eine Dowex-1x2(Cl"~) 0,297 bis 0,149 mm (50-100 mesh) Säule, Schichtdimensionen 3>9 cm χ 25 cm, in einer Strömungsrate von 5 bis 10 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser, gefolgt von 2 1 0,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/UM neutrale EDTA in 50^igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol gewaschen.

Das Produkt wird dann mit 30 g/l NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/UM EDTA in 80?£igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol in einer Strömungsrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 5 bis 180 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 70 auf. Die Fraktionen 12 bis 105 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert. Der pH-Wert wird mit 1 M HCl auf 6,5 einge-

- 28 -

stellt, und das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 χ 55 cm) aus XAD-2 aufgebracht, die mit je 2,5 1 6O?Sigem (Vol/Vol) wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5% NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen worden war. Die Säule wird mit 3 x 5 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült und mit entionisiertem Wasser bei 10 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 32 bis 270 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 bis 62 auf. Die gesamte Bioaktivität, die eluiert wird, beträgt 25^ der Aktivität der ursprünglichen Brühe. Die Fraktionen 40 bis 240 werden vereinigt, und die gelagerten, vereinigten Fraktionen 12 bis 34 aus der XAD-2-Säule von Beispiel 1 werden zugegeben. Die gesamten, vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert. Sie enthalten 120

Das Konzentrat wird mit 200 ml Methanol verdünnt und bei 2 ml/min auf eine Säule (2,15 x 40 cm) aus Dowex-1x4, -0,037 mm (-400 mesh), gegeben, die zuvor mit 2 1"von 30 g/l NaCl in 80%igem wäßrigem Methanol und 1 1 80ftLgem wäßrigem Methanol gewaschen worden war. Nach Anwendung der Probe wird die Säule mit 100 ml 80%igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol gewaschen und mit 2,5 1 0,22 M NaCl + 0,01 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in SO&Lgem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol, gefolgt von 3 1 0,31 M NaCl + 0,01 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in 80#igem (Vol/Vol) wäßrigem Methanol eluiert. Die Strömungsrate beträgt 2 ml/min, und Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890Ag wird an einer Dowex-1x4-Säule getrennt und in Fraktionen 280 bis 350 eluiert, bestimmt durch Analyse an ATCC 8461.

Dowex-1x4-Fraktionen 307 bis 338 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 7,6 ml konzentriert. 30/Ul 1 M NaOH werden

- 29 &0 9833/0988

zur Einstellung des pH-Werts in den Bereich von 7,0 bis 7,5 zugegeben. Das Konzentrat wird mit 7,6 ml Methanol verdünnt, und die Lösung wird zur Entfernung von Salzniederschlag zentrifugiert. Das überstehende Material wird bei vermindertem Druck auf 4 ml konzentriert, und zu diesem Konzentrat werden 6 ml Methanol zugegeben. Der Salzhiederschlag kann sich ab~ setzen, und dieses überstehende Material wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) aus Sephadex-G10, die zuvor mit 10 ml 1M NH, in 80%igem wäßrigem Methanol, gefolgt von 1 1 0,0001 M NH, in 80%igem Methanol gewaschen worden war, pipettiert. Nach der Anwendung der Probe wird die Säule dreimal mit 1 ml 0,0001 M NH^ in 80%igem Methanol gespült und mit 400 ml des gleichen Lösungsmittels mit einer Strömungsrate von 1 ml/min gewaschen. Die Säule wird dann mit 0,00005 M NH, in 50%igem wäßrigem Methanol mit einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert, und

10 ml-Fraktionen werden gesammelt, wobei man mit dem Zählen ab der ersten Anwendung des 50%igen Methanolelulats beginnt.

Ein Absorptionspeak bei 305 nm tritt bei den Fraktionen 9 bis 22 mit einem Maximum bei der Fraktion 12 auf. Die Fraktionen

11 bis 17 werden vereinigt, die 17 A,_Q,--Einheiten enthalten, wovon 9,1 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert, mit 99,7% D^O auf 10 ml verdünnt, dann bei vermindertem Druck auf 1,5 ml konzentriert, gefroren und lyophilisiert. Das entstehende, weiße Pulver, das das Produkt 890Aq und mehr als 5 mg Natriumchlorid enthält, wird durch NMR-Spektroskopie analysiert.

Beispiel 3

10 g gemäß Beispiel 2 hergestelltes 890Ag werden in 5 ml Wasser aufgenommen.

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15 976 ^T

10 mg Palladiumoxid in 5 ml Wasser, die mit Wasserstoff unter 1 at Druck behandelt wurden, werden als Reduktionsmittel verwendet .

Das 890Aq in dem Wasser zusammen mit dem behandelten Palladiumoxid in Wasser werden 30 min in eine Mikrohydriervorrichtung unter 1 at Wasserstoffdruck gegeben. Nach 30 min wird die Probe entfernt und das Palladiumoxid wird abfiltriert. Das Filtrat wird lyophilisiert; man erhält. Dihydro 890Aq.

Beispiel 4

Deacetylierung von Dihydro 890Aq

Ein Teil des Wachstums auf einer Schrägkultur von Protaiainobacter ruber MB-3528 wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml Medium C enthält, verwendet. Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Dextrose 20 g

Pharmamedia 8 g

Maisquellwasser(Naßbasis) 5 g

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH
oder HCl auf 7 eingestellt

N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

⁺ N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird in Wasser auf das 1Ofache verdünnt und gegenüber einer Membran stabilisiert. Diese Lösung wird nach der Behandlung im Autoklaven zugegeben.

Der Kolben wird 4 Tage bei 28°C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5»08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt. Ein 25 ml-Teil aus dem Kolben wird 15 min bei 8000U/min zentrifugiert. Das überstehende Material wird entfernt und die Zellen

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auf der Oberfläche der Medienfeststoffe werden in 0,5 ml 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, abgekratzt. Die entstehende Suspension wird der Ultraschallzerstörung unter Verwendung eines Branson Instrument Modell LS-75 Sonifiers mit einer 1,27 cm Sonde bei der Stellung 4 während vier 15 sec-Intervallen unterworfen, während die Suspension in Eis-Wasser während und zwischen der Zerstörung gekühlt wird. Ein 10/ul-Teil des Sonikats wird mit 25/ul einer Dihydro 890Ag-Lösung, die 500 /ug/ml enthält, vermischt. Kontrollproben, die Antibiotikum und Puffer allein und Sonikatzellen und Puffer ohne Antibiotikum enthalten, werden ebenfalls geprüft. Nach der Inokulierung über Nacht bei 28°C werden 10/Ul-Mengen auf Schleicher und Schuell Nr. 2043-B-Papier aufgebracht. Unter Verwendung eines 0,03 M Kaliumphosphatpuffers,pH 7,1, wird ein Spannungsgradient von 50 V/cm 30 min angewandt. Das Papier wird auf eine Staphylococcus aureus ATCC 6538P-Assayplatte gelegt und 18 h bei 37⁰C inkubiert.

Die Assayplatten werden folgendermaßen hergestellt: Ein Übernachtwachstum des Assayorganismus, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, in Nährbrühe +0,2% Hefeextrakt wird mit Nährbrühe + O,2?6 Hefeextrakt zu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit von 60?έ bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt. Diese Suspension wird zu Difco Nähragar gegeben, das mit 2,0 g/l Difco Hefeextrakt bei 47 bis 48⁰C ergänzt war. Man erhält eine Zusammensetzung, die 33,2 ml Suspension/l Agar enthält. 40 ml dieser Suspension werden in 22,5 cm χ 22,5 cm Petrischalen gegossen, und diese Schalen werden gekühlt und bei 4°C bis zu ihrer Verwendung (maximal 5 Tage) gehalten.

Zusätzlich zu dem unveränderten bioaktiven Dihydro 890Ag-Fleck, der 8 cm in Richtung auf den positiven Pol wandert, wird ein neuer bioaktiver Fleck, bedingt durch Desacetyl-dihydro 890Aq, festgestellt, der 4 cm in Richtung auf den positiven Pol wandert. Kontrollinkubationsgemische aus Antibiotikum plus

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Puffer und Zellsonikat plus Puffer ergeben kein bioaktives Material, das 4 cm in Richtung auf den positiven Pol wandert.

Beispiel 5

Herstellung von Antibiotikums 890A,

10,0	g	ml
10,0	g	ml
0,05g	g
2	g
1000	ml
91,0
95,0
1000

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600a wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium A

Hefeextrakt

Glucose

MgSO₄.7H₂O

Pho sphatpuffer⁺

destilliertes Wasser

⁺ Phosphatpufferlösung: KH₂PO₄
Na₂HPO₄
destilliertes Wasser

Diese Suspension wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyer-Impfkolbens mit dreifachen Ablenkorganen verwendet, der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium B

autolysierte Hefe (Ardamine ) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05g

Pho sphatpuf fer⁺⁺ 2 ml

destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt ⁺ Ardamine: Yeast Products Corporation

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Pho sphatpufferlösung: KHPO

₂₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0g -

destilliertes Wasser 1000 ml

Der Impfkolben wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen und 30 h bei 28+1⁰C auf einer 220 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt.

Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkorgane, die je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit 1 ml/Kolben der Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen.

Medium C

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl₂.6H₂O 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben 3 Tage bei 28+1⁰C unter Schütteln auf einer 220 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) inkubiert. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegenüber Standard Vibrio percolans ATCC 8461-Assayplatten unter Verwendung von 1,27 cm Assayscheiben, die in die zentrifugieren Fermentationsbrühenproben eingetaucht wurden, analysiert. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

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Erntealter, h 72

pH-Wert 6,4

Vibrio percolans

(1/100 Verdünnung)Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

Die gesamte Brühe wird 15 min in 200 ml-Teilen in Polycarbonatflaschen bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält I6OO ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Potenz von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml neutrale EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an einer Dowex-1x2(Cl~), 0,297 bis 0,149 mm (50-100 mesh) Säule, Schichtdimensionen 3,8 χ 22 cm, mit einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 1 1 entionisiertem V/asser, das 50 g Natriumchlorid enthält, 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25/uM neutraler EDTA bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890A₁ tritt bei den Fraktionen 13 bis 81 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33 auf, gezählt vom Beginn der ersten Anwendung des Salzeluats. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/A-QQ-Verhältnissen werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder 17% der angewandten Bioaktivität.

Das Dowex-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, und der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3 x 36 cm, aufgebracht, die zuvor mit je 2 1 60%igem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5&Lgem (Gew./Vol.) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen worden war. Die "^robe wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungs-

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rate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

Die antiobiotische Aktivität tritt bei den Fraktionen 6 bis 14 auf, die sich von 220 bis 2560 ml eluiertem Volumen erstrecken. Der Peak tritt bei den Traktionen 9 und 10 auf, die sich von 370 bis 590 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 9 bis 12, die sich von 370 bis.1060 ml eluiertem Volumen erstrecken, besitzen die höchsten-HAEA^₀₀/^A220~"^Ver"* hältnisse und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen besitzen 36 600 Einheiten, gleich 126% der scheinbar aufgebrachten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Dowex-1x4(Cl~), -0,037 mm(-400 mesh), Schichtdimensionen 2,2 χ 41 cm, mit einer Strömungsrate von 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 3 1 0,07 M NaCl + 0,005 M NH^Cl + 0,0001 M NH^ in entiorisiertem Wasser mit einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend von der ersten Anwendung des Eluierungsraittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁ tritt in den Fraktionen 181 bis 217 mit einem Maximum bei der Fraktion 198 auf. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden gesammelt.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16/ul 1 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Bio-Gel P-2, 0,074 bis 0,037 mm (200 bis 400 mesh), Schichtdimensionen 2,15 x 70 cm, aufgebracht, dreimal mit 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser bei 0,96 ml/min eluiert. Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.

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Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A^ tritt bei den Fraktionen 24 bis 44 mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34 auf. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den höchsten A^QQ/Ap^c-Verhältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72

Zur Durchführung der Lyophilisierung v/erden die vereinigten Fraktionen auf 3»0 ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10/ul 0,1 M-NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Glasampullen mit Schraubverschluß lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890A₁, dies entspricht 35,8 A₃₀₀-Einheiten.

Eine Kultur von Streptomyces flavogriseus, bezeichnet als MA-4600a in der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc., wurde permanent ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit in der Culture Collection of the Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peorie, Illinois, hinterlegt und ist öffentlich unter der Nr. NRRL 8140 zugänglich.

Ende der Beschreibung.

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Claims (1)

1. Merck & Co., Inc. 15 976

   Patentansprüche

   1.j Die Verbindung Desacetyl-dihydro 890Aq der Struktur

   COOH
   und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

   2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung Desacetyldihydro 890Aq der Struktur

   COOH

   dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung Dihydro der Struktur

   -CH₂-CH₂-NH-C-CH₃

   COOH

   mit einem Enzym innigst behandelt, das die N-Acetylgruppe hydrolysieren kann.

   35. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Amidohydrolase ist.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Amidohydrolase eine N-Acetyläthanolamin-amidohydrolase ist.

   — 1 —

   /805724

   15 976 2-

   5. Verfahren nach Anspruch ]5, dadurch gekennzeichnet, daß die Amidohydrolase eine N-Acetyl-dihydro-890Ag-amidohydrolase ist.

   6. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen mit II-Acetyl-dihydro-egOAg-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Mikroorganismen auswählt, die N-Acetyläthanolamin für das Wachstum verwenden können, und diese Mikroorganis men auf die Anwesenheit von M-Acetyl-dihydrο-890Aq-amidohydrolase prüft.

   7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit einer Amidohydrolase durchgeführt wird, die durch einen Amidohydrolase liefernden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber gebildet wird.

   8. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-dihydro dadurch gekennzeichnet, daß man Dihydro 890Ag mit dem Enzym N-Acetyl-dihydro-SgOAg-amidohydrolase innigst behandelt, das durch einen Amidohydrolase liefernden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber gebildet wird.

   9. Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer antibakteriell wirksamen Menge der Verbindung Desacetyl dihydro 890Aq nach Anspruch 1 und einem nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür.