DE2920293A1

DE2920293A1 - Beta -lactamase-inhibitor em4615 und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2920293A1
Application number: DE19792920293
Authority: DE
Inventors: Wen-Chih Liu; Pacifico A Principe; Richard B Sykes; Jerry S Wells
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1978-05-18
Filing date: 1979-05-18
Publication date: 1979-11-22
Also published as: FR2426088A1; GB2021096A; IT7949074A0; FR2426088B1; US4205068A; JPS54163897A

Description

Die ß-Lactamasen sind Enzyme, die durch pathogene Mikroorganismen, wie Bakterien der Gattung Staphylococcus, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas und Enterobacter, gebildet werden. Sie besitzen die Fähigkeit, den ß-L.actamring von ß-Lactam-Antibiotika, insbesondere von Penicillinen und Cephalosporinen, zu öffnen. Durch diese Reaktion werden diese Antibiotika bei der Bekämpfung von bakteriellen Infektionen inaktiviert. Dies bewirkt wiederum das Entstehen resistenter Stämme der pathogenen Mikroorganismen. Ein ß-Lactamase-Inhibitor dient daher zum Schutz des Antibiotikums gegen seine Inaktivierung durch ß-Lactamasen und erhöht damit die Wirksamkeit der Antibiotika.

In der GB-PS 1 363 075 und in J. Antibiotics, Bd. 25 (1972), S. 473 und Bd. 26 (1973), S. 51, wird über Actinomycetenkulturen berichtet, die ß-Lactamase-Inhibitoren bilden.

In J. Antibiotics, Bd. 27 (1974), S. 493 und US-PS 4 078 056 sind Arten von Micromonospora beschrieben, die Antibiotika wie Gentamicin, Sisomycin und Neomycin produzieren. Diese durch Micromonospora produzierten Antibiotika zeigen typische Spektren antibakterieller Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, wie Streptococcus fecalis. Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Candida albicans. Die Bildung von ß-Lactamase-Inhibitoren durch diesen Mikro-Organismus ist jedoch nicht beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen ß-Lactamase-Inhibitor der Bezeichnung EM4615 zu schaffen, der die Wirkung der ß-Lactamase-Enzyme hemmt. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mikroorganismen der Art Micromonospora bei der Züchtung unter submers aeroben

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Bedingungen in einem assimilierbaren Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen enthaltenden wäßrigen Nährmedium diesen Inhibitor bilden. Die Züchtung kann bei etwa 20 bis 35°C, vorzugsweise bei etwa 25⁰C, während etwa 48 bis 240 Stunden, vorzugsweise etwa 144 Stunden, durchgeführt werden. Anschließend kann der ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 durch Extraktion aus der Kulturbrühe gewonnen werden. Dabei wird die Kulturbrühe zentrifugiert, um das Mycel und andere Feststoffe zu entfernen. Die verbleibende Brühe wird mit einem niede— ren aliphatischen Alkohol, vorzugsweise n-Butanol, bei einem niedrigen pH-Wert, vorzugsweise etwa pH 2, extrahiert, und der Alkoholextrakt wird bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 9 mit Wasser rückextrahiert. Der Wasserextrakt enthält den ß-Lactamase-Inhibitor.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Figur 1 zeigt das Infrarotspektrum des Natriumsalzes von EM4615 als Kaliumbromid-Preßling.

Der erfindungsgemäße ß-Lactamase-Inhibitor wird durch Arten des Mikroorganismus Micromonospora produziert. Der bevorzugte Mikroorganismus wurde aus Bodenproben isoliert und als Micromonospora sp. SC 11 133 gekennzeichnet, der ein Stamm von Micromonospora chalcea ist. Eine Subkultur dieser Art wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31395 hinterlegt. Andere den ß-Lactamase-Inhibitor produzierende Stämme von Micromonospora, wie Micromonospora chalcea ATCC 21561, Micromonospora carbonacea ATCC 27114 und Micromonospora carbonacea ATCC 27115, sind ebenfalls von dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.

Zur Isolierung und Charakterisierung von Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 wird eine luftgetrocknete Bodenprobe mit einem Stempel auf ein Nähragarmedium folgender Zusammensetzung überimpft:

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Gramm

Lösliche Stärke	(vitaminfrei)
Casein
KNO₃
NaCl
K₂HPO₄	7H₂O
MgSO₄.
CaCO₃	7H₂O
FeSO₂.

1O 0,3 2,0 2,0 2,0 0,05 0,02 0,01 Agar 20

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ml.

Das Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 7,O eingestellt und 20 Minuten in einem Autoklaven bei 121⁰C sterilisiert. Nach einer Bebrütungszeit von 7 bis 10 Tagen bei 25⁰C werden die Kolonien von Micromonospora chalcea sp. SC 11 isoliert. Diese isolierten Kolonien werden auf einem Nährmedium folgender Zusammensetzung weiter gezüchtet:

Gramm Rindfleischextrakt

Hefeextrakt

NZ amine A (enzymatisch aufgeschlossenes Enzym)

Glucose
Agar
aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ml

Das Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und 30 Minuten in einem Autoklaven bei 121⁰C sterilisiert.

Der den ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 produzierende Mikroorga-

nismus bildet kein echtes Luftmycel. Er bildet einzelne Sporen an den Enden einfacher Sporophoren, die als monopodial ausgerichtete Cluster in Erscheinung treten.

__ Hydrolysate der gereinigten Zellwände enthalten Meso-Diamino-

pinelinsäure, Glykokoll, Xylose und Arabinose. Dieser Mikroorga-

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j nismus wird auf Grund seiner charakteristischen Morphologie und dem Typ II der Zellwände der Gattung Micromonospora zugeordnet .

Kennzeichen der Kultur beruhen auf Beobachtungen, die nach 14tägigem und 21tägigem Verbleib von Micromonospora auf Agar gemacht wurden. Agarplatten werden bei 28⁰C bebrütet. Nach 14 Tagen ist die Farbe des vegetativen Mycels mäßig orange (ISCC Nr. 53), entsprechend dem Färbstück (4 1c)

JO im Color Harmony Manual. Nach 21 Tagen ist das vegetative Mycel mit einer trockenen schwarzen Masse von Sporen überschichtet. Nach 14 Tagen entspricht die Unterseite der Kolonie ihrer Oberfläche; sie wird dunkler nach Einsatz der Sporenbildung. Es wird kein lösliches Pigment gebildet.

j5 Die Farbe des Mycels ist die gleiche auf Tomatenmark-Haferschleim- Agar und auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar.

Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 produziert einen ß-Lactamase-Inhibitor, der die Wirkung der ß-Lactamasen, insbesondere von gram-negativen Organismen hemmt.

Der Mikroorganismus vermehrt sich optimal bei 30 bis 37°C; bei 45⁰C ist kein Wachstum festzustellen. Er vermehrt sich auch auf zwischen einem pH-Wert von 6,0 und 8,0 gepufferten Medien; bei einem ph-Wert von 5,5 ist kein Wachstum festzustellen. Die Kultur ist proteoIytisch, sie zeigt eine positive Aufhellungsreaktion auf Milch und Gelatineplatten. Stärke wird hydrolysiert. Auf Medien mit mehr als 1,5 % NaCl erfolgt kein Wachstum.

Folgende Kohlenhydrate können als einzige Kohlenstoffquelle verwendet werden: Glucose, d-Xylose, 1-Arabinose, Fructose, Raffinose, Melibiose, Rohrzucker und Lactose. Kein oder schlechtes Wachstum wird auf Glycerin, Mannit, Inosit und Rhamnose erhalten.

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Zur Herstellung des ß-Lactamase-Inhibitors EM4615 wird Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 bei 25°C unter submers aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Kohlenhydrate und assimilierbare Stickstoffverbindungen enthaltenden wäßrigen Nährmedium gezüchtet. Die Bebrütungszeit beträgt etwa 48 bis 24O, vorzugsweise etwa 144 Stunden.

Nach vollständiger Fermentation wird die Kulturbrühe zur Abtrennung des Mycels zentrifugiert. Der ß-Lactamase-Inhibitor wird aus der überstehenden Flüssigkeit mit Butanol bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiert und bei einem pH-Wert von 9,0 mit Wasser rückextrahiert. Der wäßrige Extrakt wird gefriergetrocknet, Die weitere Reinigung erfolgt durch Säulenchromatographie an Sephadex LH2O (Polydextran-Anionenharzaustauscher), wobei mit einem Gemisch von Methanol und Wasser (9 : 1) eluiert wird. Anschließend wird die aktive Fraktion an Sephadex G15 Ionenharzaustauscher chromatographiert. Die aktiven Fraktionen werden gefriergetrocknet.

EM4615 ist eine starke Säure und mäßig säurelabil.

Der Inhibitor findet vorzugsweise als Salz mit dem jeweils geeigneten Kation Verwendung. Seine Salze mit zweiwertigen Metallen, wie Magnesium, Calcium, Barium oder Zink, sind in Wasser schwer löslich und werden durch Zusatz einer wäßrigen Lösung eines Metallhalogenids, vorzugsweise des Chlorids, zu einer wäßrigen Lösung eines löslichen EM4615 Salzes, beispielsweise eines Ammoniumsalzes oder eines Alkalimetallsalzes, wie des Natrium- oder Kaliumsalzes, erhalten. Lösliche Salze von EM4615 können in andere Salze umgewandelt werden durch Be-

^O handlung einer Lösung von EM4615 in Butanol auf einer konzentrierten wäßrigen Lösung des entsprechenden Kationsulfats. Dabei wird das Salz von EM4615 in der Butanolphase gebildet.

Die Substanz EM4615 ist ein Inhibitor des Enzyms ß-Lactamase. Sie inhibiert speziell ß-Lactamasen, jedoch nicht andere nicht verwandte Enzyme, wie Alkoholdehydrogenase, Carboxy-

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— ο —

j peptidasen und das die Umwandlung von Angiotensin bewirkende Enzym bei oder unterhalb lOO^g/ml. EM4615 kann daher zum Schutz von Verbindungen eingesetzt werden, die durch ß-Lactamasen inaktiviert werden, wodurch die antibakterielle Wirkung von durch ß-Lactamasen angegriffenen Antibiotika verstärkt wird. EM4615 ist insbesondere wertvoll zur Erhöhung der antibakteriellen Wirkung von Penicillinen und Cephalosporinen gegen resistente Mikroorganismen.

Der ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 oder eines seiner Salze findet als einziger Wirkstoff in einem Arzneimittel Verwendung, das entweder gleichzeitig oder in Verbindung mit Antibiotika verabfolgt wird; er kann auch zusammen mit anderen Wirkstoffen in einem Arzneipräparat eingesetzt werden. Bei

■J5 der Verwendung von EM4615 als ß-Lactamase-Inhibitor ist eine Tagesdosis von etwa 5 bis 150, vorzugsweise etwa 10 bis 100 mg/kg geeignet. Dabei kommt der Einsatz des Inhibitors für durch gram-positive und gram-negative Mikroorganismen verursachte bakterielle Infektionen in Betracht, die üblicherweise mit Antibiotika behandelt werden, beispielsweise Infektionen der Atem- und Harnwege. Der Inhibitor findet Verwendung bei verschiedenen bakteriellen Infektionen von Haustieren, beispielsweise von Mastitis bei Vieh. EM4615 wird vorzugsweise oral verabreicht, kann aber auch intramuskulär, intravenös, intraperitoneal und subcutan verabfolgt werden. Für die orale Verabfolgung kann die Substanz in Tabletten, Kapseln, Elixieren oder ähnlichen Zubereitungen verarbeitet werden. Für den parenteralen Gebrauch sind sterile Lösungen oder Suspensionen geeignet.

Geeignete ß-*Lactam-Antibiotika, die gegenüber ß-Lactamasen empfindlich sind und die in Verbindung mit dem ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 oder einem seiner Salze zu Arzneipräparaten verarbeitet werden können, sind beispielsweise Penicilline und Cephalosporine, wie Benzylpenicillin, Ampicillin, Epicillin, Hetacillin, Phenoxymethy!penicillin, Carbenicillin,

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Methicillin, Amoxycillin, Propicillin, Ticarcillin, Cyclacillin, Cephalexin, Cephaloridin, Cefoxitin, Cefazolin, Cefamandol, Cefadroxil, Cephapirin, Cephalothin, Cephradin, Cephaloglycin, ihre Salze oder Ester und andere bekannte Antibiotika dieses Typs.

Im allgemeinen werden die Antibiotika des vorstehend genannten Typs in Mengen von etwa 50 bis 1000 mg zu Einzeldosen verarbeitet. In diesen Präparaten kann der ß-Lactamase-Inhibitor in der Weise mit eingeschlossen sein, daß das Mengenverhältnis von Antibiotikum zu ß-Lactamase-Ihhibitor etwa 1 : bis 15 : 1, vorzugsweise etwa 1 : 3 bis 3:1 beträgt. Die Tagesdosis dieser Präparate entspricht im allgemeinen der

Tagesdosis des entsprechenden Antibiotikums; sie beträgt in ._ t

der Regel 500 bis 3Q00 mg/Tag in einfachen oder geteilten Tagesdosen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 (ATCC 31395) wird auf folgendem sterilisiertem Agar-Nährmedium (A) gezüchtet:

Gramm

Rindfleischextrakt 3

Trypton 5

Hefeextrakt 5

Lösliche Stärke 24

Dextrose 1

"Agar 15

CaCO₃ 4

aufgefüllt mit Leitungswasser auf 1 Liter.

Mit einer öse wird Oberflächenwachstum von auf Schrägagar-Röhrchen (Medium A) gewachsenem Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 auf sechs 500 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die jeweils 100 ml sterilisiertes Nährmedium (B) der folgenden Zusammensetzung enthalten:

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	- 10 -	2920293	Gramm
		15
NährSojamehl		15
Lösliche Stärke		50
Glucose		0,005
CoCl₂.6H₂O		10
CaCO₃		auf 1 Liter.
aufgefüllt mit	destilliertem Wasser

Die Kolben werden etwa 96 Stunden bei 28°C auf einer Dreh-]Q Schüttelmaschine mit 280 U.p.m und 15 cm Hub bebrütet. Anschließend werden je 5 % (Vol/Vol) der angereicherten Kulturbrühe in einhundert 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben, die jeweils 1OO ml sterilisiertes Medium (C) der folgenden. 2usammensetzung enthalten:

Gramm

Hefeextrakt 4

Malzextrakt 10

Dextrose 4

FeSO₄.7H₂O 0,3

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter.

Der pH-Wert wird vor dem Sterilisieren auf 7,O eingestellt.

Nach dem Beimpfen werden die Kolben etwa 144 Stunden bei 25⁰C auf einer Drehschüttelmaschine mit 300 ü.p.M und 5 cm Hub bebrütet. Anschließend wird der Inhalt der Kolben vereinigt und die Kulturbrühe zentrifugiert. Es werden etwa 9 Liter überstand erhalten.

Die ß-Lactamase-lnhibitor-Wirkung wird mikrobiologisch an Micrococcus luteus und Benzylpenicillin ermittelt.

Beispiel 2

In einem 250 Liter-Ansatz wird Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 in einem korrosionsbeständigem, 378,5 Liter fassenden Fermenter mit dem Medium und den Verfahrensbedingungen

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y wie nachstehend beschrieben, gezüchtet.

1. Stufe

Herstellung des Inoculums:

Kultur von Micromonospora chalcea sp. SC Π 113, konserviert durch Gefriertrocknen in Milch, gezüchtet in einem sterilisierten Nährmedium (A) folgender Zusammensetzung:

Gramm

Rindfleischextrakt 3

Trypton 5

Hefeextrakt . 5

Lösliche Stärke 24

Dextrose 1

Agar 15

CaCO₃ 4

aufgefüllt mit Leitungswasser auf 1 Liter.·

Mit einer öse wird Oberflächenwachstum von auf Schrägagar-Röhrchen (Medium A) gewachsenen Micromonospora chalcea sp. SC 11 133 auf drei 500 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die jeweils 100 ml sterilisiertes Nährmedium (B) der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Gramm

Nährsojamehl Lösliche Stärke Glucose

-OH₂O 0,005

CaCO₃

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. 30

Die Kolben werden etwa 96 Stunden bei 28°C auf einer Drehschütte lma schine mit 280 U.p.M. und einem Hub von 5 cm bebrütet. Anschließend werden je 5 % (Vol/Vol) von der Kulturbrühe in drei 4 Liter Erlenmeyer-Kolben gegeben, die jeweils 800 ml des vorstehend beschriebenen sterilisierten Nährmediums (B) enthalten. Die Kolben werden weiterhin etwa 72 Stunden bei

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28°C wie vorstehend beschrieben bebrütet.

2. Stufe

Inoculum: 1500 ml der 1. Stufe.
Nährmedium (B) wie vorstehend beschrieben.

30 Liter des Inoculum enthaltenden Nährmediums (B) werden 72 Stunden bei 28⁰C in einem 37,85 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl bebrütet. Während dem Bebrüten wird die Kulturbrühe mit einer Geschwindigkeit von 65 Liter/min belüftet und mit 220 U.p.M. geschüttelt.

3. Stufe

Inoculum: 12 500 ml der 2. Stufe.
Nährmedium (C) :

Gramm

Hefeextrakt 4

Malzextrakt 10

Dextrose 4

FeSO₄.7H₂O 0,3

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter.

Vor dem Sterilisieren wird das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

250 Liter des Inoculum enthaltenden Nährmediums (C) werden 144 Stunden bei 25⁰C in einem 378,5 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl bebrütet. Während dem Bebrüten wird die Kultur mit einer Geschwindigkeit von 283 Liter/min belüftet und mit 155 U.p.M. geschüttelt.

Beispiel 3

Das Mycel wird durch Zentrifugieren entfernt. Es werden 185 Liter überstehende Kulturbrühe erhalten. 35

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_ 13 —

•j Beispiel4

Der überstand von Beispiel 3 wird mit 3 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und rasch mit 80 Liter n-Butanol extrahiert. Der erhaltene Butanolextrakt wird mit 4O Liter Wasser mit einem pH-Wert von 7 so schnell wie möglich extrahiert. Im allgemeinen soll das aktive Material bei einem pH-Wert von 2 in Butanol nicht langer als 10 Minuten verbleiben, um einen Aktivitätsverlust des ß-Lactamase-Inhibitors zu vermeiden. Mit der Extraktion des Wirkstoffes in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 ist die Gefahr des Aktivitätsverlustes wesentlich vermindert. Der pH-7-Wasserextrakt wird konzentriert und gefriergetrocknet. Aus 185 Liter Kulturbrühenfiltrat werden nach dem Gefriertrocknen etwa 300 g Feststoff erhalten; dies entspricht in etwa 1/3 der ursprünglichen Aktivität des Filtrats; die verbrauchten wäßrigen und Butanollösungen zeigen keine nennenswerte Aktivität.

Beispiel5

Eine Probe von 50 g des gemäß Beispiel 4 gewonnenen gefriergetrockneten Feststoffes wird in 400 ml Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird langsam unter Rühren in einen 4 Liter Methanol enthaltenden Kolben gegossen. Nach vollständiger Ausfällung wird das Gemisch weitere 15 Minuten gerührt und anschließend zentrifugiert. Der Niederschlag zeigt einige Aktivität, jedoch ist der größte Anteil an Aktivität in das Methanol übergegangen. Die klare überstehende Methanollösung wird unter vermindertem Druck auf etwa 600 ml eingeengt. Die aktive Verbindung beginnt auszufallen. Das Gemisch wird 15 bis 18 Stunden bei 5⁰C stehengelassen und anschließend zentrifugiert. Nach dem Aufarbeiten des Niederschlags mit Aceton und Trocknen unter vermindertem Druck werden 8,5 g eines trockenen Pulvers erhalten.

Beispiel 6

1 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen trockenen Pulvers wird in 1O ml Wasser gelöst und an einer mit Wasser eingeschlämm-

L J

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ten G-3,5 Sephadex-Säule (4 χ 73 cm)' chrorcatographiert. Die Säule wird mit Wasser eluiert, es werden Fraktionen von jeweils 15 ml aufgefangen. Die Fraktionen werden auf Celluloseplatten (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) aufgetragen, mit einem Gemisch von Acetonitril und Wasser (5 : 1) entwickelt und mit RP1-Enzym und chromogenem Cephalosporin besprüht. Die aktiven Fraktionen werden auf Grund der Dünnschichtchromatographie-Analyse vereinigt und gefriergetrocknet. Zwei Komponenten werden an der G-15 Sephadex-Säule getrennt. Die Hauptkomponente mit mehr als 90 % Bioaktivität und Trockengewicht ist das Natriumsalz und hat einen R_-Wert von etwa 0,6 (A), die andere Komponente ist nur schwach aktiv und hat einen R_f-Wert von etwa 0,4 (B).

Beispiel7

Eine Probe von 0,5 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen trockenen Pulvers wird in 200 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird auf etwa 40 ml ohne Bildung eines Niederschlags konzentriert und an einer Lh20 Sephadex-Säule (3 χ 60 cm; Perlen von Hydroxypropyldextrange]) in Methanol chromatographiert.

Anschließend wird mit Methanol eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 15 ml gesammelt. Die Aktivität der Fraktionen wird gemäß Beispiel 6 bestimmt, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Anschließend wird unter vermindertem Druck unterhalb 3O°C zur Trockene eingedampft. Es erfolgt keine Trennung der Komponenten an der LH20-Sephadex-Säule, jedoch ist der Reinigungsgrad der aktiven Verbindung beachtlich.

Mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie wird EM4615 von anderen ß-Lactamase-Inhibitoren, insbesondere MM455O und

Clavulansäure getrennt und unterschieden. Beim Chromatographie- ren auf Celluloseplatten und Entwickeln mit einem Gemisch von Acetonitril-Wasser (6:1) werden die nachstehenden R-- Werte der verschiedenen ß-Lactamase-Inhibitoren erhaltenι 35

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- 15 -	EM4615 CA)	^Rf	2S20233
	Clavulansäure (Li-SaIz)	0,57
EM4615 (B)	0,49
MM455O	0,42
	0,29

Beispiel 8

Gemäß Beispiel 6 oder 7 erhaltenes, gereinigtes EM4615 wird in sein Bariumsalz überführt und weiter gereinigt.

Zu einer Lösung von EM4615 in Methanol wird tropfenweise unter Rühren eine Lösung von Ba(OH)₂ in Methanol gegeben, bis die Ausfällung vollständig ist. Anschließend wird das Gemisch zentrifugiert. Der Niederschlag wird zur Entfernung von Ba(OH)„ und anderen in Wasser löslichen Verunreinigungen gründlich mit Wasser gewaschen. Anschließend wird das Bariumsalz gründlich mit Methanol gewaschen und schließlich unter vermindertem Druck getrocknet.

Beispiel 9
Eigenschaften von EM4615:

1. F. - Natriumsalz, kein eindeutiger Schmelzpunkt;

es erfolgt Zersetzung
- Bariumsalz, 144 bis 146°C (Zers.)

2. UV-Absorptionsspektrum - k_max 214 nm E* 95 (Wasser)

3. IR-Absorptionsspektrum - Die Spektren des Natrium- und Bariumsalzes sind nahezu identisch. Jedes Spektrum hat eine Carbonyl-Absorptionsbande von 5,85 μ bzw. 5,90 μ; jedes Spektrum hat eine Absorptionsbande für Sulfat bei etwa 8,ο μ. Das IR-Absorptionsspektrum des Natriumsalzes ist in Figur 1 wiedergegeben.

4. Dünnschichtchromatographie - Bei der Chromatographie an Celluloseplatten, Entwickeln mit einem Gemisch von Acetonitril-Wasser (5 : 1) und Besprühen mit RP1-Enzym /Klasse III ß-Lactamase-Enzym von E. coli (Richmond & Sykes, Recent Advances in Microbial Physiology, Bd. 9,

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S. 31 bis 88, Ed. Rose & Tempest, Academic Press, 1973)/, und anschließende Behandlung mit chromogenem Cephalosporin /b'Callaghan et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 4 (1972), S. 283 bis 2887, liegen die R^-Werte für das Natriumsalz bei etwa 0,6 und für das Bariumsalz bei etwa 0,4.

5. Löslichkeit - Natriumsalz ist löslich in Wasser und Methanol, unlöslich in Aceton und Chloroform. Bariumsalz ist unlöslich in Wasser, Methanol, Aceton, . Chloroform, löslich in Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.

6. Elementaranalyse für das Natriumsalz:

C 49,99 %; H 7,71 %; O 23,69 %; S 10,51 %; Na 8,10 %.

7. Angenäherte Bruttoformel auf Grund der Elementaranalyse: C₁^₇ H₂₃^₃ S₍₁₎ O₄^₅₂ Ha^₀₇.

8. Papierelektrophorese sowohl des Natrium- als auch des Bariumsalzes von EM4615, durchgeführt in Werum-Puffer (J. Chromatog., Bd. 3 (1960), S. 125) mit den pH-Werten 3,3, 4,7, 7,2, 8,0 und 9,3, enthaltend 30 % Formamid, offenbart die Gegenwart einer einzelnen, stark sauren Komponente mit ß-Lactamase-Inhibitor-Aktivität.

Das spezielle Schaubild dieser Substanz auf dem Elektropherogramm (getrocknet während 1 Stunde bei 110⁰C) kann durch Ver-Wendung folgender Reagentien hergestellt werden:

1) TEM oder RPI-Enzyme, gefolgt von chromogenem Cephalosporin 87/312. EM4615 erscheint als gelber Fleck auf einem rosa Hintergrund.

2) 0,Iprozentige Lösung von 6-Äthoxy-1-methyl-2-(m-nitrostyryl)-chinolinmethosulfat in Methanol. EM4615 erscheint im UV-Licht 3.60 nm als intensiver gelb-fluoreszierender Fleck.
3) 0,2prozentige Lösung von 2',7'-Dichlorfluorescein in Methanol. EM4615 erscheint im UV-Licht 360 nm als blauer fluoreszierender Fleck auf einem gelben Hintergrund.

L _J

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COPY

* 4) O,Iprozentige Lösung von 1-Anilinonaphthalin-8-sulfonat in Äthanol. EM4615 erscheint im UV-Licht 36Ο nm als leuchtend l>lau fluoreszierender Fleck auf einem dunklen Hintergrund.

Die elektrophoretische Beweglichkeit von EM4615 in AM-Einheiten (Werum, s.oben), ergibt folgende Werte: pH AM-Wert

3,3 -128

4,7 -123

7.2 -123 . 8,0 . -123

9.3 -123

Beispiel 1O Die 50prozentige Hemmung von ß-Lactamasen (I₅₀) wurde mit dem gemäß Beispiel 7 erhaltenen ß-Lactamase-Inhibitor untersucht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

ß-Lactamasepräparat aus I₅ ug/ml Substrat

Staphylococcus aureus (SC 10839)	6	Ampicillin
Escherichia coli (SC 10837)	1	Cephaloridin
Escherichia coli ²⁵ (SC 10979)	O,1	Cephaloridin
Klebsie11a aerogenes (SC 10947)	2	Cephaloridin
Enterobacter cloacae	O,O4	Cephaloridin

(SC 10945)

Zur Herstellung vom EM4615 wurden die folgenden Nährmedien als wirkungsvoll gefunden; diese können das vorstehend genannte Nährmediun» (C) ersetzen. Die wirkungsvollsten Medien sind zuerst aufgeführt.

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Nährmedium D

Gramm

Hafermehl 20

Tomatenmark 20

FeSO₄.7H₂O 1,O

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

Nährmedium E

	Gramm
Nährsoj amehl	1O
Glucose	20
FeSO₄.7H₂O	0,1
MnSO₄.4H₂O	0,05
CoCl₂-OH₂O	O,OO1
MgSO₄.7H₂O	1,0
CaCO₃	1O
aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf	1 Liter.
Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert	auf 7,O einge-
stellt.
Nährmedium F

Gramm

Hefeextrakt 4

Malzextrakt 10

Glucose 4

FeSO₄.7H₂O 0,1

MnSO₄.4H₂O 0,05

CoCl₂-6H₂O O,OO1

MgSO₄.7H₂O 1,O

CHCO₃ 10

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

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- 19 - 2B20293

Nährmedium G

Lösliche Stärke
Glucose

Malzextrakt
Nährsoj amehl
FeSO₄.7H₂O

Ilährmedium H

Gramm

Hefeextrakt 4

Ma1ζ extrakt 10

Dextrose 10

Hafermehl 10

FeSO₄.7H₂O 0,3

aufgefüllt mit destillxertem Wasser auf 1 Liter.

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

Nährmedium I
Gramm

Nährsojamehl 10

Glucose 10

Hafermehl 10

FeSO₄.7H₂O 0,3 aufgefüllt mit destillxertem Wasser auf 1 Liter.

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

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Nährmedium J	Gramm
	10
Nährsojamehl	10
Glucose	20
Hafermehl	0,3
(NH₄)₂SO₄	0,5
FeSO₄-TH₃O	0,5
CaCO₃	aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter.
	Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 7,0 einge
stellt.

Beispiel 11

Weitere Micromonosporakultüren werden auf ihre Produktion von ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Kultur Aktivität gegenüber

RPI-Enzym

^x

Agar I Agar II

Micromonospora chalcea + +

ATCC 21561

Micromonospora carbonacea + +

ATCC 27114

Micromonospora carbonacea + _+

ATCC 27115

Die Kulturen werden durch Beimpfen eines Hefe-Malζ-Extrakt-Agar (Agar I) oder Rindfleischextrakt-Agar (Agar II) und 6tägi-

ges Bebrüten hergestellt. Anschließend werden die Agarplatten mit RPI-Enzym enthaltendem Agar überschichtet und weitere 2 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Die Agarplatten werden mit einer Lösung von chromogenem Cephalosporin (500μg/ml) überschwemmt. Die Bildung des Enzym-Inhibitors zeigt sich als gelbe Zone auf

einem roten Hintergrund. Die Agar-Nährböden haben die folgenden Zusammensetzungen:

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Agar I

Hefeextrakt 4 g

Malzextrakt 10 g

Dextrose 4 g

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf 7,3 eingestellt und es werden 20 g Agar zugegeben.

Agar II

Rindfleischextrakt 3 g

Trypton 5 g

Hefeextrakt 5 g

lösliche Stärke 24 g "

Dextrose 1 g

Agar 15 g

CaCO₃ 4 g

Leitungswasser 1 Liter

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Leerseite

Claims

VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL · TAUCMNER HEUNEMANN PATEMVANWÄ-.TE j Q O Π Ο Q O SIEBERTSTRASSE 4. · 8ΟΟΟ MÖNCHEN 86 · PHONE: (Ο89) 4-7 4Ο75 - CABUEs BENZOLPATENT MDNCHEN - TELEX 5-29 4-53 VOPAT D 18 MAY 1979 u.Z.j P 162 (DV/kä) Case: A 906,906-S E.R. SQUIBB & SONS, INC. Princeton, New Jersey, 08540, V.St.A. 10 11 ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 und Verfahren zu seiner Her-. . stellung " ."."... Priorität:. 1.8. Mai 1978, V.St.A., Nr. 906 906 Patentansprüche

1. ß-Lactamase-Inhibitor EM4615-und seine Salze mit Basen,

gekennzeichnet durch folgende Parameter:

- IR-Spektrum des Natriumsalzes wie in Figur 1 ,-

- Schmelzpunkt des Bariumsalzes von 144 bis 146⁰C;

- das Natriumsalz ist in Wasser und Methanol löslich, in Aceton und Chloroform unlöslich;

- das Bariumsalz ist in Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid löslich, in Wasser, Methanol, Aceton und Chloroform unlöslich.

2. Verfahren zur Herstellung des ß-Lactamase-Inhibitor EM4615 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Art Micromonospora in einem assimilierbare Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter submers aeroben Bedingungen züchtet und aus der Kulturbrühe den Inhibitor isoliert.

909847/6940

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei 20 bis 35°C züchtet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus während 48 bis 240 Stunden züchtet.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Züchtung die Feststoffe aus der Kulturbrühe

° entfernt, die verbleibende Brühe zunächst mit einem niederen Alkanol extrahiert und anschließend den Alkanolextrakt mit Wasser rückextrahiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß

man die verbleibende Brühe bei einem pH-Wert von 2 extrahiert und den Alkanolextrakt bei einem pH-Wert von 7 bis 9 rückextrahiert .

7. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbleibende Brühe mit n-Butanol extrahiert.

8. Verfahren nach Anspruch 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Art Micromonospora chalcea oder Micromonospora carbonacea züchtet.

9. Verfahren nach Anspruch 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Micromonospora chalcea ATCC Nr. 31395 züchtet.

10. Micromonospora chalcea ATCC Nr. 31395.

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