AT352275B - Verfahren zur herstellung der neuen clavulan- saeure und von deren salzen - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen antibakteriell wirksamen   Clavulansäure   und von deren Salzen, die aus Streptomyces clavuligerus isoliert werden können. Die Clavulansäure besitzt die Formel 
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 antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese neue Substanz wird als "Clavulansäure" bezeichnet. 



   Clavulansäure hat folgende Eigenschaften : a) sie ist eine Carbonsäure ; b) sie bildet ein Natriumsalz mit einem charakteristischen IR-Spektrum, c) sie kann das Wachstum von Staphylococcus   aureus-Stämmen   hemmen ; d) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber ss-Lactamase erzeugenden Stäm- men von Escherichia coli,   Klebsiella aerogenes   und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflus- sen ; e) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Cephaloridin gegenüber ss-Lactamase erzeugenden
Stämmen von Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen ; und f) sie bildet einen Methylester, der auf Grund der Massespektroskopie ein Molgewicht von 213, 0635 ent- sprechend der Formel   C9   Hit NO besitzt. 



   Die Clavulansäure kann als einwertige Carbonsäure der Formel C8H9NO5 betrachtet werden, die in Form des Natriumsalzes ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum besitzt,
Die von Streptomyces   clavuligerus   erzeugte Verbindung mit den obgenannten Eigenschaften besitzt die Formel 
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Kristalline Formen derartiger Salze können Hydratwasser enthalten. 



   Zweckmässige Clavulansäureester, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden, sind diejenigen, die von den betreffenden Alkoholen stammen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, 2, 2, 2-Trichloräthanol, 2, 2, 2-Trifluoräthanol, Benzylalkohol,   p-Nitrobenzylalkohol,   Phenol, Acetoxymethanol, Trimethylacetoxymethanol, 2-Dimethylaminoäthanol und andere übliche Alkohole. 



   Der   Ausdruck "Ester" umfasst   solche, die sich von einem Alkohol oder einem Thiol der allgemeinen Formeln 
ROH oder RSH ableiten, worin R die oben angegebene Bedeutung hat. Um das Molgewicht nicht übermässig zu erhöhen, sollte R gewöhnlich nicht über 16 C-Atome, zweckmässigerweise nicht über 12 C-Atome, insbesondere nicht über 8 C-Atome, enthalten. 



   Vorzugsweise stammt R von einem Alkohol ROH oder weniger bevorzugt von einem Thiol RSH, die pharmakologisch verträglich sind. 



   Beispiele von geeigneten Substituenten an der Gruppe R sind Halogen, Hydroxyl, nied. Alkoxy, nied. 



  Acyloxy, nied. Alkylamino oder nied. Dialkylamino. 



   Der Ausdruck"nied."gibt an, dass der Rest bis 6 C-Atome, vorzugsweise bis zu 4 C-Atome, enthält. 



  Demzufolge kann R Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, geradkettiges oder verzweigtes Butyl, Pentyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Vinyl, Allyl, Butenyl, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclohexenyl, Cyclohexadienyl, Methylcyclopentyl, Methylcyclohexyl, Benzyl, Benzhydryl, Phenyläthyl, Naphthylmethyl, Phenyl, Naphthyl, Propinyl, Tolyl, 2-Chloräthyl,   2, 2, 2-Trichloräthyl, 2, 2, 2-Trifluoräthyl,   Acetylmethyl, Benzoylmethyl, 2-Methoxyäthyl, 2-Dimethylaminoäthyl, 2-Diäthylaminoäthyl, 2-Piperidinoäthyl, 2-Morpholinoäthyl, 3-Dimethylaminopropyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Brombenzyl, m-Chlorbenzyl, 6-Methoxynaphthyl-2-methyl, p-Chlorphenyl oder p-Methoxyphenyl und ferner eine solche Gruppe bedeuten,

   die aus der Penicillin- oder Cephalosporinchemie zur Herstellung solcher Ester bekannt ist, die in vivo leicht zur antibiotischen   Stamm Substanz     lydrolysieren.   



   Leicht hydrolysierbare Ester sind z. B. auch die Ester der allgemeinen Formeln 

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 und 
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 worin Ai Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Aralkyl, A2 Wasserstoff oder Methyl, Ag Alkyl, Aryl oder Aralkyl, X und Y Sauerstoff   und/oder   Schwefel und Z einen zweiwertigen organischen Rest darstellen. Ester der Formeln (V) und   (VI),   die nach Verabreichung ziemlich leicht die Clavulansäure im Blutkreislauf freisetzen, 
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Adarstellen. 



   Der hier verwendete   Ausdruck "Alkyl" umfasst   Alkyl mit bis zu 6   C-Atomen, der Ausdruck"Aryl"Phenyl   oder Naphthyl oder Phenyl, das durch einen inerten Substituenten, wie Fluor, Chlor, Methyl, Methoxy od. dgl., substituiert ist, und der   Ausdruck"Aralkyl"arylsubstituiertes Alkyl.   



   Besonders zweckmässige Ester der Formeln (V) und (VI) sind jene der allgemeinen Formeln 
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 und 

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   worin A4 Wasserstoff oder Methyl, A 5 Methyl, tert. Butyl oder Phenyl und A6 6 Wasserstoff und/oder Methoxy   bedeuten. 



   Zahlreiche Clavulansäureester unterscheiden sich von analogen Estern von Penicillinen oder Cephalosporinen dadurch, dass sie unter milden Bedingungen eine erhöhte Bereitschaft zur Hydrolyse zu Clavulansäure zeigen. So hydrolysieren   z. B.   einfache Alkylester, wie der Methylester, langsam in auf PH 7 gepuffertem Wasser zu Clavulansäure. Ester, die schon unter milden Bedingungen in gewissem Grad einer Hydrolyse unterliegen, sind solche der allgemeinen Formel 
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Weise hergestellt werden. 



   Die Clavulansäure oder deren Salze können in den Arzneimitteln als einziger therapeutischer Wirkstoff oder zusammen mit andern therapeutischen Mitteln, wie einem ss-Lactamantibiotikum, vorliegen. Geeignete   ss-Lactamantibiotika   für derartige synergistische Arzneimittel sind nicht nur solche, die in hohem Masse   i gegen ss-Lactamase   empfindlich sind, sondern auch solche, die ein gutes Ausmass an Widerstandsfähigkeit gegen ss-Lactamasen haben. 



   Wenn die Clavulansäure oder deren Salze in den Arzneimitteln zusammen mit einem   ss-Lactamantibto-   tikum vorliegen, beträgt das Verhältnis der Clavulansäure oder deren Salz zum ss-Lactamantibiotikum bei- spielsweise   10 : 1   bis 1 : 10, vorteilhafterweise von   3 : 1   bis 1 : 3. 



  Die Gesamtmenge der in einer Einzeldosierungsform vorhandenen antibakteriellen Mittel beträgt be- wöhnlich 50 bis 1500 mg, üblicherweise 100 bis 1000 mg. 



   Die Arzneimittel können zur Behandlung von Infektionen unter anderem der Atemwege, des Harnsystems und der Weichteile beim Menschen verwendet werden. Sie können auch zur Behandlung von Infektionen bei
Haustieren, wie der Mastitis beim Vieh, eingesetzt werden. 



   Die genaue Form der Arzneimittel hängt von dem zu behandelnden Mikroorganismus ab. Für eine Be- handlung von Infektionen werden die Arzneimittel üblicherweise so eingestellt, dass sie im Blutspiegel ein
Maximum von mindestens   0, 1 jug/ml,   zweckmässiger von mindestens   0, 25 I-Ig/ml, vorzugsweise von min-   destens 1   jKg/ml   Clavulansäure hervorrufen. 



   Zur Gewinnung des   erfindungsgemäss   eingesetzten Clavulansäureesters wird zunächst der Stamm Strep-   tomyces     clavuligerus,   vorzugsweise Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 oder einer seiner hohe Aus- beuten liefernden Mutanten, gezüchtet, aus dem Kulturmedium die unreine Clavulansäure oder ein Salz hie- von isoliert und der Ester gebildet. 



     Unter "Züchten" wird   hier ein wohlerwogenes aerobes Wachstum eines Clavulansäure erzeugenden Or- ganismus in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalzen verstan- den. Dieses aerobe Wachstum kann auf einem festen, halbfesten oder in einem flüssigen Nährmedium er- folgen, indem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche, oder mittels einer Submerskultur stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammen- gesetzt oder chemisch definiert sein. Es wurde gefunden, dass Medien mit komplexen Nährstoffen, wie Hefe- extrakt,   Sojabohnenmehl u. dgl.,   besonders geeignet sind. 



   Das Züchten von Streptomyces clavuligerus erfolgt gewöhnlich bei 15 bis   40oC,   vorzugsweise 20 bis   35 C,   insbesondere 25 bis   30 C,   und bei einem pH-Wert von 5 bis 8, 5, vorzugsweise von 6 bis   7, 5.   



   Der Stamm Streptomyces clavuligerus kann in den Nährmedien in   belüfteten   konischen Glasflaschen durch Schütteln auf einem Drehschüttler oder in mit Prallblechen ausgerüsteten und mit Scheibenkreisel- mischern gerührten und mittels Zerstäubereinrichtungen belüfteten   Züchtungsgefässen   aus rostfreiem Stahl gezüchtet werden. Die Fermentation kann auch kontinuierlich durchgeführt werden. 



   Der Ausgangs-pH-Wert der Fermentation beträgt typischerweise 7, 0. Die höchste Ausbeute an Clavu- lansäure erhält man in 2 bis 10 Tagen bei einer Temperatur von 20 bis   35 C.   In einem Rührgefäss aus rost- freiem Stahl unter Verwendung eines Mediums mit Sojabohnenmehl, Malzdestillat-Trockensaft und Dextrin 
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 wirdhalten. 



   Die Clavulansäure kann aus dem Filtrat der Nährbouillon auf verschiedene Weise extrahiert werden, nämlich Lösungsmittel-Extraktion aus dem kalten, auf einen sauren pH-Wert eingestellten Filtrat und Anionenaustauscherverfahren. Die Zellen des Streptomyces clavuligerus werden zuerst aus dem Züchtungsmedium abfiltriert oder abzentrifugiert, bevor man mit der Extraktion beginnt. 



   Man erhält bei beiden Methoden ein festes Clavulansäurerohsalz. 



   Es ist auch möglich, ein Filtrat der Nährbouillon, das ein Salz der Clavulansäure enthält, bei annähernd neutralem pH-Wert mit einer organischen Phase, in der ein wasserunlösliches Amin gelöst ist, in Berührung zu bringen. Beispiele geeigneter Amine sind sek. oder   tert. Amine, in   denen einer der Substituenten ein langkettiger aliphatischer Rest, z. B. mit 12 bis 16 C-Atomen, und der andere Reste tert. Alkyl ist, so dass das Molekül lipophil ist. Üblicherweise wird das Amin als Säureadditionssalz eingesetzt. 



   Nach diesem Extraktionsverfahren liegt die Clavulansäure in der organischen Phase als Aminsalz vor. 



  Die organische Phase wird dann von dem Filtrat der Nährbouillon abgetrennt. Die Clavulansäure kann in die wässerige Phase mittels einer Salzlösung, vorzugsweise einer konzentrierten Lösung von Natriumchlorid, Natriumnitrat od. dgl., rückextrahiert werden. Das rohe Salz der Clavulansäure kann dann durch Gefriertrocknen od. dgl. erhalten werden. 



   Weitere mögliche Isolierverfahren sind z. B. Adsorption an Aktivkohle, Ionenpaar-Extraktion, Ausfällen, Aussalzen und Molekularfiltration. 



   Der Ester wird nun in üblicher Weise gebildet. 



   Eine geeignete Gruppe erfindungsgemäss eingesetzter Ester besitzt die allgemeine Formel 

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 einem   Ultraschall-Desintegrator   zertrümmert. Die Zellbruchstücke werden abzentrifugiert und aliquote Anteile der überstehenden Lösung im tiefgefrorenen Zustand gelagert. Zur Verwendung beim Versuchsverfahren wird die überstehende Flüssigkeit mit 0, 005 M Phosphatpufferlösung verdünnt, bis man eine etwa 
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 ige HydrolyseVersuchsverfahren
Geeignete Verdünnungen des Hemmpräparats und der   ss-Lactamaselösung   werden vermischt und 15 min bei   37 C   bebrütet (Test). Ein Kontrollversuch mit einer Pufferlösung an Stelle des Inhibitorpräparats wird ebenfalls bebrütet.

   Dann wird eine Benzylpenicillinlösung (Substrat) zu dem Test- und dem Kontrollgemisch gegeben. Dann wird die Bebrütung weitere 30 min bei   370C   fortgesetzt. Es wird dann das restliche Benzylpenicillin in jedem Gemisch unter Verwendung des Hydroxylaminversuchs bestimmt, wie von Bachelor und Mitarbeitern in Proc. Roy. Soc. B 154   [1961].   S. 498, beschrieben. Zu allen Tests werden 6 ml Hydroxylaminreagens zugegeben. Die Kontrollversuche und die Versuche mit den reinen Substanzen lässt man 10 min bei Raumtemperatur reagieren, bevor man 2 ml eines   Eisen- (m) -ammoniumsulfatreagens zusetzt.   Die Absorption der Endlösungen wird in   einem Colorimeter   oder in einem Spektrophotometer bei 490 nm gegenüber dem reinen Reagens gemessen.

   Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen, der Testlösungen und der reinen Substanzen vor dem Hydroxylaminversuch sind wie folgt : 
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<tb> 
<tb> Bestandteile <SEP> (alle <SEP> gelöst <SEP> reines <SEP> Benzyl- <SEP> Kontroll- <SEP> reines <SEP> 
<tb> in <SEP> oder <SEP> verdünnt <SEP> mit <SEP> 0,005 <SEP> M <SEP> penicillin, <SEP> versuch, <SEP> Reagens,
<tb> Phosphatpuffer <SEP> vom <SEP> pil <SEP> 7) <SEP> Test <SEP> ml <SEP> ml <SEP> ml <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> -ss <SEP> - <SEP> Lactaroase- <SEP> 
<tb> lösung <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 
<tb> Inhibitor <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Benzylpenicillin <SEP> 5 <SEP> rog/ml <SEP> 0,5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 0,005 <SEP> M <SEP> Phosphatpuffer <SEP> vom
<tb> PH <SEP> 7 <SEP> 0,

   <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 
 Berechnung der Ergebnisse Die prozentuale Hemmung der ss-Lactamase wird wie folgt berechnet : Absorption des reinen Benzylpenicillins minus Absorption der Kontrollösung (nicht gehemmte Reaktion) = x Absorption der Testlösung (gehemmte Reaktionslösung) minus Absorption der Kontrollösung (nicht gehemmte Reaktion) = y 
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Um den I50-Wert zu erhalten, wird das Hemmpräparat verdünnt, bis eine 50%ige Hemmung der   ss-Lac-   tamaseinaktivierung des Benzylpenicillins erzielt wird. 



   Beschreibung 2
Papierchromatographische Bestimmung der Clavulansäure
Das Filtrat der Nährbouillon und eine Bezugslösung der Clavulansäure (250   g/ml   eines teilweise gereinigten Präparats) werden auf 1 cm breite Papierstreifen (Whatman No. 1) (20   MI   der Ausgangslösung) getüpfelt. Die Chromatogramme laufen bei absteigender Chromatographie 16 h bei   5 C   unter Verwendung eines Gemisches von   n-Butanol/Isopropanol/Wasser   im Volumsverhältnis 7 : 7 : 6 als Lösungsmittel. Die Streifen werden bei   400C   getrocknet und auf Agarplatten ausgelegt, die 6   jMg/ml   Benzylpenicillin enthalten, und dann mit einem ss-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes (synergistisches System) beimpft.

   Die Platten werden über Nacht bei   30 C   bebrütet und die Clavulansäure zeigt sich als Zone eines gehemmten Wachstums. Der Rf-Wert der Zone beträgt 0, 46. Die Menge von 6   j g/ml Benzylpenicillin alleinliegt unter-   halb der erforderlichen Konzentration, um Klebsiella aerogenes abzutöten. Jedoch wird in Gegenwart eines   -Lactamasehemmstoffes   diese Konzentration toxisch, was für Synergismus spricht. 



   Die Verwendung des obgenannten synergistischen Systems ermöglicht die Feststellung der Clavulan-   säure   bei Konzentrationen unterhalb denjenigen, bei denen sie antibakterielle Wirksamkeit zeigt. 

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  Beschreibung 3 Dünnschichtchromatographische Bestimmung des Clavulansäurenatriumsalzes Lösungen von Präparaten des Clavulansäurenatriumsalzes werden in einer Menge von   5 gel   von 
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25 mmDie Chromatogramme laufen bei 2200 unter Verwendung einer oberen Phase eines Gemisches von n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumsverhältnis von 4 : 1 : 5. Die Chromatogrammplatten werden bei 400C ge- 
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 gedeckt, bevor die   Dünnschichtchromatographieplatte   darübergelegt wird.

   Nach 15 bis 30 min langem Ruhenlassen zum Befeuchten und Diffundieren wird die Dünnschichtchromatographieplatte mit Hilfe des Filtertuches abgehoben und die Agarplatte über Nacht bei   3 () OC bebrütet,   um die Zonen eines gehemmten Wachstums aufzuzeigen, Der Rf-Wert des Clavulansäurenatriumsalzes im obgenannten Lösungsmittel beträgt annähernd   0, 37,   Zwei sprühbare Reagentien, nämlich   Erlich'sches   Reagens und   Triphenyltetrazoliumchlorid,   werden ebenfalls verwendet, um die Zone des Clavulansäurenatriumsalzes aufzuzeigen, Das erstgenannte Reagens besteht aus 300 mg p-Dimethylaminobenzaldehyd, der in 9 ml Äthanol, 54 ml n-Butanol und 9 ml   konz.   Salzsäure gelöst ist.

   Bei 1 bis 2 min langem Erhitzen der besprühten Dünnschichtchromatographieplatte auf 1200C erscheint das Clavulansäurenatriumsalz als rosaroter Fleck, Das   Triphenyltetrazolium-   
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 igen LosungMethanol und 1 Vol.-Teil methanolischer Natronlauge, Nach dem Aufsprühen werden die   Dünnschichtchro-   matographieplatten auf 800C erhitzt. Das Clavulansäurenatriumsalz erscheint als roter Punkt auf weissem Untergrund. 



   Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt sein soll. 



     Beispiel l :   a) Züchtung von Streptomyces clavuligerus
Es wird ein   Hefeextrakt-Glucose-Nähragar   zur Beimpfung eines   Hefeextrakt-Glucose-Schrägagars   in einer Roux-Flasche verwendet, indem man eine Suspension des Mycels und der Sporen in sterilem Wasser herstellt. Die   schrägliegende Roux-Flasche   wird 10 Tage bei   260C   bebrütet. Zu diesem   Schrägagar   werden 100 ml steriles Wasser zugefügt und eine Mycel-Suspension hergestellt.

   Diese wird zur Beimpfung von 50   l   eines dampfsterilisierten Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet : 
Malzextrakt   l %-Masse   bakteriologisches Pepton   l %-Masse  
Glycerin 1 %-Masse   10% iges Antlschaummittel    ("Pluronic L81") in Sojabohnenöl 0, 05%-Masse 
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7 cm Leitschaufelngerührt. Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 50   Lmin   zugeführt und das Gefäss bei   260C   bebrü-   tet.   



   Nach 72 h wird der Anzuchtfermenter zur Beimpfung von 150   l   der gleichen Nährbouillon unter Verwendung eines 5   vol.-% eigen   Zusatzmittels einer sterilen Überführung verwendet, Diese Produktionsnährbouillon wird in einem 300   l   fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der mittels eines Scheibenkreiselmischers mit 21,   6 cm Leitschaufeln bei 210 Umdr/min gerührt wird.   Es wird sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 150   l/min   zugeführt. Die Fermentation wird bei   260C   ge- 
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 werden zum ss-Lactamasehemmversuch Proben entnommen.

   Nach 4 bis 5 Tagen hat der Fermenter das Maximum an einer   ss-Lactamasehemmwirkung   erreicht, wie aus Tabelle I hervorgeht. 

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   Tabelle I ss-Lactamasehemmwirkung von Proben eines aus einem 300 l-Fermenta- tionsgefäss von Streptomyces clavuligerus entnommenen Kulturfiltrats 
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<tb> 
<tb> Fermentations- <SEP> prozentuelle <SEP> Hemmung <SEP> beim <SEP> ss-Lactamasehemmversuoh
<tb> zeit, <SEP> Tage <SEP> bei <SEP> einer <SEP> Endverdunnung <SEP> von <SEP> 1/2500
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 12
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> 20
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 31
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> 36
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> 50
<tb> 3, <SEP> 5 <SEP> 54
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 51
<tb> 4, <SEP> 5 <SEP> 56
<tb> 5,0 <SEP> 55
<tb> 
 b) Herstellung des Clavulansäurebenzylesters aus rohen Extrakten des Kulturfiltrats von Streptomyces elavuligerus
20   I   des gemäss a) erhaltenen Kulturfiltrats werden unter Einsatz eines Kletterverdampfers auf 5   l   eingeengt.

   Das Konzentrat wird in einem Gefriertrockenschrank gefriergetrocknet. Die dabei erhaltenen 300 g Feststoff enthalten 3 g Clavulansäurenatriumsalz, wie mittels des   ss-Lactamasehemmversuchs   festgestellt wird. Der Feststoff wird in 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 150 ml Benzylbromid versetzt. Das Gemisch wird 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 11 Äthylacetat verdünnt. 



  Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat auf ein möglichst geringes Volumen eingedampft. 



  Der ölige Rückstand wird mit 1 weiterem   l   Äthylacetat extrahiert. Nach dem Filtrieren des Extraktes wird das Filtrat wieder eingedampft und man erhält einen öligen Rückstand, der auf eine 7, 6 x 35, 6 cm grosse Silikagel-Säule ("Biogel   Biosel   A" mit einer Teilchengrösse von 0, 15 mm) in Cyclohexan gegeben wird. Die Säule wird mit Cyclohexan eluiert, um Benzylbromid zu entfernen. Das Lösungsmittel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fängt 20 ml-Fraktionen auf. Die Fraktionen werden auf das Vorliegen des Clavulansäurebenzylesters durch Tüpfeln auf mit Silikagel beschichteten Dünnschichtchromatographieglasplatten (Silikagel 60F254) und Besprühen mit   2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Sprühreagens   (TTC) untersucht. 



   Die Fraktionen, die mit diesem Reagens intensive rote Flecken liefern, werden weiterhin mittels Dünn-   schichtchromatographie   an Silikagelplatten unter Verwendung eines   Chloroform-Äthylacetat-Gemisches   im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel und durch Sprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray   geprüft.   Der Benzylester der Clavulansäure läuft bei   220C   mit einem RrWert von 0, 31. Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf 15 ml eingeengt. Diese Lösung wird nochmals chromatographiert an 
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 Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel. Es werden 15 ml-Fraktionen gesammelt und auf die oben beschriebene Weise auf den Benzylester geprüft.

   Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden auf 8 ml eingeengt und nochmals durch   Säulenchromatographie   an einer   2,   5 x 40 cm Silikagelsäule ("Silikagel H, Typ   60")   mit einem Äthylacetat/Cyclohexan-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel gereinigt. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 160 ml reinen Benzylester als Öl. c) Herstellung des Clavulansäurenatriumsalzes 
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   Tabelle II Antibakterielles Spektrum des Clavulansäurenatriumsalzes 
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<tb> 
<tb> Bakterienstamm <SEP> Mindesthemmkonzentration
<tb> gt1nl
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> (Oxford <SEP> H) <SEP> 7,5
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> (Russell) <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 62
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> > <SEP> 500
<tb> Streptoooccus <SEP> pyogenes <SEP> CN10 <SEP> 125
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> NCTC <SEP> 10418 <SEP> 31
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes <SEP> 31-62
<tb> Klebsiella <SEP> oxytocum <SEP> 62
<tb> Enterobacter <SEP> aerogenes <SEP> T624 <SEP> 31
<tb> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> 62
<tb> Acinetobacter <SEP> antitratus <SEP> 125
<tb> Providentia <SEP> stuartii <SEP> 125
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 125
<tb> Proteus <SEP> mirabilis <SEP> C977 <SEP> 62
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> W090 

  <SEP> 31
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 31
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 62
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> A <SEP> 500
<tb> 
 ss-Laotamasehemmung durch Clavulansäurenatriumsalz Clavulansäure hemmt fortschreitend und irreversibel die ss-Lactamase von Escherichia coli. Die Me- 
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    "Beschreibung 1" zeigt,Clavulansäure   gehemmt werden. 



   Tabelle III
Hemmung der ss-Lactamasen durch Clavulansäure 
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<tb> 
<tb> Quelle <SEP> der <SEP> ss-Lactamase <SEP> ungefährer <SEP> 150-Wert <SEP> im
<tb> Verhältnis <SEP> zu <SEP> Escherichia
<tb> eoli <SEP> JT <SEP> 4 <SEP> = <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> (Russell) <SEP> 1,0
<tb> Escherichia. <SEP> coli <SEP> JT4 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> Bll <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1822 <SEP> (R-Faktor) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Pseudomonas <SEP> dalgleish <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 
 

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Mit Penicillin G als Substrat beträgt der Iso-Wert des Clavulansäurenatriumsalzes gegenüber der   ss -Lactamase   von Staphylococcus aureus Russell annähernd 0,06  g/ml. 



     Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin   und dem Clavulansäurenatriumsalz
Die Mindesthemmkonzentration von Ampicillin, des Clavulansäurenatriumsalzes und von Ampicillin in Gegenwart von 1  g/ml des Clavulansäurenatriumsalzes werden bei einer Reihe von ss-lactamaseerzeugenden
Bakterien bestimmt. Die Organismen werden in eine Oxoid-Empfindlichkeitstestflüssigkeit überimpft, die sich in kleinen Löchern   ineinerPlastikkivette   befinden und die unterschiedliche Konzentrationsgradienten, von einmal Ampicillin, zum andern des Clavulansäurenatriumsalzes und zum dritten von Ampicillin plus 
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 enthalten.bakteriellen Wachstums wird am nächsten Morgen vorgenommen.

   Die Mindesthemmkonzentrationswerte in   jg/ml   sind in Tabelle IV angegeben, die auch zeigt, dass der Synergismus bei der niedrigen Konzentration von   lg/ml   in bemerkenswerter Weise die antibackterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber bestimmten gram-positiven und gram-negativen Bakterien steigert. Der Mechanismus dieses Synergismus besteht wahrscheinlich darin, die Hemmung der ampicillinzerstörenden ss-Lactamassenzyme nach sich zu ziehen, doch kann die Existenz anderer Mechanismen nicht ausgeschlossen werden. 



   Ähnliche Ergebnisse wie die in Tabelle IV angegebenen werden erhalten, wenn man Ampicillin durch
Amoxycillin oder durch den Phthalidylester des   Ampicillins   ersetzt. 



   Tabelle IV 
Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und dem
Clavulansäurenatriumsalz 
 EMI13.2 
 
<tb> 
<tb> Bakterienstamm <SEP> Mindesthemmkonzentration- <SEP> ug/ml <SEP> 
<tb> Clavulansäure- <SEP> Ampicil- <SEP> Ampicillin <SEP> in <SEP> Gegennatriumsalz <SEP> lin <SEP> von <SEP> 1 <SEP> JLg/m1 <SEP> Clavulansäurenatriumsalz
<tb> E <SEP> scherichiacoli <SEP> NCTC <SEP> 10418 <SEP> 31 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> Bll <SEP> 62 <SEP> > <SEP> 500 <SEP> 125
<tb> Klebsiella <SEP> aerogenes <SEP> A <SEP> 31 <SEP> 125 <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Klebsiella <SEP> sp <SEP> 62 <SEP> 31 <SEP> 125 <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> 62 <SEP> 250 <SEP> 62
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 125 <SEP> > <SEP> 500 <SEP> 62
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> (Russell)

   <SEP> 15 <SEP> 500 <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 62 <SEP> 250 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI13.3 
 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 



   Tabelle V Antibakterieller Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Clavulansäurenatriumsalz 
 EMI14.1 
 
<tb> 
<tb> Bakterienstamm <SEP> Mindesthemmkonzentration-g/ml
<tb> Clavulansäure- <SEP> Cephalori- <SEP> Cephaloridin <SEP> in <SEP> Gegenwart
<tb> natriumsalz <SEP> din <SEP> von <SEP> 5 <SEP>  g/ml <SEP> Clavulansäurenatriumsalz
<tb> Proteus <SEP> mirabilis <SEP> 899 <SEP> > <SEP> 500 <SEP> * <SEP> 62 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> (Russell) <SEP> 15 <SEP> 3,1 <SEP> < 0,03+
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 62 <SEP> 15 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 
 * = Endpunkt + = der gleiche Wert wird erhalten, wenn 1  g/ml anstatt 5   g/ml Synergist   zugegeben wird. 



  Antibakterieller Synergismus zwischen dem Clavulansäurenatriumsalz und verschiedenen Penicillinen Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse werden, wie oben beschrieben, erhalten. 



   Tabelle VI 
Antibakterieller Synergismus zwischen dem Clavulansäurenatriumsalz und verschiedenen Penicillinen gegenüber Stämmen von Klebsiella aerogenes 
 EMI14.2 
 
<tb> 
<tb> Amoxycillin <SEP> Carbenicillin* <SEP> Benzylpenicillin
<tb> Stamm <SEP> allein <SEP> + <SEP> 5 <SEP>  g/ml <SEP> allein <SEP> + <SEP> 5 <SEP>  g/ml <SEP> allein <SEP> + <SEP> 5 <SEP> jKgnl
<tb> Synergist <SEP> Synergist <SEP> Synergist
<tb> A <SEP> 500 <SEP> 0,97 <SEP> 500 <SEP> 7,8 <SEP> 250 <SEP> 7,8
<tb> E70 <SEP> 500 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 500 <SEP> 15 <SEP> 500 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 62 <SEP> 250 <SEP> 15,6 <SEP> 125 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 250 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 
 * = Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn Carbenicillin durch den Phenyl-- - ester des Carbenicillins oder durch Ticarcillin ersetzt wird. 

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : 1, Verfahren zur Herstellung der neuen Clavulansäure der Formel EMI14.3 <Desc/Clms Page number 15> und von deren Salzen, insbesondere des Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, Ammonium- und substituierten Ammoniumsalzes, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Clavulansäureester der allgemeinen Formel EMI15.1 worin R nied. Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Arylalkyl, die gegebenenfalls substituiert sind, darstellt, gegebenenfalls in Anwesenheit einer Base, durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse, vorzugsweise durch milde alkalische Hydrolyse, entestert.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial einen Ester der allgemeinen Formel EMI15.2 worin A7 Wasserstoff oder eine gegebenenfalls durch Methyl, Chlor oder Methoxy substituierte Phenylgruppe und A 8 eine gegebenenfalls durch Methyl, Chlor oder Methoxy substituierte Phenylgruppe bedeuten, einsetzt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial den Benzylester einsetzt.