CH622825A5 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Thienamycin. Dieses Antibioticum kann in verdünnten Formen, in Form roher Konzentrate und in reinen Formen erhalten werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines neuen und wertvollen Antibioticums zur Verfügung zu stellen, das in hochgradig wirksamer Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmt.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces cattleya in einem wässrigen Nährmedium, welches assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, in aerober Submerskultur züchtet und das so erhaltene Antibioticum gewinnt.

Es können auch Mutanten von Streptomyces cattleya im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden.

Der im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Mikroorganismus wurde bisher noch nicht beschrieben. Dieser Mikroorganismus Streptomyces cattleya wird im erfindungsgemässen Verfahren unter gesteuerten Bedingungen gezüchtet.

Aufgrund umfangreicher taxonomischer Untersuchungen wurde der aus einer Bodenprobe isolierte Streptomyces cattleya als ein bisher noch nicht beschriebener Actinomycet identifiziert und in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, N. J., V. St. A., als MA-4297 bezeichnet. Eine Kultur davon wurde als permanente Hinterlegung bei der Kultursammlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V. St. A., hinterlegt und mit NRRL 8057 bezeichnet. Die Hinterlegung fand am 19. November 1974 statt.

Die Klassifizierungsdaten für das Genus Streptomyces und die Kulturbeschreibungen von Streptomyces-Species, die sich in «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology» (7. Auflage, 1957), in «The Actinomycetes», Band II (1961) von S. A. Waksman und in «Cooperative Descriptions of Type Cultures of Streptomyces» von E. B. Shirling und D. Gottlieb, «International Journal of Systematic Bacteriology», Band 18, Seite 69-189 (1968), Band 18, Seite 279-392 (1968), Band 19, Seite 391-512 (1969), und Band 22, Seite 265-394 (1972) finden, sind nach Streptomyces-Species mit morphologischen Merkmalen und Kulturmerkmalen ähnlich denjenigen von MA-4297 durchsucht worden. In den genannten klassischen Bezugswerken ist aber keine Streptomyces-Species beschrieben, die die orchideenfarbene Pigmentierung des Luftmycels, die morphologischen Eigenschaften und die Abwesenheit von diffusionsfähigem Pigment aufweisen, die zusammen die unterscheidenden Merkmale von MA-4297 bilden. Diese Umstände rechtfertigen und erfordern die Zuordnung einer neuen Streptomyces-Species.

Die morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale von Streptomyces cattleya sind nachstehend zusammenge-fasst:

Morphologie: Die Sporophoren sind kompakte Spiralen, die als Seiten- und Endzweige am Luftmycel auftreten. Die Sporen sind in ihrer Form ellipsoidisch bis zylindrisch, haben Grössen von 0,9 |i x 1,2 p, und kommen in Ketten von mehr als 10 vor.

Kulturmerkmale:

Tomatenmark-Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum - Unterseite bräunlich, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit weiss; lösliches Pigment - keines.

Czapek-Dox-Agar (Saccharosenitrat-Agar)

Vegetatives Wachstum - farblos, flach, sich ausbreitend; Luftmycel - spärlich, rosa-weiss;

lösliches Pigment - keines.

Eieralbumin-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich mit ins Graue gehendem orchideenfarbenem Anflug, flach, sich ausbreitend; Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit helleren Tönen der Orchideenfarbe und etwas weiss;

lösliches Pigment - keines.

Glycerin-Asparagin-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite bräunlich mit grau-

rosa Anflug, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit etwas weiss;

lösliches Pigment - keines.

Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich mit ins Graue gehendem rosa Anflug;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit rosa-weiss;

lösliches Pigment - keines.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit rosa-

weiss;

lösliches Pigment - keines.

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - geringe Braunfärbung des Mediums; Melanin - negativ;

H2S-Erzeugung - negativ.

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Nähragar

Vegetatives Wachstum - hellbräunlich;

Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - keines.

Nährstärke-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben bis bräunlich; Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - keines;

Hydrolyse von Stärke - mässig.

Nährgelatine-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - keines;

Gelatineverflüssigung - mässig.

Gelatinestäbe (Gelatin stabs)

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - keines;

Gelatineverflüssigung - mässig.

Kartoffelpfropfen

Vegetatives Wachstum - mässig, bräunlich;

Luftmycel - spärlich, grau-rosa-weiss;

lösliches Pigment - keines.

Loefflers Blutserum

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung - keine.

Magermilch-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - spärlich, weisslich;

lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Caseinhydrolyse - positiv.

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum - bräunlich bis braun;

Luftmycel - keines;

Farbe - kein lösliches Pigment, Lackmus-Indikator wird bläulich;

Koagulation und/oder Peptonisierung - Teilpeptonisie-rung, wird alkalisch.

Magermilch

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - keines;

lösliches Pigment - keines;

Koagulation und/oder Peptonisierung - Teilpeptonisie-rung, wird alkalisch.

Tyrosin-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - Gemisch aus orchideenfarben (10 gc) und weiss;

lösliches Pigment - keines;

Zersetzung von Tyrosin - positiv.

Alle oben angegebenen Beobachtungen wurden, falls nichts anderes angegeben ist, nach 3-wöchiger Inkubation bei 28°C angestellt. Der pH-Wert des für die Untersuchungen verwendeten Mediums war ungefähr neutral und betrug 6,8 bis 7,2. Die für die Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen stimmen mit den Definitionen des «Color Harmony Manual», 4. Auflage (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois, V. St. A., überein.

Streptomyces cattleya wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus 3 Wochen bei 28°C auf einem synthetischen Grundmedium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das 1 % Kohlehydrat enthielt. Der pH-Wert des für die Untersuchung verwendeten Mediums war etwa neutral (6,8 - 7,2). In Tabelle I ist die

Ausnutzung der Kohlehydratquellen durch Streptomyces cattleya angegeben:

+ bedeutet gutes Wachstum;

± bedeutet Wachstum und — bedeutet kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat.

TABELLE I

Glucose + Maltose ±

Arabinose — Mannit +

Cellulose — Mannose dz

Fructose ± Raffinose —

Inosit — Rhamnose —

Lactose — Saccharose ±

Xylose ±

Für das Ausmass des Wachstums bei Temperaturänderung, für den Sauerstoffbedarf und für den Einfluss von Nitrat auf den Mikroorganismus wurde folgendes gefunden: Temperaturbereich (Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar) 28°C - gut 37°C - mässig 50°C - kein Wachstum Sauerstoffbedarf (Stabkultur [Stab culture] in Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar)

aerob

Nitratreduktion - positiv.

Wie schon weiter oben erwähnt, wird für die Herstellung des neuen Antibioticums Thienamycin der Mikroorganismus Streptomyces cattleya verwendet, es können aber auch Mutanten davon eingesetzt werden. Diese Mutanten können aus dem oben beschriebenen Mikroorganismus auf verschiedene Weise, z.B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, mit ultraviolettem Licht, durch Einwirkung von N-Senfgas, durch Einwirkung von Phagen und dergleichen, erhalten werden.

Das neue Antibioticum Thienamycin entsteht erfindungs-gemäss bei der aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch Beimpfung mit dem Organismus Streptomyces cattleya. Für die Erzeugung von Thienamycin eignen sich wässrige Medien, wie diejenigen, die auch für die Erzeugung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff sowie durch den Mikroorganismus assimilierbare anorganische Salze.

Im allgemeinen kann man Kohlehydrate, wie Zucker, z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit und dergleichen, und Stärken, wie Getrende, z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, entweder für sich allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwenden. Die genaue Menge der Kohlehydratquelle(n) in dem Medium richtet sich zum Teil nach den übrigen Bestandteilen des Mediums; im allgemeinen variiert aber die Menge der Kohlehydrate zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen können in dem Medium einzeln verwendet werden, oder es können mehrere Kohlenstoffquellen miteinander kombiniert werden. Im allgemeinen können bei den Fermentations verfahren viele Proteine als Stickstoffquellen verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen sind z.B. Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Caseinhydrolysate, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenmark und dergleichen. Die Stickstoffquellen werden entweder für sich allein oder in Kombination in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent des wäss-rigen Mediums angewandt.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden, gehören vorzugsweise die üblichen Salze, die

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Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Carbonationen und ähnliche Ionen zur Verfügung stellen. Ferner können dazu die Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium, gehören.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien dienen nur zur Erläuterung der grossen Vielzahl verschiedener Arten von Medien, die bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden können.

Die Fermentation wird vorzugsweise bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C durchgeführt; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man die Fermentation jedoch insbesondere bei Temperaturen von etwa 22 bis 30°C durch. Der pH-Wert der zum Züchten der Kultur von Streptomyces cattleya und zur Erzeugung von Thienamycin geeigneten Nährmedien kann im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Obwohl das neue Antibioticum Thienamycin sowohl durch Oberflächenkultur als auch durch Submerskultur erzeugt werden kann, wird die Fermentation erfindungsgemäss in Submerskultur durchgeführt.

Eine Fermentation zur Herstellung des Antibioticums im kleinen Massstab wird gewöhnlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur beimpft und die Fermentation nach Übertragung auf ein Produktionsmedium bei konstanter Temperatur von etwa 24°C in einer Schüttelmaschine mehrere Tage fortführt.

Die Fermentation wird gewöhnlich in einem das Medium enthaltenden sterilisierten Kolben in einer oder zwei Impfstufen durchgeführt. Das Nährmedium für die Impfstufe kann jede beliebige Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten. Der Impfkolben wird z.B. in einer Kammer von konstanter Temperatur von etwa 28°C zwei Tage oder so lange geschüttelt, bis die Kultur zufriedenstellend ist, und etwas von der entstandenen Kultur wird verwendet, um entweder ein zweites Impfmedium oder das Produktionsmedium zu beimpfen. Wenn zwischenstufige Impfkolben verwendet werden, werden sie im wesentlichen in der gleichen Weise entwickelt; d.h. ein Teil des Inhalts des Kolbens von der letzten Impfstufe wird zum Beimpfen des Produktionsmediums verwendet. Die beimpften Kolben werden in der Regel mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationszeit kann der Kolbeninhalt ab-zentrifugiert oder abfiltriert werden.

Für das Arbeiten in grossem Massstabe wird die Fermentation vorzugsweise in geeigneten Behältern durchgeführt, die mit einem Rührer und einer Einrichtung zum Belüften des Fermentationsmediums versehen sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium gewöhnlich in dem Behälter hergestellt und durch Erhitzen auf Temperaturen bis etwa 120°C sterilisiert. Nach dem Erkalten kann das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Kultur beimpft werden und die Fermentation z.B. 3 bis 5 Tage unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 24°C durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von Thienamycin eignet sich besonders für die Herstellung grosser Mengen des Antibioticums.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Thienamycins

Thienamycin ist ein weisser fester Stoff, der in Wasser sehr löslich ist und eine begrenzte Löslichkeit in Methanol aufweist.

Das scheinbare Molekulargewicht in phosphatgepufferten Lösungen wird, bestimmt durch analytisches Ultrazentrifu-gieren unter Anwendung der Kurzkolonnen-Sedimentationsmethode und der Ultraviolettabsorption zur Überwachung der Sedimentationsgrenze der bei 300 nm absorbierenden Stoffe zu etwa 282 Dalton berechnet. Die Felddesorptions-Massen-

spektrometrie ergibt ein Molekulargewicht von 272. Aus einer Energiedispersionsanalyse der von dem Antibioticum unter dem Strahl eines Abtastelektronenmikroskops ausgesandten Röntgenstrahlen wurde ein Verbindungsmolekulargewicht von 290 ± 20 auf der Basis von Schwefel errechnet, der das einzige Element mit einer Ordnungszahl von mehr als 9 ist, das in signifikanten Mengen in dem Antibioticum vorkommt.

Thienamycin hat die empirische Formel CnH^NaOiS, bestimmt durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung. Die berechnete Elementarzusammensetzung, die dieser empirischen Formel entspricht, ist die folgende: 48,52% Kohlenstoff, 5,92% Wasserstoff, 10,29% Stickstoff, 23,5% Sauerstoff und 11,77% Schwefel.

Das Infrarotspektrum (Fig. 1) des Thienamycins, bestimmt an einer Suspension in Nujol, zeigt die folgenden Ab-sorptionsmaxima:

scharfes Maximum bei 1765 cm-1

breite Maxima bei 1650-1550 cm-1

2800 - 2500 cm-1 und 3500-3100 cm-1.

Andere Banden werden bei 1290, 1245, 1150-1130, 1065, 995, 970, 945-935, 885, 805, 785 und 720 cm"1 gefunden.

Ein bei 100 MHz aufgenommenes NMR-Spektrum (kernmagnetisches Resonanzspektrum) von aus D20 gefriergetrocknetem Tienamycin, untersucht in einer Konzentration von 1,5 mg je 0,4 ml DaO, das eine Spur Natrium-2,2-dime-thyI-2-silapentan-5-sulfonat als inneren Standard enthält, ergibt die folgenden Maxima:

6 1,275, d, 3H, J = 6,8; 6 3,15, m, 6H;

5 3,39, d, d, IH, J = 6,0, 2,9; S 4,20, m, 2H.

Thienamycin hat eine spezifische optische Drehung von [a]u27°c = +82,7° (Konzentration 0,1 Gewichtsteil in 100 Raumteilen einer 10-millimolaren wässrigen Phosphatpufferlösung vom pH 6,95).

Die Dispersion der optischen Drehung zeigt einen einzigen, positiven Cotton-Effekt mit einem Maximum bei 311 nm und einer Mulde bei 242 nm. Der Zirkulardichroismus zeigt ein positives Maximum bei 287,5 nm und ein negatives Minimum bei 216 nm.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Thienamycins, aufgenommen in wässriger Lösung im pH-Bereich von 4 bis 8, hat ein Maximum bei 269,5 nm (E Ylm ~ 290, e = 7900) und eine Mulde bei 242 nm (E = 88). Spektren, die unmittelbar nach der Herstellung der Lösungen bei einem pH-Wert von 2 aufgenommen sind, zeigen eine Rotverschiebung im Absorptionsmaximum auf 309 nm. Spektren, die unmittelbar nach der Einstellung des pH-Wertes auf 12 aufgenommen worden sind, zeigen eine Rotverschiebung des Absorptionsmaximums auf 300,5 nm.

Thienamycin ist ein in sich neutralisierter amphoterer Stoff, dessen Säurefunktion, bestimmt in 30-millimolarer Phosphatpufferlösung unter Ausnutzung der durch den pH-Wert ausgelösten Verschiebung im Ultraviolett-Absorptoins-spektrum, einen pKar-Wert von 3,08 aufweist.

Mit Ninhydrin, Jodplatinat und Folinschem Reagens erhält man positive Farbreaktionen. Der Sakaguchi-Test ist negativ.

Wenn Thienamycin der Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten, die einen fluoreszierenden Indikator enthalten, unterworfen und mit einem Gemisch aus 70% Äthanol und 30% Wasser entwickelt wird, wird es nach jedem der folgenden Kriterien gesondert bei einem RrWert von

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0,45 bis 0,50 festgestellt: 1) Bioautographie auf Agarplatten, die mit dem Detektor-Organismus Staphylococcus aureus MB-108, der nachstehend als Staphylococcus aureus ATCC 6538P identifiziert wird, beimpft worden sind; 2) Auslöschung der durch einfallendes ultraviolettes Licht erregten Fluoreszenz; 3) pfirsichfarbene Reaktion nach dem Besprühen mit Ninhydrin und Erhitzen; 4) langsames Ausbleichen des aufgesprühten Jodplatinat-Reagens.

Die Beweglichkeit von Thienamycin in verschiedenen weiteren Chromatographiesystemen ist nachstehend angegeben:

Lösungsmittelgemisch

Adsorptionsmittel

Rf

Butanol : Essigsäure : Wasser (40 : 10 : 50)

«Avicel TLC»

0,43

Äthanol : Wasser (70: 30)

Kieselsäuregel G «Avicel TLC»

0,49 0,48

n-Propanol : Wasser (70:30)

Kieselsäuregel G «Avicel TLC»

0,31 0,36

Äthanol : Wasser (70: 30)

Absteigendes Papier-chromatogramm auf Whatman-Filterpapier Nr. 1

0,63

Äthanol : Wasser (70: 30)

Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäuregel HF («Analtech») TLC, vorgewaschen mit Äthanol

0,44

«Avicel» ist ein Warenzeichen der American Viscose Corporation für Kristalline Cellulose. Die RrWerte beziehen sich auf die Entfernung vom Anfangspunkt bis zum Zentrum der Bioaktivität (bestimmt durch Bioautographie an Staphylococcus aureus ATCC-6538P), dividiert durch den Abstand der Lösungsmittelfront vom Anfangspunkt.

Die mit einem Hitashi-Perkin-Elmer-Analysiergerät, Modell KLA-5, durchgeführte Aminosäureanalyse eines Säure-hydrolysats des Thienamycins ergibt eine mit Ninhydrin reaktionsfähige Hauptkomponente mit einer Retentionszeit in der Mitte zwischen derjenigen des Alanins und des Glycins, die mit Ninhydrin ein Reaktionsprodukt ergibt, dessen bei 440 nm bestimmte Extinktion um das 3fache grösser ist als die bei 540 nm bestimmte Extinktion. Wenn das Antibioticum vor der Säurehydrolyse mit kalter Perameisensäure und dann mit Bromwasserstoff behandelt wird, wie es üblich ist, um Thioäthergruppen und Sulfhydrylgruppen in Sulfongrup-pen bzw. Sulfonsäuregruppen überzuführen, ergibt die Aminosäureanalyse eine mit Ninhydrin reaktionsfähige Hauptkomponente mit einer Retentionszeit, die nur wenig grösser ist als diejenige der Asparaginsäure, wobei das Reaktionsprodukt mit Ninhydrin bei 540 nm bestimmte Extinktionen zeigt, die um das 3,2fache grösser sind als die bei 420 nm bestimmten Extinktionen. Diese Komponente ist identisch mit Taurin (2-Aminoäthansulfonsäure), was durch Vergleich mit der Elutionszeit einer authentischen Probe festgestellt wird, die der gleichen Aufeinanderfolge von Oxidation und Säurehydrolyse unterworfen worden ist. Aus diesem Vergleich wird geschätzt, dass der Anteil des gewonnenen Taurins 0,8 jiMoI je mg des der Reaktionsfolge zugeführten Thienamycins beträgt.

Thienamycin zeigt eine optimale Stabilität in wässriger Lösung, wenn es bei Konzentrationen unter 1 mg/ml und in Gegenwart von Phosphatpuffern gehalten wird, die einen pH-Wert zwischen 6 und 7 ergeben. Eine bei 0°C aufbewahrte wässrige Lösung von 1 mg/ml (pH 7,0) hat z.B. eine Halbwertszeit von 20 Tagen, während die Halbwertszeit bei der gleichen Konzentration in 10-millimolarer Kaliumphosphatlösung (pH 7,0) auf 37 Tage verlängert wird. Wenn aber eine Lösung von 12 mg Antibioticum je ml 10-millimolarer Phosphatpufferlösung bei 10°C aufbewahrt wird, zeigt sie nur eine Halbwertszeit von 3 Tagen. Diese Lösung, die anfänglich blassgelb ist, nimmt im Verlaufe der 48stündigen Lagerung eine tief dunkelgelbe Farbe an.

Die Halbwertszeit des Thienamycins im pH-Bereich unter dem Neutralpunkt bei Raumtemperatur beträgt: 346 Minuten bei pH 4,0; 30 Minuten bei pH 3,0; 6,7 Minuten bei pH 2,0, wobei in allen Fällen ein 30-millimolarer Phosphatpuffer verwendet wird, um die Wasserstoffionenkonzentra-tion unter Kontrolle zu halten. Oberhalb des Neutralpunktes bei 30°C beträgt die Halbwertszeit 10 Minuten bei pH 8,2, 5,7 Minuten bei pH 8,8 (Boratpuffer) und 2,1 Minuten bei pH 12 (0,01-moIare Natronlauge).

Die antibiotische Aktivität und die Ultraviolettextinktion, bestimmt bei 296,5 nm, werden in Reaktionsgemischen, die anfänglich 0,05 (iMol Antibioticum und 4 p,Mol Hydroxyl-amin je ml enthalten und bei einem pH-Wert von 7,0 bei 20°C inkubiert werden, streng proportional mit einer Halbwertszeit von 5,7 Minuten ausgelöscht. Eine Halbwertszeit von 2,5 Minuten wird beobachtet, wenn man als Reagens Cystein in einer Konzentration von 4 [iMol/ml bei einem pH-Wert von 7,0 und 20°C anwendet. Schliesslich werden die antibiotische Aktivität und die Extinktion bei der Einwirkung von Präparaten von ß-Lactamase ausgelöscht, die durch Beschallungsabbau eines Stammes von Enterobacter cloacea erhalten werden.

Es wird angenommen, dass Thienamycin die folgende Strukturformel aufweist:

COOH

Thienamycin kennzeichnet sich ferner durch das folgende antibiotische Spektrumprofil. Bei diesem Test wird die Bauer-Kirby-Scheibendiffusionsmethode angewandt, die nur in be-zug auf die im vorliegenden Falle verwendete Agartiefe von 2 mm abgeändert ist. Die Ergebnisse, ausgedrückt in mm Durchmesser der Hemmungszone, sind in Tabelle II zusammengestellt.

5

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TABELLE II

Mikroorganismus i n in

Resistenz gegen Antibiotisches Präparat **

Antibiotica * 12 9,7 6,6

Y Antibioticum/Scheibe ***

Staphylococcus aureus

2985

—

19

39

38

Staphylococcus aureus

2314

P

40

39

38

Streptococcus faecalis

755

—

27,5

26

24

Bacillus subtilis

964

—

48,5

48

46

Escherichia coli

2017

—

30

29

28

Escherichia coli

2964

P, C

28

27

27

Escherichia coli

2482

—

30

28

27

Klebsiella

2921

P

26

25

25

Klebsiella

2922

P

26

25

25

Enterobacter cloacae

2646

p, C

26

26

25

Enterobacter cloacae

2647

—

30

30

27,5

Proteus mirabilis

2830

p, c

23

22

21

Proteus morganii

2833

P, c

23,5

22

20

Serratia

2840

P, C

25

24

23

Pseudomonas aeruginosa

2824

p, C

31

32

30

Pseudomonas aeruginosa

3210

P, c

27

27

25

Pseudomonas aeruginosa

2616

P, c

23

22

20,5

*P = Penicilline, vertreten durch Ampicillin.

C = Cephalosporine, vertreten durch Cephalothin.

** I: rohes Präparat (310 Einheiten/mg).

II: mittlere Reinheit (13200 Einheiten/mg).

III: praktisch rein (geschätzt 31000 Einheiten/mg).

Die Einheit der antibakteriellen Stärke ist in dem nachstehenden Abschnitt über «Analyse» definiert.

***: Berechnet auf der Basis der nachstehenden, durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion.

Für eine weitere Auswertung von praktisch reinem Antibioticum wird die Agar-Verdünnungsmethode angewandt. Ein Impfgut aus 2 x IO4 bis 1 x 105 Mikroorganismen wird in Form eines Tröpfchens von 0,002 ml auf die Oberfläche von Müller-Hinton-Agar aufgebracht, das eine Reihe von Verdünnungen des Antibioticums auf jeweils das Doppelte im Bereich von 0,01 bis 73 y/ml enthält. Die Ergebnisse (Tabelle III) werden als geringste Hemmungskonzentration in y/ml ausgedrückt, d.h. als die niedrigste Konzentration des Antibioticums, bei der das Wachstum des Prüforganismus im Verlaufe von 18 Stunden bei 37°C noch gehemmt wird.

TABELLE III

45

SO

55

60

65

Prüf Organismus

Resistenz gegen Antibiotica *

Geringste Hemmungs-konzentration, T/ml

Staphylococcus aureus

2314

P

0,02

Escherichia coli

2482

—

0,3

Escherichia coli

2964

P, C

0,3

Escherichia coli

2017

—

0,15

Klebsiella

2921

P

0,3

Klebsiella

2922

P

0,3

Proteus mirabilis

2830

P, c

4,7

Serratia

2840

P, c

4,7

Pseudomonas aeruginosa

2824

P, c

0,6

Pseudomonas aeruginosa

2616

P, c

4,7

Pseudomonas aeruginosa

3210

P, c

2,4

* P = Penicilline, vertreten durch Ampicillin. C = Cephalosporine, vertreten durch Cephalothin.

7

622825

Thienamycin zeigt in vivo Aktivität gegen gram-negative und gram-positive Organismen und eignet sich daher zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Wirtstieren. Zur Bestimmung der Aktivität in vivo wird Thienamycin in 0,15-molarer Kochsalzlösung, die mit 0,01-molarer Natriumphosphatlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden ist, gelöst und zur Untersuchung fünfmal nacheinander auf je das 4fache verdünnt. Weibliche weisse Schweizer Mäuse mit einem mittleren Körpergewicht von etwa 21g werden intraperitoneal und subkutan mit dem in Nährflüssigkeit suspendierten Prüforganismus infiziert. Die Anzahl der injizierten Mikroorganismen wird nach genormten Plattenzählmethoden bestimmt. Zum Zeitpunkt der Infektion und 6 Stunden später werden einige der Mäuse intraperitoneal, subkutan und oral mit dem Antibioticum behandelt. Für jede Konzentration des untersuchten Antibioticums werden 5 Mäuse verwendet. Weitere zwei Mäuse, die nicht infiziert worden sind, werden ebenfalls mit dem Antibioticum behandelt, um festzustellen, ob die injizierte Menge des Mittels toxisch war. Für jeden der verschiedenen Verdünnungsgrade der infizierenden Kultur werden bei jedem Versuch weitere fünf Mäuse zur Kontrolle verwendet, um die Anzahl der Mikroorganismen zu berechnen, die für 50% der infizierten, unbehandelten Mäuse letal war (LD-0). Diese Berechnungen werden aufgrund der Anzahl der am siebenten Tag nach der Infektion noch überlebenden Tiere durchgeführt, zu welchem Zeitpunkt die Menge des Antibioticums, die 50% der infizierten Mäuse schützen sollte (ED.™) ebenfalls berechnet wurde.

Alle Tiere, die diese Infektionsbehandlung erhielten und nicht mit dem Antibioticum behandelt wurden, verendeten innerhalb 48 Stunden nach der Infektion. Der Wirkungsgrad von Thienamycin mit einer Stärke von 30 000 Einheiten/mg ergibt sich aus Tabelle IV.

TABELLE IV Untersuchung des Wirkungsgrades (an Mäusen) a

Mikroorganismus

Anzahl LD50

Behandlungsart, Dosen

ED50, mg/kg/Dosis

Staph. aureus

7

i.p. x2

0,012

2949

7

s.c. x2

0,08

13

p.o. x2ß

0,67

Pseudomonas

7

i.p. x3«

0,45

aeruginosa

7

s.c. x3

2,05

3210

E. coli

9

i.p. x2

0,375

2017

»: x3 bedeutet Behandlung zum Zeitpunkt der infizierenden Dosis sowie 2 und 4 Stunden nach der Infektion. x2 bedeutet Behandlung zum Zeitpunkt der infizierenden Dosis und 6 Stunden später.

ß: Vor der Infektion und der therapeutischen Behandlung haben die Tiere 24 Stunden keine Nahrung erhalten.

Aus der Beobachtung, dass keine nachteiligen Wirkungen im Verlaufe von 7 Tagen nach der intravenösen Darreichung von 500 mg des Antibioticums je kg Körpergewicht der Mäuse auftreten, ergibt sich eine nur geringfügige Toxizität für Säugetiere.

Thienamycin ist ein wertvolles Antibioticum, das gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien aktiv ist und sich infolgedessen für die Human- und Veterinärmedizin eignet. Die Verbindung kann als antibakterielles Mittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien, wie z.B.

Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter cloacae, verursacht worden sind. Das antibakterielle Mittel kann ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konservie-5 ren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Es kann z.B. in wässrigen Mitteln in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Gelo räten zu zerstören oder zu hemmen; ferner können solche Mittel als Bakterizide für technische Anwendungszwecke, z.B. in Anstrichfarben auf wässriger Basis oder in dem Siebwasser von Papierfabriken, verwendet werden, um das Wachstum schädlicher Bakterien zu unterdrücken. 15 Das erfindungsgemäss erhaltene Antibioticum kann in den verschiedensten pharmazeutischen Präparaten als einziger Wirkstoff oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antibiotica oder mit einem oder mehreren pharmakologisch aktiven Stoffen verwendet werden. Als Beispiel für 20 ein anderes Antibioticum kann ein Aminocyclit-Antibioticum, wie Gentamicin, zugesetzt werden, um die Gefahr des Auftretens von resistenten Organismen zu vermindern. Als Beispiel für pharmakologisch aktive Stoffe kann man Diphen-oxylat und Atropin in Dosisformen mit dem Antibioticum 25 kombinieren, um Gastroenteritis zu heilen. Das Antibioticum kann in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern, in flüssigen Lösungen oder in Form von Suspensionen oder Elixieren verwendet werden. Es kann oral, örtlich, intravenös oder intramuskulär dargereicht werden.

30 Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisform vorliegen und herkömmliche Streckmittel, wie Bindemittel, z.B. Sirup, Akazienharz, Gelatine, Sorbit, Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon, Füllstoffe, z.B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit 35 oder Glycerin, Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Kieselsäure, den Zerfall beschleunigende Mittel, wie Kartoffelstärke, oder Netzmittel, wie Natrium-laurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können in an sich bekannter Weise beschichtet sein. Oral darzureichende flüssige 40 Präparate können in Form von wässrigen Suspensionen, Ölsuspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw. vorliegen oder als trockenes Produkt zum Anmachen mit Wasser oder anderen geeigneten Trägern vor der Verwendung bereitgestellt werden. Solche flüssigen Präparate kön-45 nen herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel, z.B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose-Zuckersirup, Gelatine, H>-droxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminium-stearatgel oder hydrierte Speisefette, Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akazienharz, nichtwässrige 50 Träger, wie Speiseöle, z.B. Mandelöl, fraktioniertes Kokos-nussöl, ölförmige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol, Konservierungsmittel, z.B. p-Hydroxybenzoesäuremethyl-oder -propylester oder Sorbinsäure, enthalten. Zäpfchen enthalten herkömmliche Zäpfchengrundstoffe, z.B. Kakaobutter 55 oder andere Glyceride.

Mittel für die Injektion können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in mehrere Dosen enthaltenden Behältern mit Zusatz eines Konservierungsmittels zur Verfügung gestellt werden. Die Mittel können als Suspensionen, Lösungen, Emul-60 sionen in öligen oder wässrigen Trägern vorliegen und können Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisier- und/ oder Dispergiermittel, enthalten. Der Wirkstoff kann auch in Form eines Pulvers vorliegen, das vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem, pyrogenfreiem Was-65 ser, angemacht wird.

Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und des Halses oder des Bronchialgewebes geeigneter Form hergestellt werden, in welchem

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Falle sie als pulverförmige oder flüssige Sprüh- oder Inhaliermittel, Pastillen, Halspinselmittel usw. bereitgestellt werden können. Für die Behandlung von Augen und Ohren können die Mittel in Form einzelner Kapseln, in flüssiger oder halbfester Form bereitgestellt werden oder als Tropfen usw. verwendet werden. Für die lokale Anwendung können sie in hydrophoben oder hydrophilen Grundstoffen als Salben, Creme, Spülungen, Farben, Pulver usw. formuliert werden.

Ausser einem Träger können die neuen Mittel andere Bestandteile, wie Stabilisiermittel, Bindemittel, Oxidations-verzögerer, Konserviermittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Verdicker oder geschmackgebende Mittel und dergleichen, enthalten.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, können die Mittel z.B. als in die Brust einzuspritzende Präparate entweder mit Langzeitwirkung oder mit schneller Freigabe hergestellt werden.

Die Dosierung richtet sich weitgehend nach dem Zustand und Gewicht des zu behandelnden Tieres, der Art der Infektion, dem Weg und der Häufigkeit der Darreichung, wobei die parenterale Applikation für allgemeinen Infektionen und die orale Applikation für Darminfektionen bevorzugt werden.

Für die Behandlung von bakteriellen Infektionen beim Menschen kann die neue Verbindung oral oder parenteral nach herkömmlichen Methoden für die Behandlung mit Antibiotica in Mengen von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und vorzugsweise von etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag in vorzugsweise unterteilten Dosen, z.B. drei- oder viermal pro Tag, dargereicht werden. Die Mittel können in Dosiseinheiten dargereicht werden, die z.B. 25, 250, 500 oder 1000 mg Wirkstoff zusammen mit geeigneten physiologisch unbedenklichen Trägern oder Streckmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen gewöhnlich in Form von flüssigen Präparaten, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als feste Stoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die günstigste Dosis richtet sich in jedem Falle nach der Art und Schwere der zu behandelnden Infektion; kleinere Dosen werden für Kinder verwendet, und alle derartige Einregelungen sind dem Fachmann geläufig.

Die das Antibioticum enthaltenden, nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellten Fermentationsflüssigkeiten haben Aktivitäten im Bereich von etwa 50 bis 400 Einheiten je ml, wenn sie nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538P analysiert werden. Präparate des Antibioticums, die eine Aktivität von mindestens 2 Einheiten je mg aufweisen, können gereinigt werden, und das Antibioticum kann daraus nach einer Anzahl von Verfahren gewonnen werden. Ein solches Verfahren ist die Adsorption von Thienamycin an ein stark kationisches Austauschharz. Beispiele für solche Harze sind Sulfonate mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst, z.B. das kernständige Sulfonsäuregruppen aufweisende Polystyrol «Dowex 50 x 2» (hergestellt von der Dow Chemical Company, Midland, Michigan) in der Natriumform. Andere typische Vertreter der Klasse der stark kationischen Austauschharze sind die folgenden: «Dowex 50 x 4», «Dowex 50 x 8» (hergestellt von der Dow Chemical Company, Midland, Michigan, V. St. A.), «Amberlite IR120» (hergestellt von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania, V. St. A.), «Duolite C25D» (hergestellt von der Chemical Process Co., Redwood City, California, V. St. A.), «Permutit Q» (hergestellt von der Permutit Co., Birmingham, New Jersey, V. St. A.), «Ionac C-249» (hergestellt von der Ionac Chemical Co., Birmingham, New Jersey, V. St. A.) und «Amberlite 200».

Weiter gereinigtes Thienamycin erhält man vorzugsweise durch Gelfiltration durch ein Polyacrylsäureamidgel mit einer Porengrösse, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 1800 ausschliesst. Ein bevorzugtes Gel ist «Bio-Gel P-2» (hergestellt von der Bio . Rad, Richmond, California, V. St. A.).

Das adsorbierte Antibioticum lässt sich von dem Katio-nenaustauschharz leicht mit wässrigen Lösungen von Ammoniak oder organischen Basen, wie Pyridin, Picolinen, Luti-dinen, Collidinen und Alkylaminen, eluieren. Das so erhaltene Eluat kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsmethoden weiter gereinigt werden. So kann man das Eluat reinigen, indem man es durch Polyester, wie «XAD-7» oder «XAD-8», oder durch Polystyrol oder hydrophobe, vernetzte Divinyl-benzolpolymerisate, wie «XAD-1», «XAD-2» und «XAD-4», vorzugsweise «XAD-2», leitet.

Ein bevorzugtes Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem Thienamycin besteht darin, dass man eine Lösung des Antibioticums, wie die filtrierte Fermentationsflüssigkeit, deren pH auf einen Wert zwischen 4 und 5 eingestellt worden ist, durch eine Kolonne leitet, die ein starkes Kationenaus-tauschharz vom Sulfonattyp in der Natriumform enthält («Dowex 50 x 2»). Das Adsorbat wird dann mit einem geeigneten Eluierungsmittel, wie 2-prozentigem wässrigem Pyridin, eluiert. Die Eluate werden in Fraktionen aufgefangen, deren Grösse sich nach der Grösse der Kolonne richtet. Die weitere Reinigung kann nach einer Verfahrensfolge vorgenommen werden, bei der die folgenden chromatographischen Medien angewandt werden: Anionenaustauschharze des Polystyrol-Trimethylammoniumtyps (z.B. «Dowex-1» in der Chloridform), Kationenaustauschharze vom Polystyrol-sulfonattyp (z.B. «Dowex-50» in der 2,6-Lutidiniumform), Gelfiltrationsharze (z.B. «Bio-Gel P-2», ein Polyacrylsäure-amidharz) und polymere Absorptionsmittel (z.B. «XAD-2», ein Polystyrolharz). Die Bioaktivität der Eluate wird durch Analysieren des Eluats unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538P als Analysenorganismus bestimmt.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern das erfindungsge-mässe Verfahren zur Herstellung der neuen Produkte. Die Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung und umfassen auch funktionell äquivalente Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung. Daher ist jede Abänderung der nachstehend beschriebenen Verfahren, die zur Bildung eines identischen Produkts führt, als eine analoge Methode aufzufassen. Die hier beschriebenen Verfahren können innerhalb weiter Grenzen abgeändert werden, und geringe Abweichungen oder Oberschreitungen der angegebenen Grenzen liegen im Bereich des Fachmanns und fallen in den Rahmen der Erfindung.

Analyse

Analysen der antibakteriellen Aktivität werden, falls nichts anderes angegeben ist, nach dem folgenden Scheibendiffusionsverfahren durchgeführt. Die Analysenplatten werden folgendermassen hergestellt: Eine Übernacht entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in einem Nährmedium, das 0,2% Hefeextrakt enthält, wird mit Nährmedium, das 0,2% Hefeextrakt enthält, zu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit für Licht von einer Wellenlänge von 660 m|x von 55 % verdünnt. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2,0 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt worden ist und sich auf 47 bis 48°C befindet, wobei man eine Masse erhält, die 33,2 ml Suspension je Liter Agar enthält. 5 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und die Schalen werden gekühlt und bis zur Verwendung (maximal 5 Tage) auf 4°C gehalten.

Proben des zu analysierenden Antibioticums werden mit Phosphatpuffer (pH 7) auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Filterpapierscheiben von 12,7 mm Durchmesser werden in die Prüflösung getaucht und auf die Oberfläche der

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Analysenplatte gelegt. Normalerweise werden für jede Probe zwei Scheiben auf die gleiche Platte einander gegenüber gelegt. Die Platten werden übernacht bei 37°C inkubiert und die Hemmungszonen dann in Millimeter Durchmesser gemessen. Die in Millimeter gemessene Hemmungszone bestimmt die relative Stärke oder, wenn sie mit einer gereinigten Bezugsnorm, wie Cephalothin, verglichen wird, die Stärke des Antibioticums in Einheiten/ml. Die in den Beispielen 4 bis 7 angegebene Aktivitätseinheit basiert auf genormten Ce-phalothinlösungen mit Konzentrationen von 8, 4, 2 bzw. 1 Y/ml. Eine Einheit ist als diejenige Menge definiert, die der Berechnung zufolge die gleiche Hemmung erzeugt wie 1 y Cephalothin/ml, wobei die Hemmungszone einen Durchmesser zwischen 16 und 21 mm hat.

Beispiel 1

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Reagenzglas in 0,7 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Davis-Salze

Natriumeitrat

0,5

g k2hpo4

7,0

g kh2po4

3,0

g

(NH4)2so4

1,0

g

MgS04. 7H20

0,1

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

0,2 ml dieser Suspension werden zum Beimpfen eines Kulturschrägröhrchens von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A

Hefeautolysat (Ardamine *)

10,0

g

Glucose

10,0

g

+Phosphatpuffer

2,0

ml

MgS04. 7H20

0,05

g

Destilliertes Wasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 6,5

eingestellt.

* Ardamine = Produkt der Yeast Products Corporation.

+ Phosphatpufferlösung

KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu — 25,0 g/1. *

Das beimpfte Schrägröhrchen wird 8 Tage bei 28°C inkubiert und dann bei 4°C gelagert.

Ein Teil der Sporen und des Luftmycels dieses Schräg-röhrchens wird zum Beimpfen eines 250 ml fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyer-Impfkolbens verwendet, der 50 ml Medium A (ohne Agar) enthält. Dieser Impfkolben wird 2 Tage bei 28°C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Fünfzehn 250 ml fassende Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Medium B enthalten, werden je Kolben mit 1 ml der aus dem Impfkolben erhaltenen Kultur beimpft. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B

Maismehl

20,0

g

Lösliche Schlempebestandteile

10,0

g

Sojabohnenmehl

15,0

g

Natriumeitrat

4,0

g

CaCl2. 2H20

0,5

g

MgS04. 7H20

0,1

g

CoCl2. 6H20

0,01

g

FeS04. 7H20

0,01

g

** «Polyglycol 2000»

0,25

Vol.-%

Destilliertes Wasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

** «Polyglycol 2000» ist ein Produkt der Dow Chemical Co.

Diese 15 Produktionskolben werden für Zeiträume bis zu drei Tagen bei 28°C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, wobei während des Gärungsvorganges Analysen durchgeführt werden. Die Analysen werden an der abzentrifugierten Fermentationsflüssigkeit vorgenommen.

Vor der Analyse wird der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, eingestellt:

Alter, Stunden 48 53 72

Aktivität gegen

ATCC 6538P, mm Zone 34/40 h 35/41 h 34

anfänglicher pH-Wert 6,3 5,9 5,0

eingestellter pH-Wert —. 6,8 6,2

h bedeutet trüb.

Nach 53 Stunden werden die Flüssigkeiten aus 13 Kolben zusammengegossen. Ein Teil wird abzentrifugiert und analysiert. Der Rest der Flüssigkeit wird filtriert, auf pH 7 eingestellt, und 500 ml werden zu 10,7 g Feststoffen gefriergetrocknet, 1,5 g dieser Feststoffe werden in 25 ml eines Gemisches aus 1 Teil n-Butylalkohol und 99 Teilen Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt. Diese Lösung wird durch eine 5 cm weite und 118 cm lange Kolonne von «Bio-Gel P-2» (Teilchengrössen 37-74 |x) gegossen, die zuvor mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird mit der gleichen Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt, wobei man einen Vorlauf von 650 ml und dann 75 Fraktionen zu je 20 ml auffängt. Der Ablauf

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wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Jede Fraktion wird auf ihre antibakterielle Aktivität analysiert. Thienamycin findet sich in den Fraktionen 34 bis 40 mit einem Maximum in der Fraktion 37. 10 ml der Fraktion 37 werden zu 2,0 mg Feststoffen gefriergetrocknet. Die Feststoffe werden für die Analyse in 5 ml Wasser aufgenommen. Analysenplatten werden über-nacht bei 28°C inkubiert. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Konzentration

Zonengrösse in mm; Staph. aureus ATCC 6538P

00

o y/ml

30

mm

40

Y/ml

25

mm

20

y/ml

21

mm

10

Y/ml

17

mm

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und dann bei 4°C gelagert.

Ein Teil der Sporen und des Luftmycels eines der Schrägröhrchen wird zum Beimpfen eines 250 ml fassenden, mit 5 Umlenkorganen versehenen Erlenmeyer-Impfkolbens verwendet, der 50 ml Medium A enthält. Dieser Impfkolben wird zwei Tage bei 28°C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

io Fünfzehn 250 ml fassende Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Medium B enthalten, werden je Kolben mit 1 ml der aus dem Impfkolben entnommenen Kultur beimpft. Das Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

15

Medium B

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Beispiel 2

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspen- 25 diert:

Davis-Salze

Natriumeitrat

0,5

g k2hpo4

7,0

g kh2po4

3,0

g

(NH4)2so4

1,0

g

MgSO,. 7H20

0,1

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

30

35

40

Maismehl

20,0

g

Lösliche Schlempebestandteile

© ©

g.

Soj abohnenmehl

15,0

g

Natriumeitrat

4,0

g

CaCl2. 2H20

0,5

g

MgS04. 7H20

0,1

S

CoC12 . 6H20

0,01

g

FeS04. 7H20

0,01

g

** «Polyglycol 2000»

0,25

Vol.-%

Destilliertes Wasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

: «Polyglycol 2000» ist ein Produkt der Dow Chemical Co.

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A

Diese Kolben werden für Zeiträume bis zu drei Tagen bei 28°C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, wobei während der Fermentation Analysen durchgeführt werden. Die Analysen werden nach dem Zentrifugieren der Fermentationsflüssigkeit an der 45 überstehenden Flüssigkeit durchgeführt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Hefeautolysat (Ardamine *)

10,0

g

Glucose

10,0

g

+ Phosphatpuffer

2,0

ml

MgS04. 7H20

0,05

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

50

55

Alter, Stunden

48

53

72

pH

6,7

6,4

5,5

Aktivität gegen

ATCC 6538P, mm

38

40

38

pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Ardamine = Produkt der Yeast Products Corporation. + Phosphatpufferlösung

KH„PO,

Na2HP04 Destilliertes Wasser

91,0 g 95,0 g 1000 ml

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu — 25,0 g/I.

Nach 53 Stunden werden die Flüssigkeiten aus 13 Kolben zusammengegossen und filtriert. Der pH-Wert von 400 ml «o des Filtrats wird mit verdünnter Salzsäure auf 4,8 eingestellt, worauf man das Material an 140 ml «Dowex 50 x 2» in der Natriumionenform mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min, adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 200 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit 2-prozentiger wässriger Pyridin-65 lösung eluiert, wobei man 6 Fraktionen zu je 70 ml auffängt. Der pH-Wert der Fraktionen wird auf 7,0 eingestellt.

Von allen Fraktionen werden Analysen durchgeführt; die Zonendurchmesser sind nachstehend angegeben:

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Filtrierte Fermentationsbrühe

Medium A

Verdünnung

Zonendurchmesser

Hefeautolysat («Ardamine *)

10,0 g

1 : 4

33 mm

5

Glucose

10,0 g

1:8

30 mm

+ Phosphatpuffer

2,0 ml

1 : 16

27 mm

MgS04. 7H20

0,05 g

1:32

24 mm

10

Destilliertes Wasser

1000 ml

Eluatfraktionen

pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Ardamine = Produkt der Yeast Products Corporation.

Verdünnung

Zonendurchmesser

15

+ Phosphatpufferiösung

1.

2.

3.

1:5 1 : 5 1 : 5

22,5 mm 36 mm 20 mm

20

KH2P04 Na2HP04 Destilliertes Wasser

91,0 g 95,0 g 1000 ml

4-,

5. u. 6. 1:5

0 mm

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu — 25,0 g/1.

Diese Analysen zeigen, dass 45 % der Aktivität sich in den Eluaten befinden. Die Eluatfraktion Nr. 2 liefert beim Gefriertrocknen 117 mg Feststoffe.

Die 117 mg Feststoffe werden in 1,5 ml eines Gemisches aus 1 Teil n-Butylalkohol und 99 Teilen Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine 1,4 cm weite und 81,5 cm lange Kolonne von «Bio-Gel P-2» gegossen, das zuvor mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/ min entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Refraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Fraktionen werden in einer Verdünnung von 1 : 20 auf ihre antibakterielle Aktivität analysiert. Von der Fraktion 44 bis zur Fraktion 53 wird ein Bioaktivitätsmaximum beobachtet. Die Fraktionen 46 bis 49 und die Hälfte der Fraktion 50 werden miteinander vereinigt. Aus den vereinigten Fraktionen wird 1 ml für die nochmalige Analyse abgenommen und der Rest gefriergetrocknet, wobei man 4,2 mg teilweise gereinigtes Antibioticum erhält.

Beispiel 3

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Davis-Salze

25 Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und bei 4°C gelagert. Ein Teil der Sporen und des Luftmycels eines der Schrägröhrchen wird zum Beimpfen von drei mit Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyer-Impfkolben verwendet, die je 50 ml Medium A 30 enthalten. Diese Impfkolben werden einen Tag bei 28°C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Zwölf Erlenmeyerkolben mit einem Inhalt von je 2000 ml, 35 die je 250 ml Medium C enthalten, werden mit je 7 ml der durch aseptisches Vereinigen des Inhalts der drei Impfkolben erhaltenen Suspension beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

40 '

Medium C

Natriumeitrat

0,5

g k2hpo4

7,0

g kh2po4

3,0

g

(NH4)2S04

1,0

g

MgS04. 7H20

0,1

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

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55

60

Maismehl 20,0 g

Lösliche Schlempebestandteile 10,0 g

Sojabohnenmehl 15,0 g

CaCl2. 2H20 0,5 g

MgS04 . 7H20 0,1 g

CoCl2. 6H20 0,01 g

FeS04 . 7H20 0,01 g

CaC03 4,0 g

«Polyglycol 2000» 0,25 Vol.-%

Destilliertes Wasser 10 000 ml pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Diese Kolben werden 72 Stunden bei 28°C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Die Fermentationsflüssigkeiten werden vereinigt, 65 und ein Anteil wird für die Analyse zentrifugiert. Die abgeernteten Fermentationsflüssigkeiten haben einen pH-Wert von 7,4, und die antibakterielle Analyse der nach dem Zen-trifugieren überstehenden Flüssigkeit ergibt 43 mm.

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Die Fermentationsflüssigkeit wird filtriert, der pH-Wert des Filtrats mit verdünnter Salzsäure auf 4,0 eingestellt, und 3000 ml werden an 300 ml «Dowex 50 x 2» in der Natrium-ionenform mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 300 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit 2-prozentiger Pyridinlösung erluiert, wobei man acht Fraktionen zu je 150 ml auffängt. Der pH-Wert der Fraktionen wird auf 7,0 eingestellt Die Eluatfrak-tionen Nr. 2 und Nr. 3 (300 ml) werden miteinander vereinigt und enthalten 48% des gesamten bioaktiven Materials, das in der Ionenaustauschersäule behandelt worden ist.

280 ml der vereinigten Fraktionen des Eluats der Ionenaustauschersäule werden bei einem pH-Wert von 7,0 durch eine 40 ml fassende Säule von «Dowex 1 x 2» in der Chlorionenform gegossen. Das Harz wird mit 160 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Der Ablauf und die Waschfraktionen werden vereinigt, wobei man 440 ml Lösung erhält. Diese Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt, unter vermindertem Druck auf 300 ml eingeengt, dann mit verdünnter Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt und zu 189 mg Feststoffen gefriergetrocknet.

Die 189 mg gefriergetrockneten Feststoffe werden in einem Gemisch aus 1 Teil n-Butylalkohol und 99 Teilen Wasser gelöst. Diese Lösung (25 ml) wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Kolonne von «Bio-Gel P-2» (Teilchen-grössen 37-74 |i) gegossen, die zuvor mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird dann mit dem Gemisch aus n-Butyl-alkohol und Wasser mit einer Geschwindigkeit von 6,7 ml/ min entwickelt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Meccomatic») überwacht. Nach einem Vorlauf von 500 ml werden Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Jede Fraktion wird in einer Verdünnung von 1 : 25 auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Die Bioaktivität wird in den Fraktionen 37 bis 42 beobachtet, wobei das Maximum in der Fraktion 39 auftritt. Die Fraktionen 38 bis 41, die ein Gesamtvolumen von 80 ml haben, werden vereinigt. Diese Lösung wird bei einem pH-Wert von 7,0 auf 10 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 13,5 mg gefriergetrocknete Feststoffe, deren relative Stärke ungefähr sechsmal höher ist als die Stärke der in die «Bio-Gel P-2»-Kolonne eingegebenen Probe, verglichen mit den mit Staphylococcus aureus durchgeführten Scheibendiffusionsanalysen.

Beispiel 4

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml steriler Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Davis Salze

Natriumeitrat

0,5

g k2hpo4

7,0

g kh2po4

3,0

g

(nh,),so,

1,0

g

MgSO,. 7h20

0,1

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A

Hefeautolysat (Ardamine *)

10,0

g

Glucose

10,0

g

+Phosphatpuffer

2,0

ml

MgSO,. 7HaO

0,05

g

Destilliertes Wasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

* Ardamine = Produkt der Yeast Products Corporation. + Phosphatpufferlösung KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu — 25,0 g/1.

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und dann bei 4°C gelagert

10 ml Medium A werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden abgeschabt und in Suspension gebracht, und 3,3 ml dieser Suspension werden zum Beimpfen eines 2 1 fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolbens verwendet, der 500 ml Medium A enthält. Dieser Impfkolben wird 48 Stunden bei 28°C in einer mit 160 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Die Kultur dieses Impfkolbens wird zum Beimpfen von 160 1 Medium A in einem 1901 fassenden Impfbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet Dieser Behälter wird 24 Stunden bei 28°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 85 1/min betrieben. Als Schaumverhütungsmittel wird nach Bedarf «Polyglycol 2000» (Dow Chemical Corporation) zugesetzt, aber nicht in Mengen von mehr als 0,1 %. Die pH-Bestimmungen ergeben die folgenden Werte:

Alter, Stunden

0

12

24

pH

6,4

6,4

6,3

43 1 der Kultur dieses Impfbehälters werden zum Beimpfen von 4671 Medium E in einem 756 1 fassenden Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

622825

Medium E

Cerelose

25,0

g

Maisquellwasser (auf nasser Basis)

15,0

g

Lösliche Schlempebestandteile

10,0

g

Baumwollsaatmedium (Pharmamedia)

5,0

g

CoCl2. 6H20

0,01

g

CaCOa (nach Einstellung des pH-Wertes)

3,0

g

«Polyglycol 2000»

0,25

%

Leitungswasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

In diesem Behälter wird die Fermentatoin 120 Stunden bei 24°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 95 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 283 1/min durchgeführt. Als Schaumverhütungsmittel wird nach Bedarf «Polyglycol 2000», aber nicht in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt. Die antibakteriellen Analysen ergeben die folgenden Werte:

Alter, h pH

Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P, mm

Dextrose, mg/ml

0

6,8

—

22

12

6,6

—

21,3

24

6,2

—

16,5

36

5,8

25

12,1

48

5,7

25

7,8

60

5,8

21,5

4,3

72

6,1

25

2,5

84

6,6

33

1,6

96

6,7

41,5

1,0

108

6,5

45

1,0

120

6,5

45

0,5

400 1 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit werden nach Zumischung eines Filterhilfsmittels in einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird mit 1,2 g Natrium-(äthylendinitrilo)--tetraacetat versetzt. Das Filtrat wird auf 6°C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,0 ± 0,2 eingestellt und auf 6°C gehalten. Das kalte Filtrat wird an 38 1 «Dowex 50 x 4» in der Natriumionenform (Teilchengrösse 0,3 bis 0,84 mm) mit einer Geschwindigkeit von 4 1/min adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 40 1 entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Adsorbat wird mit 2-prozentiger wässriger Pyridinlösung eluiert, wobei drei Fraktionen zu je 19 1 aufgefangen und analysiert werden. Die antibakterielle Analyse zeigt, dass die Eluatfraktionen Nr. 2 und Nr. 3 22% der Aktivität enthalten. Diese Fraktionen werden miteinander vereinigt, auf 3,8 1 eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.

Die so erhaltenen 3,8 1 Konzentrat werden an 2,5 1 «Dowex 1 x 2» (Teilchengrösse 0,15 bis 0,3 mm) in der Chloridform mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min adsorbiert. Das Harz wird mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser ausgewaschen. Es werden zehn Fraktionen zu je 1 1 aufgefangen, und jede Fraktion wird, falls 5 erforderlich, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Analysen ergeben, dass 75% der Bioaktivität sich in den Fraktionen 5 bis 8 befinden. Diese Fraktionen werden miteinander vereinigt und durch ein «Millipore»-FiIter mit Öffnungen von 0,45 {1 filtriert. 3 1 des Filtrats werden zu 16,6 g Fest-io Stoffen mit einer Stärke von 70 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

4 g dieser gefriergetrockneten Feststoffe werden in 50 ml einer 0,1-molaren 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung aufgenommen. Die Lösung wird bei einem pH-Wert von 6,3 durch eine 15 «Dowex 50 x 8»-Kolonne gegossen, die folgendermassen vorbereitet worden ist:

2,5 1 «Dowex 50 x 8» in der Wasserstoffionenform (Teil-chengrössen 37 bis 74 ji) werden in die 2,6-Lutidinform umgewandelt. Das Harz wird mit fünf Kolonnenvolumina von 20 0,1-molarem 2,6-Lutidinacetat-Puffer von einem pH-Wert von 6,3 ins Gleichgewicht gebracht. Die ins Gleichgewicht gebrachte Harzsäule hat einen Durchmesser von 5 cm und eine Länge von 114 cm. Die Säule wird mit 0,1-molarer Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min entwik-25 kelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird durchgeführt, bis 220 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Von den Fraktionen Nr. 44 bis 142 30 wird jede zweite Fraktion bei einer Verdünnung von 1: 50 analysiert. Die Bioaktivität wird in den Fraktionen 78 bis 136 bei einem Maximum in den Fraktionen 92 bis 94 festgestellt. Die Fraktionen 82 bis 116 werden ausgewählt und zu einer Lösung von 700 ml vereinigt. Diese Lösung wird in 35 zwei Anteile zu je 350 ml geteilt und gefriergetrocknet.

Ein Teil der gefriergetrockneten Feststoffe wird in 0,1-molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung von einem pH-Wert von 7,0 gelöst. Diese Lösung (27 ml) wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Kolonne von «Bio-Gel P-2» (Teil-chengrössen 37 bis 74 (i) gegossen, die zuvor mit der 0,1-molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

45 Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Alle Fraktionen von der Fraktion Nr. 51 bis zur Fraktion Nr. 90 werden in einer Verdünnung von 1 : 50 50 analysiert. Die Analyse zeigt, dass die Bioaktivität in den Fraktionen 67 bis 75 mit einem Maximum in den Fraktionen 70 und 71 konzentriert ist. Die Fraktionen 68 bis 75 werden zu 162 ml Flüssigkeit vereinigt. 145 ml dieser vereinigten Fraktion werden mit 3 ml einer 360-millimolaren Natrium-55 phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 versetzt, und die Lösung wird auf 9 ml eingeengt. Das Konzentrat, das 78% des gesamten, in die «Bio-Gel P-2»-Kolonne eingebrachten bioaktiven. Materials enthält, wird gefriergetrocknet, wobei man 185 mg erhält. Ein hinterbleibender Anteil von 17 ml der 60 Fraktionen 68 bis 75 wird zu 1,9 mg Feststoffen mit einer Stärke von 1050 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Beispiel 5

65 Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

622825

14

Davis-Salze

Natriumeitrat

0,5

g k2hpo4

7,0

g kh2po4

3,0

g

(NH4)2SOÌ

1,0

g

MgS04. 7H20

0,1

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

Medium A

Hefeautolysat (Ardamine *)

10,0

g

Glucose

10,0

g

+Phosphatpuffer

2,0

ml

MgS04. 7H„0

0,05

g

Destilliertes Wasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

35 1 der Kultur in diesem Impfbehälter werden zum Beimpfen von 467 1 Medium E in einem 756 1 fassenden Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Cerelose

Maisquellwasser (auf nasser Basis) Lösliche Schlempebestandteile Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) CoCI2. 6HaO CaC03 (nach Einstellung des pH-Wertes) «Polyglycol 2000»

20 Leitungswasser pH: wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

10

15

25,0 '

g

15,0

g

10,0

g

5,0

g

0,01

g

3,0

g

0,25

%

1000

ml

25

30

In diesem Behälter wird die Fermentation 120 Stunden bei 24°C, einer Rührgeschwindigkeit von 95 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 283 1/min durchgeführt. Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel «Polyglycol 2000», jedoch nicht in grösseren Mengen als 0,1 %, zugesetzt, Die antibakteriellen Analysen haben die folgenden Ergebnisse:

* Ardamine = Produkt der Yeast Products Corporation. + Phosphatpufferlösung KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu — 25,0 g/1.

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und dann bei 4°C gelagert.

10 ml Medium A werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden abgeschabt und in Suspension überführt, und 3,3 ml dieser Suspension werden zum Beimpfen von 500 ml Medium A in einem 21 fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben verwendet. Dieser Impfkolben wird 48 Stunden bei 28°C in einer mit 160 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt.

Die Kultur aus diesem Impfkolben wird zum Beimpfen von 160 1 Medium A in einem 190 1 fassenden Impfbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. In diesem Behälter wird die Fermentation 24 Stunden bei 28°C, einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 85 1/min durchgeführt. Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel «Polyglycol 2000» (Dow Chemical Corporation), jedoch nicht in grösseren Mengen als 0,1 %, zugesetzt. Die pH-Bestimmungen ergeben folgende Werte:

35

Alter, h

PH

Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P, mm

0

6,9

—

12

6,8

—

40

24

6,3

—

36

6,4

26

48

6,3

32

45

60

6,4

25

72

6,8

25

84

7,0

25

50

96

7,1

37

108

7,2

41,5

120

7,1

44,5

Alter, Stunden

0

12

24

PH

6,3

6,6

5,6

55

400 1 der gesamten Fermentationsflüssigkeit werden unter Beimischung eines Filterhilfsmittels in einer Menge von 4 Gewichtsteilen auf je 100 Raumteile durch eine Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird mit 1,2 g Natrium-(äthyIendinitrilo)-60 -tetraacetat versetzt. Das Filtrat wird auf 6°C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,0 ± 0,2 eingestellt und auf 6°C gehalten. Das gekühlte Filtrat wird an 38 1 «Dowex 50 x 4» in der Natriumionenform (Teilchengrösse 0,3 bis 0,84 mm) mit einer Geschwindigkeit von 4 1/min adsorbiert. Das Adsorbat 65 wird mit 2-prozentiger wässriger Pyridinlösung eluiert, wobei drei Fraktionen zu je 19 1 aufgefangen und analysiert werden. Die Analysen ergeben, dass 27 % der Bioaktivität des Ausgangsgutes in den Fraktionen 2 und 3 konzentriert worden

15

622825

sind. Die Eluatfraktionen 2 und 3 werden vereinigt, auf 3,7 1 eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.

Das Eluatkonzentrat von 3,7 1. wird auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und an 2,5 1 «Dowex 1 x 2» in der Chlorionenform (Teilchengrössen 0,15 bis 0,3 mm) mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min adsorbiert. Dann wird das Harz mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser eluiert.

Es werden zwei Fraktionen zu je 2 1, eine Fraktion zu 800 ml, eine Fraktion zu 4 1 und eine Fraktion zu 2 1 aufgefangen und nach Bedarf auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Fraktion Nr. 4 (4 1), die 50% der Aktivität des Konzentrats enthält, wird durch ein «Millipore» -Filter mit Öffnungen von 0,45 |i filtriert. Das klare Filtrat wird in Schalen gefriergetrocknet, wobei man 12,4 g Feststoffe mit einer Stärke von 270 Einheiten/mg erhält.

4 g der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,3 aufgenommen. Die Lösung (50 ml) wird nach Wiedereinstellung des pH-Wertes auf 6,3 mit Essigsäure durch eine 5 cm weite und 114 cm lange Kolonne von «Dowex 50 x 8» in der 2,6-Luti-dinform (Teilchengrössen 37-74 [i) gegossen, die zuvor mit der 0,1-molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Harz mit der gleichen 0,1-molaren Pufferlösung von einem pH-Wert von 6,3 mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird durchgeführt, bis 150 Fraktionen zu je 20 ml augefangen worden sind. Von der 72sten bis zur 150sten Fraktion wird jede zweite Fraktion in einer Verdünnung von 1 : 50 analysiert. Die Bioaktivität ist in den Fraktionen Nr. 76 bis 148 enthalten, wobei ein Maximum in den Fraktionen Nr. 92 bis 102 auftritt. Die Fraktionen Nr. 86 bis 113 werden zu 580 ml einer Lösung vereinigt, die 71 % der Bioaktivität des der Kolonne zugeführten Ausgangsgutes enthält. Diese Lösung wird dann gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1 -molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung (pH 7,0) zu 25 ml gelöst. Die Lösung wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Säule von «Bio-Gel P-2» (Teilchengrössen 37-74 (ji) gegossen, die zuvor mit der 0,1-molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 9 ml/min entwickelt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird fortgeführt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen 65 bis 80 wird in einer Verdünnung von 1 : 200 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen 67 bis 76. Die Fraktionen 70 bis 72 werden vereinigt und zu 16,0 mg Feststoffen mit einer Stärke von 13 800 Einheiten/mg gefriergetrocknet. Die Fraktionen 69, 73 und 74 werden vereinigt und zu 20,2 mg Feststoffen mit einer Stärke von 5200 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Die 16 mg gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer 2,6-Luditinacetat-Pufferlösung (pH 7,0) zu 10 ml gelöst. Die Lösung wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Säule von «Bio-Gel P-2» (Teilchengrössen 37-74 |i) gegossen, die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird mit der Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 9 ml/min entwickelt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen 65 bis 80 wird in einer Verdünnung von 1 : 200 analysiert.

Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen 67 bis 75. Die Fraktionen 68 bis 72 werden vereinigt und zu 9,1 mg Feststoffen mit einer Stärke von 15 000 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Beispiel 6

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 50 ml sterilem Medium A in einem 250 ml fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben suspendiert. Das Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

Medium A

Hefeautolysat (Ardamine *)

10,0

g

Glucose

10,0

g

Phosphatpuffer **

2,0

ml

MgS04. 7H20

0,05

g

Destilliertes Wasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Ardamine = Produkt der Yeast Products

Corporation.

** Phosphatpufferlösung

kh2po4

91,0

g

Na2HP04

95,0

g

Destilliertes Wasser

1000

ml

Der beimpfte Kolben wird 48 Stunden bei 28°C in einer 35 mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. 40 ml der 48-Stunden-Kultur werden aseptisch entnommen und mit 40 ml sterilem, 20-volumprozentigem Glycerin gemischt. Anteile von je 2 ml dieses Gemisches werden in sterile, 3,7 ml fassende Ampullen einpipettiert, die 40 dann gefroren und in der Dampfphase eines mit flüssigem Stickstoff arbeitenden Tiefkühlers gelagert werden.

Der gefrorene Ampulleninhalt wird zum Beimpfen von 50 ml Medium A in einem 250 ml fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben verwendet. Dieser 45 Impfkolben wird 24 Stunden bei 28°C in einer mit 160 U/min umlaufenden Schüttelmaschine geschüttelt.

Anteile zu je 10 ml aus diesem Impfkolben werden zum Beimpfen von 500 ml Medium A in 2 1 fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben verwendet. Die 5o Impfkolben werden 24 Stunden bei 28°C in einer mit 160 U/ min umlaufenden Schüttelmaschine geschüttelt.

1000 ml des vereinigten Inhalt dieser Kolben werden zum Beimpfen von 467 1 Medium A in einem 756 1 fassenden Fermentationsgefäss aus rostfreiem Stahl verwendet. In die-55 sem Gefäss wird die Fermentation 24 Stunden bei 28°C bei einer Rührgeschwindigkeit von 130 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 283 1/min durchgeführt. Nach Bedarf, jedoch nicht in grösseren Mengen als 0,1%, wird «Polyglycol 2000» (Dow Chemical Corporation) als Schaum-60 Verhütungsmittel zugesetzt. Die Messungen der pH-Werte und des Dextrosegehalts haben die folgenden Ergebnisse:

Alter, Stunden 0 12 24

6,4 6,4 6,6

8,1 8,1 8,1

65 Tr pH

Dextrose, mg/ml

20

25

622825

16

453 1 dieser Kultur werden zum Beimpfen von 4082 1 Medium E in einem 5670 ] fassenden Fermentationsgefäss aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Cerelose

25,0

g

Maisquellwasser (auf nasser Basis)

15,0

g

Lösliche Schlempebestandteile

10,0

g

Baumwollsaatmedium (Pharmamedia)

5,0

g

CoCl2 6H20

0,01

g

CaC03 (nach Einstellung des pH-Wertes)

3,0

g

«Polyglycol 2000»

0,25

%

Leitungswasser

1000

ml pH: wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

In diesem Behälter wird die Fermentation 144 Stunden bei 24°C, einer Rührgeschwindigkeit von 70 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 1537,5 1/min durchgeführt. Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel «Polyglycol 2000», jedoch nicht in grösseren Mengen als 0,1%, zugesetzt. Die Analysen werden nach dem Zentrifugieren der Fermentationsflüssigkeit an der überstehenden Flüssigkeit durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle unter der Überschrift «Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P» zusammengefasst. Die Analysen werden nach dem Scheibendiffusionsverfahren mit Filterpapierscheiben von 9,5 cm Durchmesser und 10 ml-Analysenplatten durchgeführt, und die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle unter der Überschrift «Antibiotische Aktivität (10 ml-Plat-ten)» angegeben. Die 10 ml-Analysenplatten werden folgen-dermassen vorbereitet: Eine übernacht entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC-6538P in einem 0,2% Hefextrakt enthaltenden Nährmedium wird mit 0,2 % Hefeextrakt enthaltendem Nährmedium zu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit für Licht mit einer Wellenlänge von 660 mp, von 40% verdünnt. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar von 47 bis 48°C zugesetzt, das mit 2,0 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt worden ist, wobei man einen Ansatz von 33,2 ml der Suspension je Liter Agar erhält. 10 ml dieser Suspension werden in Petriplatten mit einem Durchmesser von 85 mm gegossen, und die Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4°C gehalten.

Alter, h pH

Dextrose, mg/ml

Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P, mm

Antibiotische

Aktivität (10 ml-Platten), mm

0

6,6

22,2

12

6,3

20,2

24

5,8

18,0

0

36

6,0

13,2

21,5

48

6,0

8,6

21,5

60

5,7

6,4

26,5

72

5,8

2,7

25,5

84

6,2

0,3

27,5

96

6,4

0,2

36,0

108

6,4

0

35,0

120

6,3

41,5

37,0

132

5,8

37,5

144

5,9

43,0

37,5

Die 4082 1 Fermentationsflüssigkeit werden nach Zumischung eines Filterhilfsmittels in Mengen von 4 Gewichtsteilen auf je 100 Raumteile in einer 76 cm-Filterpresse filtriert. Zu dem Filtrat werden 12 g Natrium-(äthylendinitrilo)--tetraacetat zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6°C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 ± 0,2 eingestellt und auf 6°C gehalten. Das gekühlte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 48 1/min an 480 1 «Dowex 50 x 4» in der Natriumionenform (Teilchengrössen 0,3 bis 0,84 mm) adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 480 1 entmineralisiertem Wasser gewaschen und dann mit 2-prozentiger wässriger Pyridinlösung mit einer Geschwindigkeit von 241/min eluiert, wobei drei Fraktionen zu 300 1, 520 1 bzw. 240 1 aufgefangen und bei einem pH-Wert von 7,0 analysiert werden. Die Analyse ergibt, dass die Eluat-fraktionen 4%, 16% bzw. 6% der Bioaktivität des dem Ionenaustauscher zugeführten Ausgangsgutes enthalten. Die Eluatfraktion Nr. 2 wird auf 48 1 eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.

Die 48 1 Konzentrat werden auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und an 76 1 «Dowex 1 x 2» (Teilchengrössen 0,25 bis 0,3 mm) in der Chloridform mit einer Geschwindigkeit von 7,6 1/min adsorbiert. Das Harz wird mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden vier Fraktionen aufgefangen, zwei zu je 48 1, eine zu 70 1 und eine zu 48 1. Die Fraktionen werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Analysen .ergeben, dass 68% der Anfangsbioaktivität sich in der 70 1-Fraktion befinden. Diese Fraktion wird auf 18 1 eingeengt, auf pH 7,0 eingestellt und durch ein «Millipore»-Filter mit Öffnungen von 0,45 |x filtriert. Das Filtrat wird in Schalen gefriergetrocknet, wobei man 99 g Feststoffe mit einer Stärke von 310 Einheiten/mg erhält.

10 g der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung vom pH 6,3 aufgenommen. Die Lösung (125 ml) wird mit Essigsäure wieder auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und durch eine 7,6 cm weite und 142 cm lange Kolonne von «Dowex 50 x 8» in der 2,6-Lutidinform (Teilchengrössen 37 bis 74 [i) gegossen, das zuvor mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit 0,1-molarer Pufferlösung mit einer s

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Geschwindigkeit von 25 ml/min entwickelt. Nach einem Vorlauf von 3 1 werden 200 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Von den Fraktionen Nr. 36 bis 192 wird jede vierte Fraktion in einer Verdünnung von 1: 200 analysiert. Die Bioaktivität ist in den Fraktionen Nr. 56 bis 192 enthalten und erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr. 92 bis 96. Die Fraktionen Nr. 80 bis 136 werden vereinigt und ergeben nach Zusatz von 590 ml entmineralisiertem Wasser 1760 ml. Die vereinigte verdünnte Lösung, die 62% der dem Ionenaustauscher zugeführten anfänglichen Bioaktivität enthält, wird gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst. Die Lösung (27 ml) wird durch eine 5 cm weite und 112 cm lange Säule von «Bio-Gel P-2» (Teilchengrössen 37 bis 74 ji) gegossen, die vorher mit der 0,1-molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird dann mit der gleichen Puferlösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/'min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen Nr. 70 bis 93 wird in einer Verdünnung von 1 : 30 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 73 bis 82 und erreicht ihr Maximum in den Fraktionen Nr. 77 und 78. Die Fraktionen 75 bis 80 werden zu 90 mg Antibioticum mit einer mittleren Stärke von 10 000 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Die 90 mg gefriergetrockneten Feststoffe werden in 4 ml 0,01-molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7) aufgenommen. Diese Lösung, die 596 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält (diese Messung des Thienamycingehalts ist am Ende dieses Beispiels beschrieben), wird einer 1,7 cm weiten Kolonne zugeführt, die mit 90 ml vorgewaschenem «XAD-2» beschickt ist und vor der Verwendung mit 180 ml 0,01-molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung von 5°C und einem pH-Wert von 7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das XAD-2 wird vor der Verwendung nacheinander mit 1) 5 Raumteilen In Natronlauge und anschliessend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser, 2) 5 Raumteilen In Salzsäure und anschliessend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser, 3) je Raumteilen Methanol, Aceton, einer 0,001-molaren Lösung von Tetranatriumäthy-lendiamintetraacetat und schliesslich mit destilliertem Wasser gewaschen. Vor der Verwendung werden alle Lösungsmittel unter Vakuum gehalten.

Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne giesst man zweimal je 2 ml Phosphatpufferlösung nach. Die Kolonne wird bei 5°C mit der Pufferlösung bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Sammeln von 100 ml Eluat aufgefangenen und mit 253 ml endenden Fraktionen werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer im Vakuum bei Temperaturen unter 10°C auf 6 ml eingeengt.

Diese Lösung, die 436 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird in eine 1,7 cm weite Kolonne eingegeben, die mit 90 ml «XAD-2» beschickt ist, welches, wie oben beschrieben, vorgewaschen und bei 5°C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Im Anschluss an die Probe werden zwei Anteile destilliertes Wasser zu je 2 ml in die Kolonne eingegossen. Die Kolonne wird mit destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Auffangen von 100 ml Eluat erhaltenen und mit 151 ml endenden Fraktionen werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf 2,73 ml eingeengt; durch Gefriertrocknen der Lösung erhält man 6,49 mg Thienamycin. Die zwischen 152 und 345 ml erhaltenen Fraktionen werden miteinander vereinigt, in einem rotierenden Verdampfer auf 3,34 ml eingeengt und zu 11,53 mg Antibioticum gefriergetrocknet. Diese Fraktionen enthalten insgesamt 369 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten. Dies entspricht einer 3, lfachen Reinigung im Vergleich zu dem der ersten «XAD-2»-Kolonne zugeführten Material und ergibt eine berechnete Stärke von 31 000 Einheiten je mg. Die spektrophotometrische Analyse einer Probe dieses Produkts zeigt E = 253, bestimmt in einer Phosphatpufferlösung vom pH 7 bei 297 nm.

Durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion

Der Anteil der bei 297 bestimmten Extinktion, die auf den Gehalt unreiner Proben an Antibioticum zurückgeführt werden kann, wird durch die selektive Auslöschung dieser Extinktion (mit gleichzeitiger Inaktivierung der antibiotischen Aktivität) durch Umsetzung mit verdünntem Hydroxylamin bestimmt.

Proben werden in 0,01-molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) so hergestellt, dass sie eine anfängliche Extinktion A2!i7 zwischen 0,05 und 2,0 aufweisen. Frisch hergestelltes, neutrales Hydroxylamin (NH2OH . HCl + NaOH bis zu einem End-pH-wert von 7) wird bis zu einer Endkonzentration. von 10 mMol/1 zugesetzt, worauf man die Umsetzung mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur fortschreiten lässt. Wenn man die dann bestimmte Extinktion A297 von der anfänglichen Extinktion (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagens) subtrahiert, erhält man die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion. Lösungen von reinem Thienamycin zeigen eine durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion von 94,5%.

Beispiel 7

10 g der 99 g gefriergetrockneter Feststoffe, die durch Reinigung an «Dowex 1 x 2» gemäss Beispiel 6 erhalten worden sind, werden in 0,1-molarer 2,6-Lutidinacetat-Puffer-lösung vom pH 6,3 aufgenommen. Diese Lösung (125 ml)

wird nach Wiedereinstellung des pH-Wertes mit Essigsäure auf 6,3 in eine 7,6 cm weite und 142 cm lange Kolonne von «Dowex 50 x 8» in der 2,6-Lutidinform eingegeben, die zuvor mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit 0,1-molarem Puffer mit einer Geschwindigkeit von 35 ml/min entwickelt. Nach einem Vorlauf von 3,6 1 werden 200 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Von den Fraktionen Nr. 6 bis 194 wird jede vierte Fraktion in einer Verdünnung von 1 : 200 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 18 bis 178 und erreicht ihr Maximum in den Fraktionen Nr. 62 bis 82. Die Fraktionen Nr. 42 bis 102 werden vereinigt und ergeben nach Zusatz von 640 ml entmineralisiertem Wasser 1920 ml. Die vereinigte verdünnte Lösung enthält 63% der Bioaktivität des der «Dowex 50 x 8»-Kolonne zugeführten Materials und wird gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst. Diese Lösung (25 ml) wird durch eine 5 cm weite und 112 cm lange Kolonne von «Bio-Gel P-2» (Teilchengrössen 37-74 (j.) gegossen, die zuvor mit der 0,1-molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird dann mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer («Mecco-matic») überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 125 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen Nr. 70 bis 89 wird in einer Verdünnung von 1 : 300 analysiert. Die Bioaktivität

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findet sich in den Fraktionen Nr. 72 bis 81 und erreicht ihr Maximum in der Fraktion Nr. 77. Die Fraktionen Nr. 75 bis 79 werden zu 100,5 mg Antibioticum mit einer Stärke von 8320 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Die 100,5 mg gefriergetrocknete Feststoffe werden in

4 ml 0,01-molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7) aufgenommen. Diese Lösung, die 692 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Einheiten enthält, wird in eine 1,7 cm weite Kolonne gegossen, die mit 90 ml vorgewaschenem «XAD-2» beschickt und vor der Verwendung mit 180 ml 0,01-molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung von 5°C und einem pH-Wert von 7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Vor der Verwendung ist das «XAD-2» nacheinander mit 1)

5 Raumteilen In Natronlauge und anschliessend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser,

2) 5 Raumteilen In Salzsäure und anschliessend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser,

3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, 0,001-molarer Lösung von Tetranatriumäthylendiamintetraacetat und schliesslich mit destilliertem Wasser gewaschen worden. Alle Lösungsmittel werden vor der Verwendung unter Vakuum gehalten.

Nach der Probe werden in die Kolonne zwei Anteile Phosphatpufferlösung zu je 2 ml eingegeben. Die Kolonne wird bei 5°C- mit der Pufferlösung bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Es werden Eluat-fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Auffangen von 109 ml Eluat erhaltenen und mit dem 309ten ml endenden Fraktionen werden miteinander vereinigt. Zu diesem vereinigten Eluat setzt man 11,53 mg des nach Beispiel 6 an dem «XAD-2» gereinigten Antibioticums zu, das 186 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten aufweist. Das vereinigte Eluat wird zusammen mit dem zugesetzten Antibioticum im Vakuum in einem rotierenden Verdampfer bei Temperaturen unter 10°C auf 7 ml eingeengt.

Diese Lösung, die 720 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird in eine 1,7 cm weite Kolonne eingegeben, die mit 90 ml «XAD-2» beschickt ist, welches, wie oben beschrieben, vorgewaschen und vor der Verwendung bei 5°C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach der Probe werden zweimal je 2 ml destilliertes Wasser in die Kolonne eingeführt. Die Kolonne wird mit destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Auffangen von 109 ml Eluat erhaltenen und mit dem 301sten ml endenden Fraktionen werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf 10,3 ml eingeengt. Diese Lösung, die 589 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird zu 23,6 mg Antibioticum gefriergetrocknet, dessen berechnete Stärke 30 140 Einheiten/mg beträgt.

Das so erhaltene Antibioticum ist ein weisser, amorpher, fester Stoff von faserartiger Konsistenz, von dem eine Probe 5 in einer Glaskapillare bei Temperaturerhöhung um 3°C/min ohne Auftreten einer flüssigen Phase Zersetzung erleidet: Die Substanz erweicht bei 130 bis 140°C unter Volumenverminderung des festen Stoffes, die bis 170-174°C anhält; in dem letztgenannten Temperaturbereich färbt sich die Sub-10 stanz gelb; Sintern und fortschreitende Intensivierung der Farbe bis rotbraun wird im Temperaturbereich von 180 bis 200°C beobachtet, und schliesslich findet man bei 205°C Verkokung und restliche Spuren von festem Stoff.

15 Eine weitere Probe dieses Materials zeigt bei der spektro-photometrischen Analyse ein Extinktionsmaximum bei 296,5 nm mit E }^m = 268,2. Die Elementaranalyse hat die folgenden Ergebnisse: 1) Gewichtsverlust bei 4-stündigem Trocknen im Vakuum 5,67%; 2) Zusammensetzung: 47,68% Kohlen-20 Stoff, 6,22% Wasserstoff, 11,48% Stickstoff. Diese Ergebnisse stimmen mit der empirischen Formel CuH^AS • (NH3)0j28 überein, die die folgende berechnete Elementarzusammensetzung hat: C = 47,68%; H = 6,13%; N = 11,52%; S = 11,57% undO = 23,1%. Die polarimetrische 25 Analyse einer Lösung von 1 mg dieser Probe je ml 10-millimolarer Kaliumphosphat-Pufferlösung zeigt eine spezifische optische Rotation [a]D2T° = +80°. Das Infrarotspektrum (Fig. 1) einer Suspension dieser Probe in Nujol zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 1765 cm-1,1650-1550 cm-1, 30 2800-2500 cm-1 und 3500-3100 cm-1. Ein bei 100 MHz aufgenommenes kernmagnetisches Resonanzspektrum einer Probe dieser Produkts in Lösung in D20 zeigt ein Dublett bei 8 1,275, ein Paar von Dubletten bei 5 3,39 und Multiplette bei S 3,15 und 5 4,20; diese Maxima sind charakteristisch für 35 Thienamycin.

Mittel, die das Antibioticum enthalten, können in verschiedenen Dosisformen, z.B. in fester oder flüssiger Form, oral dargereicht werden. Gleich ob die Mittel flüssig oder fest sind, können sie je Einheitsdosis 0,1 bis 99% Wirkstoff ent-40 halten; der bevorzugte Bereich beträgt etwa 10 bis 60%. Im allgemeinen enthalten die Mittel etwa 25 bis 1000 mg Wirkstoff, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels; im allgemeinen ist es jedoch zu bevorzugen, eine Dosismenge im Bereich von etwa 250 bis 1000 mg anzuwenden. Die Einheits-45 dosis für die parenterale Darreichung ist gewöhnlich die reine Verbindung in einer etwas angesäuerten, sterilen wässrigen Lösung oder in Form eines für das Auflösen bestimmten löslichen Pulvers.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

622825 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Thienamycin, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomy-ces cattleya in einem wässrigen Nährmedium, welches assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, in aerober Submerskultur züchtet und das so erhaltene Antibioticum gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Streptomyces cattleya NRRL 8057 züchtet.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften des Penicillins hat auf diesem Gebiet ein grosses Interesse hervorgerufen, das zur Auffindung vieler anderer wertvoller Antibiotica, wie anderer Penicilline, Strepto-mycin, Bacitracin, Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine und dergleichen, geführt hat. Im allgemeinen erstreckt sich die antibakterielle Aktivität aller dieser Antibiotica nicht auf gewisse klinisch wichtige pathogene Bakterien. Einige Antibiotica sind z.B. in erster Linie nur gegen grampositive Bakterien wirksam. Ferner hat die im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung der bisher bekannten Antibiotica für die Behandlung von bakteriellen Infektionen erworbene Resistenz zu einem ernsthaften Resistenzproblem geführt.

Die Mängel der bekannten Antibiotica haben weitere Forschungen angeregt, um andere Antibiotica aufzufinden, die gegen einen weiteren Bereich von Krankheitserregern sowie auch gegen resistente Stämme von besonderen Mikroorganismen aktiv sind.