PL96314B1 - Sposob wytwarzania antybiotyku tienamycyny - Google Patents

Sposob wytwarzania antybiotyku tienamycyny Download PDF

Info

Publication number
PL96314B1
PL96314B1 PL1975184950A PL18495075A PL96314B1 PL 96314 B1 PL96314 B1 PL 96314B1 PL 1975184950 A PL1975184950 A PL 1975184950A PL 18495075 A PL18495075 A PL 18495075A PL 96314 B1 PL96314 B1 PL 96314B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fractions
solution
antibiotic
liters
thienamycin
Prior art date
Application number
PL1975184950A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of PL96314B1 publication Critical patent/PL96314B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
    • C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
    • C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
    • C07D477/20—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C12P17/184—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing a beta-lactam ring, e.g. thienamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia antybiotyku tienamycyny.Odkrycie wyraznych wlasciwosci przeciwbakte- ryjnych penicyliny spowodowalo wielkie zainte¬ resowanie w tym zakresie, którego efektem jest znalezienie wielu wartosciowych antybiotyków, jak inne penicyliny, streptomycyna, baeytracyna, tet¬ racykliny, chloramfenikol, erytromycyny itp. W o- gólnosci, praeciwbakteryjne dzialanie kazdego z tych antybiotyków nie obejmuje niektórych, waz¬ nych w medycynie bakterii chorobotwórczych. Nie¬ które z nich wykazuja na przyklad aktywnosc przeciw bakteriom jedynie Gram-dodatnich. Odpor¬ nosc nabywana podczas szerokiego zastosowania istniejacych antybiotyków do leczenia bakteryj¬ nych infekcji stwarza powazny problem.Wady tych znanych antybiotyków wplynely za¬ tem na rozszerzenie badan prowadzonych w kie¬ runku znalezienia innych antybiotyków, aktyw¬ nych w stosunku do szerokiego wachlarza choro¬ botwórczych bakterii, jak równiez odpornych szcze¬ pów poszczególnych mikroorganizmów.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego i uzytecznego antybiotyku tienamycy¬ ny, odznaczajacego sie duza skutecznoscia w za¬ kresie hamowania rozwoju róznych Gram-ujem- nych i Gram-dodatnich mikroorganizmów, na dro¬ dze fermentacji nie opisanego dotychczas mikro¬ organizmu w odzywczym srodowisku.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze 2 poddaje sie hodowli mikroorganizm Streptomyces cattleya NRRL-8057 w wodnym srodowisku odzyw¬ czym, zawierajacym przyswajalne zródla weglo¬ wodanów, azotu i sole nieorganiczne, w aerobo- wych warunkach podpowierzchniowych, po czym wyodrebnia sie wytworzony antybiotyk.W oparciu o rozlegle badania taksonometryczne, wyizolowany z próbki gleby mikroorganizm Strep¬ tomyces cattleya zidentyfikowano jako nie opisa¬ ny dotychczas grzyb promieniowiec i oznaczono symbolem MA-4297 w zbiorze hodowli Merck and Co., Inc., Rahway, N.J. Jego hodowle zdeponowano w kolekcji Northern Regional Research Laborato¬ ries, Northern Utilization Research and Develop- ment Division, Agricultural Research Service, U.S.Departament of Agriculture, Peoria, III, gdzie zo¬ stala ona oznaczona nr NRRL 8057.W celu znalezienia gatunków Streptomyces o charakterystyce morfologicznej i hodowlanej, po¬ dobnej do MA-4297, przeszukano podstawowe kla¬ syfikacje rodzaju Streptomyces i opisy hodowli ga¬ tunków Streptomyces w Bergey's Manual of De- terminative Bacteriology /wydanie 7 1957/ i The Actinomycetes, tom II /1961/, wydany przez S. A.Waksman'a i „Cooperative Descriptions of Type Cultures of Streptomyces", wydane przez E. B.Shirling'a i D. Gottlieb'a, International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 69—189 /1968/, 18, 279—392 /1968/, 19, 391—512 /1969/ i 22, 265—394 /1972/. W przytoczonej klasycznej literaturze nie 96 3143 J opisano gatunków Streptomyces, o zabarwieniu po¬ wietrznej grzybni w kolorze storczyka i wykazu¬ jacych charakterystyke morfologiczna, która lacz¬ nie z brakiem dyfumdujacego pigmentu, stanowi charakterystyczne cechy mikroorganizmu MA-4297.Na po4stawie tych rozwazan uzasadnione i ko¬ nieczne jest uznanie wymienionego mikroorganiz¬ mu za nowy gatunek Streptomyces.Morfologiczne i hodowlane wlasciwosci Strepto¬ myces cattleya podano w ponizszym zestawieniu.Wlasciwosci morfologiczne. Torebki zarodnikowe tworza zwarte spirale, wystepujace jako boczne i koncowe rozgalezienia powietrznej grzybni. Za¬ rodniki maja ksztalt elipsoidalny do cylindryczne¬ go o wymiarze 0,9X1,2 mikrona i wystepuje ich powyzej 10 w lancuchach.Hodowla Agar, pasta pomidorowa i maczka owsiana Wzrost wegetatywny — zabarwienie, spód ruda- wo-brazowy, plaski, rozszerzajacy sie; Powietrzna grzybnia :— zabarwienie storczyko- wate /10 gc/ zmieszane z bialym; Rozpuszczalny pigment — brak Agar Czapka Dox /agar z azotanem sacharozy/ Wzrost wegetatywny — bezbarwny, plaski, roz¬ szerzajacy sie; Grzybnia powietrzna — rozrzucona, rózowawo- -biala; Rozpuszczalny pigment — brak Agar, albumina jajka Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo-bra- zowe z nalotem szarawo-storczykowym, plaski, roz¬ szerzajacy sie; Grzybnia powietrzna — zabarwienie storczyko- wate /10 gc/ zmieszane z jasnostorczykowanym i nieco bialego Rozpuszczalny pigment — brak Agar glicerynowo-asparaginowy Wzrost wegetatywny — zabarwienie spodu ru- dawo-brazowe z nalotem szarawo-rózowawym, plaski, rozszerzajacy sie; Grzybnia powietrzna — zabarwienie storczyko- wate /10 gc/ zmieszany z bialawym; Rozpuszczalny pigment — brak Agar z ekstraktem drozdzowym z glikoza i sola¬ mi Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo-bra¬ zowe z nalotem szarawo-rózowym; Grzybnia powietrzna — zabarwienie storczyko- wate /10 gc/ zmieszane z rózowawo^bialym; Rozpuszczalny pigment — brak Agar z ekstraktem drozdzowym i z ekstraktem slodowym Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo-bra- zowe; Grzybnia powietrzna — zabarwienie storczyko- wate /10 gc/ zmieszany z rózowawo-bialym; Rozpuszczalny pigment — brak Agar z ekstraktem drozdzowym, peptonem i ze¬ lazem Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo-bra- zowe; Grzybnia powietrzna — brak 314 4 Rozpuszczalny pigment — lekkie zabarwienie srodowiska na brazowo; Reakcja melaninowa — ujemna; Wytwarzanie H2S — brak Agar odzywczy Wzrost wegetatywny — zabarwienie jasno ru- dawo^brazowe Grzybnia powietrzna — brak Rozpuszczalny pigment — brak Agar odzywczy ze skrobia Wzrost wegetatywny — zabarwienie smietanko¬ we do rudawo-brazowego Grzybnia powietrzna — brak Rozpuszczalny pigment — brak Hydroliza skrobi — umiarkowana Agar odzywczy z zelatyna Wzrost wegetatywny — zabarwienie smietanko¬ we; Grzybnia powietrzna — brak Rozpuszczalny pigment — brak Uplynnianie zelatyny — umiarkowane Naklucia na zelatynie , Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo- -brazowe; Grzybnia powietrzna — brak Rozpuszczalny pigment — brak Uplynnianie zelatyny — umiarkowane Skrawki ziemniaczane Wzrost wegetatywny — umiarkowany, zabarwie- nie rudawo-brazowe; Grzybnia powietrzna — rzadka, szarawo-rózowa- wo-biala; Rozpuszczalny pigment — brak Surowica krwi Leoffier'a Wzrost wegetatywny — zabarwienie smietanko¬ we; Grzybnia powietrzna — brak Rozpuszczalny pigment — brak Uplynni anie — brak 40 Agar ze zbieranym mlekiem Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo-bra- zowe; Grzybnia powietrzna — rzadka, bialawa; Rozpuszczalny pigment — lekkie zabarwienie srodowiska na brazowo ¦ . ¦ Hydroliza kazeiny — dodatnia Mleko lakmusowe Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo- s -brazowe do brazowego; Grzybnia powietrzna — brak Barwa — brak rozpuszczalnego pigmentu, papie¬ rek lakmusowy zabarwia sie na niebiesko; Koagulacja i/lub peptonizacja — czesciowa pep- M tonizacja, staje sie alkaliczny.Mleko zbierane Wzrost wegetatywny — zabarwienie' rudawo- -brazowe; Grzybnia powietrzna — brak m Rozpuszczalny pigment — brak Koagulacja i/lub peptonizacja — czesciowa pep¬ tonizacja, staje sie alkaliczny.Agar tyrozyna Wzrost wegetatywny — zabarwienie rudawo- 65 -brazowe96 3*4 /Grzybnia powietrzna — zabarwienie mieszane storczykowate /10 gc/ i biale; . Rozpuszczalny pigment — brak Rozklad tyrozyny — dodatni.Jesli nie zaznaczono inaczej, wszystkie przedsta- woine powyzej charakterystyki zbierano po okre¬ sie 3-tygodniowej inkubacji w temperaturze 28°C.Wszystkie te badania prowadzono przy odczynie mniej wiecej obojetnym, a mianowicie przy pH= =MJ,8—7,2. Stosowane przy opisie oznaczenia barw zgodne sa z definicjami podanymi w Color Har- mony Manual, 4 wydanie /1958/, Container Cor¬ poration of America, Chicago, Illinois.Streptomyces cattleya badano równiez na ich zdolnosc do wykorzystywania lub asymilacji róz¬ nych weglowodanów. W tym celu mikroorganizm hodowano w ciagu 3 tygodni w temperaturze 28°C na podstawowej pozywce syntetycznej /Pridham i Gottlieb/, zawierajacej l*/i weglowodanu. Odczyn stosowanej w badaniach pozywki jest w przyblize¬ niu obojetny, to jest pH=6,8—7,2. Ponizej wska¬ zano wykorzystanie tych surowców weglowodano¬ wych przez Streptomyces cattleya: + wskazuje dobry rozwój, ± wskazuje slaby .rozwój i — wska¬ zuje brak rozwoju na danym weglowodanie. gllkoza + arabinoza — celuloza — fruktoza ± inozyt — laktoza — ksyloza ± maltoza ± mannit + mannoza ± rafinoza — ramnoza — sacharoza ± Ilosciowo rozwój zalezy od temperatury, zapo¬ trzebowania na tlen i wplywu mikroorganizmu na azotan. Wlasciwosci te przedstawiaja sie naster pujaco: Zakres temperatury /agar ^ ekstraktem drozdzo¬ wym i glikoza i z solami/; 28°C — dobry, 37°C — umiarkowany, 50°C — brak rozwoju.Zapotrzebowanie na tlen /nakluwane kultury na agarze z ekstraktem drozdzowym i glikoza i z so¬ lami/ — aerobowa.Redukcja azotanu — dodatnia.Nowy antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku, to jest tienamycyne, wytwarza sie pod¬ czas aerobowej fermentacji w odpowiednim wod¬ nym srodowisku odzywczym w kontrolowanych warunkach za pomoca zaszczepienia organizmem Streptomyces cattleya.Do wytwarzania tienamycyny nadaja sie srodo¬ wiska odzywcze, stosowane do produkcji innych antybiotyków. Srodowiska takie zawieraja substan¬ cje, stanowiace zródla wegla, azotu i nieorganicz¬ ne sole przyswajalne przez mikroorganizm.Jako przyswajalne zródla wegla w pozywce sto¬ suje sie pojedynczo lub lacznie weglowodany, ta¬ kie jak cukry na przyklad glikoze, fruktoze, mal¬ toze, sacharoze, ksyloze, mannit itp. oraz skrobie, takie jak zboza npf owies, ryz, skrobia kukury¬ dziana, maczka kukurydziana itp. Dokladna ilosc substancji dostarczajacej lub dostarczajacych we¬ glowodanu w pozywce zalezy czesciowo od innych skladników pozywki, lecz zazwyczaj weglowodan stosuje sie w ilosci okolo 1—jf°/o wagowych w od¬ niesieniu do ilosci srodowiska^ Takie zródla wegla mozna stosowac samodzifelnie lub po kilka razem.Jako zródla azotu w procesie fermentacyjnym mozna stosowac liczne substancje bialkowe, takie jak mp. hydrolizaty drozdzowe, pierwotne drozdze, maczka sojowa, maczka z nasion bawelny, hydro- io lizaty kazeiny, namok kukurydziany, rozpuszczal¬ ne pozostalosci podestylacyjne lub pasta pomidoro¬ wa itp. Zródla azotu .pojedynczo lub w mieszani¬ nie, stosuje sie w ilosci okolo 0,2—6tyo wagowych w odniesieniu do ilosci wodnego srodowiska.Jako odzywcze sole nieorganiczne w pozywce mozna stosowac typowe sole, uwalniajace jon so¬ dowy, potasowy, amonowy, wapniowy, fosforanowy, siarczanowy, chlorkowy, weglanowy itp. W slado¬ wych ilosciach wprowadza sie równiez takie me- tale, jak kobalt, mangan, zelazo i magnez.Nalezy zwrócic uwage, ze opisane w przykladach srodowiska maja charakter ilustracyjny, a nie ograniczajacy.Fermentacje przeprowadza sie w temperaturach od okolo 20 do 37QC, lecz optymalne wyniki osia¬ ga sie prowadzac fermentacje w temperaturach . okolo 22 do 30°C pH pozywki nadajacej sie do roz¬ woju hodowli Streptomyces cattleya i wytwarza¬ nia tienamycyny moze zmieniac sie w granicach jo okolo 6,0—8,0.Nowy antybiotyk, tienamycyne mozna wytwa¬ rzac zarówno w hodowlach powierzchniowych, jak i podpowierzchniowych, korzystniejsze jest pro¬ wadzenie fermentacji w warunkach podipowierzch- niowych. • Fermentacje antybiotyku w malej skali przepro¬ wadza sie korzystnie przez zaszczepienie odpo¬ wiedniego srodowiska kultura, wytwarzajaca anty¬ biotyk hodowla, przeniesienie go do srodowiska 40 produkcyjnego i prowadzenie fermentacji w sta¬ lej temperaturze okolo 24°C w ciagu kilku dni na wytrzasarce.Fermentacje rozpoczyna sie w sterylizowanej kolbie na .pozywce i przeprowadza siej przez jedno 45 lub wiecej stadiów wysiewania. Jako pozywke w stadium wysiewania mozna stosowac dowolne zró¬ dla wegla i azotu. Po wysianiu kolbe wytrzasa sie w ciagu kilku dni w temperaturze otoczenia do temperatury okolo 28°C az do uzyskania zadowa- so lajacego wzrostu i czesc uzyskanego wyrosnietego mikroorganizmu stosuje sie do zaszczepienia albo drugiego stadium wysiewania, albo srodowiska pro¬ dukcyjnego. Posrednie stadia wysiania /jesli sie stosuje/ hoduje sie zasadniczo takim samym spo- 55 sobem, to znaczy czesc zawartosci kolby* z ostat¬ niego stadium wysiania stosuje sie do zaszczepie¬ nia srodowiska produkcyjnego. Kolby z zaszcze¬ piona pozywka wytrzasa sie w stalej temperaturze w ciagu kilku dni i po zakonczeniu okresu inku- 60 bacji skladniki kolby odwirowuje sie lub odsa¬ cza.W skali przemyslowej fermentacje przeprowa¬ dza sie w odpowiednich zbiornikach, zaopatrzonych w mieszadla i urzadzenia do napowietrzania po- 65 zywki fermentacyjnej. Zgodnie' z tym sposobem,96 314 7 pozywke przygotowuje sie w fermentorze i stery¬ lizuje sie przez ogrzewanie w temperaturach do o- kolo 120°C. ^Po oziebieniu sterylizowana pozywke szczepi sie uprzednio rozwinieta hodowla produk¬ cyjna i fermentacje, przeprowadza sie w ciagu na przyklad 3—5 dni, mieszajac i/lub napowietrzajac .pozywke i utrzymujac temperature okolo 24°C.Ten sposób wytwarzania iienamycyny szczególnie nadaje sie do wytwarzania antybiotyku w duzych ilosciach.Fizyczne i chemiczne wlasciwosci tienamycy¬ Tienamycyna jest bialym cialem stalym bardzo dobrze rozpuszczalnym w wodzie i slabo rozpusz¬ czalnym w metanolu. Pozorny ciezar czasteczkowy w roztworach buforu fosforanowego wynosi oko¬ lo 282 Daltonów. Ciezar ten okreslono przez ultra- odwirowanie analitycznej próbki, stosujac metode sedymentacji w krótkiej kolumnie i urzadzenia do rejestracji absorpcji w ultrafiolecie w celu ozna¬ czenia granicznej sedymentacji substancji absorbu¬ jacej przy 300 mm. Ciezar czasteczkowy okreslony metoda spektrometrii masowej z zastosowaniem desorpcji pola wynosi 272. Na podstawie analizy dyspersyjnej energii promieniowania X, emitowa¬ nego przez antybiotyk pod wplywem wiazki z prze- miatajacego mikroskopu elektronowego, oblicza sie kombinowany ciezar czasteczkowy w przeliczeniu na siarke. Wynosi on 290 6l 20, co oznacza, ze w .znacznych ilosciach wystepuje pojedynczy pierwia¬ stek o liczbie atomowej powyzej 9.Metodami wysokorozdzielczej spektrometrii ma¬ sowej okreslono empiryczny wzór tienamycyny CnH16N204S. Sklad elementarny, odpowiadajacy temu doswiadczalnemu wzorowi sumarycznemu, wynosi: 43,52% C; 5,92% H; 10,29% N; 23,5% O i 11,77% S.W widmie tienamycyny w podczerwieni /Fig./ /próbka w nujolu/ wystepuja nastepujace piki ab¬ sorpcyjne: ostry pik przy 1765 cm-1, szerokie piki przy 1650—1550, 2800—2500 i 3500—3100 cm-'1. Inne pasma wystepuja przy: 1290, 1245, 1150—1130, 1065, 395, 970, 945—935, 885, 805, 785 i 720 cm"1.W widmie NMR /l00 MHz/ tienamycyny liofili¬ zowanej z D20 i badanej przy stezeniu roztworu 1,5 mg/0,4 ml D20, zawierajacego sladowe ilosci 2,2-dwumetylo-2-silanopentano-5-suifonianu sodo¬ wego jako wzorca wewnetrznego, wystepuja na¬ stepujace piki: 8 1,275, d, 3H, J=6,8; 8 3,15, m, 6H; 8 3,39, d, d, 1H, J=6,0, 2,9; 8 4,20, m, 2H.Wlasciwa skrecalnosc optyczna tienamycyny wy¬ nosi /a/p27OCH-82,7°/C=0,l%, wagowo /objetosc w mmolowym buforze fosforanowym, ipH=6,95/.Dyspersja skrecakiosci optycznej wskazuje na pojedynczy, dodatni efekt Cotton^a z pikiem przy 311 ran i minimum przy 242 nm. Dichoroizm ko¬ lowy ujawnia dodatnie maksimum przy 287,5 nm i ujemne minimum przy 216 nm.Widmo absorpcji w ultrafiolecie tienamycyny w wodnym roztworze o pH=4—8 wykazuje pik przy 1% 296,5 nm /Ej ^=290, £=7900/ i minimum przy 1% 242 nm /E j PTn=B8/. Wdimo zdjete bezposrednio 8 po przygotowaniu roztworów przy pH=2 wykazu¬ je przesuniecie w kierunku mniejszych czestosci /red-schift/ maksimum absorpcji do 309 nm. Wid¬ mo zdjete bezposrednio po ustaleniu pH roztwo- rów 12 wykazuje przesuniecie w kierunku mniej¬ szych czestosci /red-shift/ maksimum absorpcji do 300,5 nm.Tienamycyna jest wewnetrznie zobojetniona sub¬ stancja amfoteryczna o liczbie kwasowej pKa^ io =3,08. Wartosc te zmierzono w 30 mmolowym bu¬ forze fosforanowym, wykorzystujac zalete przesu¬ niecia widma absorpcji w ultrafiolecie przy zmia¬ nie pH.Dodatnie reakcje barwne Otrzymuje sie z ninhy- dryna, jodoplatynianem i odczynnikiem Folin'a.Test Sakaguchi'ego daje wynik ujemny.Tienamycyna, identyfikowana metoda chromato¬ grafii cieknowarstwowej na plytkach celulozowych, zawierajacych wskaznik fluorescencyjny i rozwi- janych mieszanina etanolu i wody w stosunku 70:30, wykazuje wartosci Rf 0,45 do 0,50, na .podstawie nastepujacych stosowanych osobno kry¬ teriów: 1/ bioautografia na plytkach agarowych, wysianych detektorem organizmu Staphylococcus aureus MBh108, zwanym tu jako Staphylococcus aureus ATCC 6538P; 2/ zgaszenie fluorescencji, po¬ budzonej padajacym promieniem swiatla ultrafio¬ letowego; 3/ brzoskwiniowe zabarwienie, powsta¬ jace po spryskaniu ninhydryna i ogrzewaniu; 4/ powolne bielenie natryskowego odczynnika jodo- platynianowego.W tablicy 1 zestawiono ruchliwosc tienamycyny w kilku dodatkowych ukladach chromatograficz¬ nych.Tablica 1 Rozpuszczalnik butanol: kwas oc- ktowy : woda- ¦'¦¦-*¦¦ •¦ /40:10:50/ etanol: woda /70 : 30/ n-propanol: woda /TO : 30/ etanol: woda /70 : 30/ etanol: woda /70 : 30/ Adsorbent - ¦-" Avicel TLC Silikazel G Avicel TLC Silikazel G Avicel TLC Bibulowa chro¬ matografia zste¬ pujaca, What- man 1 TLC Silica Gel HF /Analtech/ TLC wstepnie przemyty eta¬ nolem Rf 1 0,43 . 0,49 0,48 0,31 0,36 0,63 0,44 Avicel jest nazwa handlowa krystalicznej celu¬ lozy produkcji American Viscose Corporation. War¬ tosci Rf oznaczaja odleglosc pomiedzy poczatkiem i srodkiem biologicznej aktywnosci /okreslonej 65 bioautograficznie na Staphylococcus aureus ATCC9 6538P/, podzielona przez odleglosc od poczatku do czola rozpuszczalnika.Analiza aminokwasu produktu kwasowej hydro¬ lizy tienamycyny na analizatorze Penkin-Elme^a model KLA-5 Hitashi wskazuje na wystepowanie jednego glównego skladnika reagujacego z ninhy- dryna o czasie retencji posrednim pomiedzy alani¬ na i glicyna, i dajacego w reakcji ninhydrynowej produkt, którego absorbancja, zmierzona przy 440 nm, jest trzykrotnie wieksza niz absorbancja, zmie¬ rzona przy 540 nm. Jesli ^przed kwasowa hydroli¬ za na antybiotyk dziala sie zimnym kwasem nad- mrówkowym, a nastepnie bromowodorem /sposo¬ bem typowym stosowanym do konwersji grup tio- eterowych i sulfhydrylowych do odpowiednio grup sulfonowych i kwasu sulfonowego/, analiza amino¬ kwasu ujawnia wystepowanie jednego glównego skladnika, reagujacego z ininhydryna, o czasie re¬ tencji nieznacznie. wiekszym od czasu retencji dla kwasu asparaginowego i absorbancja produktu re¬ akcji ninhydrynowej, zmierzona przy 540 nm jest 3,2 razy wieksza, niz zmierzona przy 420 nm. Sklad¬ nik ten jest identyczny z tauryna /kwas 2-amino- etanosulfonowy/ na podstawie porównania czasu eluowania autentycznej próbki tauryny, która pod¬ dano takim samym operacjom utleniania i kwas¬ nej hydrolizy. Na podstawie tego opracowania o- szacowano, ze wydzielona tauryna wystepuje w ilosci 0,8 \i mola na miligram tianomycyny, wpro¬ wadzonej do ukladu reakcyjnego.Optimum trwalosci tienamycyny obserwuje sie w wodnym roztworze o stezeniu ponizej 1 mg/ml i w obecnosci buforów fosforanowych zapewniaja¬ cych pH=t8—7. Na przyklad, okres póltrwania dla roztworu o stezeniu 1 mg/ml w wodzie /pH=7,0/ przy przechowywaniu w temperaturze 0°C wynosi dni, podczas gdy przy tym .samym stezeniu w mmolowym fosforanie potasowym /pH=7,0/ czas póltrwania wydluza sie do 37 dni. Jednakze roz¬ twór antybiotyku o stezeniu 12 mg/ml w 10 mmo¬ lowym buforze fosforanowym przechowywany w temperaturze 10oC wykazuje czas póltrwania je¬ dynie 3 dni. Ten jasnozólty poczatkowo roztwór zmienia w ciagu 48 godzin zabarwienie na ciem- nobursztynowe.Czas póltrwania tienamycyny przy pH w zakre¬ sie kwasowym i w temperaturze pokojowej wy¬ nosza: 346 minut — pH=4,0, 30 minut — pH=3,0, 6,7 minut — pH=2,0, przy czym dla okreslenia tej wartosci w kazdym przypadku stosowano 30 mmo- lowy bufor fosforanowy do regulacji stezenia jo¬ nów wodorowych. W zakresie zasadowym i w tem¬ peraturze 30°C czasy póltrwania wynosza: 10 mi¬ nut — pH=8,2, 5,7 minut — pH=8,8 /bufor bora- nowy/ i 2,1 minuty — pH=12 /0,01 molowy wodo¬ rotlenek sodowy/.Aktywnosc antybiotyku i absorbancja ultrafio¬ letu, zmierzona przy 296,5 nm, sa wprost propor¬ cjonalne do okresu póltrwania, wynoszacego 5,7 minuty w mieszaninach reakcyjnych, zawierajacych poczatkowo 0,05 fi mola antybiotyku i 4 \i mola hydroksyloaminy na mililitr i inkubowanych przy pH=7,0 w temperaturze 20°C. Okres póltrwania 2,5 minuty obserwuje sie, gdy jako odczynnik sto¬ suje sie cysterne w stezeniu 4 p mola/ml, przy pH=7,0 i w temperaturze 20°C. Wreszcie, aktyw¬ nosc antybiotyku i absorbancja zmieniaja sie pod wplywem preparatów P-laktamazy, otrzymywanej przez dzwiekowe rozdrobnienie szczepu Enterobac- ter cloacae.Przyjmuje, sie, ze budowe tienamycyny opisuje wzór, przedstawiony na rysunku.Tienamycyne, charakteryzuje nastepujace spek¬ trum aktywnosci przeciwbakteryjnej. W testach io stosowano plytkowa metode dyfuzyjna Bauer'a — Kirby — ego, zmodyfikowana jedynie tym, ze gle¬ bokosc agaru wynosi 2 mm. Wyniki, wyrazone w sensie srednicy w milimetrach strefy zahamowa¬ nia, podano w tablicy 2.Tablica 2 Organizm Staphylococcus aureus 2985 Staphylococcus aureus 2314 Streptococcus faecalis 755 Bacillus subtilis 964 Escherichia coli 2017 Escherichia coli 2964 Escherichia coli 2482 Klebsiella 2921 Klebsiella 2922 Enterobacter cloacae 2646 Enterobacter cloacae 2647 Proteus mirabilis 2830 Proteus morgamii 2833 Serratia 2840 Pseudomonas aeru- ginosa 2824 Pseudomonas aeru- ginosa 321Ó Pseudomonas aeru- ginosa 2616 Odpor¬ nosc przeciw— bakteryj¬ na* s P — — — P, C P P P, C — P, C P, C P, C P, C P, C P, C 1 Antybiotyk ** 1 Nn 1 IH \ag antybioty- 1 ku/plytke *** ~£T 39 40 27,5 48,5 ' 28 26 26 26 23 23,5 31 27 23 9,7 39 39 26 48 29 27 28 26 22 22 24 32 27 22 | 1 6'6 38 1 38 1 24 1 46 28. 27 27 S5 27,5 21 23 ,5 | * P = penicyliny, reprezentowane przez ampicy¬ line, C — cefalosporyny, reprezentowane przez ce- falotyne.** I: surowy preparat /310 jednostedc/mg/. II: czy¬ stosc posrednia /l3200 jednostek/mg/. III: czysty w 60 zasadzie preparat /oszacowany na 31000 jednostek/ /mg/.Jednostke mocy przeciwbakteryjnej okreslono w nastepnym rozdziale zatytulowanym „Próba". 65 Obliczona na .podstawie absorbancji produktu re-96314 u akcji hydroksyloaminy i tienamycyny, jak to opi¬ sano ponizej. Kolejne oszacowanie czystego w za¬ sadzie antybiotyku przeprowadzono metoda roz- cienczen agaru. Szczepionke 2X104 do 1X105 orga¬ nizmów naklada -sie w formie kropli 0,002 ml na powierzchnie agaru Mueller'a — Hinton'a, zawie¬ rajacego serie dwukrotnie zmniejszajacych sie roz- cienczen antybiotyku w zakresie 0,01 do 73 ng/ml.W tablicy 3 podano wyniki, wyrazone jako mi¬ nimalne stezenie zahamowania w ng/ml, to jest najmniejsze najmniejszego stezenia antybiotyku, przy którym rozwój badanego organizmu jest za¬ hamowany w ciagu 18 godzin w temperaturze 37°C.Tabl : Badany organizm :§taphylococcus aureus 23*14 Escherichia coli 2482 Escherichia coli 2964 Escherichia coli 2017 Klebsiella 2921 Klebsiella 2922 Proteus mirabilis 2830 Serratia 2840 Pseudomonas aerugi¬ nosa 2824 Pseudomonas aerugi- nosa 2616 Pseudomonas aerugi- | nosa 3210 ica 3 Odpornosc przeciw- bakteryj- na *N P P, C P P P, C P, C P, C P, C P, C Minimalne stezenie zahamowa¬ nia /fig/ml/ 0,02 0,3 0,3 0,15 0,3 0,3 4,7 4,7 0,6 4,7 | 2;4 i * P <= penicyliny, reprezentowane przez ampicy¬ line, C = cefaJosporyny, reprezentowane przez ce- falotyne.Tienamycyna wykazuje aktywnosc in vivo prze¬ ciw Gram-dodatrii!m i Gram-ujemnym organizmom i znajduje zastosowanie do leczenia bakteryjnych infekcji u zwierzat. W celu okreslenia aktywnosci in vivo tienamycyne rozpuszcza sie i rozciencza 0,15 m roztworem NaCl i 0,01 m fosforanem sodo¬ wym o pH=7,0 i uzyskuje sie 5 czterokrotnie zmniejszajacych sie stezen leku do badania. Sa¬ mice bialych myszy szwajcarskich o srednim cie¬ zarze okolo 21 g infekuje sie dootrzewnowo i pod¬ skórnie badanym organizmem, zawieszonym w brzeczce. Ilosc wstrzykiwanych organizmów okres¬ la sie typowymi metodami zliczania plytki. Pod¬ czas wstrzykiwania i 6 godzin pózniej niektórym myszom podaje sie dootrzewnowo, podskórnie i do- zoladkowo antybiotyk. 5 myszy bada sie dla kaz¬ dego stezenia testowanego leku. Dodatkowo, dwóm nie infekowanym myszom podaje sie antybiotyk w celu stwierdzenia, czy jego ilosc dziala toksycz¬ nie. W kazdym tescie grupy po 5 myszy kontrol¬ nych infekuje sie organizmami dla kazdego z kil¬ ku rozcienczen. Na tej podstawie oblicza sie liczbej organizmów, które powoduja smiertelnosc 50Vo za¬ infekowanych i nie leczonych myszy /LD50/. Obli- 40 45 50 55 12 czenia te przeprowadza sie na podstawie danych dotyczacych przezycia w siódmym dniu po zain¬ fekowaniu, a jednoczesnie oblicza sie ilosc leku, która powinna zabezpieczyc 50°/t zainfekowanych myszy /ED50/.Wszystkie zwierzeta, poddane tej próbie i nie leczone antybiotykiem, padaja w ciagu 48 godzin od zainfekowania. Skutecznosc tienamycyny o mo¬ cy 30000 jednostek/mg podano w tablicy 4.Organizm Staph. aureus 2949 Pseudomonas aeruginosa 3210 E. coli 2017 Tablica 4 Badania skutecznosci /myszy/* Dawka smiertel¬ na LD£0 7 ' 7 13 7 7 9 Sposób poda¬ wania, dawki dootrzewno¬ wo X2 podskórnie X2 dozoladko- wo X2P dootrzewno¬ wo X3« podskórnie X3 dootrzewno¬ wo X2 ED50 mg/kg/ dawke 0,012 0,08 0,67 0,45 2,05 0,375 65 a=X3, wskazuje podanie leku w momencie zain¬ fekowania i 2 oraz 4 godziny pózniej, X2, wskazu¬ je podanie leku w czasie zainfekowania i 6 godzin pózniej P=zwierzeta glodzi sie 24 godziny przed zainfe- knowaniem i leczeniem.Mala toksycznosc dzialania na ssaki stwierdzo¬ no na podstawie braku ujemnych efektów po uply¬ wie 7 dni od dozylnego podania 500 mg antybio¬ tyku na kilogram ciezaru myszy.Tienamycyna jest wartosciowym antybiotykiem aktywnym przeciw Gram-dodatnim i Gram-ujem¬ nym bakteriom i dlatego znajduje zastosowanie w medycynie i w weterynarii. Zwiazki wedlug wy¬ nalazku mozna stosowac jako leki przeciwbakte- ryjne do leczenia infekcji, spowodowanych Gram- -dodatnimi i Gram-ujemnymi bakteriami, takimi jak na przyklad Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter cloacae.Substancje przeciwbakteryjna, wytworzona spo¬ sobem wedlug wynalazku, mozna równiez stosowac jako dodatki do karmy zwierzecej, do konserwacji karmy i jako srodki dezynfekujace. Mozna ja na przyklad stosowac w formie wodnych srodków w stezeniach 0,1—100 czesci antybiotyku na milion czesci roztworu w celu zniszczenia i zahamowania rozwoju szkodliwych bakterii na wyposazeniu le¬ karskim i chirurgicznym oraz jako bakteriocydy w zastosowaniach przemyslowych, na przyklad w fabrykach wodnych i wodzie sitowej w papierniach w celu zahamowania rozwoju szkodliwych bak¬ terii.Antybiotyk, wytworzony wedlug wynalazku,96314 13 14 mozna stosowac w formie róznorodnych prepara¬ tów farmaceutycznych jako samodzielny aktywny skladnik lub w polaczeniu z jednym lub wiecej innymi antybiotykami albo jedna lub wiecej ak¬ tywnymi farmakologicznie substancjami. W pierw¬ szym przypadku, wspólnie mozna podawac anty¬ biotyk typu aminocyklitolu, taki jak gentamycy- na, w celu zminimalizowania mozliwosci pojawie¬ nia sie uodpornionych organizmów. W drugim przypadku mozna na przyklad wspólnie podawac dwufenoksyhan i atropine w formie dawek, prze¬ znaczonych do leczenia zapalenia zoladka i jelit.Antybiotyk mozna stosowac w formie kapsulek lub tabletek, proszków lub cieklych roztworów, zawie¬ sin lub eliksirów. Mozna go podawac dozoladko- wo, powierzchniowo, dozylnie lub domiesniowo.Tabletki i kapsulki do podawania dozoladkowe- go mozna przygotowywac w formie dawek jedno¬ stkowych i moga one zawierac typowe rozczynni- ki, takie jak srodki wiazace, na przyklad syrop, guma akacjowa, zelatyna, sorbit, tragakant lub po- liwinylopiralidon, wypelniacze jak na przyklad laktoza, cukier, skrobia kukurydziana, fosforan wapnia, sorbit lub glicyna, srodki poslizgowe jak na przyklad stearynian magnezu, talk, poliglikol etylenowy i krzemionka, srodki rozpraszajace jak na przyklad skrobia ziemniaczana lub dopuszczal¬ ne srodki zwilzajace, takie jak laurylosiarczan so¬ dowy. Tabletki mozna pokrywac znanymi w far¬ macji metodami.Ciekle preparaty do podawania dozoladkowego mozna przygotowywac w formie wodnych lub ole¬ istych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów, elik¬ sirów itd. luib w formie suchego produktu do roz¬ prowadzenia w wodzie lub innym odpowiednim medium przed .uzyciem. Takie ciekle preparaty mo¬ ga zawierac typowe dodatki, jak srodki zawiesza¬ jace, na przyklad syrop sorbitowy, metyloceluloza, glikoza-syrop cukrowy, zelatyna, hydroksyetyloce- luloza, karboksymety.loceluloza, zel stearynianu glinowego lub uwodornione tluszcze jadalne, srod¬ ki emulgujace takie jak lecytyna, monooleinian sorbitu lub guma akacjowa, niewodne rozczynniki takie jak jadalne oleje, na przyklad olej migdalo¬ wy, frakcjonowany olej kokosowy, oleiste estry, glikol propylenowy lub alkohol etylowy, srodki konserwujace, jak na przyklad p-hydroksybenzo¬ esany metylu lub propylu lub kwas sorbinowy.Czopki moga zawierac typowe substancje podsta¬ wowe, takie jak maslo kakaowe lub inny glice¬ ryd.Srodki do wstrzykiwania moga "wystepowac w formie dawki jednostkowej w ampulkach luib w wielodawkowych pojemniczkach z dodatkiem srod¬ ka konserwujacego. Sa to takie srodki, jak zawie¬ siny, roztwory, emulsje w oleistym lub wodnym rozczyinniku i moga zawierac takie srodki, jak czynniki zawieszajace, stabilizujace i/lub dysper¬ gujace. Aktywny skladnik moze równiez wystepo¬ wac w formie proszku do rozprowadzenia przed uzyciem w odpowiednim rozczynniku, na przyklad w sterylnej, nie zawierajacej czynnika goraczko- twórczego wodzie.Srodki mozna tez przygotowywac w formie, na¬ dajacej sie do absorpcji przez blony sluzowe nosa i gardla albo tkanki oskrzelowe i moga wystepo¬ wac wówezas jako proszki, plyny do natryskiwa¬ nia, inhalatory, pastylki romboidalne, srodki do pedzlowania gardla itp. Do leczenia oczu i uszu preparaty mozna przygptowywad jako pojedyncze kapsulki w formie cieklej lub pólstalej albo moz¬ na je stosowac jako krople. Do zastosowan po¬ wierzchniowych mozna je przygotowywac przy u- zyciu hydrofobowych lub hydnofilowych substan¬ cji podstawowych w formie masci, kremów, ply¬ nów do przemywania, plynów do pedzlowaiiia, proszków itp.Srodki te moga oprócz nosnika zawierac równiez inne skladniki, takie jak stabilizatory, srodki wia¬ zace, antyutleniacze, srodki konserwujace, srodki poslizgowe, srodki zawieszajace, srodki zwieksza¬ jace lepkosc lub srodki smakowe itp.Dla celów weterynaryjnych, takich jak leczenie kurczaków, krów, owiec, swin itp., srodki te moz¬ na przygotowywac na przyklad w formie prepara¬ tów dosutkowych o przedluzonym dzialaniu lub do szybkiego uwolnienialeku. v Podawana dawka zalezy w duzej mierze od sta¬ nu leczonego, jego wagi i typu infekcji, sposobu i czestosci podawania, przy czym zaleca sie poda¬ wanie pozajelitowe przy infekcjach ogólnych i podawanie dozoladkowe przy infekcjach przewodu pokarmowo-jelitowego.Do leczenia bakteryjnych infekcji u ludzi tiena- mycyne podaje sie dozoladkowo lub pozajeliltowo, stosujac typowe metody podawania antybiotyku, w ilosci okolo 2--600 mg/kg/dzien, a najlepiej oko¬ lo 5—100 mg/kg/dzien i zaleca sie na przyklad trzy do czterokrotne podawanie leku na dzien. Mozna je podawac w dawkach, zawierajacych na przy-\ klad '25, 250, 500 lub 1000 mg aktywnego skladni¬ ka w odpowiednich, dopuszczalnych fizjologicznie nosnikach lub rozczynnikach. Dawki jednostkowe przygotowuje sde w formie cieklych preparatów, takich jak rozwtory lub suspencje albo stalych w formie tabletek lub kapsulek. Zrozumiale jest oczy¬ wiscie, ze optymalna dawka w kazdym konkret¬ nym przypadku zalezy od rodzaju i ostrosci in¬ fekcji u leczonego oraz, ze w pediatrii stosuje sie mniejsze dawki, co znane jest w praktyce w tym zakresie.Brzeczki fermentacyjne, zawierajace antybiotyk, wytwarzane opisanymi tu sposobami, wykazuja aktywnosc w zakresie okolo 50 do 400 jedno¬ stek/ml podczas prób, prowadzonych dyfuzyjna me¬ toda plytkowa przy uzyciu Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Frzeciwbakteryjne preparaty o ak¬ tywnosci co najmniej 2 jednostki/mg mozna oczysz¬ czac i antybiotyk mozna wydzielac wielu znanymi metodami.Jedna z takich metod jest adsorpcja tienamycy¬ ny na silnie kationitowej zywicy jonowyimdennej.Przykladami takich zywic sa zywice styreriodwu- winylobenzenowe typu sulfonianów, na przyklad sulfonowany w pierscieniu polistyren typu Dowex 50X2 /produkcji Dow Chemical Co., Midland, Mi¬ chigan/, w formie jonów sodowych. Inna repre¬ zentacyjna klase silnie kationitowych zywic jono- 40 45 50 55 6096 314 16 wymiennych stanowia: Dowex 50X 4, Dowex 50 X 8 /produkcji Dow Chemical Co., MidlancL Michigan/, Amberlite IR120 /produkcji Rohm and Haas Co., Philadelphia, Peimsysvania/, Duólite C25D yjpro- dufccji Chemficail Plrocess Co., Redwood City, Ca- lifornia/, Permutit Q /produkcji Permutit Co., Bir¬ mingham, New Jersey/, Ionac C-249 /produkcji Io- nac Chmical Co., Birmingham, New Jersey/ i Am¬ berlite 200.W celu dalszego oczyszczenia tienasmycyny filtru¬ je sie ja przez zel /taki jak zel ipoliakcryloarnido- wy o wymiarze porów, wykluczajacych przechodze¬ nie czasteczek o ciezarze czasteczkowym powyzej 1800/. Zaleca sie tu zastosowanie zelu Bio-Gel P-2 /produkcji Bio-Rad, Richmond, Califomia/. Zaad- sorbowany antybiotyk latwo eluuje sie z kationi- -towej zywicy jonowymiennej przy uszyciu wod¬ nych roztworów amoniaku lub organicznych zasad, takich jak pirydyna, pikoliny, lutydymy, kolidyny i alkiloaminy. Uzyskany w ten sposób oluat oczysz¬ cza sie jeszcze znanymi metodami /jesli to poza¬ dane/. I tak, eluat mozna oczyszczac, przepuszcza¬ jac go przez poliestrowe polimery, takie jak XAD-7 lub 8 (LuJb polistyren, hydrofobowe usieciowane po¬ limery dwuwinylobenzenu, takie jak XAD-1, 2 i 4, a najlepiej XAD-2.Najlepszym sposobem wydzielania oczyszczonej tienamycyny jest przepuszczenie roztworu antybio¬ tyku, takiego jak przesaczona brzeczka (pofermen¬ tacyjna, której pH doprowadzono do 4—5, przez kolumne wypelniona silnie kationitowa zywica jo¬ nowymienna typu sulfonianu w formie jonów so¬ dowych /Dowex 50X2/. Uzyskany adsorbat Eluuje sie nastepnie odpowiednim eluentem, takim jak 2% wodny roztwór pirydyny. Eluaty zbiera sie ja¬ ko frakcje, których wielkosc zalezy od rozmiaru stosowanej kolumny.Dalsze oczyszczanie mozna przeprowadzic, stosu¬ jac nastepujace wypelnienia chromatograficzne: anionowe zywice jonowymienne typu trójimetyl©- amoniowej soli polistyrenu /na przyklad Dowex-l w formie jonów chlorkowych/, kattionitowe zywice jonowymienne typu sulfonianu polistyrenu /na przyklad Dowex-50 w formie jonów 2,(Murydynio- wycly, przepuszczalne zele /na przyklad Bio-Gel P-12, zywica poliakryloamidowa/ i polimeryczne ab- sorbenty /na przyklad XAD-2, zywica polistyreno¬ wa/. Aktywnosc biologiczna eluatów okresla sie przy uzyciu Staphyllococcus aureus ATCC 6538P jako organizmu testowego.Podane dalej przyklady ilustruja sposoby otrzy¬ mywania produktów sposobem wedlug wynalazku.Przyklady te podano jedynie dla ilustracji i po¬ winno byc sprawa oczywista dla fachowców w tej dziedzinie, ze wynalazek obejmuje funkcjonalnie równowazne sposoby. Wszystkie modyfikacje opi¬ sanych tu sposobów, prowadzacych do otrzyma¬ nia identycznych produktów, nalezy zatem trakto¬ wac jako metode analogiczna. Opilsane sposoby mozna realizowac z wieloma zmianami i modyfi¬ kacjami, a niewielkie odchylenia od nich uwaza sie za zgodne z.fachowa praktyka i objejte sa za¬ tem zakresem tego wynalazku. ^ Próby. O ile nie zaznaczono tego inaczej próby aktywnosci przeciwbakteryjnej przeprowadza sie nastepujaca dyfuzyjna metoda plytkowa.Plytki przygotowuje sie nastepujacym sposobem.Calonocna hodowle testowanego organizmu, to jest i Staphyiocoocus auireus ATCC 6530P, w odzywczym bulionie z dodatkiem Oj&h ekstraktu drozdzowego rozciencza sie odzywczym bulionem z dodatkiem 0,2*/o ekstraktu drozdzowego do zawiesiny o irans- mitancji S5P/o- przy dlugosci fal 060 [m^. Te zawie¬ lo sine dodaje sie do odzywczego agaru Ddfco z do¬ datkiem 2,0 g/litr ekstraktu dtrozdzowego Difco w temperaturze 47—48°C i otrzmuje sie mieszanine,, zawierajaca 33,2 ml zawiesmy na lita: agaru. 5 ml tej zawiesiny wylewa sie na plytki Petriego o sred- nicy 85 mm i plytki te oziebia sie i utrzymuje w temperaturze 4°C przed uzyciem /najdluzej 5 dni/.Próbki badanego antybiotyku rozciencza sie bu¬ forem fosforanowym o pH=7 do odpowiedniego stezenia. Krazki z bibuly filtracyjnej o srednicy 12,5 mm zanurza sie w badanym roztworze i u- mieszcza sie na powierzchni próbnych plytek. Dwa krazki kazdej próbki umieszcza sie zazwyczaj na jednej plytce jeden naprzeciw drugiego. Plytki poddaje sie inkubacji w ciagu nocy w tempera¬ turze 37°C i strefe zahamowania okresla sie* po¬ dajac srednice w milimetrach. Strefa zahamowa¬ nia zmierzona W milimetrach okresla wzglledna moc lub, w porównaniu z oczyszczona substancja wzorcowa, taka jak cefalosperyna, moc antybioty¬ ku w jednostkach/ml. Jednostka aktywnosci wska¬ zanaw przykladach IV do VII oparta jest na wzor¬ cowych stezeniach cefalotyny 8, 4, 2 i 1 |xg/ml.Jedna jednostka okresla obliczona ilosc, powodu- jaca zahamowanie takie jak 1 \ag cefalotyny/ml, to jest strefe zahamowania 16—21 mm srednicy.Przyklad I. Rurke, zawierajaca liofilizowa¬ na hodowle Streptomyces cattleya, otwiera sie w warunkach asceptyczriyoh i jej zawartosc zawiesza 40 sde w rurce, zawierajacej 0,7 idI sterylnej soli Davis'a o nastepujacym skladzie: 0,5 g cytrynianu sodowego, 7,0 g K2HPO4, 3,0 g KHaJPO* 1,0 g /NH4/2S04, 0,1 g MgS04.7HiO i 1000 ml wody de¬ stylowanej. Porcje 0,2 ml tej zawiesiny stosuje sie 45 do zaszczepienia hodowli pozywki A /plus agar/ o nastepujacym skladzie: Pozywka A Produkt auitolizy drozdzy /Ardamme */ 10,0 g Glikoza 10,0 g 50 *Bufor fosforanowy 2,0 ml MgS04 •7HzO 0,05 g Woda destylowana 1000 ml pH ustalone 6,5 przy uzyciu NaOH Zaszczepiona hodowle inkubuje sie w ciagu 8 55 dni w temperaturze 28°C i przechowuje sie w tem¬ peraturze 4°C.Czesc zarodników powietrznej grzybni tej ho¬ dowli stosuje sie do zaszczepienia 50 ml pozywki A /bez agaru/, umieszczonej w uszczelnionej kol- 60 bie Erlenmeyera do wysiewania o objetosci 250 ml.* Ardamine: Yeast Products Corporation.+ Roztwór buforu fosforanowego: 01,0 g KH2P04, 9(5,0 g Na2HP04 i 1000 ml wódy destylowanej. Dla 65 hodowli: dodatek agaru — 25,0 ig/litr.96 314 17 Kolbe te wytrzasa sie w temperaturze 28°C na wytrzasarce z szybkoscia 220 obrotów/minute /skok 2 cale/ w ciagu 2 dni, w którym to czasie uzysku¬ je sie zadowalajacy rozwój. kolb Erlenmeyera o objetosci 250 ml zawie¬ rajacych ipo 40 ml pozywki B, szczepi sie 1 ml /na kolbe/ hodowli z wysiewanych kolb.Pozywka B ma nastepujacy sklad: Pozywka B Maczka kukurydziana Rozpuszczalne pozostalosci podestylacyjne Maczka sojowa Cytrynian sodowy CaGlt'-2H/ Mg®04.7H20 CoCl2.l6H20 FeSO4-7H*0 0,01 g 0,25% objetosciowych 1000 ml pH: ustalone do 6,5 przy uzyciu NaOH Te ,15 kolb produkcyjnych wytrzasa sie w tem¬ peraturze 28°C na wytrzasarce z szybkoscia 220 Obrotów/minute /skok 2 cale/ w ciagu 3 dni i w czasie cyklu fermentacyjnego przeprowadza sie próby. Próby przeprowadza sie na odwirowanej brzeczce. pH brzeczki przed próba reguluje sie wedlug tablicy 5.Tablica $ 18 Tablica 6 ,0 ,0 ,0 4,0 0,5 0,1 0,01 g g g g g g g ** Poliglikol 2000 Woda destylowana 1 Czas /godziny/ Aktywnosc wzgledem ATCC 0538P /strefa w mm/ i pH poczatkowe pH uregulowane 48 34 —40h 6,3 — 53 —41h ,9 6,8 72 . 34 ,0 6,2 h — rozmyta .., Po uplywie 53 godzin brzeczki z 13 kolb wyle¬ wa sie. Próbki odwirowuje sie i bada^ Pozostaja¬ ca brzeczke przesacza sie, ustala jego pH na 7 i 500 ml sufbliinuje sie, uzyskujac 10,7 g substancji stalych. Porcje 1,5 g tych substancji rozpuszcza sie w 25 ml mieszaniny alkoholu n-butylowego i wo¬ dy w stosunku 1 :99. pH roztworu wynosi 7,0.Ten roztwór wprowadza sie do kolumny o wymia¬ rach 5Xilll8 cm wypelnionej Bio-Gel P-2 /200—400 mesh/, która uprzednio zrównowazono mieszanina alkoholu n^butylowego i wody. £el rozwija sie tym samym roztworem z szybkoscia 10 ml/minute i zbiera sie .050 ml przedgonu, a nastepnie 75 frak¬ cji po 20 mai.Wyplywajacy strumien kontroluje sie przy uzy¬ ciu róznicowego rejestrujacego refraktometru Mec- conmatic. Kazda frakcje bada sie na aktywnosc przeciwbakteryjna. Stwierdza sie wystepowanie tienamycyny we ftrakcjach 34—40, przy maksimum we frakcji 37. 10 ml frakcji 37 odparowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymuje sie 2,cTmg osadów.Osady te rozpuszcza sie w 5 ml wody i bada sie.Próbne plytki inkuibuje sie w ciagu nocy w tem¬ peraturze 28°C. Wyniki przedstawiono w tabli¬ cy 6.Stezenie 80 \ig/nn 40 ng/ml ng/ml ng/iml Wyimair strefy w mm wzgledem Staph. aureus ATCC 6538P mm mm 21 mm 17 mm ** -Poliglikol 2000: Dow Chemical^Co. 40 45 50 55 * Ardamine: Yeast Products Corporation.+Hoztwór buforu fosforanowego: 91,0 g KH^P04, 95,0 g NagHPOi i 1000 ml wody destylowanej. Dla 60 hodowli: dodatek agaru — 25,0 g/litr.** Poliglikol 2000: Dow Chemical Co.Kolby wytrzasa sie w temperaturze 28°C na wy¬ trzasarce z szybkoscia 220 obrotów/lminute /skok 65 2 cale/ w ciagu 3 dni i podczas cyklu ferm&anta- Przyklad II. Rurke z liofilizowana hodowla Streptomyces catittleya otwiera sie w warunkach aseptycznych i zawartosc zawiesza sie w 0,8 ml sterylnej soli Davis'a o nastepujacym skladzie: 0,5 g cytrynianu sodowego, 7,0 g KjHPO^ 3,0 g KH^PO^ 1,0 g /NH4/zS04,MgS04-7H20, 0,1 g 1000 ml wody destylowanej. Te zawiesine stosuje sie do zaszczepienia 4 hodowli pozywki A /plus agar/ o 'nastepujacym skladzie: Pozywka A Produkt autolizy drozdzy /Ardamine*/ 10,0 g Glikoza 10,0 g +Bufor fosforanowy 2,0 ml Mg804.7HdO 0,05 g Woda destylowana 1000 ml pH ustalone na 6,5 przy uzyciu NaOH Zaszczepione hodowle inkubuje sie w ciagu 1 ty¬ godnia w •cieplarce w temperaturze 28°C, a nastep¬ nie w temperaturze 4°C.Czesc zarodników powietrznej grzybni j. jednej hodowli stosuje sie do zaszczepienia 50 ml pozyw¬ ki A, umieszczonej w kolibie Erlenmeyera /uszczel¬ nionej/ do wysiewania o objetosci 250 ml. Te wy¬ siana kolbe wytrzasa sie w temperaturze 28°C na wytrzasarce z szybkoscia 220 obrotów/lminute /skok 50,8 mm/ w ciagu 2 dni, po którym to czasie uzys¬ kuje sie zadowalajacy rozwój. kolb Enlenimeyera o objetosci 250 ml, zawie¬ rajacych 40 ml pozywki B, szczepi sie 1 ml /na kolbe/ hodowli z wysiewanej kolby. Pozywka B ma nastepujacy sklad: Pozywka B Maczka kukurydziana Rozpuszczalne pozostalosci Maczka sojowa Cytrynian sodowy CaCl2-2H20 MgS04 • TH^O CoC^-^H^O FeS04 • TH/) ** Poliglikol 2000 Woda destylowana podestylacyjne ,0 ,0 ,0 4,0 0,5 04 o,oa 0,01 g g g g g g g g 0,25f/o objetosciowych pH; ustalone do 6,5 przy uzyciu NaOH 1000 ml19 96 314 cyjnego pobiera sie próbki. Do próbek pobiera sie i ciecz sklarowana nad odwirowana brzeczka. Otrzy¬ muje sie wyniki, przedstawione w tablicy 7.Tablica 7 1 Czas~ /godziny/ Aktywnosc wzgledem ATCC 6538P 48 6.7 38 - 53 ,-. 6,4 40 72 ,5 38 mm Po uplywie 53 godzin brzeczki z 13 kolb wylewa sie i odsacza. Do porcji 400 ml przesaczu dodaje sie rozcienczonego kwasu solnego do pH=4,8 i roztwór ten adsorbuje sie w kolumnie wypelnio¬ nej 140 ml Dowex 50Xi w formie jonów sodowych z szybkoscia 14 ml/minute. Adsorbent przemywa sie 200 ml zdejonizowanej wody i eluuje sie 2% roztworem pirydyny w wodzie, zbierajac 6 frakcji po 70 mil. ipH frakcji ustala sie na 7,0. Bada sie wszystkie frakcje i okresla sie srednice stref, któ¬ re podano w tablicy 8.Tablica 6 j Przesaczona brzeczka ] 1 Rozcienczenie 1:4 1:6 1 :16 | 1 :32 | . Srednica strefy 1 33 mm [ mm 1 27 mm 1 24 mm 1 | Frakcje eluowane | 1 Rozcienczenie 1.1. 1:5 f 2. 1:5 3. 1:5 1 4, 5 i 6 1:5 Srednica strefy I 22,5 tmm 1 36 mim mim 0 mm 1 Próby te wskazuja, ze aktywnosc w eluatach wynosi 45*/i. Efluat frakcji 2 odparowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymuje sie 1117 mg substan¬ cji stalych. 117 mg substancji stalych rozpuszcza sie w 1,5 ml mieszaniny alkoholu n^butylowego i wody w stosunku 1 :M. Ten roztwór naklada sie na war¬ stwe Bio-Gefl. P-2 1,4X81,5 cm, zrównowazonego uprzednio mieszanina alkoholu n-butylowego i wo¬ dy. Zel rozwija sie mieszanina alkoholu n-butylo¬ wego i wody z szybkoscia 1 ml/minute i zbiera sie frakcje po 2 mil. Wyplywajacy strumien kontrolu¬ je sie przy uzyciu rejestrujacego refraktometru Meoeomattic. Frakcje bada sie na aktywnosc prze- ciwbakteryjna przy rozcienczeniu 1 :20, Pik aktyw¬ nosci biologicznej obserwuje sie dla frakcji 44—53.Frakcje 46—40 i polowe frakcji 50 laczy sie. Prób¬ ke 1 ml tych polaczonych frakcji oddziela sie do badan i pozostalosc odparowuje sie ze stanu za¬ mrozenia, uzyskujac 4,2 mg czesciowo oczyszczone¬ go antybiotyku.Przyklad III. Rurke, zawierajaca liofilizo¬ wana hoclowlei Streptomyces cattleya, otwiera sie w warunkach aseptycznych i zawartosc zawiesza sie w 0,6 ml sterylnej soli Davis'a o nastepujacym ikladzie: 0,5 g cytrynianu sodowego, 7,0 g KaHPO^ 3,0 g KH,P04, ,1,0 g /NH^jSO^ 0,1 g MgS04 • 7H/)r 1000 ml wody destylowanej. Te zawiesine stosuje sie do zaszczepiania hodowli pozywki A /plus agar/ o nastepujacym skladzie: Pozywka A Produkt autolizy drozdzy /Ardamine */ 10,0 g Glikoza 10,0 g +Bufor fosforanowy 2,0 ml MgSC4.7H*0 0,05 g 19 Woda destylowana 1000 ml pH ustalone na 6,5 przy uzyciu NaOH Zaszczepione hodowle inkubuje sie w cieplarce w ciagu 1 tygodnia w temperaturze 28°C, a na¬ stepnie w temperaturze 4°C. Czesc zarodników po¬ wietrznej grzybni jednej z tych hodowli stosuje sie do zaszczepienia 3 uszczelnionych kolb Erlen- meyera do wysiewania o objetosci 250 ml, zawie¬ rajacych po 50 ml pozywki A. Te wysiane kolby wytrzasa sie w temperaturze 28°C na wytrzasar- w ce z szybkoscia 220 obrotów/minute /skok 50,8 mm/ w ciagu 1 dnia, po którym to czasie uzyskuje sie zadowalajacy wzrost. 12 kolb Erlenmeyera o objetosci 2000 ml, zawie- rajacych po 250 ml pozywki C, szczepi sie po 7 ml zawiesiny, uzyskanej po wylaniu /w warunkach aseptycznych/ zawartosci z 3 wysiewanych kolb.Sklad pozywki C jest nastepujacy: Pozywka C Maczka kukurydziana 20,0 g Rozpuszczalne pozostalosci,podestylacyjne 10,0 g Maczka sojowa 15,0 g Cad2 •ZH& 0,5 g MgS04 •7H/) 0,1 g u CoCl2 •6HjO 0,01 g FeS04 •7H^O 0,01 g CaOO, 4,0 g Poliglifcol 2000 0fl&/% objetosciowych Woda destylowana 1000 ml 40 pH: ustalone na 6,5 przy uzyciu NaOH Kolby wytrzasa sie w temperaturze 28aC na wy¬ trzasarce z szybkoscia 220 obrotów/minute /skok 50,8 mm/ w ciagu 72 godzin. Brzeczki wylewa sie 45 i próbki odwirowuje sie do badan. pH uzyskanej brzeczki wynosi 7,4 i do próby aktywnosci prze- ciwbakteryjnej stosuje sie ciecz sklarowana na od¬ wirowanej brzeczce. Aktywnosc wynosi 43 mm.Brzeczke przesacza sie i dodaje sie rozcienczone¬ go kwasu solnego do pH=4,0 3000 ml roztworu 50 adsorbuje sie na- 300 ml zywicy Dowex 50X2 w formie jonów isodowych z szybkoscia 30 ml/mi¬ nute. Adsortbait przemywa sie 300 ml zdejonizowa¬ nej wody i eluuje sie 2f/« pirydyna, zbierajac 8 55 frakcji po 150 mil. pH frakcji ustala sie na 7,0.Eluaty frakcji 2 i 3, zawierajace 300 ml roztworu wylewa sie. Zawieraja one 4$Vo calej aktywnie biologicznie substancji, wprowadzonej do kolumny wypelnionej Dowex 50X2 w formie jonów sodo- 50 wych.* Ardamine: Yeast Products Corporation.+Roztwór buforu fosforanowego: 91,0 g KHgPC^, 05,0 g NaaHPC^ i 1000 ml wody destylowanej. Dla hodowli: dodatek aigaru — 25,0 g/litr.96 314 21 Porcje 280 ml powyzszych frakcji eluatu z Do- wex 50X2 w formie jonów sodowych przy pH=7,0 perkoluje sie przez kolumne wypelniona 40 ml Dowex 1X2 w formie jonów chlorkowych. Zywice przemywa sie 160 ml zdejonizowanej wody, Wy¬ plywajaca ciecz i frakcje myjace laczy sie, uzys¬ kujac 440 ml roztworu. Do tego roztworu dodaje sie rozcienczonego wodorotlenku sodowego do pH= =8,2, zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 300 ml, dodaje sie "rozcienczonego kwa¬ su solnego do pH=7,0 i odparowuje sie ize stanu zamrozenia, uzyskujac 189 mg substancji stalych. 189 mg tego osadu rozpuszcza sie w mieszaninie alkoholu n^butyilowego i wody w stosunku 1 :99. ml tego roztworu wprowadza sie do kolumny o wymiarach 5X108 cm wypelnionej Bio-Gel P-2 /200^400 mesh/, zrównowazonego uprzednio mie¬ szanina alkoholu n-butylowego i wody. Zel rozwi¬ ja sie, nastepnie mieszanina alkoholu n-butylowe¬ go i wody z szybkoscia 6,7 mil/minute. Wymywa¬ jacy strumien kontroluje sie przy uzyciu rózni¬ cowego rejestrujacego refraktometru Mecco-matic.Odbiera sie 500 ml przedgonu i zbiera sie frakcje po 20 ml. Kazda frakcje bada sie na aktywnosc przeciwbakteryjna przy rozcienczeniu 1 :25. Ak¬ tywnosc biologiczna obserwuje sie we frakcjach 37—42, z maksimum dla frakcji 39. Frakcje 38—41 o sumarycznej objetosci 80 ml laczy sie. Ten roz¬ twór zateza sie do objetosci 10 ml przy pH=7,0 i odparowuje sie ze stanu zamrozenia. Otrzymuje sie 13,5 mg osadu o wzglednej mocy w przyblize¬ niu 6-krotnie wiekszej niz moc próbki, wprowa¬ dzonej do kolumny wypelnionej Bio-Gel P-2, w porównaniu z dyfuzyjna próba plytkowa dla Stalp- hylococcus aureus.Przyklad IV. Rurke z liofilizowana hodowla Streptomyces cattleya otwiera sie w warunkach aseptycznych i zawartosc zawiesza sie w 0,8 ml sterylnej soli Davis'a o nastepujacym skladzie: 0,5 g cytrynianu sodowego, 7,0 g K^HPO^ 3,0 g KH*P04, 1,0 g /NH4/^S04, 0,1 g MgS04 • 7H^O i 1000 ml wody destylowanej. Te zawiesine, stosuje sie do zaszczepienia 4 hodowli pozywki A /plus agar/ o nastepujacym skladzie: Pozywka A Produkt autolizy drozdzy /Ardamine*/ 10,0 g Glikoza 10,0 g +Bufor fosforanowy 2,0 ml MgS04 •7H^O 0,05 g Woda destylowana 1000 ml pH ustalone na 6,5 przy uzyciu NaOH Zaszczepione hodowle inkubuje sie w ciagu 1 tygodnia w cieplarce w temperaturze 28°C oraz przechowuje sie w temperaturze 4°C. ml pozywki A przenosi sie w warunkach aseptycznych do jednej z tych hodowli, zarodniki i powietrzna grzybnie zdrapuje sie do zawiesiny i 3,3 ml tej zawiesiny stosuje sie do zaszczepienia 500 ml pozywki A, umieszczonej w uszczelnionej kolbie Erlenmeyera o objetosci 2 litry. Te wysie- 22 40 45 50 wana kolbe wytrzasa sie w temperaturze 28°C na wytrzasarce z szybkoscia 160 obrotów/minute /skok 50,8 mm/ w ciagu 48 godzin, który to czas wy¬ starcza do rozwojuhocjowli. v Hodowle z tej kolby stosuje sie do zaszczepie¬ nia 160 litrów pozywki A, umieszczonej w fermen- torze ze stali kwasoodpornej do wysiewania o objetosci 190 litrów. Ten fermentor pracuje w cia¬ gu 24 godzin w temperaturze 28°C i jest miesza¬ ny z szybkoscia 150 obrotów/minute i napowietrza¬ ny zszybkoscia 0,084 m,/minute. W razie potrzeby stosuje sie srodelk przeciw pienieniu, to jest Poly- glycol 2000 /Dow Chemical Corp./ lecz jego ilosc nie (powinna przekraczac 0,l9/t.Oznaczenia pH sa nastepujace: Czas, godziny 0 12 24 pH 6,4 6,4 6,3 43 litry tej hodowli z wysiewanego fermentora stosuje sie do zaszczepienia 467 litrów pozywki E umieszczonej w fermentorze ze stali kwasoodpor¬ nej o objetosci 756 litrów. Sklad pozywki E jest nastepujacy: Pozywka E Cereloza 26,0 g Naimok kukurydziany /wilgotny/ 15,0 g Rozpuszczalne pozostalosci podestylacyjne 10,0 % g Preparat z nasion bawelny /Pharmamedia/ 5G g CoCl2-611,0 0,01 g Ca008 /po regulacjipH/ 3,0 g Poliglycol2000 0,25»/t Wodabiezaca 1000 ml pH: po regulacji na 7,3 przy uzyciu NaOH Fermentacje w tym zbiorniku prowadzi sie w ciagu 120 godzin w temperaturze 24°C, mieszajac z szybkoscia 95 obrotów/minute i przy przeplywie. powietrza 0,28 m*/minute. W miare potrzeby/do¬ daje sie srodka przeciw pienieniu, to jest Poli¬ glycol 2000 i jego ilosc nie przekracza 0,lf/o. W trakcie doswiadczenia otrzymuje sie próby aktyw¬ nosci przeciwfoakteryjnej, przedstawione w tabli¬ cy 9.Tablica 9 Czas ' ' ° 12 24 36 48 60 7B '84 96 106 120 pH 6,6 6,2 ,8 ,7 ,3 6,1 6,6 6,7 6,5 6,5 Aktywnosc anty¬ biotyku wzgledem ATCC 6538P (mm) .—. . — — 121,5 33 41,5 45 45 Dekstroza mg/ml 22 21,3 16,5 1 12,1 t 7,8 ¦ • 4,3 2,5 1,6 1,0 lfi o;s | * Ardamine: Yeast Products Corporation.+Roztwór buforu fosforanowego: 91,0 g KH4PO4, 95,0 g Na2HP04 d 1000 ml wody destylowanej. Dla hodowli: dodatek agaru — 25,0 g/litr. 65 400 litrów calego bulionu filtruje sie na prasie filtracyjnej z dodatkiem srodka, ulatwiajacego fil¬ tracje. Do przesaczu dodaje sie 1,2 g soli sodowej kwasu /etyilenodwunitrylo/tetraoctowego. Filtrat oziebia sie do temperatury 6°C, reguluje sie pH do 4,0 ± 0,2 i utrzymuje sie w temperaturze 6°C. Zim-96 314 23 24 ny filtrat adsorbuje sie na 38 litrach zywicy Do- wex 50X4 w formie jonów sodowych /2<*-^50 mesh/ z szybkoscia 4 litry/ininute, Adsonbat przemywa sie 40 litrów dejonizowanej wody. Adsorbat eluuje sie Z0/* wodnym roztworem pirydyny i zbiera sie 3 Jcakcje po 19 litrów i bada sie je. Próby aktyw¬ nosci przeciwfoakteryjnej wskazuja, ze w etuatach frakcji 2 i 3 wystepuje 22*/o wstepnej aktywnosci.Fiikcje te laczy sie, zateza do objejtosci 3,6 litra i ustala sie ipH=7. 3,8 litra powyzszego koncentratu adsorbuje sie na ,2,5 litra Dowex 1X2 /50—ilOO mesh/ w formie jonó^w chlorkowych z szybkoscia 200 ml/minute.Zywice eluuje sie zdejonizowana woda z taka sa¬ ma szybkoscia. Zbiera sie frakcje o objetosci 1 li¬ tra i kazda frakcje doprowadza sie do pH=7,0.Próby wskazuja 75f/f aktywnosci biologicznej we frakcjach 5—fi. Frakcje te laczy sie, i przesacza przy uzyciu zloza o wymiarze porów 0,45 mikro¬ na /Millipore/. Porcje 3 litrowe tego filtratu od¬ parowuje sie ze stanit zamrozenia i otrzymuje sie 16,6 g substancji stalej o mocy 70 jednostek/mg. 4 g otrzymanej powyzej substancji rozpuszcza sie w 50 ml 0,1 m octanu 2,0-lutydyny jako buforu.Roztwór o pH=6,3 wprowadza sie do kolumny, wypetoiionej Dowex 50X8, przygotowanego jak na¬ stepuje: 2,5 litra Dowex 50X8 /200—400 mesh/ w formie jonów wodorkowych przeprowadza sie w forme jonów 2,6^1utydyny. Zywice równowazy sie prze¬ puszczajac pieciokrotna objetosc kolumny 0,1 m roztworu octanu 2,6-lutydyny o pH=6,3 jako bu¬ foru. Zrównowazone zloze zywicy ma wymiary 5KH44 cm. Kolumne, rozwija sie 0,1 m roztworem bafcpu z szybkoscia 14 ml/minute.Wyplywajacy strumien kontroluje sie przy uzy¬ ciu róznicowego refraktometru rejestrujacego Mec- co-matic. Rozwija sie az do zebrania 220 frakcji o objetosci 20 mL Wszystkie frakcje 44^142 ana¬ lizuje sie przy rozcienczeniu .1 :50. Aktywnosc bio¬ logiczna wystepuje dla frakcji 78—136, przy mak¬ simum dla frakcji 9i2—94. Wybiera sie frakcje 82— —116, laczy sie je i otrzymuje 700 ml roztworu.Ten roztwór dzieli sie na dwie porcje po 350 ml i odparowuje sie ze stanu zamrozenia.Jedna porcje uzyskanej substancji stalej roz¬ puszcza sie w 0,11 m octanie 2,6-lutydyny o pH= =7,0. 27 ml tego roztworu wprowadza sie do ko¬ lumny o wymiarach 5Xil08 om wypelnionej Bio- -Ged P-2 /200—400 mesh/, zrównowazonej uprzed¬ nio 0,1 m buforem. Zel rozwija sie tym samym taborem z szybkoscia 10 ml/minute.W|rplywajacy strumien cieczy kontroluje sie przy uzyciu róznicowego rejestrujacego refraktometru Mecoo-matic. Rozwija sie az do uzyskania 105 frakcji po 20 ml. Wszystkie frakcje 51—90 anali¬ zuje sie przy rozcienczeniu 1 : 50. Pik aktywnosci biologicznej wystepuje dla frakcji 67—75 z maksi¬ mum dla frakcji 70 i 71. Frakcje 68—75 laczy sie uzyskujac 16E ml roztworu. Do 146 iml polaczonych frakcji dodaje sie 3 ml 360 mmolowego buforu fosforanu sodowego o pH=7,0 i roztwór zateza sie do objejtosci 9 ml. Ten koncentrat, który reprezen¬ tuje 78°/© [calkowitej aktywnosci biologicznej sub¬ stancji 'Wprowadzonej do kolumny wypelnionej Bio-Gel P-2, odparowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymuje sie 185 mg osadu. 17 ml pozostajacych próbek frakcji 6&—76 odparowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymuje sie 1,9 mg substancji sta- lej o mocy 1050 jednostefle/mg.Przyklad V. Rurke z liofilizowana hodowla Streptomyces cattleya otwiera sie w warunkach aseptycznych i zawartosc zawiesza sie w 0,8 ml sterylnej soli Davis'a o nastepujacym skladzie: 0,5 io g cytrynianu sodowego, 7,0 g K*HP04, 3,0 g KH*P04, 1,0 g /NH4/^S04, 0,11 g MgS04-7H«0 i 1000 ml wody destylowanej. Te zawiesine stosuje sie do zaszczepienia 4 hodowli pozywki A /plus agar/ o nastepujacym skladzie: Pozywka A Produkt autolizy drozdzy /Ardamine*/ 10,0 g Glikoza 10,0 g +Bufor fosforanowy 2,0 ml MgS04 •71^0 0,05 g Woda destylowana 1000 ml pH ustalone na 6*5 przy uzyciu NaOH Zaszczepione hodowle inkubuje sie w ciagu 1 tygodnia w cieplarce w temperaturze 28°C oraz przechowuje sie w temperaturze 4°C. ml pozywki A przenosi sie w warunkach aseptycznych do jednej z tych hodowli, zarodniki i powietrzna grzybnie zdrapuje sie do zawiesiny i 3,3 ml tej zawiesiny stosuje sie do zaszczepienia 500 ml pozywki A, umieszczonej w kolbie uszczel¬ nionej Erlemmeyera o objetosci 2 litry. Te wy¬ siana kolbe wytrzasa sie w temperaturze 28°C na wytrzasarce z szybkoscia 160 obrotów/minute /skok 50,6 nim/ w ciagu 48 godzin.Hodowle, z tej wysianej kolby stosuje sie do zaszczepienia 160 litrów pozywki A, umieszczonej w fenrifntorze ze stali nierdzewnej do wysiewa¬ nia o objetosci 190 litrów, Fermentor ten pracuje w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C z szyb- 40 koscia 150 obrotów/minute i przeplywie powietrza 0,084 ma/minute. W razie potrzeby dodaje sie srod¬ ka przeciw pienieniu, to jest Poliglycolu 2000 /Dow Chemical Corp./, lecz nie wiecej niz Oyl°/o.Oznaczenia pH sa nastepujace: Czas, godziny 0 12 24 pH 6,3 6,6 5,6 litrów hodowli z tego wysiewanego fermen- tora stosuje sie do zaszczepienia 467 litrów pozyw- so ki E, umieszczonej w fermentorze ze stali nje- rdzewnej o objetosci 756 litrów. Sklad pozywki E jest nastepujacy: Pozywka E Cereloza 25,0 g Natmok kukurydziany /wilgotny/ 15,0 g Rozpuszczalne destylaty 10,0 g Preparat z nasion bawelny /Pharmamedia/ 5,0 g CoCl2 •6H^O 0,01 g CaCO, /po regulacjipH/ 3,0 g 55 * Ardamine: Yeast Products Corporation.+Roztwór buforu fosforanowego: 91,0 g KHjjPO^ 95,0 g Na2HPD4 i 1000 ml wody destylowanej. Dla 65 hodowli: dodatek agaru — 25,0 g/litr.96 314 Poliglycol2000 0,25% Wodabiezaca 1000 ml pH: po reguilacji na 7,3 przy uzyciu NaOH Fermentor ten pracuje w ciagu 120 godzin w temjperaturze 24^C mieszany z szybkoscia 95 obro¬ tów/minute i przy przeplywie powietrza 0,28 m8/ /minute. W razie potrzeby dodaje sie srodka prze- ciwpiennego Poliglycol 2000, lecz je^o ilosc nie przekracza 0,1%. W tablicy 10 przedstawiono wy¬ niki prób na aktywnosc przeczwbakteryjna.Tablica 10 s Czas ' 0 12 24 ' 36 48 60 72 84 | 96 108 1:20 pH 6,9 6,8 6,3 6,4 6,3 6,4 6,8 7,0 7,1 7,2 7,1 Aktywnosc przeciwbakteryjna wzgledem ATCC 6538P — — — 26 32 37 41,5 41,5 400 litrów calej brzeczki filtruje sie na prasie filtracyjnej z dodatkiem do 4% wagowych/obje¬ tosc srodka ulatwiajacego filtracje. Do filtratu do¬ daje sie 1,2 g soli sodowej kwasu /etylenodwu- nitrylo/-tetraoetowego. Filtrat oziebia sie do tem¬ peratury 6°C, reguluje sie pH do 4,0 ± 0,2 i utrzy¬ muje sie w temperaturze 6°C. Zimny filtrat adsor- buje sie na 38 litrów zywicy Dowex 50X4 w for¬ mie jonów sodowych /20—50 mesh/ z szybkoscia 4 litry/minute Adsorbat eluuje sie 2% wodnym roztworem pirydyny oraz zbiera sie i bada 3 frak¬ cje po 19 litrów. Próby te wskazuja na wystepo¬ wanie 27% wejsciowej aktywnosci biologicznej we frakcjach 2 i 3. Eluaty frakcji 2 i 3 laczy sie, za- teza do objetosci 3,7 litra i ustala sie pH=7. pH tych 3,7 litrów zatezonego eluatu ustala sie na 7,4 i adsorbuje sie na 2,5 litrach Dowex 1X2 w formie jonów chlorkowych /50—ilOO mesh/ z szybkoscia 200 ml/minute. Zywice eluuje sie z ta sama szybkoscia zdejonizowana woda. Zbiera sie frakcje 2X2 litry, 1X800 ml, 1X4 litry i 1X2 litry oraz w razie potrzeby reguluje sie ich pH do 7,0.Frakcje 4 /4 litry/, która reprezentuje 50% aktyw¬ nosci koncentratu, filtruje sie na filtrze o wymia¬ rze porów 0,45 mikrona /Millipore/. Klarowny prze¬ sacz odparowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzy¬ muje sie 12,4 g substancji stalej o mocy 270 jedno¬ stek/mg. 4 g tej substancji stalej rozpuszcza sie w 0,1 molowym octanie 2,6^1utydyny jako buforze o pH= =6,3. 50 ml roztworu o pH=6,3 utrzymany z do¬ datkiem kwasu octowego, wprowadza sie do ko¬ lumny o wymiarach 5X114 cm wypelnionej zy¬ wica Dowex 50X8 /200—400 mesh/ w formie jonów 2,6-lutydyny, zrównowazonym uprzednio 0,1 molo- 26 wym buforem. Zywica rozwija sie tym samym 0,1 molowym buforem o pH=6,3 z szybkoscia 14 ml/ /minute.Wyplywajacy strumien cieczy kontroluje sie za pomoca rejestrujacego róznicowego refraktometru Mecco-matic. Kolumne rozwija sie az do zebrania 150 frakcji po 20 ml. Wszystkie frakcje 72—150 analizuje sie przy rozcienczeniu 1 : 50. Pojedynczy pik aktywnosci biologicznej wystepuje dla frakcji 76—ii48 z maksimum dla frakcji. 92—102. Frakcje 86—1:13 laczy sie i otrzymuje 580 ml roztworu, który wykazuje 71% aktywnosci biologicznej roz¬ tworu, wprowadzanego do kolumny wypelnionej Dowex 50X8. Roztwór ten odparowuje sie ze sta- nu zamrozenia.Uzyskana substancje stala rozpuszcza sie w 0,1 molowym octanie 2,6-lutydyny jako buforze o pH= =7,0 i otrzymuje sie 25 ml roztworu. Roztwór ten' wprowadza sie do kolumny o wymiarach 5X108 cm, wypelnionej Bio-Gel P-2 /200—400 mesh/, zrównowazonym uprzednio 0,1 molowym buforem.Zel rozwija sie. nastepnie tym samym buforem z szybkoscia 9 mfl/minute.Wyplywajacy strumien kontroluje sie przy uzy- ciu róznicowego refraktometru Mecco-matic. Roz¬ wija sie az do uzyskania 105 frakcji po 20 ml.Frakcje 65—80 analizuje sie przy rozcienczeniu 1 : : 200. Pik aktywnosci biolgicznej obserwuje sie dla frakcji 67—76. Frakcje 70—72 laczy sie i odparo- wuje ze stanu zamrozenia, uzyskujac 16 mg sub¬ stancji stalej o mocy 13 800 jednostek/mg. Frakcje 69, 73 i 74 laczy sie, odparowuje ze stanu zamro¬ zenia i otrzymuje 20,2 mg substancji stalej o mo¬ cy 5(200 jednostek/lmg. 16 mg substancji stalej rozpuszcza sie w 0,1 mo¬ lowym octanie 2,6-lutydyny jako buforze o pH= =7,0, aby uzyskac 10 ml roztworu. Roztwór ten wprowadza sie na zloze Bio-Gel P-2 /200—400 mesh/ o wymiarach 5X108 cm, zrównowazonego 40 tym samym buforem. Zel rozwija sie buforem z szybkoscia 9 ml/minute. Wyplywajacy strumien kontroluje sie przy uzyciu rejestrujacego róznico¬ wego refraktometru Mecco-matic. Rozwijanie pro¬ wadzi sie az do uzyskania 105 frakcji o objetosci 45 20 ml. Wszystkie frakcje 65—80 analizuje sie przy rozcienczeniu 1 :200.Pik aktywnosci biologicznej obserwuje sie dla frakcji 67—75. Frakcje 68—72 laczy sie, odparo¬ wuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymuje sie 0,1 5D mg substancji stalej o mocy 15 000 jednotetek/mg.Przyklad VI. Rurke z liofilizowana hodowla Streptomyces cattleya otwiera sie w warunkach aseptycznych i zawartosc zawiesza sie w 50 ml sterylnej pozywki A umieszczonej w 250 ml, u- 55 szczelnionej kolbie Erlenmeyera. Sklad pozywki A jest nastepujacy: Pozywka A Produkt autolizy drozdzy /Ardamine*/ 10,0 g eo Glikoza 10,0 g *Busor fosforanowy 2,0 ml * Ardamine: Yeast Products Corporation.+Roztwór buforu fosforanowego: M,0 g KH&P04, 65 95,0 g Na^HP04 i 1000 ml wody destylowanej.96314 27 MgS04-7H^O 0,05 g Woda destylowana 1000 ml pH ustalone na 6,5 przy uzyciu NaOH Kolbe z zaszczepiona pozywka wytrzasa sie w ciagu 48 godzin W temperaturze 28°^ z szybkoscia 220 obrotów/minute /skok 50,8 mim/. Odbiera sie 40 nal tej brzeczki w warunkacli aseptycznych i mieska sie z 40 ml sterylnej 20*/o objetosciowo gliceryny. Porcje po 2 ml Uzyskanej mieszaniny |)ipetuje sie do sterylnych naczyn o pojemnosci 1 drani oraz zamraza sie i przechowuje w fazie pa¬ rowej zamrazalnika z cieklym azotem.Zawartosc zamrozonych naczyn stosuje sie do za¬ szczepienia 50 ml pozywki A, umieszczonej w u- szczelnionej kolbie Erlenmeyera o Objetosci 250 ml.Te wysiewana kolbe wytrzasa sie w ciagu 24 go¬ dzin w temperaturze 28°C na wytrzasarce z szyb¬ koscia 160 Obrotów/minuta Porcje o objetosci 10 ml z tej wysianej kolby stosuje sie do zaszczepienia 500 ml pozywki A, u- mieszczonej w uszczelnionych kolbach Erlenmeye¬ ra o objetosci 2 litry. Te wysiane kolby wytrzasa sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 28°C na wy¬ trzasarce z szybkoscia 160 obrotów/minute.Porcje 1000 ml z tych wysianych kolb stosuje sie do zaszczepienia 467 litrów pozywki A, umiesz¬ czonej w fermentorze z stali nierdzewnej o obje¬ tosci 756 litrów. Fermentor ten pracuje w ciagu 24 godzin w temperaturze 28qC, z mieszaniem z szybkoscia 130 obrotów/minute i przeplywem po¬ wietrza 0,28 ms/minute. W razie potrzeby stosuje sie Poliglycol 2000 /Dow Chemical Corp./ jako srodek przeciw pienieniu, lecz jego ilosc nie prze¬ kracza 0,l°/f. Wyniki pomiarów pH i zawartosci dekstrozy podano w tablicy 11.Ta 1 Czas /godziny/ pH Defcstroza mg/ml blica 11 0 6,4 8,1 12 6,4 B,l 24 | 6,6 | 8.1 453 litry tej hodowli stosuje sie do zaszczepienia 4082 litrów pozywki E w fermentorze ze stali nie¬ rdzewnej o objetosci 5670 litrów. Sklad pozywki E jest nastepujacy: Pozywka E Cereloza 25,0 g Namok kukurydziany /wilgotny/ 15,0 g Rozpuszczalne pozostalosci podestylacyjne 10,0 g Preparat z nasion bawelny /Pharmamedia/ 5,0 g CoCl2-6H*Q 0,01 g CaQOs Jpo regulacjipH/ 3,0 g Poliglycol2000 0,25% Woda biezaca 1000 ml pH: po regulacji na 7,3 przy uzyciu NaOH Fermentor ten pracuje w ciagu 144 godzin w temperaturze 24°C z mieszaniem z szybkoscia 70 obrotów/minute i przy przeplywie powietrza 1,52 mVminute. W razie potrzeby dodaje sie Poligly- colu 2000 jako srodka przeciw pienieniu, lecz je¬ go ilosc nie przekracza Ojl*/; Próby przeprowadza sie z roztworem sklarowa¬ nym po odwirowaniu, brzeczki. Wyniki przedsta- 45 50 55 60 65 28 wiono w tablicy 12 pod naglówkiem „Aktywnosc przeciwbakteryjna wzgledem ATCC 6536P". Próby przeprowadza sie dyfuzyjna metoda plytkowa przy uzyciu krazków z bibuly filtracyjnej o srednicy 3/8 cala i plytek o objetosci 10 ml.Wyniki przedstawiono w tablicy 12 pod na¬ glówkiem „Aktywnosc przeciwbakteryjna /Plytki ml/". Plytki o objetosci 10 ml przygotowuje sie nastepujaco: calonocna hodowle testowanego organizmu Stap- hylococcus aureus ATCC 6530P w odzywczym bu¬ lionie z dodatkiem 0,2% ekstraktu drozdzowego rozciencza sie odzywczym bulionem z dodatkiem 0,2Vt ekstraktu drozdzowego do zawiesiny, wyka¬ zujacej 40°/o transmitancje przy dlugosci fal 660 m\i. Te zawiesine dodaje sie do odzywczego aga¬ ru Difco z dodatkiem 2,0 g/litr ekstraktu drozdzo¬ wego Difco w temperaturze 47—48°C w celu uzys¬ kania mieszanki zawierajacej 33,2 ml zawiesiny na litr agaru. 10 ml tej zawiesiny wylewa sie na plytki Petriego o srednicy 85 mm i plytki te o- ziebia sie i przechowuje w temperaturze 4°C przed uzyciem /maksimum 5 dni/.Tablica 12 Czas 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 pH 6,6 6,3 ,8 6,0 6,0 ,7 ,8 6,2 6,4 6,4 6,3 ,8 .9 Dekstro- za mg/ml 22,2 ,2 18,0 13,2 8.6 6,4 2,7 0,3 0,2 0 Aktywnosc przeciw¬ bakteryjna wzgledem ATCC 6538P (mm) 41,5 \ Aktywnosc przeciw¬ bakteryjna (plytki lOml) (mm) 0 21,5 21,5 26,5 ,5 27,5 36,0 n 35,0 37,0 37,5 37,5 408(2 litry brzeczki fermentacyjnej filtruje sie na 75 cm prasie filtracyjnej z dodatkiem do 4°/o wa¬ gowych/objetosc czynnika ulatwiajacego filtracje.Do filtratu dodaje sie 12 g soli sodowej kwasu /etylenodwunitrylo/tetraoctowego. Filtrat oziebia sie do temperatury 6°C, reguluje sie jego pH do 4,5 ± 0,2 i utrzymuje sie w temperaturze 6°C. Zim¬ ny filtrat adsorbuje sie na 480 litrów zywicy Do- wex 50X4 w formie jonów sodowych ,/20^50 mesh/ z szybkocia okolo 48 litrów/minute. Adsorbat prze¬ mywa sie 480 litrów zdejonizowanej wody i eluuje sie 2% wodnym roztworem pirydyny z szybkoscia 24 litry/minute. Zbiera sie frakcje 300 litrów, 520 litrów i 240 litrów i bada sie je przy pH=7,0. Pró¬ by te wskazuja, ze frakcje te reprezentuja odpo¬ wiednio 4, H6 i Wg aktjrwnosci biologicznej sub- 1stancji, wprowadzonej do kolumny wypelnionej Dowex 50X4 w formie jonów sodowych. Eluat96 314 29 frakcji 2 zateza sie do objetosci 48 litrów i regu¬ luje sie do pH=7. 48 litrów tego koncentratu doprowadza sie do pH=7,3 i adsor$uje sie na % litrów zywicy Do- wex 1X2 /50^-100 (mesh/ w formie jonów chlorko- s wych z szybkoscia 7,8 .Mtra/minute. Zywice eluuje sie zdejonizowana woda z taka sama szybkoscia.Zbiera sie 4 frakcje, to Jest dwie po 48 litrów, jedna — 70 litrów i jedna — 48 litrów. Ustala sie pH tych. frakcji 7. Próby wskazuja, ze we frakcji io o objetosci 70 litrów wystepuje 88°/* wyjsciowej aktywnosci biologicznej. Te frakcje zateza sie do objetosci 18 litrów przy pH=7,0 i filtruje sie przez zloze o srednicy porów 0,45 mikrona /Millipore JFil- ter/. Przesacz odparowuje sie ze sttaou zamrozenia 15 i otrzymuje sie 90 g produktu o mocy 310 jedno¬ stek/mg. . g tego produktu rozpuszcza sie w 0,1 molo¬ wym octanie 2,6-lutydyny jako bufortee o pH=6,3.Dodaje sie kwasu octowego do pH^,3 i 125 ml 20 tego roztworu wprowadza sie do kolumny o wy¬ miarach 7,8Xi14i2 cm, wypelnionej zywica Dowex 50X8 /20O-^40O imesh/ w formie jonów 2,6-lutydy¬ ny, zrównowazonej uprzednio buforem i rozwija sie 0,1 molowym buforem z szybkoscia 25 ml/mi- 25 nute. Odbiera isie przedgon o objetosci 3 litry, a nastepnie obiera sie 200 frakcji po 20 ml. Co czwarta frakcje o numerach 36—492 analizuje sie przy rozcienczeniu 1 :200. .Aktywnosc biologiczna stwierdza sie we frakcjach 30 56—il9i2 przy maksimum dla frakcji 92—96. Frak¬ cje 80-r436 laczy sie i dodaje sie -590 ml zdejoni- zowanej wody, uzyskujac 1780 ml roztworu. Odla¬ ny, rozcienczony roztwór reprezentuje 62% wyj¬ sciowej aktywnosci biologicznej substancji, wpro- 35 wadzanej do kolumny wypelnionej Dowex 50X8.Hoztwór ten odparowuje sie ze stanu zamrozenia i osad rozpuszcza isie w 0yl molowym octanie 2,6- -lutydyny jako buforze o pH=7,0. 27 ml roztworu wprowadlza sie do kolumny o wymiarach 5X112 40 cm, wypelnionej Bio-Gel P-i2 /200—400 mesh/, zrównowazonego uprzednio 0,1 molowym buforem.Zel rozwija sie nastepnie tym samym buforem z szybkoscia 10 ml/minute.Wyplywajacy strumien reguluje sie przy uzyciu 45 rejestrujacego róznicowego refraktometru Meccc*- rmatic. Rozwija sie az do uzyskania 105 frakcji po 20 ml. Wszystkie frakcje 70—95 analizuje sie przy rozcienczeniu 1 : 300. Wystepowanie, aktyw¬ nosci biologicznej stwierdza sie dla frakcji 73—82 50 z maksimum dla frakcji 77 i 78. Frakcje 75-^80 odparowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymuje sie 90 mig antybiotyku o sredniej mocy 10 000 je¬ dnostek/mg. 90 mg tej substancji stalej rozpuszcza sie w 4 ml 55 0,01 molowego fosforanu potasowego jako buforu o pH=7. Ten roztwór, zawierajacy 596 jednostek gestosci optycznej produktu reakcji hydroksylo¬ aminy i tienamycyny ,/te miare zawartosci tiena- mycyny opisano przy koncu tego przykladu/, wpro- eo wadza sie do kolumny o srednicy 1,7 cm wypel¬ nionej 90 ml ¦ przemytego. XAD-2 i równowazonego przed uzyciem 180 ml 0,01 molowego fosforanu potasowego jako buforu o pH=7, w temperaturze °C. XAD-2 przemywa sie przed uzyciem kolej- 65 no: 1/5 objetosciami In NaOH, a nastepnie zdejo¬ nizowana wojda az do uzyskania obojetnego odczy¬ nu eluentu, 2/5 objejtosciami In HC1, a nastepnie zdejonizowana woda az do uzyskania obojetnego odczynu eluentu, 3/5 objetosciafmi metanolu, ace¬ tonu, 000il m czterosocjowej soM EDTA i w koncu woda destylowana. Wsfcystkie rozpuszczalniki utrzy¬ muje sie pod zmniejszonym cisnieniem przed uzy¬ ciem.Po; próbce do kolumny wprowadza sie 2 pojeje po;,2 ml buforu fosforanowego. Koluirmej rozwija sie w temperaturze 5°C przy uzyciu buforu, poda¬ wanego z szybkoscia 2 nul/minute. Zbiera sie frak¬ cje o objetosci 4 mi. Frakcje, uzyskane po odebra¬ niu 100 ml eluatu i konczace uzyskanie 253, ml eluatu, laczy sie i zateza do objetosci 6 ml na obrotowym odparowalniku w temperaturze ponizej °C i pod zmniejszonym cisnieniem.Ten roztwór, zawierajacy 436 jednostek gestosci optyczriej produktu reakcji hydroksytoaminy i tie¬ namycyny, wprowadza sie do kolumny o srednicy 1,7 cm, wypelnionej. 96 ml XAD-n2 przemytego i zrównowazonego destylowana woda w temperatu¬ rze 5°C. Po próbce wprowadza sie 2 porcje po 2 ml destylowanej wody. Kolumne rozwija sie, destylo¬ wana woda z szybkoscia 2 imsl/mUriufte. Zbiera sie frakcje o objetosci 4 ml. Frakcje, uzyskane po odebraniu HO0 ml eluatu i konczace uzyskanie 151 ml eluatu, odbiera sie i zateza na obrotowymi od¬ parowalniku do objetosci 2,73 ml oraz roztwór lio¬ filizuje sie, uzyskujac 6,40 mg tienamycyny. Frak¬ cje, uzyskane pomiedzy 152 i 845 mi, odlewa sie i zateza na obrotowym odparowalniku do objetos¬ ci 3,34 ml i po liofilizacji otrzymuje sie lii,58 mg antybiotyku. Frakcje te zawieraja w sumie 389 jednostek gestosci optycznej produktu reakcji hy¬ droksyloaminy z antybiotykiem. Oznacza to 3,1- -krotne oczyszczenie w stosunku do substancji wprowadzanej do kolumny wypelnionej CAD-2 i prowadzi do obliczonej mocy 31O0O jednostek/mg.Spelrtrofotometryczna analiza próbki tego produk- 1% tu wskazuje wartosc Ej ^ =i253 przy 297 nm, zmierzona w buforze fosforanowym o pH=7.Absorbancja produktu reakcji hydroksyloaminy z tienamycyna. Czesc absorbancji, zmierfeona przy 297 .hm, która mozna przypisac zawartosci anty¬ biotyku w zanieczyszczonych próbkach okresla sie metoda selektywnej ekstynkcji tej absonbancji /z jednoczesnym zdezaktywowaniem antybiotyku/ na drodze reakcji z rozcienczona hydroksyloamina.Dla próbek, przygotowanych w 0,01 molowym fosforanie potasowym jako buforze o pH=7,0, po¬ czatkowa wartosc AjgY wynosi 0,06^-^2,0. Swiezo przygotowana, obojejtna hydroksyloamina /NHzOH« • HC1 plus NaOH do koncowego pH=7/ dodaje sie do ostatecznego stezenia 10 mmoli i reakcje prze¬ prowadza sie w temperaturze pokojowej w ciagu co najmniej 30 minut. Gdy uzyskana wartosc A^ odejmuje sie, od poczatkowego odczytu /poprawka na rozcienczenie dodawanego reageritu/ to otrzy¬ muje sie absorbancje produktu reakcji hydroksy¬ loaminy z antybiotykiem. Dla czystych roztworów96 314 31 tienamycyny absorbancja produktu reakcji hydro¬ ksyloaminy z antybiotykiem wynosi 94,5%.Przyklad VII. Porcje 10 g z 99 g substancji stalej, otrzymanej przez suszenie ze stanu zamro¬ zenia wedlug przykladu VI przez oczyszczanie na zywicy Dowex 1X2, rozpuszcza sie w 0,1 molowym ocCaime 2,6-Juiydyny jako buforze o pH=M5,3. Do- da|ac kwasu octowego ustala sie pH—6,3 i 125 ml tego roztworu wprowadza siie do kolumny o wy¬ miarach 7,6X142 cm wypelniona zywica Dowex 50Xt8 w formie jonów 2,6-ltitydyny, uprzednio rów¬ nowazonej buforem. Kolumne rozwija sie 0,1 m buforem z szybkoscia 35 ml/minute. Zbiera sie 3,6 litra przedgonu oraz 200 frakcji po 20 ml. Co czwarta frakcje o numerze 6 do 194 bada sie przy rozcienczeniu ii : 200.Aktywnosc biologiczna wystepuje we frakcjach 18 do 178 i osiaga maksimum dla frakcji 62 do 82.Frakcje 42 do 102 laczy sie i dodaje sie do nich 640 ml zdejonizowanej wody, uzyskujac 1920 ml roztworu. Odlany, rozcienczony -roztwór reprezen¬ tuje 03°/* aktywnosci biologicznej substancji, wpro¬ wadzanej do kolumny wypelnionej Dowex 50X6 i roztwór ten odparowuje sie ze stanu zamrozenia.Osad rozpuszcza sie w 0,1 molowym octanie 2,6- -iLCtydyny jako buforze o pH=7,0. 25 ml tego roz¬ tworu wprowadza sie do kolumny o wymiarach &y&2 cm, wypelndonej Bio-Gel P-2 /200—400 mesh/, równowazonej uprzednio 0,1 molowym bu¬ forem. Zel rozwija sie tym salmym buforem z szybkoscia ilO ma/mirnute.Wyplywajacy roztwór kontroluje sie przy uzyciu rejestrujacego róznicowego refraktometru Mecco- mnatic. Rozwija sie az do uzyskania 125 frakcji jM»20 ml. Kazda frakcje 70 do 89 analizuje sie przy rozcienczeniu 1:300. Aktywnosc biologiczna stwierdza sie dla frakcji 72 do dl z maksimum dla frakcji 77. Frakcje 75—79 odparowuje sie ze sta¬ nu zamrozenia i otrzymuje sie 100,5 mg antybioty¬ ku o mocy 6320 jednostek/mg. 100,5 mg tego stalego produktu rozpuszcza sie w 4 mil 0,01 molowego fosforanu potasowego jako buforu o pH=7. Ten roztwór, zawierajacy 692 jednostki gestosci optycznej produktu reakcji hy¬ droksyloaminy z tienamycyna, wprowadza sie do kolumny o srednicy 1,7 om, wypelnionej 90 ml przemytego XAD-2 i równowazonego przed uzy¬ ciem za pomoca 180 ml 0,01 molowego fosforanu potasowego jako buforu o pH=7 w temperaturze °C. XAD-2 przemywa sie uprzednio kolejno: 1/5 objejtosciami In NaOH, a nastepnie zdejonizowana woda az do uzyskania obojetnego odczynu eluen- tu, 2/5 objejtosciami In Hd, a nastepnie zdejoni- zewana woda az do uzyskania obojetnego odczynu eluentu, 3/5 objetosciami metanolu, acetonu, 0,001 molowym roztworem czterosodowej soli EDTA i w koncii destylowana woda. Przed uzyciem wszy¬ stkie rozpuszczalniki utrzymuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem.Po próbce do kolumny wprowadza sie dwie por¬ cje po 2 ml buforu fosforanowego. Kolumne roz¬ wija sie w temperaturze 5°C buforem z szybkoscia 2 ml/minute. Zbiera sie frakcje o objetosci 4 ml Frakcje uzyskano po odebraniu 109 mol eluatu i gdy odbierze sie w sumie 309 32 i dodaje sie do nich próbke illl,53 mg antybiotyku, uzyskanego wedluig przykladu VI /oczyszczonego na XAD-2/ i zawierajacego 186 jednostek gestosci optycznej produktu reakcji hydroksyloaminy i tie- namycyny. Polaczone frakcje eluatu wraz z doda¬ nym antybiotykiem zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem na obrotowym ddiparowalniku w tem¬ peraturze ponizej 10°C do objetosci 7 ml.Ten roztwór, zawierajacy 720 jednostek gestosci optycznej produktu reakcji hydroksyloaminy z tie¬ namycyna, wprowadza sie do kolumny o srednicy 1,7 om, wypelnionej 90 ml XAD-2, przemytego jak to powyzej opisano i równowazonego przed uzyciem woda destylowana w temperaturze 5°C. Po prob- ce wprowadza sde dwie porcje po 2 mil destylowa¬ nej wody. Kolumne rozwija sie destylowana wo¬ da z szybkoscia 2 ml/minute. Odbiera sie frakcje po 4 ml eluatu. Frakcje, uzyskane po odebraniu 109 md eluatu i przed odebraniem w sumie 3011 ml eluatu, odlewa sie i zateza na obrotowym odjparo- walniku do objetosci 10,3 ml. Ten roztwór, zawie¬ rajacy 589 jednostek4 gestosci optycznej produktu reakcji hydroksyloaminy z tienamycyna, liofilizuje sie i otrzymuje sie 23,6 mg antybiotyku o obliczo- nej mocy 30140 jednostek/mg.Uzyskany w ten sposób antybiotyk jest bialym, bezpostaciowym cialem stalym o wlóknistej kon¬ systencji. Jego próbka wprowadzona do szklanej kapilary i ogrzewana z szybkoscia 3°C/minute ule- ga rozklladowi bez przechodzenia przez faze ciekla w nastepujacych stadiach: miekniecie wystepuje przy temperaturze 130—140°C bez zmniejszania ob¬ jetosci osadu i przebiega do temperatury 170— ^174°C, w którym to zakresie substancja zólknie; spiekanie i stopniowe poglejbianie sie ozerwonawo- -brazowego zabarwienia obserwuje sie w zakresie 180-h200°C i w koncu w temperaturze 2Ó5°C prze¬ biega karfoonizacja i stwierdza sie wystepowanie sladowych ilosci czesci stalych. 40 Spektrofotometryczna analiza innej próbki tej substancji wskazuje pik absorbancji przy 296,5 nm ,1% \ cm' 45 daje nastepujace wyniki: 1/ 5,67*/* wagowych stra¬ ty podczas suszenia w temperaturze^ pokojowej pod zmniejszonym cisnieniem w ciagu 4 godzin i 2y sklad: 47,68% — C, 6,22% — H, 111,48% — N. Wy¬ niki te zgodne sa z doswiadczalnym wzorem 50 C11H16Ni04S • /NH8/028, gdyz obliczony sklad ele¬ mentarny odpowiadajacy temu doswiadczalnemu wzorowi wynosi: C — 47,68%, H — 6,;13%s N — 11,52%, S — 11,57%. i O — 23,1%. Polarometryczna analiza tej próbki o stezeniu 1 mg/ml w 10 mimo- 55 lowym fosforanie 'potasowym jako buforze wyka¬ zuje wlasciwa skrecalnosc optyczna / W widmie w podczerwieni /fig./ dla czystej prób¬ ki wystepuja charakterystyczne piki absorpcji przy 1765 cm-1, 1650^11550 cm-1, 2800^2500 cm"1 i 60 3500—3100 cm-1. W widmie NMR /przy 100 MHz/ próbki tego produktu rozpuszczonego w D^O wy¬ stepuje dublet przy 8 1,275, para dubletów przy 8 3,39 i multiplety przy 8 3,15 i 8 4,20, przy czym sa to sygnaly charakterystyczne dla tienamycy- 65 ny.96 314 33 Srodki, zawierajace antybiotyk, mozna podawac w formie kilku dawek jednostkowych, na przyklad w formie stalych lufo cieklych dozoladkowych da¬ wek. Ciekle lufo stale dawki srodka moga zawie¬ rac 0,1—99%, a najlepiej 10—60% aktywnej sub¬ stancji. Zwiazek zawiera na ogól 26—1000 mg ak¬ tywnego skladnika w przeliczeniu na cala mase zwiazku. Korzystne jest jednak zazwyczaj stoso¬ wanie dawki, zawierajacej okolo 250—ilOOO mg aktywnego skladnika. Do podawania pozajelitowe¬ go stosuje sie na ogól czysty zwiazek w slabo za¬ kwaszonej, sterylnej wodzie lufo w formie rozpusz¬ czalnego proszku, przeznaczonego do uzyskania roz¬ tworu. Reprezentatywne srodki mozna otrzymywac* nastepujacymisjposofoami: ,. y Kapsulki Na kapsulke Tienamycyna 400mg v , Laktoza /Farmakopea USA/ w ilosci wystarcza¬ jacej /kapsulka Nr 0, okolo 475 mg kazda/.Wedlug powyzszego przykladu, aktywny zwia¬ zek i rozcienczalnik miesza sie w celu uzyskania jednorodnej mieszanki, kt6ra recznie lub przy po¬ mocy odpowiedniego urzadzenia wprowadza sie do zelatynowych kapsulek o twardosci Nr 0. Miesza¬ nie i wypelnianie kapsulek przeprowadza sie naj- dogodniej w pomieszczeniu o wilgotnosci wzgled¬ nej ponizej 40%.Sklad tabletek /ilosci podawano wagowo na tab¬ letke/: 330 mg tienamycyny, 192 mg fosforanu wapniowego, 190 mg laktozy /Farmakopea USA/, 80 mg skrobi kukurydzianej i 8 mg stearynianu magnezu /w sumie 800 mg/.Wedlug powyzszego przykladu, aktywny sklad¬ nik miesza sie z fosforanem wapniowym, laktoza i mniej wiecej polowa ilosci skrobi kukurydzianej.Mieszanke granuluje sie przy uzyciu 15% pasty skrobi kukurydzianej, zgrubnie przesiewa sie i po¬ nownie przesiewa sie przez sito Nr 16. Do mie¬ szanki dodaje sie uzupelniajace ilosci skrobi ku¬ kurydzianej i stearynianu magnezu oraz prasuje sie ja na tabletki o srednicy okolo 12,5 mm i wadze 800 mg.Alternatywnie, aktywny skladnik miesza sie z fosforanem wapniowym, laktoza i polowa skrobi kukurydzianej. Mieszanke „prasuje sie wstepnie'" w ciezkiej prasie z wytworzeniem zwartej masy, przypominajacej tabletki. Tabletki, te rozdrabnia sie do granulatu o wielkosci 16 mesh. Dodaje sie 34 uzupelniajace ilosci skrobi kukurydzianej i steary¬ nianu magnezu oraz mieszanke prasuje sie na tab¬ letki o srednicy okolo 12,5 mmi wadze 800 mg.Srodek liofilizowany Na ampulke /do zastrzyków/ Tienamycyna 25 mg Woda do zastrzyków /FarmakopeaUSA/ 5 ml Wedlug powyzszego przykladu, aktywny sklad- *• nik rozpuszcza sie w wystarczajacej ilosci wody do zastrzyków w podanych proporcjach. Roztwór przepuszcza sie przez swiece Selasa lufo przepone filtracyjna /Millipore/ w celu "sterylizacji. Roztwór -¦¦ rozdziela sie w sterylnych ampulkach. Ampulki i . ich zawartosc zamraza sie i wode usuwa sie me- ,toda liofilizacji w warunkach aseptycznych. Am¬ pulki, zawierajace sterylny, suchy osad, uszczelnia sie w warunkach aseptycznych.W celu odtworzenia srodka do podawania poza- jelitowego do zawartosci ampulki dodaje sie 5 ml sterylnej wody do zastrzyków.Dozoladkowy srodek ciekly Na 1000 ml Tienamycyna 1,0 g Sacharoza 600,0 g Glikoza 250,0 g Benzoesanisodowy 1,0 g Koncentrat olejku pomaranczowego 0,2 ml Oczyszczona woda /Farmakopea USA/ w ilosci uzupelniajacej do 1000 ml.Sacharoze i glikoze rozpuszcza sie w okolo 400 ml wody, podgrzewajac w celu ulatwienia utwo¬ rzenia roztworu. Ten roztwór oziebia sie i dodaje sie benzoesanu sodowego, a nastepnie zatezonego olejku pomaranczowego. Do roztworu dodaje sie wody do objetosci okolo 900 mil i wprowadza sie antybiotyk. Roztwór klaruje sie przepuszczajac go przez gruboziarnisty filtr. 40 PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania antybiotyku tienamycyny, znamienny tym, ze poddaje sie podpowierzchnio- wej hodowli mikroorganizmu Streptomyces cattle- ya NRRL-8057 w wodnym srodowisku odzywczym, 45 zawierajacym przyswajalne zródla; weglowodanów, azotu i sple nieorganiczne, w warunkach aerobo- wych, po czynu wyodrebnia sie wyjtworzony anty¬ biotyk.96 314 CH3-CH(OH) S-CH2-CH2-NH2 COOH Wzór J'l 9. IH \2
1.5 W 2f 1000 9W 600 TM MO WJ Bltk 409/78 r. 90 egz. A4 Cena 45 zl PL PL PL PL
PL1975184950A 1974-11-25 1975-11-24 Sposob wytwarzania antybiotyku tienamycyny PL96314B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/526,992 US3950357A (en) 1974-11-25 1974-11-25 Antibiotics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL96314B1 true PL96314B1 (pl) 1977-12-31

Family

ID=24099662

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1975184950A PL96314B1 (pl) 1974-11-25 1975-11-24 Sposob wytwarzania antybiotyku tienamycyny

Country Status (35)

Country Link
US (1) US3950357A (pl)
JP (1) JPS5839519B2 (pl)
AR (1) AR211109A1 (pl)
AT (1) AT341664B (pl)
BE (1) BE835859A (pl)
BG (1) BG27916A3 (pl)
CA (1) CA1058104A (pl)
CH (1) CH622825A5 (pl)
CS (1) CS183829B2 (pl)
CY (1) CY1092A (pl)
DD (1) DD122103A5 (pl)
DE (1) DE2552638C3 (pl)
DK (1) DK138663B (pl)
EG (1) EG11963A (pl)
ES (1) ES442920A1 (pl)
FI (1) FI53718C (pl)
FR (1) FR2291748A1 (pl)
GB (1) GB1498087A (pl)
HK (1) HK60480A (pl)
HU (1) HU178052B (pl)
IE (1) IE42067B1 (pl)
IL (1) IL48521A (pl)
KE (1) KE3094A (pl)
LU (1) LU73860A1 (pl)
MY (1) MY8100228A (pl)
NL (1) NL182008C (pl)
NO (1) NO142227C (pl)
NZ (1) NZ179332A (pl)
PH (1) PH10809A (pl)
PL (1) PL96314B1 (pl)
RO (1) RO70072A (pl)
SE (1) SE431348B (pl)
SU (1) SU576967A3 (pl)
YU (1) YU36991B (pl)
ZA (1) ZA757366B (pl)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4206202A (en) * 1974-03-28 1980-06-03 Beecham Group Limited Antibiotics
US4181716A (en) * 1974-03-28 1980-01-01 Beecham Group Limited Antibiotics
US4146610A (en) * 1974-03-28 1979-03-27 Beecham Group Limited Antibiotics mm13902
US4113856A (en) * 1974-03-28 1978-09-12 Beecham Group Limited Antibiotic mm 13902
US4172129A (en) * 1974-03-28 1979-10-23 Beecham Group Limited Antibiotics
US4189473A (en) * 1974-03-28 1980-02-19 Beecham Group Limited Antibiotic MM 13902
GB1467413A (en) * 1974-03-28 1977-03-16 Beecham Group Ltd Antibiotics
US4006060A (en) * 1974-11-25 1977-02-01 Merck & Co., Inc. Thienamycin production
US4304867A (en) * 1974-11-25 1981-12-08 Merck & Co., Inc. Culture of Streptomyces cattleya
US4000161A (en) * 1974-12-19 1976-12-28 Merck & Co., Inc. Process for purifying thienamycin
US4163051A (en) * 1975-03-15 1979-07-31 Beecham Group Limited Streptomycetal antibiotic
US4179498A (en) * 1975-03-15 1979-12-18 Beecham Group Limited Streptomycetal antibiotic
US4162304A (en) * 1975-03-15 1979-07-24 Beecham Group Limited Streptomycetal antibiotic
AU512383B2 (en) * 1975-11-21 1980-10-09 Merck & Co., Inc. Thinenamycin derivatives
US4208330A (en) * 1975-11-21 1980-06-17 Merck & Co., Inc. O-Derivatives of thienamycin
US4165379A (en) * 1975-11-21 1979-08-21 Merck & Co., Inc. N-acetyl thienamycin
US4162324A (en) * 1975-11-21 1979-07-24 Merck & Co., Inc. Antibiotics 890A1 and 890A3
US4181733A (en) * 1975-11-21 1980-01-01 Merck & Co., Inc. Carboxyl derivatives of thienamycin
CH633554A5 (en) * 1975-11-21 1982-12-15 Merck & Co Inc Process for the preparation of novel thienamycin derivatives.
US4235920A (en) * 1975-11-21 1980-11-25 Merck & Co., Inc. N-Alkylated derivatives of thienamycin
DE2652676A1 (de) * 1975-11-21 1977-06-02 Merck & Co Inc N-alkylierte derivate von thienamycin, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel
US4839352A (en) * 1975-11-21 1989-06-13 Merck & Co., Inc. N-acyl derivatives of thienamycin
US4282322A (en) * 1975-11-24 1981-08-04 Merck & Co., Inc. Process for enzymatic deacylation of antibiotics
US4196211A (en) * 1976-03-22 1980-04-01 Merck & Co., Inc. 6-(α-Hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid and derivatives thereof
DK145504C (da) * 1976-04-28 1983-04-25 Merck & Co Inc Fremgangsmaade til fremstilling af det antibiotiske stof 890a2og/eller det antibiotiske stof 890a5 og farmaceutisk acceptable salte deraf
GB1577725A (en) * 1976-06-30 1980-10-29 Beecham Group Ltd Azetidinone derivatives
US4172144A (en) * 1976-10-18 1979-10-23 Merck & Co., Inc. Schiff's base derivatives of thienamycin
GB1593524A (en) * 1976-11-19 1981-07-15 Merck & Co Inc 1-carba-2-penem-3-carboxylic acids
US4348320A (en) * 1976-11-19 1982-09-07 Merck & Co., Inc. Substituted azetidiones
US5055573A (en) * 1976-11-19 1991-10-08 Merck & Co., Inc. Process for preparing 1-carba-2-penem-3-carboxylic acid
US4234596A (en) * 1976-11-19 1980-11-18 Merck & Co., Inc. 3-(2-Aminoethylthio)-6-(1-hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid
US4146633A (en) * 1976-11-19 1979-03-27 Merck & Co., Inc. Δ3 -Thienamycin
US4210661A (en) * 1977-01-27 1980-07-01 Beecham Group Limited Synthetic β-lactam compounds, a process for their preparation and compositions containing them
US4168268A (en) * 1977-03-01 1979-09-18 Merck & Co., Inc. Process for isolating thienamycin
GR62185B (en) * 1977-03-31 1979-03-02 Panlabs Inc Preparation process of an antibiotic ps-5 and its derivatives with inhibitory activity of b-lactamase
GB1584762A (en) * 1977-04-01 1981-02-18 Beecham Group Ltd Azabicycloheptenes
NL7802826A (nl) * 1977-04-08 1978-10-10 Merck & Co Inc Thienamycinederivaat, werkwijze voor het bereiden daarvan, alsmede farmaceutische preparaten.
US4162323A (en) * 1977-04-18 1979-07-24 Merck & Co., Inc. Antibiotic N-acetyl-dehydro-thienamycin
US4235917A (en) * 1977-05-05 1980-11-25 Merck & Co., Inc. N-Alkyl-N-acyl derivatives of thienamycin
SE436569B (sv) * 1977-05-05 1985-01-07 Merck & Co Inc Analogiforfarande for framstellning av tienamycinderivat
DE2724560A1 (de) * 1977-05-31 1978-12-21 Merck & Co Inc O-derivate von thienamycin
US4123547A (en) * 1977-08-04 1978-10-31 Merck & Co., Inc. Thienamycin sulfoxide and sulphone
US4135978A (en) * 1977-08-19 1979-01-23 Merck & Co., Inc. Production of n-acyl-thienamycins
US4162193A (en) * 1977-08-19 1979-07-24 Merck & Co., Inc. Enzymatic cleavage of N-acyl-thienamycins
US4232030A (en) * 1977-09-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Substituted N-methylene derivatives of thienamycin sulfoxide and sulfone
US4150145A (en) * 1977-09-15 1979-04-17 Merck & Co., Inc. N-alkylated derivatives of thienamycin sulfoxide and sulfone
AU4061378A (en) * 1977-10-19 1980-04-17 Merck & Co., Inc. 1-azabicyclo (3.2.0) hept-2-enes
AU531084B2 (en) * 1977-10-19 1983-08-11 Merck & Co., Inc. Azetidine derivatives
US4168314A (en) * 1977-11-17 1979-09-18 Merck & Co., Inc. 6-(1'-Hydroxyethyl)-2-aminoethylthio-pen-2-em-3-carboxylic acid
US4155912A (en) * 1977-12-14 1979-05-22 Bristol-Myers Company 2-Methylpenem-3-carboxylic acid antibiotics
US4189493A (en) * 1977-12-28 1980-02-19 Merck & Co., Inc. N-heterocyclic derivatives of thienamycin
US4218463A (en) * 1977-12-28 1980-08-19 Merck & Co., Inc. 3-Substituted thio-6-amido-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid
US4172895A (en) * 1977-12-28 1979-10-30 Merck & Co., Inc. 6-(1'-Hydroxyethyl)-2-aminoethylthio-oxapen-2-em-3-carboxylic acid
US4198338A (en) * 1978-03-13 1980-04-15 Merck & Co., Inc. Process for purifying thienamycin
US4203902A (en) * 1978-04-21 1980-05-20 Merck & Co., Inc. Process for preparing 6- and 2-substituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4182711A (en) * 1978-04-27 1980-01-08 Bristol-Myers Company Antibacterial agents of the β-lactam type
SE7805032L (sv) * 1978-05-03 1979-11-03 Merck & Co Inc Karboxylsyror och derivat derav
US4880793A (en) * 1978-07-24 1989-11-14 Merck & Co., Inc. Combination of thienamycin-type antibiotics with dipeptidase inhibitors
US5147868A (en) * 1978-07-24 1992-09-15 Merck & Co., Inc. Thienamycin renal peptidase inhibitors
PH16708A (en) * 1978-07-24 1984-01-20 Merck & Co Inc Z-2-acylamino-3-monosubstituted propenoates
US4212807A (en) * 1978-08-10 1980-07-15 Merck & Co., Inc. Process for deacylating N-acyl-6-substituted-2-[2-aminoethylthio]-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4275207A (en) * 1978-08-14 1981-06-23 Merck & Co., Inc. Process for preparing 7-(1-hydroxyethyl)-3-(2-aminoethylthio)-1-carbadethiaceph-3-em-3-carboxylic acid and intermediate therefor
US4206219A (en) * 1978-10-24 1980-06-03 Merck & Co., Inc. 6- and 1-Substituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acid
US4232036A (en) * 1978-10-24 1980-11-04 Merck & Co., Inc. 6-, 1- and 2-Substituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4260627A (en) * 1978-10-24 1981-04-07 Merck & Co., Inc. 1-, 6- And 2-substituted-1-carba-2-penem-3-carboxylic acids
US4208422A (en) * 1978-10-24 1980-06-17 Merck & Co., Inc. 1-Substituted-pen-2-em-3-carboxylic acids
US4218462A (en) * 1978-10-24 1980-08-19 Merck & Co., Inc. 6-(1-Hydroxyethyl)-2-(2-aminoethylthio)-1-substituted-1-carbade-thiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4282150A (en) * 1978-12-18 1981-08-04 Bristol-Myers Company 2,6-Disubstituted penem compounds
US4272437A (en) * 1978-12-18 1981-06-09 Bristol-Myers Company Antibacterial agents, and 4-thio azetidinone intermediates
JPS55153789A (en) * 1979-04-11 1980-11-29 Sankyo Co Ltd Penem-3-carboxylic acid derivative and its preparation
US4376774A (en) * 1979-05-29 1983-03-15 Merck & Co., Inc. Antibiotic N-heterocyclyl thienamycin
US4264621A (en) * 1979-07-06 1981-04-28 Merck & Co., Inc. 5-Substituted-3-(2-aminoethylthio)-6-(1-hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid
US4247640A (en) * 1979-07-23 1981-01-27 Merck & Co., Inc. Fermentation process for 6-hydroxymethyl-2-(2-aminoethylthio)-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acid
JPS5622782A (en) * 1979-08-03 1981-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Dc-38-v and its preparation
US4378314A (en) * 1979-09-21 1983-03-29 Bristol Myers Company Antibacterial agents and metal containing azetidinone intermediates therefore
US4374065A (en) * 1979-09-21 1983-02-15 Bristol-Myers Company Antibacterial agents of the β-lactam type
GR72296B (pl) * 1979-12-03 1983-10-18 Merck & Co Inc
US4262010A (en) * 1979-12-03 1981-04-14 Merck & Co., Inc. 6-(1-Hydroxyethyl)-2-(2-aminoethylthio)-1,1-disubstituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
JPS56148297A (en) * 1980-04-17 1981-11-17 Shionogi & Co Ltd Novel preparation of thienamycin
US4357342A (en) * 1980-05-02 1982-11-02 Merck & Co., Inc. 1-Azabicyclo[3.2.0]heptan-3,7-dione-2-carboxylic acid
US4426390A (en) 1980-10-01 1984-01-17 Sanraku-Ocean Co., Ltd. Novel β-lactam compounds, process for producing thereof, and use thereof as medicines
US4683301A (en) * 1982-04-08 1987-07-28 Bristol-Myers Company Carbapenem antibiotics
US4460689A (en) * 1982-04-15 1984-07-17 Merck & Co., Inc. DNA Cloning vector TG1, derivatives, and processes of making
US4508826A (en) * 1982-04-15 1985-04-02 Merck & Co., Inc. Bacteriophage DNA cloning vector TG1 and microorganisms containing TG1
US4544557A (en) * 1982-07-29 1985-10-01 Merck & Co., Inc. 6-(1-Hydroxyethyl)-2-(2-aminoethylthio)-3-tetrazoly-1-carbadethiapen-2-em
CA1220215A (en) * 1983-03-07 1987-04-07 Yasutsugu Ueda Carbapenem intermediates
US5310897A (en) * 1984-12-27 1994-05-10 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Beta-lactams and their production
DK141786A (da) 1985-03-29 1986-09-30 Merck & Co Inc Fremgangsmaade til fremstilling af et mellemprodukt til brug ved fremstilling af 1-beta-methylcarbapenemantibiotika
US5104984A (en) * 1985-03-29 1992-04-14 Merck & Co., Inc. Enantioselective process for producing 1-beta-methyl carbapenem antibiotic intermediates
US4833167A (en) * 1985-06-10 1989-05-23 Merck & Co., Inc. 2-aza-substituted 1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4782051A (en) * 1985-06-10 1988-11-01 Merck & Co., Inc. 2-aza-substituted 1-carbadethiapen-2-em-3 carboxylic acids
US4892869A (en) * 1985-06-10 1990-01-09 Merck & Co., Inc. 2-aza substituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4783453A (en) * 1985-06-10 1988-11-08 Merck & Co., Inc. 2-aza-substituted 1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids
US4665169A (en) * 1985-09-11 1987-05-12 Bristol-Myers Company Carbapenem antibiotics
ATE109764T1 (de) * 1985-12-28 1994-08-15 Sumitomo Pharma Beta-lactamverbindungen und deren herstellung.
US5021566A (en) * 1989-03-06 1991-06-04 Merck & Co. Inc. 6- and 6,6-disubstituted-3-substituted-1-azabicyclo(3.2.0)hept-2-en-7-one-2-carboxylic acids
US5672701A (en) * 1990-01-16 1997-09-30 Bristol-Myers Squibb Company 4-substituted alkyl carbapenem antibiotics
FI96863C (fi) * 1990-02-23 1996-09-10 Sankyo Co Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten /2-(1-homopiperatsiinikarbonyyli)pyrrolidin-4-yylitio/-6-(1-hydroksietyyli)-1-karbapen-2-eemi-3-karboksylaattisuolojen valmistamiseksi
US5241073A (en) * 1990-10-12 1993-08-31 Lederle (Japan) Process for preparing (1R,5S,6S)-2-[(6,7-dihydro-5H-pyrazolo [1,2-a][1,2,4]triazolium-6-yl)]thio-6-[(R)-1-hydroxyethyl]-1-methyl-carbapenem-3-carboxylate and starting materials thereof
US5712267A (en) * 1991-06-04 1998-01-27 Sankyo Company,. Limited Carbapenem derivatives, their preparation and their use as antibiotics
US5496816A (en) * 1994-03-14 1996-03-05 Merck & Co., Inc. Carbapenem antibacterial compounds, compositions containing such compounds and methods of treatment
JP3848693B2 (ja) * 1994-07-06 2006-11-22 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 新規カルバペネム誘導体
AU5450199A (en) 1998-09-10 2000-04-03 Wyeth Lederle Japan, Ltd. Carbapenem compounds
US10539561B1 (en) 2001-08-30 2020-01-21 Customarray, Inc. Enzyme-amplified redox microarray detection process
US20030180766A1 (en) * 2002-01-24 2003-09-25 Ecopia Biosciences, Inc. Method, system and knowledge repository for identifying a secondary metabolite from a microorganism
KR20120099727A (ko) * 2004-06-10 2012-09-11 포브 신서시스 인코포레이티드 그램-양성 카바페넴 항균제 및 그의 제조방법
US20060102471A1 (en) 2004-11-18 2006-05-18 Karl Maurer Electrode array device having an adsorbed porous reaction layer
US20070034513A1 (en) 2005-03-25 2007-02-15 Combimatrix Corporation Electrochemical deblocking solution for electrochemical oligomer synthesis on an electrode array
US9394167B2 (en) 2005-04-15 2016-07-19 Customarray, Inc. Neutralization and containment of redox species produced by circumferential electrodes
US20070065877A1 (en) 2005-09-19 2007-03-22 Combimatrix Corporation Microarray having a base cleavable succinate linker
US8855955B2 (en) * 2005-09-29 2014-10-07 Custom Array, Inc. Process and apparatus for measuring binding events on a microarray of electrodes
WO2009114921A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-24 Dmitrienko Gary I INHIBITORS OF CLASS B AND CLASS D β-LACTAMASES
US9637746B2 (en) 2008-12-15 2017-05-02 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways
CN105132387A (zh) * 2008-12-22 2015-12-09 绿光生物科学公司 用于制造化合物的组合物和方法
WO2011090793A2 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Customarray, Inc. Multiplex microarray of serially deposited biomolecules on a microarray
EP2566953B1 (en) 2010-05-07 2019-01-02 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways through enzyme relocation
JP5922110B2 (ja) 2010-06-18 2016-05-24 フオブ・シンセシス グラム陰性活性を有するカルバペネム系抗菌薬
WO2012030980A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation
EP2753702B1 (en) 2011-09-09 2021-12-15 GreenLight Biosciences, Inc. Cell-free preparation of carbapenems
DK3030671T3 (en) 2013-08-05 2019-01-21 Greenlight Biosciences Inc MODIFIED PROTEINS WITH A PROTEASE CLEANING PLACE
KR20230048162A (ko) 2015-03-30 2023-04-10 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. 리보핵산의 무세포 생산
AU2017246458B2 (en) 2016-04-06 2022-08-11 Greenlight Biosciences, Inc. Cell-free production of ribonucleic acid
CA3066661A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Fob Synthesis, Inc. Carbapenem compounds and compositions for the treatment of bacterial infections
IL273887B (en) 2017-10-11 2022-09-01 Greenlight Biosciences Inc Methods and preparations for the production of nucleoside triphosphate and ribonucleic acid

Also Published As

Publication number Publication date
CA1058104A (en) 1979-07-10
YU297775A (en) 1982-02-25
IL48521A0 (en) 1976-01-30
ATA891875A (de) 1977-06-15
IE42067L (en) 1976-05-25
HK60480A (en) 1980-11-07
CS183829B2 (en) 1978-07-31
AT341664B (de) 1978-02-27
SE7513175L (sv) 1976-05-26
FI753305A (pl) 1976-05-26
DK138663C (pl) 1979-04-02
BG27916A3 (en) 1980-01-15
SE431348B (sv) 1984-01-30
NO753944L (pl) 1976-05-26
ZA757366B (en) 1977-07-27
IL48521A (en) 1979-01-31
DE2552638C3 (de) 1980-01-31
AR211109A1 (es) 1977-10-31
EG11963A (en) 1978-06-30
NL182008C (nl) 1987-12-16
ES442920A1 (es) 1977-10-01
NL182008B (nl) 1987-07-16
DD122103A5 (pl) 1976-09-12
FR2291748A1 (fr) 1976-06-18
JPS5839519B2 (ja) 1983-08-30
DE2552638B2 (de) 1979-05-23
RO70072A (ro) 1980-10-30
GB1498087A (en) 1978-01-18
BE835859A (fr) 1976-05-24
CY1092A (en) 1980-12-27
FI53718C (fi) 1978-07-10
LU73860A1 (pl) 1976-09-06
NO142227C (no) 1980-07-16
JPS5173191A (pl) 1976-06-24
HU178052B (en) 1982-02-28
FI53718B (pl) 1978-03-31
YU36991B (en) 1984-08-31
DK528075A (pl) 1976-05-26
FR2291748B1 (pl) 1980-06-20
KE3094A (en) 1981-02-13
DE2552638A1 (de) 1976-05-26
IE42067B1 (en) 1980-05-21
NL7513686A (nl) 1976-05-28
PH10809A (en) 1977-09-07
NO142227B (no) 1980-04-08
NZ179332A (en) 1981-04-24
SU576967A3 (ru) 1977-10-15
CH622825A5 (pl) 1981-04-30
US3950357A (en) 1976-04-13
AU8690675A (en) 1977-06-02
DK138663B (da) 1978-10-09
MY8100228A (en) 1981-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL96314B1 (pl) Sposob wytwarzania antybiotyku tienamycyny
DE2718782C2 (pl)
US4971965A (en) Antibiotics TAN-1057
US4006060A (en) Thienamycin production
FI77690C (fi) Foerfarande foer framstaellning av en antibiot, aad 216-komplex med mikroben kibdelosporangium aridum shearer gen. nov., sp. nov. atcc 39323.
CA1253820A (en) Cl-1577-b.sub.4 compound, its production and use
US4539203A (en) CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use
US3751459A (en) L-trans-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenoic acid
CH646432A5 (de) Beta-lactam-antibiotika.
PL80273B1 (pl)
DE2652678A1 (de) Antibiotica und verfahren zur herstellung derselben
DE2652677C2 (de) Antibiotica 890A&amp;darr;1&amp;darr; und 890A&amp;darr;3&amp;darr;, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Antibiotika enthaltende antibakterielle Mittel
US3183154A (en) Antibiotic pactacin and method of production
US4304867A (en) Culture of Streptomyces cattleya
US4003902A (en) Naphthyridinomycin antibiotics
US3911112A (en) Antibiotic substances and preparation
CH637960A5 (en) The antibiotic deacetyl 890A10
US3983231A (en) Antibiotic substances and preparation
GB1561107A (en) N-acetyl thienamycin
JPS61293996A (ja) Ａａｄ２１６抗生物質
KR830000617B1 (ko) 신 항생물질 sf-2050 물질의 제조법
GB1595233A (en) Production of an antibiotic
JPS5834115B2 (ja) 抗生物質
HU191085B (en) Process for producing 3-/5-comma above-ribonucleotide/derivatives
JPH01228483A (ja) 抗腫瘍剤