DE2513854A1 - Neue antibiotika, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

"Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel"

Priorität: 28. März 1974 - Großbritannien - Nummer 13 856/74

Nach den Ausführungen in der G3-PS 1 303 075 kann man wertvolle 3-Lactamase-Hemmstoffe durch Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces olivaceus erhalten. Bisher hat man angenommen, daß das in dieser GB-PS 1 363 075 beschriebene Produkt im wesentlichen rein ist. Es ist jedoch gefunden worden, daß dies nicht der Fall ist, und daß man aus diesem Produkt in geringer Menge einen Bestandteil isolieren kann, der eine starke antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese neue Substanz wird als "MM 13902" bezeichnet, und man nimmt an, daß sie teilweise verantwortlich für die antibakterielle Wirksamkeit bei dem Produkt gemäß der GB-PS 1 363 075 ist, obwohl die Substanz nur zu einem sehr geringen Teil für die ß-Lactamase-Hemmwirkung verantwortlich ist, die dieses Produkt zeigt. Selbstverständlich umiaßt die vorliegende Erfindung nichts, was in der GB-PS 1 363 075 hinsichtlich des

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dort genannten Produkts "beansprucht ist. Es sind auch andere \ ß-Lactamase-Hemmstoffe bekannt, die durch Streptomyces-Stämme erzeugt werden, wie sie z.B. in der DT-OS 2 34o 005 beschrieben sind. Jedoch ist von derartigen bekannten Substanzen nicht gezeigt worden, daß sie eine starke antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, wie sie die Substanz MM 13902 besitzt.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun diese Substanz MM 13902 und ihre Salze.

Die Substanz MM 13902 ist eine feste Carbonsäure, die in Form ihres praktisch reinen Natriumsalzes die nachstehenden Eigenschaften aufweist:

(l)" leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

(2) ein charakteristisches Ultraviolett-Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm in Wasser;

(3) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr- Platte ein charakteristisches Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, l400 und 12βθ cm"¹;

(4) ein charakteristisches NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser mit u.a. (a) einem Paar Niederfeld-Doubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,85r und 4,00"C mit Kopplungskonstanten (J) von etwa 14 Hz, (b) mit einem Doublet mit dem Zentrum bei etwa 8,55"^ und (c) mit einem scharfen -Singulett bei etwa 8,00r ; .

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(5) eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies u.a. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Eseherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi und Pseudomonas aeruginosa;

(6) im Gemisch mit Ampicillin eine synergistische Wirksamkeit gegenüber Organismen, wie Eseherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.

Das reine Dinatriumsalz der Substanz MM 13902 ist ein ß-Lactamase-Inhibitor und hat den nachstehend näher erläuterten I₁-~-

Wert zwischen 0,001 ug/ml und_0,0001 ug/ml gegenüber der ß-Lactamase von Eseherichia coli B 11.

Wenn das reine Dinatriumsalz der Substanz MM 13902 der Dünnschichtchromatographie an Cellulose unterworfen wird, weist es die annähernden R~-Werte bei den nachstehenden Systemen auf:

(a) "bei n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 einen R_f-Wert von 0,72;

(b) bei Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7 ϊ 3 einen R_f-Wert von 0,85;

(c) bei n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 einen R_f-Wert von 0,8l und

(d) bei n-Propanol/Wasser im Volumverhältnis von 4 : 1 einen R_f-Wert von 0,75.

Nach einem anderen Gesichtspunkt kann die Substanz MM 13902 als

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Schwefel enthaltendes antibakterielles Mittel charakterisiert werden, dessen Salzewährend der Züchtung von Streptomyces olivaceus ATCC 31126 erzeugt werden und das in Form der wässrigen Lösung eines Dinatriumsalzes ein UV-Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm und bei etwa 225 nm besitzt, wie es im wesentlichen aus Fig. 1 hervorgeht.

Gegebenenfalls kann die Substanz MM 13902 als antibakterielles Mittel charakterisiert werden, das in Form seines praktisch reinen Dinatriumsalzes ein Infrarot-Absorptionsspektrum besitzt, wie es im wesentlichen in Fig. 2 zu sehen ist, wenn 0,4 Gewichtsprozent der Substanz in einer frisch zubereiteten KBr- Platte enthalten ist, und das weiterhin in Form seines praktisch reinen Dinatriumsalzes ein NMR-Spektrum besitzt, wie es im wesentlichen aus Fig. 3 ersichtlich ist, wenn es in einer frisch zubereiteten Lösung von deuteriertem Wasser vorliegt.

Die Substanz MM 13902 neigt zur Instabilität, wenn sie in Form der freien Säure vorliegt. Demgemäß sind die Salze der Substanz MM 13902 bevorzugt. Zweckmäßigerweise sind die Salze der Substanz MM 13902 dibasische Salze. Am gebräuchlichsten werden diese Salze mit pharmakologisch verträglichen Ionen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, in üblicher Weise substituierten Ammoniumionen, und dergleichen, gebildet. Besonders bevorzugte Salze sind die Alkalimetallsalze, wie die Natrium- und Kaliumsalze, z.B. das Dinatrium- oder das Dikaliumsalz.

Zweckmäßigerweise weist die Substanz MM 13902 und ihre Salze

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gemäß vorliegender Erfindung einen Reinheitsgrad von mindestens 50 Prozent, zweckmäßigerweise von mindestens 70 Prozent und vorzugsweise von mindestens 80 Prozent, z.B. von 90 bis 100 Prozent, auf. Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bilden Arzneimittel mit einem Gehalt an der Substanz MM 13902 und/oder ihren Salzen, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.

Am zweckmäßigsten enthalten die erfindungsgemäßen Arzneimittel das Natrium- oder Kaliumsalz der Substanz MM 13902, z.B. das Dinatrium- oder das Uikaliumsalz.der Substanz MM 13902.

Derartige Arzneimittel können in Form zu einer oralen, lokalen oder parenteralen Anwendung vorliegen, z.B. können sie als Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe,. rekonstituierbare Pulver und in sterilen Formen für Injektions- oder Infusionszwecke verwendet werden. Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Gecchmacksstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallsmittel und dergleichen in Übereinstimmung mit der üblichen pharmazeutischen Praxis in der bei der Formulierung von Antibiotika, wie Penicillinen und Cephalosporinen, bekannten Art und Weise enthalten.

Die Substanz MM 13902 oder ihre Salze können in den Arzneimitteln vorliegender Erfindung als einziger Wirkstoff oder auch zusammen mit einem ß-Lactam-Antibiotikum vorliegen. Cet?icjnete ß-Lactam-Antibiotika umfassen solche bekannte Substanzen, die gegenüber ■ ß-Lactamasen empfindlich sind und auch eine gewisse eigene Wider-

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Standsfähigkeit gegen ß-Lactamasen besitzen. Beispiele derartiger ß-Lactam-Antibiotika sind Ampicillin, Amoxycillin, Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Propicillin, Cephaloridin, Cefoxitin, Cephalothin, Cephalexin, Carbenicillin, Ticarcillin und in vivo hydrolysierbare Ester solcher Verbindungen, wie die Phenyl-, Tolyl- oder Indanylester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder die Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder Phthalidylester von Ampicillin, Benzylpenicillin, Amoxycillin, Cephaloridin, Cephaloglycin und dergleichen.

Das Verhältnis der Substanz MM 13902 oder ihr^r 3alz zu dem ß-Lactam-Antibiotikum liegt normalerweise zwischen 10 : 1 und 1 : 10, z.B. zwischen 3:: 1 und 1 : 3·

Die Gesamtmenge der antibakteriellen Mittel in beliebigen Einzeldosierungen liegt normalerweise zwischen 50 und 15OO mg und gewöhnlich zwischen 100 und 1000 mg.

Bevorzugte Einzeldosierungen nach vorliegender Erfindung können einmal oder mehrere Male täglich, z.B. 2 bis 4 mal täglich, zur Behandlung von Erkrankungen der Harnwege, der Atmungswege, der Weichteile und dergleichen, verabreicht werden. Die Arzneimittel können zur Behandlung von Erkrankungen, wie Bronchitis, Gonorrhoe, Mittelohrentzündung, Brustentzündungen und dergleichen, verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 13902 oder ihrer Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung eines MM 4550-

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Komplexes Chromatograph!sch in Fraktionen unterteilt, die hauptsächlich aus einer Lösung der Substanz MM 13902 oder ihrer Salze oder aus anderen Fraktionen bestehen, und daß man die Substanz MM I3902 oder ihre Salze aus der Lösung isoliert.

Der Ausdruck "hauptsächlich aus einer Lösung der Substanz MM 13902 oder ihrer Salze bestehen" bedeutet, daß entweder die einzige in dieser Lösung vorliegende antiblotische Substanz die Substanz MM 13902 oder deren Salze ist oder daß, wenn irgendeine andere antibiotische Substanz vorhanden sein soll, dann diese Substanz in einer geringeren Menge als die Substanz MM 13902 oder deren Salze vorhanden ist. Zweckmäßigerweise liegt die Substanz MM I3902 oder ihre Salze in einer Menge von 70 Prozent, noch zweckmäßigerweise in einer Menge von 80 Prozent und vorzugsweise in einer Menge von 90 bis 100 Prozent in der Fraktion vor. Es ist gefunden worden, daß ein anwendbares Verfahren zur Bestimmung, welche Fraktionen hauptsächlich eine Lösung der Substanz MM 13902 oder deren Salz enthalten, in der Überwachung des UV-Absorptionsspektrums jeder Probe liegt. Derartige Fraktionen, die ein UV-Spektrum ähnlich dem der Fig. 1 zeigen, enthalten normalerweise die Substanz MM 13902 oder deren Salze im wesentlichen frei von anderen antibiotischen Substanzen, wie der nachstehend beschriebenen Substanz MM 4550. Gewöhnlich weisen die ein ausgeprägtes UV-Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigenden Fraktionen die gewünschte Reinheit auf.

Normalerweise wird das Herstellungsverfahren zur Isolierung der Substanz MM 13902 als dibasisches Salz angewendet. Wenn man jedoch die Herstellung eines monobasisehen Salzes der Substanz

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MM 13902 oder gar die freie Säure wünscht, können diese Verbindungen durch Ansäuern des dibasischen Salzes der Substanz MM 13902 hergestellt werden, da gewöhnlich die monobasischen Salze der Substanz MM 13902 und die freie Säure der Substanz MM 13902 nicht in ausreichendem Maße stabil s'ind, um aus den Gemischen wie der nachstehend beschriebene MM 4550-Komplex isoliert zu werden. Diese monobasischen Salze und die freie Säure sind wegen ihrer geringen Stabilität nicht leicht erhältlich.

Wie bereits ausgeführt,worden ist, wird angenommen, daß die chromatographische Isolierung der Substanz MM 13902 am besten unter Verwendung eines Salzes der Substanz MM 13902, wie des Dinatriumsalzes, durchgeführt wird. Die Salze der Substanz MM 13902 sind in wässrigen Lösungsmittelsystemen löslicher als in stark lipophilen Lösungsmitteln,und demzufolge bevorzugt man die Verwendung wässriger Lösungsmittelsysteme bei der chromatographischen Reinigung gemäß vorliegender Erfindung.

Erfindungsgemäß haben sich annähernd neutral gepufferte wässrige Lösungen von Elektrolyten als zweckmäßig zur Verwendung in Verbindung mit polaren Trägermaterialien, wie basischen Ionenaustauscherharzen, gezeigt. Demzufolge kann eine mittels eines üblichen Puffers, wie einem Phosphatpuffer, auf einen ungefähren pH-Wert von 7 gepufferte wässrige Lösung von Natriumchlorid in Verbindung mit Trägermaterialien verwendet werden, die tertiäre Aminogruppen oder quartäre Ammoniumgruppen enthalten. Es ist gefunden worden, daß basische Celluloseaustauscher und basische Austauscher auf Basis vernetzter Dextrane als Trägermaterialien zweckmäßig sind, insbesondere ein vernetztes Dextran, das unter

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der Bezeichnung "QAE-Sephadex A 25" bekannt ist, wenn das Lösungsmittelsystem aus einer 0,7-m Natriumchloridlösung in einem Phosphatpuffer vom pH 7 besteht.

Es haben sich auch erfindungsgemäß Lösungsmittelsysteme, die aus Gemischen von V/asser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkoholen, bestehen, als anwendbar in Verbindung mit inerten Trägermaterialien, wie Silikagel oder Cellulose, erwiesen. Ein besonders zweckmäßiges Lösungsmittelsystern zur Verwendung mit Cellulose ist ein Gemisch aus Wasser und Isopropanol, nämlich ein soxches aus 7 Teilen Isopropanol und J Teilen Wasser.

Das Produkt nach den vorgenannten Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen enthält jedoch häufig einen sehr hohen Anteil an Natriumchlorid, so daß es vorteilhaft ist, die vereinigten Lösungen zu entsalzen. Das Entsalzen kann dadurch bewirkt werden, daß man die Lösung durch eine Säule leitet, die ein lipophiles Material, an das die Substanz MM 13902 absorbiert wird, enthält, doch die nicht Natriumchlorid adsorbiert. Zweckmäßige Säulenmaterialien sind Polystyrole, wie "Amberlite XAD 4". Gegebenenfalls kann eine Gelfiltration unter Verwendung von Filtrierhilfsmitteln angewendet werden, wie vernetzte Dextrane ("Sephadex G-25"), und Polyacrylamidgele ("Biogel P2"). Aus diesen Säulen können die Antibiotika unter Verwendung von Wasser, wässrigem Methanol oder dergleichen, eluiert werden.

Wenn die gewünschten Lösungen nach dem vorgenannten Verfahren erhalten werden, kann man die dibasischen Salze der Substanz

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MM 13902 In fester Form durch Entfernen des Lösungsmittels unter milden Bedingungen erhalten. Es wurde gefunden, daß ein geeignetes Verfahren zum Erhalten der festen Substanz im Eindampfen unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen der vereinigten, die Substanz MM 13902 enthaltenden Fraktionen besteht.

Gewünschtenfalls kann das Herstellungsverfahren in zwei oder .mehreren Stufen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Lösung des MM 4550-Komplexes in Fraktionen aufgeteilt werden, die die Substanz MM 13902 oder deren Salze enthalten, welchletztere mit bis zu ihrem eigenen Gewicht mit anderen Antibiotika verunreinigt sind. "Die Fraktionen können gefriergetrocknet werden, um ein Material zu liefern, das z.B. zu 50 bis 60 Prozent die Substanz MM 13902 oder deren Salz enthält, die man dann nochmals Chromatograph!ert, um ein Material zu erhalten, das zu 90 bis 100 Prozent die Substanz MM 13902 oder deren Salze enthält.

In vorliegender Beschreibung wird der Ausdruck ¹¹MM 4550-Komplex" verwendet, um eine Substanz zu beschreiben, die ursprünglich als Substanz MM 4550 in der GB-PS 1 363 075 bezeichnet worden ist. Der MM 4550-Komplex, wie er bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS 1 3β3 075 erzeugt worden ist, ist ein unreines Material, das in unterschiedlichen Anteilen Salze von MM 4550 (wie zuvor angegeben) und Salze der Substanz MT-I 13902 sowie erhebliche Mengen anderer Substanzen enthält. Der MM 4550-Komplex zeigt nicht das charakteristische UV-Spektrum der Substanz MM 13902. Der nachstehend erläuterte I -Wert des bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS 1 363 075 hergestellten MM 4550-Komplexes liegt gewöhnlich unter 0,0004 yug/ml. Das Verhältnis der Salze von MM 4550 zu

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den Salzen der Substanz MM 13902 in dem MM 4550-Komplex scheint in hohem Maße variabel und deshalb abhängig von solchen Faktoren zu sein, wie dem verwendeten Organismusstamm und/oder den angewendeten genauen Isolationstechniken, doch ist im allgemeinen gefunden worden, daß der Komplex mehr MM 4550 als die Substanz MM 13902 enthält. Die Herstellung des MM 4550-Komplexes wird nachstehend in dem Kapitel "Beschreibungen" angegeben.

In der Beschreibung wird der Ausdruck "MM 4550" zur Beschreibung der im wesentlichen reinen Substanz verwendet, die eine starke ß-Lactamase-Hemmsubstanz ist und die auch einen gewissen Grad einer antibalcteriellen V7irksamkeit besitzt. Die Eigenschaften von MM 4550 sind nachstehend in dem Kapitel "Besehreibungen" näher erläutert.

In weiterer Hinsicht befaßt sich die Erfindung auch mit einem Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 13902 und deren Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen die Substanz MM 15902 erzeugenden Stamm von Streptomyces züchtet und danach die Substanz MM 13902 oder deren Salz aus der Kulturlösung gewinnt.

Bei diesem Verfahren ist gefunden worden, daß die die Substanz MM 13902 erzeugenden Stämme zu den nachstehend beschriebenen Stämmen von Streptomyces olivaceus und verwandten Organismen gehören.

Der am geeignetsten verwendete Organismus ist ein Stamm von Streptomyces olivaceus ATCC 21379, 21380, 2138I, 21382, 31126

oder dessen Mutanten.

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Ein besonders bevorzugter Organismus zur Verwendung beim Verfahren vorliegender Erfindung ist Streptomyces olivaceus ATCC 31126.

Der hier verwendete Ausdruck "züchten" bedeutet sorgsames aerobes Wachsen des Organismus in Gegenwart assimilierbarer Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Mineralsalzquellen. Ein derartiges aerobes Wachsen kann auf oder in einem festen oder halbfesten •Nährmedium oder in einem flüssigen Medium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder submers stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt sein oder kann chemisch definiert vorliegen. Es' wurden Medium gefunden, die komplexe Nährstoffe enthalten, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, die besonders zweckmäßig sind. Es ist ferner gefunden worden, daß der Zusatz von Kobaltionen, Sulfationen und Calciumcarbonat vorteilhaft ist.

Es ist gefunden worden, daß das Züchten bei einer Temperatur von 28 + 2°C annehmbare Ausbeuten an dem Antibiotikum ergibt und daß man nach 2 bis J5 Tagen nach Beginn der Fermentation die Züchtung •gewinnen kann.

Der hierin verwendete Ausdruck "Mutanten" schließt beliebige Mutanten des Stammes ein, die spontan oder durch den Einfluß eines äußerlich angewendeten Mittels entstehen, gleich ob das Mittel gewollt oder in anderer Weise angewendet wird. Geeignete Verfahren zur Erzeugung von Mutanten umfassen die von H.I. Adler in "Techniques for the Development of Micro-organisms" in dem

Buch "Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro-

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organisms", Proceedings of a Symposium, Wien 1973, S. 24l, International Atomic Energy Authority, angegebenen. Diese Methoden umfassen:

(1) Ionisierende Bestrahlung,(Röntgen- oder ^-Strahlen), UV-Licht, UV-Licht plus ein lichtempfindliches Mittel (wie 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidin-Analoga (wie 5-Brom-uracil), Acridine, alkylierende Mittel (wie Senfgas, Ä'thyl-methan-sulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Wärme, und

(2) genetische Techniken, wie Neukombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisation, lysogenische Konversion und

. selektive Techniken für .spontane Mutanten.

Es ist gefunden worden, daß die Verwendung von die Mutation beschleunigenden Mitteln zu einer Erzeugung von Organismen führen kann, die die Fähigkeit zur Erzeugung größerer Mengen der gewünschten Antibiotika besitzen . Zum Beispiel führt die Bestrahlung von Kulturen von Streptomyces olivaceus ATCC 21379 mit anschließender Isolierung des erhaltenen Stammes, der die ausgedehnteste Aktivitätszone bei der nachstehend beschriebenen KAG-Probe zu erzeugen scheint, zur Isolierung von Streptomyces olivaceus ATCC 31126, der der bevorzugte Stamm zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist und der auch in den Niederlanden unter der Hinterlegungsnummer CBS 155.75 registriert worden ist.

Für gewöhnlich sollen alle, zum Erhalten der gewünschten Antibiotika angewendeten Isolierung- und Reinigur.^verfahren bei r;ioht erhöhten Temperaturen, z.B. unter 20⁰C und noch zweckmäßiger

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nicht oberhalb 12⁰C, stattfinden.

Die gewünschte Substanz wird gewöhnlich in der Hauptsache aus dem Kulturfiltrat erhalten, so daß die bevorzugte Anfangsstufe bei dem Isolierungsverfahren im Entfernen festen Materials aus der Fermentationsbouillon, z.B. durch Filtrieren, ist.

Eine mit Verunreinigungen vermischte Zubereitung der Substanz MM 13902 oder deren Salze kann aus dem geklärten Kulturfiltrat erhalten werden, indem man die Substanz MM 13902 oder deren Salze an ein aktives Material, wie Aktivkohle oder dergleichen, adsorbiert und danach die gewünschte Substanz von dem aktiven Material unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie wässriges Aceton, eluiert. üblicherweise wird das Verfahren bei einem dibasischen Salz der Substanz MM 13902 durchgeführt.

Gegebenenfalls kann man eine verunreinigte Zubereitung der Substanz MM 13902 oder deren Salze aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion unter Verwendung eines lipophilen Ammoniumsalzes und eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels erhalten. Dies ist häufig wirkungsvoller als das zuvor beschriebene Verfahren. (Die Substanz MM 13902 kann auch als substituiertes Ammoniumsalz durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhalten werden). Vorzugsweise wird dann die Ausgangslösung des substituierten Ammoniumsalzes der Substanz MM 13902 unter Verwendung einer Lösung eines Alkalimetalljodids, wie Natr'iumjodid, in die wässrige Phase zurückextrahiert. Diese letztgenannte VerfahrensVariante führt im allgemeinen zur Herstellung einer wässrigen Lösung eines unreinen dibasischen Salzes der Substanz

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MM 13902.

Streptomyces olivaceus und verwandte Organismen besitzen die nachstehenden Haupteigenschaften:

(a) Sporenbildende Luftmycele entweder in der Grau-Reihe oder in der Gelb-Reihe;

(b) die Morphologie eines Sporenträgers entweder mit rektiflexiblen Sporen oder mit Spiralen;

(c) oberflächlich glatte Sporen Und

(d) keine Melanin-Bildung.

Einige diese vorstehenden Eigenschaften besitzende Spezies sind in den Tabellen V bis IX aufgeführt.

Die zuvor beschriebenen verunreinigten Formen der Substanz MM 13902 oder deren Salze werden gewöhnlich der vorgenannten Chromatographie unterworfen, um ein Material von annehmbarer Reinheit zu erzeugen.

Die nachstehenden "Beschreibungen" erläutern die allgemeinen, bei der Isolierung von antibakteriellen Verbindungen wertvollen Informationen. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beschreibung 1 ICQ-BeStimmung

Der IcQ-Wert ist diejenige Menge an Substanz, die erforderlich

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ist, um eine 50prozentige Hemmung der Hydrolyse von Ampicillin durch das S-Lactamase-Enzym von Escherichia coli BIl zu erzeugen, einem Organismus, der den die ß-Lactamase steuernden R-Faktor enthält. Diese ß-Lactamase wird als Enzym vom Typ IHa gemäß der Klassifikation von Richmond and Sykes klassifiziert (vgl. Adv. in Microbiol. Physiol. 9 (1975), S.

Die Geschwindigkeit der ß-Lactamase-Hydrolyse von Ampicillin zu seiner panicil^ansäure kann mittels der Jodstärke-Probe verfolgt werden, bei der man die Geschwindigkeit der Bildung von Penicillansäure durch Entfernung des Jodstärke-Komplexes mißt. Dieses Verfahren und die Herstellung der ß-Lactamase sind beschrieben in dem Aufsatz von M. Cole, S. Elson und P.D. Pullbrook in "Biochemical Journal" 127 (1972)₅ S. 295 bis J5O8. Es wird eine geringfügige Modifikation des vorgenannten Verfahrens angewendet, indem eine Probe des Inhibitors mit dem Enzym 15 Minuten bei 57°C vorbebrütet wird, bevor es dem Ampicillinsubstrat zugegeben wird. Das Verfahren ist wie folgt:

Reagent!en;

Puffer 0,05-m Kaliumphosphatpuffer vom

pH 7;

Jodstärke-Lösung hergestellt gemäß Novick in "Bio

chemical Journal" 8j5 (19β2), S. 2}6;

Substrat 4o ug/ml Ampicillin in der Puffer

lösung;

ß-Lactamase-Enzym hergestellt aus Escherichia coli BIl

gemäß CoIe und Kitarbeiter "Biochemical Journal" 127 (1972), S. 295. Ein Verdünnen der Enzymzubereitung in der Pufferlösung erfolgt derart, daß man einen Abfall der optischen

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Dichte-Einheiten von etwa 0,3 auf 100 Sekunden bei der ungehemmten Reaktion erhält. Andere ß-Lactamase erzeugende Stämme von Escherichia coil können verwendet werden, insbesondere solche, die den R-Faktor enthalten, z.B. "R TEM".

Bedingungen

Die Reaktionen werden in einer 1 cm-Cuvette bei 37°C in einem "SP 800-Pye-Unicam"-Spektrophotometer durchgeführt. Dieses Instrument kann 4 Probecuvetten und die entsprechenden Cuvetten für Blindversuche tragen. Die erste Cuvette wird zur Kontrollreaktion verwendet und enthält keinen Inhibitor. Die zweite, dritte und vierte Cuvette werden mit verschiedenen Verdünnungen des Inhibitors eingesetzt.

Reagentien

Jodstärke-Reagens E.eoli-ß-Lactamase Puffer Inhibitor des Puffers

Substrat (nach 15minütigem Bebrüten

des vorstehenden Gemisches bei

37°C zugegeben) 1,0 ml 1,0 ml

Im Anschluß daran folgt die Aufzeichnung der Änderung der optischen Dichte bei 590 nm durch Messen der Geschwindigkeit der Reaktion als Änderung der optischen Dichte je 100 Sekunden während eines 3- bis 6minütigen Intervalls. Die InnLbItorprobe wird verdünnt, bis man eine Verdünnung erreicht, die 50 Prozent der beider keinen Inhibitor enthaltenden Blindprobe gesehenen Reaktions-

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Probe	ml	Blind versuch	ml
1,0	ml	1,0
0,1	ml	-	ml
0,3	ml	0,4	ml
0,1	0,1

geschwindigkeit entspricht.

Beschreibung 2

Die KAG-Probe (Klebsie11a aerogenes-Penicillin G-Probe)

Die KAG-Probe ist eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von ß-Lactamase-Inhibitor in Fermentationsbouillons oder während der Isolierungsstufen. Der geschmolzene Nähragar wird bei 45°C mit einem geeigneten ß-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes beimpft und dann mit einer ausreichenden Menge einer sterilen Lösung von Penicillin G vermischt, so daß man eine Konzentration von 6 ug/ml Penicillin G in dem Agar erhält. Der Agar wird dann in eine Petrischale gegossen. Nach seine/¹ Verfestigung werden unter Verwendung eines Metallbohrers in gleichen Abständen zylindrische Bohrungen in die Schicht gebohrt. Dann werden in die Bohrungen die zu untersuchenden Lösungen eingebracht.. Die Schale wird dann bei konstanter Temperatur zwischen 27 und 37°C bebrütet. Während der Bebrütungsdauer diffundieren die Inhibitoren in der zu untersuchenden Lösung aus den Bohrungen in den Agar und hemmen dort die Wirkung der dirch die Klebsiella-Zellen erzeugten ß-Lactamase. Somit wird das Penicillin G vor dem Abbau durch ß-Lactamase geschützt und liegt in ausreichender Konzentration vor, um das Wachstum von Klebsieila zu verhindern. In denjenigen Teilen des Agars, in die der Inhibitor nicht in ausreichender Konzentration diffundiert ist, wird das Penicillin G durch die ß-Lactamase abgebaut, wodurch sich ein dichtes Wachstum von Klebsiella entwickelt. Es bilden sich somit klare Ringzonen einer Hemmung des Klebsiella-Wachsturns um die den Inhibitor enthaltenden Bohrungen, wobei die Größe jeder Zone von

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der Inhibitorkonzentration in der zu untersuchenden Lösung abhängt. Die Stärke der Prüflösungen (in beliebigen Einheiten je ml) wird unter Bezugnahme auf die Standardlinie des Logarithmus der Inhibitorkonzentration gegenüber dem Zonendurchmesser erhalten. Diese Versuchsanordnung kann auch für eine Bioautographle verwendet werden.

Beschreibung 3

Herstellung des MM 4550-Komplexes, der mit dem in der GB-PS I.363 075 vergleichbar ist.

Man züchtet Steptomyces olivaceus ATCC 21379 7 Tage lang bei 28⁰C auf einem festen Schrägagar in einer Roux-Flasche. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (g/Liter)

Hefe-Extrakt 10,0

Glucose-monohydrat 10,0

Agar 15,0

Leitungswasser ad 1 Liter

Zur Sterilisation wird das Medium auf pH 6,8 eingestellt. 50 ml steriles entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-Sorbitan-Monooleats werden in die Roux-Flasche mit der Züchtung gegeben und dann die Sporen durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspension wird dann als Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100 Liter fassenden Fermentor aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Hährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

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Bestandteile Menge (g/Liter)

Sojabohnenmehl 10,0

Glucose-monohydrat 20,0

Leitungswasser ad 1 Liter

Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml eines 10 Volumprozent eines Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls vor der Sterilisation dem Fermentationsmedium zugesetzt,

Das Medium wird dann in dem Fermentor 20 Minuten bei 120⁰C durch Dampf sterilisiert. Die" Nährlösung wird mit 3kO UpM mittels eines Leitsehaufelrührers mit 21,6 cm Durchmesser gerührt und durch eine offenendige Sprüheinrichtung mit 150 Liter/Minute steriler Luft versorgt. Das Züchtungsgefäß ist mit Prallblechen ausgerüstet. Die Temperatur wird auf 28°C eingeregelt. Nach einer 45-stündigen Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 7*5 Liter dieser Züchtungslösung als Impfsto'ff zu 150 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einen 300 Liter-Fermentor aus rostfreiem Stahl überführt. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (g/Liter)

Sojabohnenmehl 10,0

Glucose-monohydrat 20,0

Kreide (gefälltes Calciumcarbonat) 0,2

Kobaltchlorid (CoCl₂*6H₃O) 0,001 Leitungswasser ad 1 Liter

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Zur Schaumverhinderung werden 300 ml des 10 Volumprozent des vorgenannten Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls zugegeben. Die Fermentation wird nach 48 Stunden gewonnen und durch Zentrifugieren geklärt. Die geklärte Bouilkn liefert eine 50prozentige Hemmung bei der Enzymprobe bei einer Verdünnung von 1 in 100 000. 100 Liter der geklärtenBouilbn werden mit 12 kg einer Ionenaustausch-Cellulose in der Acetatform, feucht berechnet, verrührt, wobei die cellulose eine mikrokristalline Cellulose mit Diäthylaminoäthyl-Gruppen ist.

Nach dem Filtrieren der Aufschlämmung wird der MM 4550-Komplex mittels 12 Liter einer 0,5-m Kaliumsulfatlösung aus dem Austauscher eluiert. Das Eluat wird in einem aufsteigendem Filmverdampfer unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C auf 6 Liter eingeengt. Durch eine Zugabe von 12 Liter Aceton wird der größte Teil des Kaliumsulfats ausgefällt. Die Lösung wird filtriert und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 200 ml eingeengt. Das Konzentrat wird auf eine Säule von 76 mm χ 2 m, die mit einem nichtionischen Polystyrolharz beschickt worden ist, aufgegeben und mit entsalztem Wasser eluiert. Das Eluat wird in l40 ml-Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen, die mittels der KAG-Probe festgestellt werden, werden gesammelt (2,2 Liter) und auf 275 ml durch Ultrafiltrieren mittels einer "Amicon UM-05"-Membrane von 150 mm Durchmesser unter einem Stickstoffdruck von 4,20 kg/cm eingeengt. Das Konzentrat wird gefriergetrocknet. Man erhält 2,2 g eines braunen Pulvers vom I,-.^-Wert 0,004 ug/rr.L.

1 g dieses Pulvers wird in 1 Liter einer 0,2-m Natriumsulfat-

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lösung gelöst und mit 1 Liter einer 2gewichtsprozentigen Tetran-butylammonium-hydrogensuifat-Lösung in Di chlorine than vermischt. Die Di chlorine than-Phase wird durch Absitzenlassen abgetrennt, auf -70 C gekühlt, zur Entfernung von Eis filtriert und dann durch Eindampfen auf 20.ml eingeengt. Zu dem Konzentrat werden 400 ml Petroläther vom Siedebereich 40 bis 60°C gegeben. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in 10 ml Dichlormethan wieder aufgelöst und mit 10 ml Wasser, das 8o mg Bariumjodid und 70 mg Bariumcarbonat enthält, extrahiert. Die Phasen werden getrennt, wobei die wässrige Phase filtriert und auf pH 6,5 eingestellt wird. Die Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält ein gelbes Pulver. Das Pulver wird mit Aceton gewaschen, um überschüssiges Bariumjodid auszuwaschen. Der blaßgelbe Peststoff wird wiederum durch Zentrifugieren gewonnen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute beträgt 15 mg und der I₁- -Wert 0,0004 ug/ml-.·

Beschreibung 4

Darlegung der Kohlenadsorption des Kulturfiltrats an Kohle, das zur Gewinnung des in der GB-PS 1 56j5 075 beschriebenen Materials vorteilhaft ist

Das nach der "Beschreibung 3" erhaltene Kulturfiltrat liefert einen Zonendurchmesser von 17 mm bei einer antibakteriellen Diffusionsprobe mit Bohrungen in einer Agarplatte gegenüber Klebsiella aerogenes, einen Zonendurchmesser von 38 mm bei der KAG-Probe und einen Ι,-q-Wert bei einer Verdünnung von 1 in 100000. 170 Liter des geklärten Kulturfiltrats werden bei 5⁰C mittels eines aufwärts gerichtet ^r; Strorr.3 durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser, die bis zu einer Höhe von 40,6 cm mit Aktivkohle

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(einer Korngröße von 0,17 bis 0,25 mm Durchmesser und vorgewaschen mit η-Salzsäure und mit Phosphatpuffer auf pH 6 eingestellt) gefüllt ist, bei einer Fließgeschwindigkeit von 800 bis 1000 ml/Minute perkoliert. Die Brühe wird von der Aktivkohle mit 10 Liter entsalztem Wasser ausgewaschen, und die Säule wird bei 20⁰C mit 20 Prozent Aceton eluiert. Die in einer Menge bis zu 10 Liter anfallenden aktiven Fraktionen werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 6 Liter eingeengt und schließlich gefriergetrocknet . Man erhält 282 g eines rohen MM 4550-Komplexes mit einem I^_Q-Wert von 0,05 ug/ml. Die Hemmwirkung des gewonnenen Enzyms beträgt 22 Prozent.

Anstelle der aktivierten Kohle liefern auch andere Aktivkohlen die gleichen Ergebnisse.

Beschreibung 5

Darstellung der Chromatographie des Kulturfiltrats an einem Ionenaustauscherharz, das zur Gewinnung des in der GB-PS 1 363 075 beschriebenen Materials vorteilhaft ist

Eine Säule mit 1 cm Innendurchmesser wird bis zu einer Höhe von 6 cm (Bettvolumen 4,7 ml) mit einem Ionenaustauscherharz in der Chloridform und einem Teilchendurchmesser von 0,3 bis 0,82 mm gefüllt. Das Ionenaustauscherharz ist ein Polystyrol-Divinylbenzol-Harz mit basischen Gruppen. Das Harzbett wird dann 4 mal mit etwa 4,7 ml 5prozentigem wässrigen Methanol und anschließend einmal mit etwa 4,7 ml destilliertem Wasser gewaschen. Es werden hauptsächlich 2 Liter Kulturfiltrat wie in der "Beschreibung 3" beschrieben und auf die Säule angewendet erhalten. Das Harz wird

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dann mit 50prozentigera wässrigen Methanol zum Entfernen der Verunreinigungen gewaschen.

Der MM 4550-Kompiex wird vom Harz mit 5 Prozent Natriumchlorid enthaltendem 50prozentigen Methanol eluiert. Die nachstehende Tabelle I zeigt die erhaltenen Ergebnisse in Wirkungseinheiten. Der MM 4550-Komplex-Gehalt des Kulturfiltrats wird willkürlich mit 8 Einheiten/ml festgesetzt. Die aus der Säule eluierten Fraktionen werden unter Anwendung der antibakteriellen Diffusionsmethode gegenüber Klebsiella aerogenes geprüft. Die Aktivitätsein-' heiten werden unter Bezugnahme auf die Standardlinie berechnet, die durch Aufzeichnen des Zonendurchmessers gegen die Einheiten/ ml für verschiedene Verdünnungen des Kulturfiltrats ermittelt worden ist, d.h. daß das Kulturfiltrat als Standard verwendet worden ist.

Es ist ersichtlich, daß die Säule einen wirksamen Weg zur Konzentrierung des MM 4550-Komplexes darstellt. Die Fraktionen 2 bis 5 enthalten βθ Prozent der Aktivität in einem Gesamtvolumen von nur 37 ml . Das Gesamttrockengewicht dieser Fraktionen beträgt etwa 210 mg, während 35 g Feststoffe auf die Säule gegeben worden sind.

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Tabelle I

Ergebnisse der Chromatographie an einem basische Gruppen enthaltenden Polystyrol-Divinylbenzol-Harz

Probe	PH	Volumen (ml)	Eiheiten (ml)	Gesamt einheiten
Kulturfiltrat	6,5	1970	8	15760
Perkolat 1 Perkolat 2 Perkolat 3 Perkolat 4	6,9 7,0 7,0 7,0	550 525 595 300	<! <1 ■<l	<:ioo <100 <100 <100
Eluat 1 Eluat 2 Eluat 3 Eluat 4 Eluat 5 Eluat 6 Eluat 7 Eluat 8	7,8 7,8 7,7 7,7 7,6 7,5 7,6 7,6	7,0 7,0 8,5 10,0 11,5 11,0 14,2 20,0	84 328 44o 320 l60 80 66 33	588 2296 3740 2200 1840 880 937 660
insgesamt: 13l4l

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I Ό I J ö 0 - 2β -

Beschreibung 6

Darstellung der Ionenpaar-Extraktion eines Kulturfiltrats, das zur Gewinnung des in der GB-PS 1 J563 075 beschriebenen Materials vorteilhaft ist

248 g Natriumsulfat werden zu 10 Liter eines geklärten Kulturfiltrats gegeben, das nach der "Beschreibung J5" hergestellt v/orden ist. Die Lösung wird unter ^Ominütigem Rühren mit 10 Liter 2 Prozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat enthaltendem Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und auf 2°C gekühlt. Ejne geringe Menge suspendierten Viassers wird durch Filtrieren durch ein "Whatman No. l-PS"-Papier entfernt. Dann wird die Dichlorm'ethan-Lösung durch Eindampfen unter vermindertem Druck und einer Temperatur unter JO⁰C auf 20 ml eingeengt. Nach Zugabe von 400 ml eines Petroläthers vom Siedebereich 40 bis 60°C fällt eine gummiartige Substanz aus, die den MM 4550-Komplex enthält.

Die gummiartige Substanz wird abzentrifugiert, in 50 ml Dichlormethan wieder gelöst und mit 50 ml Wasser, das 1 g Bariumjodid und 1 g Bariumcarbonat enthält, durch 2minütiges Schütteln extrahiert. Die vorhandenen Feststoffe werden abfiltriert, und die beiden Phasen aufgetrennt. Die wässrige Phase mit dem MM 4550-Komplex als Bariumsalz wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und gefriergetrocknet. Man erhält 317 mg des rohen MM 4550-Komplexes mit einem !(-„-Wert von 0,001 ug/ml.

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Beschreibung 7

Herstellung eines teilweise gereinigten antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an MM 4550 und MM 13902 unter Verwendung von Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat

12,5 g eines nach der "Beschreibung 4" hergestellten rohen
MM 4550-Komplexes werden in 125 ml Wasser wieder aufgelöst und
mit 125 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 10 Gewichtsprozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und nochmals mit 100 ml Wasser, das 190 mg Natriumjodid enthält, bei 2°C unter langsamem Rühren und
Einstellen der wässrigen Phase mittels 2prozentiger Natriumbicarbonatlösung auf pH 6,4 extrahiert. Die Lösung wird gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton gewaschen. Die Ausbeute beträgt 88 mg der gemischten Natriumsalze von MM 4550 und
MM 13902 mit einem Ι,-Q-Wert von 0,0002 pg gegenüber der Escheri- chia coli-ß-Lactamase. Die Gewinnung der Antibiotika beträgt
70 Prozent.

Die antibakterielle Wirksamkeit von Gemischen aus Ampicillin und der" nach der "Beschreibung 7" hergestellten Substanz wird mittels der Reihenverdünnungsmethode in einem Nähragar bestimmt. Die erhaltenen Mindesthemmkonzentrationen sind in der Tabelle II angegeben .

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Tabelle II

Synergismus zwischen Ampicillin und MM 4550-Komplex der "Beschreibung 7"

	Ampicillin	Ampcillin + MM 4550- Komplex bei	1 ug/ml	10	ug/ml
Organismus		0,1 ug/ml	500		50
E4 ooll BIl		>500	250		50
E. coil JT417		250	500		25+-
E. coil JT39		>500	125		25+
Shigella sonnei S239		125	VJl		< 0,I+
Klebsiella aerogenes :A	25
Klebsiella aerogenes		12,5		0,5+
IP282	50	50		0,5
	>5oo	5,0		0,5
	125	25		0,5
Proteus mirabilis 889	50	25+		0,254
Proteus mirabilis 247	125	<.o,i		0,25
Proteus morganii F	125	< 0,1		< 0,1
	<" 0,1
Proteus rettgeri RIlO
Staph.aureus (Russell)
Staph.aureus (Rusell H)
(allein)
>500
250
>500
125
125
50
>500
>500
50
250
250
>5oo

+) teilweise Hemmung durch den MM 4550-Komplex allein bei diesen Konzentrationen.

Ähnliche synergistische Wirkungen werden bei Gemischen von Amoxycillin und dem MM 4550-Komplex beobachtet.

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Beschreibung 8

Herstellung eines teilweise gereinigten antlblotlschen Komplexes mit MM 4550 und MM 13902 unter Verwendung von Cetyl-dimethylbenzyl-arnmoniumchlorid

Das nach der "Beschreibung 4" aus der Aktivkohlesäule mit Aceton und Wasser eluierte gefriergetrocknete Produkt mit dem I₁-Q-Wert von 0,02 ug/ml wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 13 mg/ml gelöst. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.

100 ml dieser Lösung werden mit dem gleichen Volumen Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Cetyl-dimethyl-benzylammoniumchlorid extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt. Die organische Phase wird nochmals mit 100 ml einer 0,05prozentigen Natriumjodidlösung extrahiert. Die Phasen werden aufgetrennt, und Dichlormethan in der wässrigen Phase wird entfernt, indem die Lösung 10 Minuten unter vermindertem Druck gehalten wird.

Die wässrige Lösung wird gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wird 3 mal mit je 50 ml Aceton gewaschen. Das mit Aceton gewaschene Produkt wird unter vermindertem Druck im Trokkenschrank getrocknet. Man erhält 4,3 mg eines schwachbraunen Pulvers mit einem I(-₀-Wert von 0,002 ug/ml.

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Beschreibung 9

Herstellung eines teilweise gereinigten antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an MM 4550 und MM 13902 unter Verwendung der Gelfiltration

1 g des nach dem Verfahren der "Beschreibung 4" hergestellten rohen MM 4550-Komplexes mit dem I^-Wert von 0,2 ^ig/ml wird an einem vernetzten Dextran chromatographiert und unter Verwendung eines Gemisches von Aceton und Wasser im VoIumverhältnis von 4 : 6 eluiert. Die Säulenabmessungen betragen 2,5 cm χ 32 cm. Die Eluierung wird rajt r^ner Geschwindigkeit von 1,5 ml/Minute durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 22 mg eines amorphen gelbbraun gefärbten Peststoffes mit einem I(-₀-Wert von 0,005 .ug/ml. Die Ausbeute beträgt 88 Prozent und die Reinigung 40fach.

Beschreibung 10

Herstellung eines gereinigten antibiotischen Komplexes mit MM 4550 und MM 13902 unter Anwendung einer Chromatographie an Cellulose

610 mg des nach der "Beschreibung 7" hergestellten MM 4550-Komplexes werden an einer Säule von 2,5 cm χ 32 cm mit einer Füllung von Cellulose vom Typ "Whatman CC 31" chromatographiert. Die Säule wird mit einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis von 7 : 3 mit einer Geschwindigkeit'von 1,5 ml/Minute eluiert. Die antibakteriell wirksamen Fraktionen werden vereinigt,

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unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter j50°C eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 40 mg eines amorphen braunen Feststoffes eines antibiotischen Komplexes mit einem It-Q-Wert von 0,00007 Jig/ml. Der sehr kleine !(-„-Wert zeigt an, daß die aktive Substanz eine verbesserte Reinheit besitzt.

Bei einer Wiederholung der Verfahrensschritte erhält man eine Substanz mit einem Ij-Q-Wert von 0,001 ^ag/ml. Diese Substanz besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gemäß der Tabelle III, wenn sie mittels der Standard-Mikrotiter-Methode in einer Oxoid-Empfindlichkeits-Boumm unter Verwendung schwacher Impfstoffe (1 Prozent einer über Nacht stehengelassenen Bouillon) bestimmt

wird.

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Tabelle III

Antibakterielle Wirksamkeit eines Gemisches von

MM 4550 und MM 1J902 mit einem Ι,-Q-Wert von 0,001 ug/ml

Organismus	Mindesthemmkonzentra- tion in yug/ml
Staphylococcus aureus (Oxford)	7,5
Staphylococcus aureus (Russell)	7,5
Streptococcus faecalis	125
Bacillus subtilis	0,9
Escherichia coli (104l8)	3,7
Escherichia coli (BIl)	15
Klebsiella aerogenes	1,8
Enterobacter cloacae	62
Proteus mirabilis	7,5
Providentia stuartii	7,5
Acinetobacter anitratus	0,9
Pseudomonas aeruginosa	250
Serratia marcescens	7,5
Salmonella typhimurium	15
Shigella sonnei	7,5

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Beschreibung 11 Die Substanz MM 4550

Die Substanz MM 4550 kann durch ihre nachstehenden Eigenschaften erkannt werden:

Die Substanz MM 4550 ist ein saurer Feststoff, der in Form des Natriumsalzes die iblgenden Eigenschaften aufweist:

(1) er ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

(2) in wässriger Lösung besitzt er ein charakteristisches Ultraviolett-Spektrum mit Absbrptionsmaxima bei etwa 2^8 nm und etwa 287 nm;

(3) wenn er zu 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch zubereiteten KBr-Platte vorliegt, hat er ein charakteristisches Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei etwa 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 und 126O cm"*¹. Wenn nach etwa 1 Woche seit der Herstellung der KBr-Platte nochmals ein Spektrum aufgenommen wird, zeigt es beträchtliche Änderungen, z.B. wird das zuvor breite Maximum bei etwa 1765 cm beträchtlich abgebaut oder ist verschwunden;

(4) die Substanz besitzt ein charakteristisches NMR-Spektrum, wenn es in deuteriertem Wasser aufgenommen wird. Dieses Spektrum besitzt u.a. (a) ein Paar Niederfeld-Dubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,45 t: und 3,65 -c mit Kopplungskonstanten bei etv;a 15 Hz, (b) ein Dubiett, mit d-?m Zener-Jn: bei etwa 8,55«£ und (c) ein scharfes Singulett bei etwa 7,95t¹;

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(5) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose weist die Substanz bei den nachstehenden Lösungsmittelsystemen die sehr angenäherten R_f-Werte auf:

(a) Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7 : 7 '· einen R_f-Wert von 0,6;

(b) Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis ¹J : 3> einen R_f-Wert von 0,7;

(c) n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6, einen R~-Wert von 0,7 und·

(d) n-Propanol/Wasser im Volumverhältnis 4 : 1, einen R_f-Wert von 0,6;

(6) die Substanz besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies, u.a. gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsieila aerogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens und Shigella sonnei;

(7) die Substanz besitzt eine Enzymhemmwirkung gegen die von zahlreichen Spezies erzeugte ß-Lactamase, u.a. Escherichia coli, Klebsieila aerogenes und Staphylococcus aureus. Sie besitzt einen I^-Wert von unter 0,0001 ug/ml gegen die ß-Lactamase von Escherichia coli BIl;

(8) wenn die Substanz mit Ampicillin vermischt wird, weist sie eine synergistische Wirksamkeit gegen Organismen auf, wie Stämme von Escherichia coli, Klebsieila aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell;

(9) die Aminosäuren-Analyse zeigt/ daß die Substanz kein PoIy-

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(I) peptid oder Protein ist. Nach saurer Hydrolyse findet man keine cC-Aminoadipinsäurej

(10) die Substanz reagiert mit Ehrlieh-Reagens (300 mg 4-Dimethylaminobenzaldehyd gelöst in einem Gemisch von 54 ml n-Butanol, 9 ml Äthanol und 9 ml konzentrierter Salzsäure), wobei eine blaue Farbe auf dem Papierchromatogramm und auf den Folien des Dünnschichtchromatogramms erzeugt wird;

(II) die Substanz ist kein allgemeines Enzymgift und hemmt nicht die nachstehenden Enzyme bei Konzentrationen, die im Über- schuß gegenüber der zur Hemmung der ß-Lactamase von Escherichia coli, Monamin-oxidase, Carbonsäure-anhydrase, Dopadecarboxylase, Trypsin, Chymotrypsin oder Urease erforderlich ist.

Beispiel 1

Herstellung des MM 4550-Komplexes und Auftrennung in die Substanzen MM 4550 und MM 13902

Die bei den "Beschreibungen" im einzelnen ausgeführten Isolierungsverfahren können bei ihrer Anwendung in verschiedener Weise aufeinanderfolgen. Eine besonders zweckmäßige Reihenfolge ist die Adsorption an Kohle, die Ionenpaar-Extraktion und die Chromatographie an Cellulose, wie es nachstehend beschrieben wird:

340 Liter des nach der "Beschreibung 3" erhaltenen Kulturfil- trats werden in aufsteigender Richtung mit einer Geschwindigkeit von 800 bis 1200 ml/Minute durch eine Säule von 22,9 cm Durch-

messer und 53*3 cm Höhe, die mit Aktivkohle gefüllt war, perkoliert. Die Aktivkohle ist zuvor zur Adsorption des MM 4550-Komplexes verwendet worden und anschließend durch Waschen mit folgenden Reagentien regeneriert worden:

0,5-n Natronlauge; 0,2-n Natronlauge/Aceton im Verhältnis 3:2;' Wasser; n-Salzsäure; Wasser; Phosphatpufferlösung vom pH 6 und Wasser.

Die Säule wird mit 20 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann durch Abstrom mit einem Gemisch von Aceton und Wasser im Volumverhältnis 2 : 8 mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 250 ml/Minute eluiert. Das Eluat wird in 1 Liter-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem MM 4550-Komplex, der durch die antibakterielle Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsiella aerogenes bestimmt worden ist, werden vereinigt (11 Liter) und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf ein Volumen von 5,5 Liter eingeengt. Die Gewinnung an MM 4550-Komplex bei dieser Stufe beträgt 20 Prozent.

Das Konzentrat wird auf 2°C gekühlt und dann mit 5,5 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 2 Gewichtsprozent Tetra-n-butylammonium-hydrogensulfat bei -5⁰C versetzt. Die beiden Phasen werden 2 Minuten miteinander vermischt. Dann wird die Dichlor-

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methan-Phase abgetrennt und bei O⁰C zu 1 Liter einer 0,6prozentigen Natriumjodidlösung gegeben. Die beiden Phasen werden langsam miteinander verrührt, und die wässrige Phase wird allmählich mittels einer 2prozentigen wässrigen Bicarbonatlösung auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7*0 eingestellt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumjodld zu lösen. Das Aceton wird vom unlöslichen Rückstand unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 1,1 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komplex in dieser Stufe beträgt 10 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststorfe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 125fach.

Eine Säule von 2,5 cm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis von 7 : 3 bis zu einer Höhe von 32 cm beschickt. 500 mg des gelbbraunen Pulvers werden in 2 ml eines Gemisches von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis 7 : 3 gelöst und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute chromatographiert. Es werden 3 ml-Fraktionen aus der Säule gesammelt. Diejenigen mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm werden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält den MM 4550-Komplex. Frühere Untersuchungen haben ergeben, daß die bei 285 nm absorbierenden Fraktionen eine enzyminhibierende, antibakteriell wirksame Substanz enthalten. Die Ausbeute an dem gefriergetrockneten MM 4550-Komplex beträgt 35 rn~, ..' -:¹ -"in amorph·:·.·= h-\- ■::·-■ Vassehen und einen I^-Wert von 0,0001 ug/ml besitzt. Die Gewinnung der aktiven Substanz bei dieser Stufe beträgt insgesamt 3 Prozent und die

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BAD ORIGINAL

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Reinigung insgesamt ist öOOfachv

Die antibakterielle Wirksamkeit dieser Substanz wird mittels der Standard-Mikrotiter-Methode bei der Oxoid-Empfindlichkeits-TestbouOlon unter Verwendung eines schwachen Impfstoffes bestimmt. Die erhaltenen Mindesthemmkonzentrationen sind denjenigen in der Tabelle III beschriebenen ähnlich.

Eine Analyse der Substanz mjtbels Dünnschichtchromatographie an Cellulose, wobei mit einem Gemisch von n-Butanol-Isopropanol-Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 entwickelt wird, liefert eine Auftrennung in zwei aktive Substanzen, von denen die eine einen R„-Wert von annähernd 0,58, der die Substanz MM 4550 anzeigt, und die andere mit einem R--Wert von annähernd 0,72 aufweisen, was die Substanz MM 13902 anzeigt. Diese beiden Substanzen werden durch Bioautographie an verschiedenen Organismen bestimmt, z.B. Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillinresistent), Escherichia coil (penicillinempfindlich und penicillinresistent), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Klebsiella aerogenes. Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengefaßt.

Bei einem weiteren Versuch werden die beiden Substanzen auf einer Cellulosedünnschicht getrennt, die mit einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Verhältnis 8 : 2 entwickelt worden ist, und dann aus der Cellulose mittels Phosphatpuffer extrahiert. Jeder Extrakt wird auf eine ß-Lactamase-Hemmung geprüft. Beide Substanzen zeigen, daß sie Inhibitoren der Escherichia coli-ß-Lactamase sind. Beide Substanzen zeigen auch, daß sie mit Benzylpenicillin

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gegenüber Klebsiella aerogenes synergistisch wirken.

Tabelle IV

Antibakterielle Wirksamkeit von MM 4550 und MM 13902, bestimmt durch Bioautographie (DünnschichtChromatographie mit Cellulose und Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6)

	Zonendurchmesser bei Bioautographie	4550-Zone in bei R^sO,58	mm	MM 13902-Zone in mm bei R„= 0,70	mm
Organismus	MM mm	20,0	mm	20,0	mm
Klebsiella aerogenes		17,5	mm	13,5	mm
Proteus mirabilis		16,0	mm	9,5	mm
Proteus morganii		19,5	mm	21,0	mm
Salmonella typhi		20,0	mm	13,5	mm
Escherichia coli 104l8		17,5	mm	10,5	Zone
Escherichia coli BIl		6,5	mm	keine	mm
Enterobacter aerogenes		13,0	mm	4,0	mm
Staphylococcus aureus	(Oxford)	12,0	mm	4,0	mm
Staphylococcus aureus	(Russell)	24,0		15,0
Bacillus subtilis

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Beispiel 2

Herstellung des MM 4550-Komplexes und Auftrennung in die Substanz MM 4550 und in die Substanz MM 13902

1100 Liter Kulturfiltrat aus der Fermentation von Streptomyces olivaceus ATCC 31126 werden bei einem pH von 6,5 und bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 3,2 Liter/Minute durch eine mit granulierter Aktivkohle gefüllten Säule von 0,3 χ 1 m perkoliert, (die Aktivkohle ist bereits einmal zur Adsorption des MM 4550-Komplexes verwendet, aber vor Anwendung durch Waschen mit den nachstehenden Mitteln regeneriert worden:

0,5-n Natronlauge;

0,2-n eines Gemisches von Natronlauge und Aceton im Verhältnis 3 : 2;

Wasser; n-Salzsäure; Wasser; Phosphatpuffer vom pH 6 und Wasser.

Die Säule wird mit 60 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 2:8 bei 30⁰C mit einer Geschwindigkeit von 1,1 Liter/Minute eluiert. Es werden 60 Liter aufgefangen, gefolgt von 5 10-Liter-Fraktionen. Diese Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie sich mittels der antibakteriellen Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebriella aerogenes bestimmen läßt, werden vereinigt (40 Liter) und unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 32 Liter eingeengt.

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Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt 15 Prozent.

Das Konzentrat wird auf 5⁰C gekühlt und' dann bei 5⁰C mit 16 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetyl-dimethylbenzyl-ammoniumchlorid versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und bei 5⁰C mit 3*75 Liter einer Natriumjodidlösung versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt. Dann wird die wässrige Phase abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit wasserfreiem Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumjodid herauszulösen. Der Rückstand wird unter verminderten- Druck getrocknet. Man erhält 2,87 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komlex dieser Stufe beträgt 6 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 160-fach.

Eine Säule mit 63 mm Durchmesser wird mit Mikrocellulosepulver in einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 : 3 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. 2,0 g des gelbbraun gefärbten Pulvers werden in 5 ml eines Gemisches von Isopropanol und V/asser im Volumenverhältnis 7 : 3 gelöst und dann in dem gleichen Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute chromatographiert. Die Fraktionen, die den MM 4-550-Komplex enthalten, wie durch eine Probe gegenüber Klebsiella aerogenes bestimmt worden ist, werden vereinigt, durch Verdampfen ur.cor vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 207 mg eines braunen Feststoffs.

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Die Gewinnung des MM 4550-Kcmplexes in dieser Stufe beträgt 51 Prozent, und die Reinigung ist 5fach.

Eine Säule mit ΐβ mm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 1 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. Dann werden 198 mg des braunen Peststoffes in einem Gemisch von Wasser und n-Propanol im Volumenverhältnrs 1 : 1 gelöst und in einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4 : mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute chromatographiert. Es werden o-n.l-iVaktionen gesammelt, die gegen Klebsiella aerogenes geprüft werden. Es werden auch bei jeder Fraktion die UV-Spektren gemessen. Die Fraktionen Nr. 23 bis Nr. 28 mit einem UV-Maximum bei etwa 305 nm enthalten das Dinatriumsalz der Substanz MM 13902. Diese Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 30 rag eines Feststoffes. Diese Substanz zeigt lediglich eine einzige Zone von antibiotischer Wirksamkeit bei einem R_f-Wert von 0,77 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Celluloseplatten mit einem Gemisch aus n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4:1. Die Zone wird mittels Bioautographie an Bacillus subtilis bestimmt. Die Fraktionen Nr. 29 bis Nr. mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm enthalten die Substanz MM 4550. Diese Fraktionen werden ebenfalls vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 53 mg eines Feststoffes, der ein Salz der Substanz MM 4550 enthält, das mit einer geringen Menge des Salzes der Substanz MM I3902 verunreinigt ist).

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Beschreibung 12 Organismen

Die Eigenschaft, den MM 4550-Komplex zu erzeugen, ist zuerst in den Kulturen der Stämme ATCC 21379, ATCC 2138O, ATCC 21381 und ATCC 21382 festgestellt worden, die aus Bodenproben isoliert worden sind, die man aus Spanien, Neuseeland, Südafrika und Israel erhalten hat. Im Laboratorium scheinen diese Kulturen identisch zu sein, und sie wurden sämtlich als Streptomyces olivaceus von Dr. Bousfield identifiziert, der ein Experte bezüglich Actinomyceten bei der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen (Schottland), ist, wobei die I967 weltweit anerkannte Klassifikation von Hütter ("Systematik der Streptomyceten", S. Karger, Basel, S. 382 ff) verwendet worden ist. Eine MM 4550-Erzeugung ist bisher bei anderen Streptomyces-Spezies gefunden worden, wie dies aus Tabelle IV ersichtlich ist.

Streptomyces olivaceus ist zuerst von Waksman 1919 beschrieben worden '(vgl. "Cultural Studies of Species of Actinomyces" Soil. Sei. £ϊ S. 71 bis 215). Anschließend hat im Jahre i960 eine Gruppe von russischen Forschern eine Spezies mit sehr ähnlichen Eigenschaften beschrieben, doch ist sie als Actinomyces (Streptomyees) fulvoviridis bezeichnet worden (vgl. Kuchaeva und Mitarbeiter, Trud. Inst. Mikrobiol., Akad. Nauk. SSSR. 8 (i960), S. 226 bis 253).

Die Mikroorganismen der Gattung Streptomyces sind außerordentlich variabel in ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaf-

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ten in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter denen sie wachsen. Beschreibungen von zahlreichen Spezies sind veröffentlicht worden, bevor die Existenz dieser außerordentlichen Veränderlichkeit erkannt worden ist, mit der Folge,von Duplikationen und Synonyma. Hütter (1967) führt 25 Spezies auf, die mit Streptomyces olivaceus synonym sind, einschließlich Streptomyces fulvoviridis.Un diese Verwirrung bei der Nomenklatur und der Klassifikation zu lösen ist 19Ö2 ein "International Streptomyces Project" begonnen worden.(vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst. Bacteriol. l8 (1968), S. 69 bis I89). Mitarbeiter an diesem Projekt haben eine Reihe von Studien durchgeführt, die bei der Erstellung genauer Beschreibungen der Spezies von Streptomyces unter Standardbedingungen hilfreich sind. In diesem Schema sind Standardbeschreibungen von typischen Stämmen von über 400 benamten Spezies aufgenommen worden, einschließlich Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis.

Die I.S.P.-Beschreibung von Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis unterscheidet sich nur in zwei Eigenschaften:

(a) In Form der Sporenträger und

(b) der Fähigkeit, Inosit als einzige Kohlenstoffquelle zu spalten

Streptomyces olivaceus wird wie folgt beschrieben:

Sporenkettenmorphologie: Sektion Spiralen, mit offenen Spiralen, die allmählich in gekrümmte Sporenketten übergehen, die Sektion rektiflexible Sporen andeutend. Die reifen Spcrenketten sind gewöhnlich lang, häufig mit über 50 Sporen je Kette.

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Kohlenstoffquellen: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, I-Inosit, D-Mannit, D-Pructose und Rhamnose werden für das Wachstum benötigt . Auf Saccharose und Raffinose findet kein Wachstum oder nur ein spurenweises Wachstum statt.

Streptomyces fulvoviridis wird wie folgt beschrieben:

Sporenkettenmorphologie: Sektion rektiflexible Sporen. Die reifen Sporenketten sind mäßig kurz mit 10 mit 50 Sporen je Kette. Kohlenstoffquellen: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Mannit, D-Pructose und Rhamnose werden für ein Wachstum benötigt. Die Spaltung von Saccharose ist zweifelhaft. Auf i-Inosit oder Raffinose findet kein Wachstum oder nur spurenweises Wachstum statt.

Die Charakterisierung einer Anzahl von Kulturen, die als Streptomyces olivaceus oder Streptomyces fulvoviridis und andere verwandete Spezies benannt oder damit synonym sind, werden unter Anwendung von Standardmethoden und Mitteln, wie sie in dem "International Streptomyces Project" (I.S.P.) empfohlen worden sind, bestimmt (vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst. Bacteriol. VS (1966), S. 313 bis 3¹K)),

Die Kulturen leiten sich von verschiedenen Quellen ab. Die Stämme ATCC 21379, 21380, 2138I und 21382 wurden aus Bodenproben auf der Basis isoliert, den MM 4-550-Komplex zu erzeugen. Die anderen Stämme wurden aus zahlreichen Kultursammlungen für Vergleichszv;ecke erhalten.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Erzeugung des MM-4550-

5098AO/1091

Komplexes, der Farbe des Luftmycels, die Gestalt der Sporenträger, die Farbe des Mycelsubstrats, lösliche Pigmenterzeugung, Melaninerzeugung und Spaltung von Kohlenstoffquellen sind in den Tabellen IV bis VIII angegeben. Bei allen Stämmen ist die Sporenoberfläche bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop glatt.

Aus der I.S.P.-Beschreibung ist es' offensichtlich, daß das Spiralenwachstum des Sporenträgers bei Streptomyces olivaceus von unterschiedlichem Charakter ist. Echte Spiralen werden mit unterschiedlicher Häufigkeit oei den typischen Spezies von Streptomyces olivaceus beobachtet, nämlich bei ATCC 5335. Die Mehrzahl der Sporenträger ist lang. Keine echten Spiralen werden bei Kulturen der Spezies ATCC 21379, 21380, 2138I oder 21382 beobachtet, obwohl die Sporenträger lang sind und die Neigung zu Spiralen bei einem Hintergrund der rektiflexiblen Arten zeigen. Jedoch bei zwei Streptomyces olivaceus-Stämmen, nämlich NCIB 8238 und NCIB 8509, ist die Mehrzahl der Sporenträger von der rektiflexiblen Art. Beim Stamm NCIB 8230 sind sie mäßig lang, während sie beim Stamm NCIB 8509 lang sind.

Die bei dem Stamm ATCC 15863 beobachteten Sporenträger, einer typischen Spezies von Streptomyces fulvoviridis, sind kurzer als die von den isolierten Stämmen ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 und 31126 und stellen lediglich rektiflexible Arten dar. Im Hinblick auf diesen Charakter entsprechen deshalb die isolierten Stämme ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 und 31126 ziemlich gut, jedoch nicht genau der Beschreibung von Streptomyces olivaceus.

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Die reinen Stämme ATCC 21379, 21380, 2138I, 21382 und 31126 zeigen eine gewisse -Variabilität im Hinblick auf die inositspaltung die ein anderes Unterscheidungsmerkmal gemäß den I.S.P.-Typenbeschreibungen der Spezies zwischen den Spezies Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis sind (vgl. Tabelle VIII). Die Stämme ATCC 31126 und ATCC 21380 spalten Inosit, was für Streptomyces olivaceus charakteristisch ist, während die anderen Stämme eine zweifelhafte oder eine negative Spaltbarkeit zeigen. Es wird jedoch nicht als allgemein zufriedenstellend betrachtet, eine Spezies aufgrund seiner Fähigkeit, ein einzelnes Kohlehydrat zu spalten, auseinanderzuhalten. Solch ein Unterschied kann durch eine einzige Genmutation hervorgerufen werden und wird häufig lediglich als Stammsignifikanz betrachtet. Der Unterschied bei der Zucker spaltbärke it bei den Streptomyces olivaceus-Stämmen NCIB 8138, NCIB 8509, ATCC 215^9, ATCC 12019 und ATCC 3335 deutet darauf hin, daß zahlreiche Fachleute sie nicht als signifikantes Merkmal dieser Spezies betrachten. Demzufolge werden die Stämme ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 und 31126 mit Recht als Streptomyces olivaceus bezeichnet.

Wenn nicht weitere Studien bedeutendere Unterschiede zwischen diesen Kulturen aufdecken, die gegenwärtig mit Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis benannt sind, ist es möglich, daß sie vielleicht auf internationaler Basis als einzige Spezies anerkannt werden. In diesem Fall soll der richtige Name aufgrund des Prioritätsrechtes Streptomyces olivaceus sein, wobei„auch diejenigen Kulturen mit eingeschlossen sind, die bei Hütter als synonym mit Streptomyces olivaceus bezeichnet sind.

"509840/1091

Die Untersuchung der KuIturfilträte der Stämme von Streptomyces olivaceus und der verwandten Spezies hinsichtlich der Erzeugung des MM 4550-Komplexes kann wie folgt durchgeführt werden:

Kulturfiltrate der aufgeführten Stämme werden auf Papierstreifen (Whatman No. l) in einer Menge von 20 uLiter je Ausgangslösung getüpfelt und über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 chromatographiert. Ein anderer Satz Streifen wird ebenfalls über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-3utanol/Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 12 : 3 ! 5 chromatographiert .Gleichzeitig läuft eine teilweise gereinigte Probe des MM-4550-Komplexes in den beiden Systemen als Markierungsmittel mit.

Es ist gegebenenfalls möglich, 25 ml der geklärten Bouillon mit 12,5 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetylbenzyl-ammoniumchlorid zu extrahieren, die Phasen zu trennen, die organische Phase beizubehalten und diese mit 2,5 ml einer 0,5prozentigen Natriumjodidlösung zu versetzen, die Lösung zu schütteln, in Phasen aufzutrennen, die wässrige Phase beizubehalten und diese chromatographisch zu verwenden, indem z.B. 5 η auf die Dünnschichtchromatographie-Streifen getüpfelt werden, und diese sich in einem Gemisch von n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 entwickeln.

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Tabelle V

Vermögen der Kulturen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies, den MM 4550-Komplex zu erzeugen

Kultur	olivaceus	ATCC	21379	MM 4550-Komplex- Erzeugung
Streptomyces	tt	ATCC	31126	+
It	ti	ATCC	2138O	+
ti	t·	ATCC	21381	+
Il	It	ATCC	21382	+
It	ti	NCIB	8238	4-
It	ti	NCIB	8509	+
ti	favovirens	ATCC	3320	+
Streptomyces	flavus	ATCC	3369	+
Streptomyces	fulvoviridis	ATCC	15863	+
Streptomyces	argenteolus	ATCC	IIOO9	+
Streptomyces	sioyaensis	ATCC	13989	+
Streptomyces	lipmanii	NRRL	3584	+
Streptomyces			+

(Streptomyces olivaceus ATCC 21549, ATCC 12019 und ATCC 3355 erzeugen keinen MM 4550-Komplex; der Stamm ATCC 15863 wird auch als hinterlegter Stamm RIA 66O bezeichnet)

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Tabelle VI

Farbe und Morphologie des reifen sporenbildenden Luftmycels von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvovirldis und verwandten Spezies auf ISP-rMedien nach l4tägigem_Wachstum

cn ο co αο

Kultur	SS	YM	GA	OM	Morphologie des Sporenträgers (mittlere Größe)
ATCC 21579	grau	grau	grau-weiß	grau	lange RF
ATCC 51126	grau-braun	grau-braun	grau	grau	lange RF
A?;;c 21580	grau	grau	grau	grau	lange RF
ATOC 2158I	grau	grau	blaß-grau	grau-weiß	lange RF
ATCC 21582	grau-weiß	grau	grau	grau	lange RF
NCIB 8258	grau-weiß	grau	grau	grau	mittlere RF
NCIB 8509	grau	grau	grau	grau	lange RF
ATCC 215^9	grau	grau	grau	grau	lange S
ATCC I2OI9	grau	grau ·'	grau	grau	lange RF/S
ATCC 5555	grau	grau	grau	grau	lange RF/S
ATCC I5865	grau-weiß	grau	grau-weiß	grau	mittlere RF
ATOC 5520	grau-blau	grau	grau-grün	grau	lange RF
Aiv.e 5569	grau	grau	grau	blaß-grau-braun	mittlere RF/RA
ATCC IIOO9	blaß-grau	grau-braun	grau-weiß	grau-grün	mittlere RF/RA
ATCC I5898	weiß-grau	weiß	weiß-gelb	grau-weiß	kurze S

YM GA OM

Anorganische Salze - Stärkeagar (ISP-Medium Nr. 4) Hefe<-Extrakt - Malz-Extrakt-Agar (ISP-Medium Nr. 2) Glycerin - Asparaginsäure-Agar (ISP-Medium Nr. 5) Hafermehl-Agar (ISP-Medium Nr. 5)

RF = rektiflexible Sporen
RA = retinaculiaperte Sporen
S = Spiralen

Tabelle VII

Farbe des Substrats und des Mycels von der Rückseite gesehen von Streptomyces ollvaceus, Streptomyces fulvoviridls und verwandten Spezies

OO -C-O

Kultur	SS	YM	GA	OM
ATCC 21579	oliv	olivbraun	grau-braun	olivgrün
ATCC 3II26	olivbraun	olivbraun	braun	olivbraun
ATCC 2I38O	oliv	olivgrün	olivbraun	■ olivgelb
ATCC 2138I	dunkelbraun	dunkelbraun	olivgrün	olivgrün
ATCC 21382	oliv	oliv	braun	olivgrün
K1CIB 8238	braun	oliv-braun	braun	olivgelb
NCIB 8509	braun	oliv	olivbraun	olivgelb
ATCC 215^9	braun-gelb-schwarz	braun-schwarz	braun-schwarz	braun-gelb-grau
ATCC I2OI9	braun-gelb	braun-gelb	braun-gelb	braun-gelb
ATCC 3335	braun	braun	braun	grau
ATCC I5863	braun-grau	dunkelbraun	olivbraun	olivgelb
ATCC 3320	gelb-braun	oliv-braun	oliv-braun	orange-braun
ATCG 3369	braun-gelb-grau	gelbbraun	braun-gelb-grUn	gelb
ATCC IIOO9	schwarz	schwarz-gelb	schwarz-gelb	grau-grün
ATCC I3989	orange	gelb	gelb	farblos*

NJ CJl

Tabelle VIII

Erzeugung von Pigmenten in Kulturmedium durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Spezies

	21379	lösliche nicht-melanoide	—	-	YM	GA	Pigmente	* Melanin-
							Erzeugung
Kultur			+
	31126	SS	schwach			OM
ATCC	2138O		braun	-	-	+
	2138I		—	-	-	schwach
	21382			-	-	gelb
ATCC	8238	-		-	-	-	-
ATCC		_		+	-	-
ATCC				schwach	-	-
ATCC	8509			braun	-	_
NCIB		-		—	+
		-			schwach
	21549				braun
NCIB		+	+	+	+
		schwach	schwach	schwach	schwach
	I2OI9	rosa	braun	rotbraun	gelb	_
ATCC	3335	-	-	-	+
	15863	_	-	-	schwach
	3320		-	-	braun	-
ATCC			_	_	-	-
ATCC					-	-
ATCC	3369				-	_
ATCC	11009		-	-	_
			+	_
		schwach			-
ATCC	13989	braun		-
ATCC		+
		schwach
	orange
ATCC

+ = Pigment erzeugt - = Pigment nicht erzeugt

untersucht auf einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP6), Tyrosin-Agar (ISP17) und in einer Trypton-Hefe-Kulturlösung (ISPl)

509840/1091

1 +	I
Il	Il
α I ι.	α 1 I.
Η· Φ	φ
CO	<;
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Glucose

+

+

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+

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♦

Xylose

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+

+

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*

Fructose

+

+

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Mannit';

+

+

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Arabinose

*

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I 1O
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I N	H
I H·	Η·
I Φ	I
ι cn

Beispiel 3

Das bevorzugte Isolierungsverfahren zur Herstellung der Substanz MM 13902

Ein Vorrat von Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 31126 wird in Röhrchen mit trockenem Boden in einem geschlossenen Behälter mit einem Trockenmittel bei einer Temperatur von 20°C auf Lager gehalten. Eine geringe Menge der Bodenprobe (etwa 20 mg) wird aseptisch in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 100 mg des folgenden Mediums enthält:

Bestandteile Menge (g/Liter)

Glucose-monohydrat 20,0

Sojabohnenmehl 10,0

entsalztes V/asser ad 1 Liter

Vor dem Sterilisieren wird der pH auf 6,5 eingestellt.

Der Kolben wird etwa 30 Stunden bei 28°C auf einem Rotationsschüttler, der sich mit 240 UpM dreht, bebrütet. 2 ml der erhaltenen vegetativen Anzucht werden dann zur Überimpfung auf einen festen Schrägagar in einer Roux-Flasche verwendet. Der Schrägagar hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Gemüsesaft 20,0 ml

Agar 20,0 g

entsalztes Wasser ad 1 Liter

5098AO/109 1

- 55 -Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt.

Die Beimpfung erfolgt über die gesamte Agaroberfläche durch Schütteln der Flasche, die dann aufgerichtet bei 30⁰C bebrütet wird. Nach 2tägiger Bebrütung wird überstehende Flüssigkeit der Flasche mittels einer Pipette abgezogen und die Bebrütung weitere 4 Tage fortgesetzt.

Es ist früher gefunden worden, daß eine Entwicklung von Actinophagen in der Schrägkultur unterdrückt wird, wenn man sich dieses Herstellungsverfahren der Kultur in der Roux-Flasche zu eigen macht.

Zu der Kultur in der Roux-Flasche werden dann 50 ml sterilisiertes, entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleats zugegeben. Die Sporen werden durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspension wird dann als Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100-Liter-Fermentor aus rostfreiem Stahl gegeben. Die Zusammensetzung des Nährmediums lautet wie folgt:

Bestandteile Menge (g/Liter)

Sojabohnenmehl 10,0

Glucose-monohydrat 20,0

Leitungswasser ad 1 Liter

Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml Sojabohnenöl mit einem Gehalt von 10 Volumprozent des bereits genannten Xthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats zu dem Fermentationsmedium vor

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einem Sterilisieren gegeben.

Das Medium wird 20 Minuten bei 120⁰C in dem Permentor mit Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit l4o UpM mittels eines Leitschaufelrührers von 19 cm Durchmesser gerührt und durch einen offenendigen Zerstäuber mit 75 Liter je Minute steriler Luft belüftet.

Die Temperatur wird auf 28°C eingeregelt. Nach 48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen wird der Inhalt des Fermentors als Impfstoff zu 1500 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einem 2000 Liter fassenden, voll mit Prallblechen ausgerüsteten Fermentor aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (g/Liter)

Sojabohnenmehl ' 10,0

Glucose-monohydrat 20,0

Kreide (gefälltes Calciumcarbonat) 0,2

Kobaltchlorid (CoCl₂.6H₃O) 0,001

Natriumsulfat (wasserfrei) 1,0

Leitungswasser ad 15OO Liter

Vor einem Sterilisieren wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 6,0 eingestellt. Zur Verhinderung eines Schäumens werden ebenfalls vor einem Sterilisieren J> Liter Sojabohnenöl mit einem Gehalt an 10 Volumprozent des bereits genannten Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats gegeben. Nach dem Sterilisieren wird der pH-Wert wiederum mit einer sterilen Natriumhydroxidlösung auf pH

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7,0 eingestellt. Die Fermentationslösung wird mit 106 UpM gerührt. Der Rührschaft ist mit 2 Leitschaufeln mit 48,3 cm Durchmesser ausgerüstet. Die Temperatur wird auf 30⁰C und der Luftstrom auf 1200 Liter/Minute eingestellt. Nach 60 Stunden wird die Fermentation gesammelt und durch Zentrifugieren geklärt.

Das vorgehend erzeugt Produkt wird willkürlich mit einer Aktivität von 340 Einheiten je ml bezeichnet. Die Proben werden wie in der "Beschreibung 2" beschrieben bestimmt.

1050 Liter des Kulturfiltrats mit 340 Einheiten je ml werden bei 10°C und einem pH-Wert von 8 mit 310 Liter Dichlormethan von 10⁰C extrahiert, das 1200 g Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid enthält, indem die beiden Flüssigkeiten bei vorbestimmten Fließgeschwindigkeiten durch Vermischen in den Rohrleitungen gepumpt werden. Die Phasen werden in einer kontinuierlichen Zentrifuge nach vorherigem, etwa 2minütigen Vermischen getrennt. Die Dichlormethan-Phase (300 Liter) wird mit wässrigem Matri umjodid nochmals extrahiert. Die abermalige Extraktion wird in 4 Ansätzen unter Verwendung von insgesamt 7 Liter Wasser mit einem Gehalt von 210 g Natriumiodid durchgeführt. Die Phasen trennen sich aufgrund der Schwerkraft. Die wässrige Phase wird mittels Salzsäure vom pH 7,7 auf pH 7,0 eingestellt und filtriert. Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) enthält 219C0 Einheiten je ml.

Es wird eine Ionenaustauschersäule vorbereitet, indem sie mit vernetztem Dextran in einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 rrit einem Gehalt von 0,3-m Natriumchlorid beschickt wird. Die Glassäule hat einen Durchmesser von 10 cm und eine Höhe von 4o cm. Der

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Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) wird bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Minute durch den Ionenaustauscher perkoliert. Die Säule wird mit einer 0,05-m Phosphatpufferlösung ebenfalls vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,7-m Natriumchlorid bei 5⁰C und einer Pließgeschwindigkeit von 25 ml/Minute eluiert. 2 Liter des Eluats werden verworfen.und 90 Fraktionen zu 100 ml gesammelt. Die Fraktionen werden in einem Ultraviolett-Spektrophctometer genau untersucht, und diejenigen Fraktionen, die ein Absorptionsmaxima bei etwa 305 nm zeigen, werden gesammelt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Es handelt sich hierbei um die Fraktionen Nr. 50 bis 62, die nach Vereinigen ein Volumen von l44o ml und eine Wirksamkeit von 71000 Einheiten je ml haben. Es ist zu-■wor gezeigt worden, daß diese Fraktionen mit einem Maximum in diesem Bereich die Substanz MM 13902 enthalten.

Zu den vereinigten Fraktionen wird Natriumchlorid (5 g je 100 ml) gegeben. Die Fraktionen werden bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 2.0 ml/Minute durch eine Säule von 6,3 cm perkoliert, die bis zu einer Höhe von 30 cm mit "Amberlite XAD 4"-Harz beschickt ist. Unter diesen Bedingungen adsorbiert die Substanz MM 13902 an das Harz, während dies anorganische Verunreinigungen nicht tun. Die Substanz MM 13902 wird bei Raumtemperatur mit 200 ml destilliertem Wasser und anschließend 50prozentigem wässrigen Methanol eluiert. Das Eluat (1 Liter) wird unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 70 ml eingeengt, auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und gefriergetrocknet. Man erhält 1,62 g eines braunen Fettstoffes, der dac teilweise gereinigte Salz der Substanz MM 13902 mit einer Aktivität von 37OOO Einhei ten je mg darstellt.

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1,0 g der teilweise gereinigten Substanz MM 13902 (37000 Einheiten/mg) wird an einer Säule von 3*8 χ 30 cm mit einer Beschickung von Mikroeellulose chromatographiert und dann mit einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Voluinenverhältnis von 4 : 1 mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/Minute eluiert. 170 ml Eluat werden verworfen und 115 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die das Dinatriumsalz der Substanz MM 13902 enthalten, nämlich die Fraktionen Nr. 37 bis 43* wie durch UV-Absorption festgestellt worden ist, werden vereinigt (89 ml), zum Entfernen des n-Propanols bei einer Temperatur unter 30°C und unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 219 mg eines gelblichen Pulvers mit einer Aktivität von 73ΟΟΟ Einheiten je mg.

Die vorgenannte Substanz zeigt ein UV-Absorptionsmaximum bei etwa 308 nm mit einer Extinktion j _cm von etwa 343. Diese Substanz besitzt ein Infrarot- und NMR-Spektrum, wie.es aus den Fig. 2 und 3 ersichtlich ist. Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz ist in Tabelle X angegeben. Die Elementaranalyse der Substanz läßt erkennen, daß sie u.a. Stickstoff, Schwefel und Natrium wahrscheinlich in einem Verhältnis von N : S : Na wie 2:2:2 besitzt. Die positiven und negativen Maxima der kreisförmigen Dichroismus-Kurven für das Dinatriumsalz der Substanz MM 13902 werden auf einem "Cary-6l"-Aufzeichnungsspektropolarimeter bei Konzentrationen von 0,37 mg/ml bei einer Lauflänge von 1 cm bestimmt. Man erhält folgende Ergebnisse:

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- 6ο -

λ (nm)

Δ ^Ε/,

186	+ 67,24	χ	10
221	- 67,24	χ	10
286	- 3,3	X	10
323	- 8,2	X	10

-4 -4 -4 -4

Tabelle X

Antibakterielle Wirksamkeit des' Dinatriumsalzes des MM 4550-Komplexes (Mikrotiter-Methode: starker Impfstoff, 1 Prozent einer über Nacht stehengelassenen Bouillon).

Organismus	Mindes themmkonzen- tration Qug/ml)
Bacillus subtilis A	0,15 0,3 0,6 3,1 25 0,15 5 0,03 0,6 0,6 0,07 - 50 0,3 2,5
Staph. aureus Oxford	0,6-0,3 !
Staph. aureus Russell	0,08
Strep, faecalis	0,08 !
Enterbacter cloacae Nl
E. coli 104l8 E. coli JT410 Kleb, aerogenes A
Proteus mirabilis 13
Proteus vulgaris WO 90
Prov. stuartii
Ps. aeruginosa A
Salmonella typhimurium CT 10
Serratia marcescens US 39
Shigella sonnei
Haemophilus influenzae P6
Neisseria genorrhoeae

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Claims (1)

1. Patentansprüche 1. Die Substanz MM 13902 und ihre Salze.

   2/ Die feste Carbonsäure MM 13902 in Form ihres praktisch reinen Natriumsalzes mit den folgenden Eigenschaften:

   (1) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

   (2) ein charakteristisches UV-Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei etwa jjüf? nm in Wasser;

   (3) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr-Platte charakteristisches Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, l400 und 1260 cm"¹;

   (4) ein charakteristisches NMR-Spektrum in deuteriertem V/asser mit u.a.

   (a) einem Paar Niederfeld-Dubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,85¹C und 4,002" mit Kopplungskonstanten von etwa l4 Hz,

   (b) mit einem Dublett mit einem Zentrum bei etwa 8,55tT und

   (c) mit einem scharfen Singulett bei etwa 8,00 Z;

   (5) eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies, u.a. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coil, Klebsieila aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi und Pseudorr.cnas aeruginosa;

   (6) im Gemisch mit Ampicillin eine synergistische Wirksamkeit

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   gegenüber Organismen, wie Stämmen von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.

   3. Die Substanz MM 15902 und ihre Salze nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das reine Dinatriumsalz bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachstehenden Systemen die annähernden R--Werte aufweist:

   (a) bei n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 einen R_f-Wert von 0,72;

   (b) bei Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 ' 3 einen R_f-Wert von 0,85;

   (c) bei n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 • einen R^-Wert von 0,8l und

   (d) bei n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis von 4 : 1 einen R_f-Wert von 0,75-

   4. Die Substanz MM 13902 und ihre Salze, nach den Ansprüche 2 oder 3j dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin das reine Dinatriumsalz einen I^-Wert zwischen 0,001 ug/ml und 0,0001 ug/ml gegenüber der ß-Lactamase von Escherichia coil BIl aufweist.

   5. Die Substanz MM 13902 und ihre Salze nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz MM 13902 als Schwefel enthaltende antibakterielle Substanz charakterisiert ist, dessen Salze während der Züchtung von Streptomyces olivaceuo ATCC 31IZo erzeugt werden, wobei die Substanz in Form der wässrigen Lösung ihres Dinatriumsalzes Ultravio-

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   lett-Absorptionsmaxima bei etwa 305 *wi und bei etwa 225 nm im wesentlichen gemäß der Fig. 1 aufweist.

   6. Die Substanz MM 13902 und ihre Salze nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz MM 13902 als eine antibakterielle Substanz charakterisiert ist, die in Form ihres im wesentlichen reinen Dinatriumsalzes ein Infrarot-Absorptionsspektrum hauptsächlich gemäß Fig. 2 besitzt, wenn es bei einer frisch zubereiteten KBr-Platte mit einem Gehalt an 0,4 Gewichtsprozent der Substanz MM 13902 aufgenommen worden ist, und die in Form ihres im wesentlichen reinen Dinatriumsalzes ein NtoR-Spektrüm hauptsächlich gemäß Fig. 3 besitzt, wenn es in einer frisch zubereiteten Lösung in deuteriertem V/asser aufgenommen worden ist.

   7. Dibasische Salze, insbesondere das Dinatriumsalz der Substanz MM 13902 gemäß den Ansprüchen 2 bis 6.

   8. Eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 7 mit einer Reinheit von mindestens 80 Prozent, vorzugsweise von 90 bis 100 Prozent.

   9. Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 13902 und ihren Salzen nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines MM 4550-Komplexes chromatographisch in Fraktionen unterteilt, die hauptsächlich aus einer Lösung der Substanz MM 13902 oder ihrer Salze oder aus anderen Fraktionen bestehen, und daß man die Substanz MM 13902 oder ihre Salze aus

   der Lösung isoliert.

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   10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanz MM 13902 in Form ihrer dibasischen Salze isoliert.

   11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man einen die Substanz MM 13902 erzeugenden Stamm von Streptomyces züchtet und anschließend die Substanz MM 13902 oder deren Salze aus der Züchtungslösung isoliert.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm von Streptomyces einen Stamm von Streptomyces olivaceus oder einen verwandten Organismus züchtet.

   13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus Streptomyces olivaceus ATCC 31126 oder eine dessen Mutanten züchtet. __

   14. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das dibasische Salz der Substanz MM 13902 von dem dibasischen Salz der Substanz MM 4550 chromatographisch abtrennt .

   15. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Substanz MM 13902 oder deren Salze nach den Ansprüchen 1 bis 8, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmakologisch verträglichen Trägermaterial und/oder Verdünnungsmittel.

   16. Arzneimittel nach Anspruch 15* gekennzeichnet durch einen

   zusätzlichen Gehalt an Penicillin oder Cephalosporin.

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