DE1792019C

DE1792019C - Verfahren zur Herstellung von Rifamycin-SV

Info

Publication number: DE1792019C
Application number: DE19681792019
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Pavia; Hengeller Carlo Napoli; Lancini (Italien)
Original assignee: Gruppo Lepetit S.P.A., Mailand (Italien)
Priority date: 1967-07-13
Filing date: 1968-07-12
Publication date: 1973-03-01

Description

In einer früheren Veröffentlichung (Antibiotics Annual, 1959/1960, S.262) beschreibt Sensi et al. die Herstellung des Antibiotikums Rifamycin, das aus einem Gemisch vieler Substanzen mit ähnlicher Struktur besteht, durch Fermentation eines Streptomyces-mediterranei-Stammes. Als Interessanteste unter diesen Substanzen erwies sich Rifamycin B; deswegen versuchte man, die Ausbeute zu verbessern. In »Appl. Microbiol«, S. 325 (1961), wird von Margalith et al. eines der Forschungsergebnisse beschrieben; dort heißt es, daß sich die Ausbeute und die Reinheit von Rifamycin B durch Zusatz von Natriumdiäthylbarbiturat zu der Fermentationsbrühe verbessern läßt. Eine weitere Veröffentlichung (Sensi et al., Il Farmaco, Ed. Sei., 16, S. 165) betrifft die Herstellung von Rifamycin SV, das eine der Komponenten der Rifamycin-Gattung darstellt, eine höhere antibakterielle Wirksamkeit besitzt und ein wichtiges Zwischenglied zur Synthese anderer Rifamycin-Derivate darstellt. Allgemein ausgedrückt, besteht das Verfahren darin, daß man Rifamycin B einer Reihe

Vergleich der Eigenschaften der Kulturen von Streptomyces

und von Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 auf mehreren

hese ist onensicmum ^ ~*—— °-

m den verschiedenen Stufen ziemhch schwer zu losende

Praktische Probleme mit sich, verbunden mit wahrsSich häufig vorkommenden Verlusten desselben AitiSo?kl,^gAus wirtschaftlichen Uberiegungen

ίο heraus suchte man nach einem einfacheren Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV ist dadurch gekennzeichnet daß man Streptomyces mideterranei ATCC 21271 m

X₅ einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, unter aeroben submersen Bedingungen züchtet und die Fermentationslösung in üblicher Weise auf-

ao "sieptomyces mediterranei ATCC 21271 wird erhalten; wenn man Streptomyces mediterrane, der Wirkung physikalischer (z. B. UV-Strahlen), chemischer (Senfgas, N-raethyl-N'-nitrosoguamdm) oder biologischer (z. B. Actinophage) Mutationsmittel aus-

^{aS Se} Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 behält die ursprüngliche Taxonomie des Streptomyces mediterranei bei, und die seine Kultur betreffenden Eigenschaften sind praktisch die gleichen. Nur bei der

Bildung des Luftmyzeliums und in der Farbe der löslichen Pigmente wurden einige Unterschiede beobachtet, nachdem Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 auf entsprechenden Nährboden gewachsen war. In der folgenden Tabelle werden die Eigenschaften

des Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 mit denen des Streptomyces mediterranei ATCC 21 27i verglichen.

Nährboden

Vegetatives Myzelium

ATCC 13 685

Luftmyzeliuni

Lösliches Pigment Vegetatives Myzelium

ATCC 21 271

Luftmyzelium

Lösliches Pigment

Stärke Agar

Ca-Malat-Glukose-Agar

Ca-Malat-Glycerin-Agar

Bennet-Agar

glasklar bis hellbraun

glasklar bis hellorange

glasklar bis orangegelb

rosa weiß

weiß hellorange

rosa weiß

grüngelb bis hellbraun

hellgelb

wenig schwachorange

sehr helles gelbbraun glasklar bis orangebraun bis dunkelbraun

glasklar bis orangegelb

glasklar bis orangegelb bis orangebraun

glasklar bis orangegelb bis dunkles rotbraun

fehlt

helles grüngelb bis braun grüngelb

sehr helles braun grüngelb

braungelb bis braunrot

Die in der vorstehenden Tabelle genannten Nähr- ZnSO₄-7H₁O, 20 g Agar Difco, mit destilliertem boden hatten folgende Z^.-"-"mensetzung: 65 Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach 20minutiger

, Stärke Agar: 10 g lösliche Stärke, Ig K-HPO₄, Sterilisation bei 12O⁰C lag der pH-Wert bei 6,7 bis 7,8. Ig MgSOWH₁O, Ig NaCL, 2g (NH₄J₁SO₄, Ca-Malat-Glukose-Agar: 20g Glukose, 10g Ca-

2 g CaCO₁, je 0,001 g FeSO₄ · 7H₁O, MnCI₁ · 4H₁O, Malat, 0,5 g NH₄Cl, 0,5 g K₁HPO₄, 15 g Agar Difco,

mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach Wenn die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen 15minutiger Sterilisation bei 115° C lag der pH-Wert Substanz in das Lösungsmittel überführt worden'ist; bei 6,5. wird vorzugsweise bei einer Temperatur von unter

Ca-MalatTGlycerin-Agar: 10 g Glycerin, 10 g Ca- 30⁰C im Vakuum bis zur TrocKene destilliert. Malate, 0,5 g NH₄Cl, 0,5 g K₁HPO₄,15 g Agar Difco, 5 Die Reinigung des Rifamycin SV wird chromatomit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach graphisch an einer mit einem geeigneten Adsorptions-15minutiger Sterilisation bei 115°C lag der pH-Wert material, wie Silikagel, präparierten Säule durchbei 6,5 bis 6,6. ' geführt. Die Rifamycine werden in einem geeigneten

Bennet-Agar: 10 g Glukose, 1 g Hefeextrakt, 1 g organischen Lösungsmittel wie Aceton gelöst, auf die Fleischextrakt, 2gN-Z-AminA, 15 g Agar, mit io Säule gebracht und mit einem geeigneten Lösungsdestilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt Nach mittelgemisch wie Aceton und Benzol eluiert. Im Sterilisation lag der pH-Wert bei 6,7 bis 6,8. allgemeinen ist die Abtrennung von Rifamycin SV

Das Fermentations? und Extraktionsverfahren aus anderen Rifamycinen ziemlich scharf, da es eine kommt im wesentlichen dem zur Herstellung von wesentlich höhere Beweglichkeit besitzt und auf Rifamycin B beschriebenen Verfahren gleich und be- 15 Grund des charakteristischen orangegelben Farbsteht in der Züchtigung von Streptomyces mediterranei ringes innerhalb der Säule leicht verfolgt werden kann. ATCC 21 271 in einem eine assimilierbare Kohlen- Das das Rifamycin SV enthaltende Eluat wird dann stoff- und Stickstoffquelle und wichtige Mineralsalze im Vakuum zur Trockne konzentriert und ein kristalenthaltenden Nähnnedium, bis dieses Nähnnedium liner, orangegelber Rückstand erhalten, eine beträchtliche antibiotiscbe Wirksamkeit besitzt, ao Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, und in- der Extraktion von Rifamycin SV aus dem

Nährniedium. Dieser Stamm wird unter Rühren und Beispiel 1

unter belüfteten submersen Bedingungen bei einer

Temperatur zwischen 25 und 37° C und vorzugsweise Eine Suspension des Myzelium der Streptomyces

bei 28°C gezüchtet. Als Kohlenstoffquelle können die as mediterranei ATCC 13 685 wurde mit N-methylf olgenden Kohlenhydrate und Kohlenstoff derivate ver- N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt und auf Bennetwendet werden: Glukose, Galactose, Lactose, Saccha- Agar okuliert. Die Kolonien, die die mutagene Berose, Maltose, Glycerin, Mannit. Brauchbare Stick- handlung überlebten, wurden isoliert und auf ihre stoffquellen sind z. B. Aminosäuren und deren Ge- Fähigkeit, das Wachstum von Pseudomonas reptilimische, Peptide, Proteine und deren Spaltprodukte 30 vora NRRL-B6, die auf Penassay-Samenagar bei wie Pepton, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Mais- einem pH-Wert von pH 7,2 gezüchtet wurden, zu wasser, lösliche Fischrückstände, Fleischextrakte, wäß- hemmen, geprüft. Rifamycin B ist unter diesen Berige Teile der Getreidesamen. Die Fermentation kann dingungen mikrobiologisch inaktiv, und Rifamycin SV über 96 bis 180 Stunden hinweg durchgeführt werden. bildendes Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 Der Anfangs-pH-Wert, der im allgemeinen bei etwa 35 wurde ausgewählt.

pH 6,2 bis pH 6,4 lag, sank während der Fermentation Dieser Stamm wurde 6 bis 8 Tage lang auf dem

auf pH 5,5 bis 6,0. Im allgemeinen wurden die besten Bennet-Agar vermehrt und bei 28° C inkubiert. Mit der Ergebnisse bei 180stündiger Fermentation beobachtet. Kultur, die aus der schräg im Reagenzglas angelegten Nach dieser Zeit erhielt man eine ausgezeichnete Aus- Agarlcultur erhalten wurde, wurden zwei 500-mlbeute des Antibiotikums. 40 Erienmeyerkolben unter sterilen Bedingungen oku-

Nach Ablauf der Fermentation konnte das Rifa- liert. Die Kolben enthielten 100ml des vegetativen mycin SV durch folgendes Verfahren isoliert werden: Mediums der folgenden Zusammensetzung: Das Fermentationsmedium wird bei dem End-pH-

Wert von pH 6,4 bis pH 6,6 filtriert. Um die beste Fleischextrakt 5 g Stabilität der antibiotischen Substanz zu garantieren, 45 Hefeextrakt 5 g

wird das Filtrat auf einen pH-Wert, der vorzugsweise Pepton 5 g

unter pH 5 liegt, angesäuert. Die wirksame Substanz Caseinhydrolysat 3 g

wird mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmitteln, Glukose 20 g

wie Chloroform, Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- NaCl 1,5 g

oder Amylacetat, extrahiert. Das Volumenverhältnis 5° mit H₁O auf 1 Liter aufgefüllt.

zwischen dem Medium und dem Lösungsmittel ändert

sich je nach dem gewählten Lösungsmittel; im allge- Der pH-Wert wurde mit NaOH auf pH 7,3 einmeinen wird ein Verhältnis von 2:1 bis zu 10:1 ver- gestellt, wendet. Die auf diese Weise okulierten Kolben wurden

Das Myzelium behält weiterhin eine mikrobiolo- 55 72 Stunden bei 28°C auf irgendeinen Schüttelapparat gische Wirksamkeit, d« bemerkenswert höher ist als untergebracht. Der Inhalt der beiden Erlenmeyerdie bei der Fermentation von Rifamycin B beob- kolben wurde als Impfstoff benutzt, indem man ihn achtete. Mit einem mit Wasser nichtmischbaren in einen 10 Liter fassenden Vorfermenter, der 4 Liter Lösungsmittel wird die wirksame Substanz aus dem des vorstehend erwähnten vegetativen Mediums entMyzelium extrahiert und dann mit der organischen 60 hielt, eingoß.

Phase vereinigt, die bereits das meiste Rifamycin Die Inkubation wurde bei 28° C unter Rühren mit

enthält. Die wirksame Substanz kann aus dem Myze- 750 U/min und unter Belüftung mit 1 V/V/min durehlium auch mit einem mit Wasser mischbaren Lösungs- geführt. Nach 30stündigem Wachstum wurde ein mittel wie Aceton extrahiert werden. In diesem Falle 7- bis lO°/oiges Volumen gepackter Zellen erhalten, wird die Flüssigkeit filtriert, das Aceton im Vakuum 65 Im nächsten Stadium wurde ein 10 Liter fassender, abgedampft, das Rifamycin mit einem mit Wasser aas Glas bestehender Fermenter verwendet, der nichtmischbaren Lösungsmittel extrahiert und das 4 Liter des nachstehend erwähnten Fermentations-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. mediums enthielt:

1/9

Erdnußmehl 25 g

Sojabohnenmehl 5 g

(NH₄)JSO₄ 9,5g

MgSO₄-7H₁O 0,85g

Glukose : 95 g

Glycerin 40 g

KH₁PO₄ Ig

Propylenglykol 5 g

CaCOs 8,5 g

Na-Diäthylbarbiturat 1,7 c

CuSO₄ -5H,O 2,8 mg

FeSO₄ · 7HjO 8,5 mg

ZnSO₄ · 7HjO 42,5 mg

MnSO₄-4HjO 3,4 mg

CaOj · 6HjO 1,7 mg

(NH₄^Mo₇Ot₄ · 4H_SO ... 0,85 mg

mit HjO auf 1 Liter aufgefüllt

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf pH 7,8 eingestellt Die Sterilisation wurde 60 Meuten bei 120⁰C durchgeführt. Nach der Sterilisation lag der pH-Wert bei 6,4. (Ein Teil des Inhalts des Vorfermenters gleich 5% des Inhaltes des Fermenters wurde als Impfstoff verwendet).

Die Fermentation wurde bei 28° C unter Rühren mit 750 U/min und unter Belüftung mit 1 V/V/min durchgeführt. Silikon A wurde als Antischaummittel verwendet. Während der Fermentation erhielt die Kulturbrühe eine charakteristische rotbraune Farbe. Nach 120stündigem Wachstum wurde ein 20- bis 25°/oiges Volumen gepackter Zellen erhalten. Der pH-Wert der Brühe war pH 6,0. Nach 180 Stunden wurde die höchste antibiotische Wirksamkeit (2000 γ\ ml Rifamycin SV) erzielt. Die Brühe wurde zu diesem Zeitpunkt isoliert.

Beispiel 2

Eine gemäß Beispiel 1 erhaltene Kultur von Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 wurde unter Rühren gemäß Beispiel 1 in einem Kolben präpariert. Zur Vorzüchtung wurde sie in einen 10 Liter fassenden, aus Glas bestehenden Fermeater gegossen, der 4 Liter des folgenden Mediums enthielt:

Glukose 5 g

Erdnußmehl 7,5 g

CaCO₃ 1,65 g

MgSO₄-7H₈O 0,33 g

KH₅₁PO₄ 0,33 g

FeSO₄-7H₂O 3,3 mg

ZnSO₄ -7H₂O 16,5 mg

MnSO₄-4HjO 1,3 mg

mit H₂O auf 1 Litrx aufgefüllt

υ ι a

Der pH-Wert wurde auf pH 7,5 eingestellt. Die Sterilisation wurde 5G Minuten bei 120⁰C durchgeführt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,4. Nach 38stündigem Wachstum betrug das Volumen der gepackten Zellen 6 bis 8% des Gesamtvolumens. Ein Impfstoff gleich 10% wurde für einen 20 Liter fassenden, aus Glas bestehenden Fennenter, der 10 Liter des folgenden Fermentationsmediums enthielt, verwendet:

Maiswasser 20 g

Sojabohnenmehl 15 g

(NH₄)JSO₄ 6 g

MgSO₄ -7HjO 0,85 g

Glukose 100g

KH₁PO₄ Ig

CaCO, 6 g

FeSO₄-7HjO 8,5 mg

ao ZnSO₄-7HjO 42,5 mg

MnSO₄-4HjO 3,4mg

CuSO₄ · 5HjO 2,8 mg

COCl₁ · 6HjO 1,7 mg

mit H₃O auf 1 Liter aufgefüllt

Der pH-Wert wurde mit Natrium auf pH 7,8 eingestellt. Die Sterilisation wurde 50 Minuten bei 12O⁰C durchgeführt. Nach der Sterilisation betrug der

pH-Wert 6,4. Die Fermentation wurde 150 Stunden bei 28° C durchgeführt. Bei der Isolierung betrug der pH-Wert der Fermentationsbriihe pH 6,0. Die antibiotische Endaktivität betrug 1600 y/ml Rifamycin SV. Das Produkt wurde extrahiert, auf. chromatographischem Wege gereinigt und dann kristallisiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Chromatographie wurde mit SUikagel (Merck 0,05 bis 0,20 mm) durchgeführt. Das rohe Rifamycin wurde in Aceton gelöst und dann mit einem Benzol-Aceton-Gemisch

im Verhältnis 1:1 cluiert. Das auf diese Weise gereinigte Produkt zeigte die chemisch-physikalischen Eigenschaften von Rifamycin SV.

Schmelzpunkt: Zersetzungsbeginn bei 140⁰C. [λ]ο° = -3,9⁰C (c = 1 °/o in Methanol).

Das IR-Spektrum zeigte folgende Absorptionsbanden: 3440, 2920 (Nujol), 2850 (Nujol), 1700, 1658, 1605, 1545, 1464 (Nujol), 1415, 1375 (Nujol), 1325, 1290, 1260, 1218, 1197, 1164, 1125, 1115, 1102, 1083, 1050, 1020, 976, 962, 950, 930, 915, 898, 871, 845, 830, 801, 785, 772, 760, 750, 717, 703 cm-¹.

Das sichtbare und das UV-Spektrum wurden mit Phosphatpuffer pH = 7,3 durchgeführt und zeigten Absorptionsmaxima bei 223,314 und 445 ταμ.

Claims

I 792019

unterwirft, währendder es zuerst

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV, dadurch gekennzeichnet, daß man StreptGmyces mediterranei ATCC 21 271 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, unter aeroben submersen Bedingungen züchtet und die Fermentationslösung in üblicher Weise aufarbeitet