CH626628A5 - Process for the preparation of an antibiotic - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung zeigt ferner ein Verfahren auf zur Herstellung von MM 13902 und seiner Salze, das in der Kultivierung von MM 13902 produzierenden Stämmen von Streptomyces besteht, unter nachfolgender Abtrennung von MM 13902 oder seiner Salze aus dem Kulturmedium.
Es hat sich gezeigt, dass für dieses Verfahren MM 13902 produzierende Stämme Stämme von Streptomyces olivaceus und verwandter Organismen der nachfolgend beschriebenen Art sind.
Die am besten geeigneten Organismen sind Stämme von Streptomyces olivaceus, wie ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 und 31126 oder Mutanten davon. Ein besonders geeigneter Organismus für die erfindungsgemässe Herstellung ist Streptomyces olivaceus ATCC 31126.
Der hier verwendete Ausdruck «Kultivierung» bedeutet die beabsichtigte aerobe Züchtung von Organismen in Gegenwart assymilierbarer Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Mineralsalzen. Derartige aerobe Aufzucht kann stattfinden in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium, worin die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Die Kultivierung kann an einer belüfteten Oberfläche oder in Submerskultur vor sich gehen. Das Nährmedium kann zusammengesetzt sein aus komplexen Nährsubstanzen oder aus chemisch definierten Verbindungen. Es hat sich gezeigt, dass Medien, die komplexe Nährsubstanzen enthalten, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen besonders geeignet sind. Weiterhin hat sich erwiesen, dass die Zugabe von Kobaltionen, Sulfationen und Kalziumcarbonat günstig wirkt.
Eine für die Kultivierung geeignete Temperatur liegt bei 28 ±2°C, wobei annehmbare Ausbeuten an Antibiotikum erhalten werden. Eine geeignete Zeit zur Einbringung des Zuchtproduktes ist zwei bis drei Tage nach der Einleitung der Fermentierung.
Der hier verwendete Ausdruck «Mutant» umfasst jeden mutierten Stamm, welcher spontan entsteht oder sich bildet durch die Einwirkung eines äusseren Agens, wobei dieses Agens vorsätzlich oder andersartig angewendet werden kann. Geeignete Methoden zur Herstellung von mutierten Stämmen sind solche, wie sie beschrieben sind von H.I. Adler in Techniques for the Development of Microorganisms in «Radiation and Radioisotopes for Industriai Microorganisms», Prodeed-ings of an Symposium, Wien, 1973, Seite 241, International Atomic Energy Authority und diese Methoden schliessen ein:
1. Ionisierende Strahlung (wie Röntgen- und Gammastrahlen), UV-Licht plus ein lichtempfindliches Agens (wie 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidin-basen-Analoga (wie 5-Bromuracil), Acridine, Alkylierungs-mittel (wie Senfgas, Äthylmethansulfat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Wärme, und
2. genetische Techniken, wie eine Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisierung, lysogene Umwandlung und selektive Techniken für spontane Mutierung.
Es wurde gefunden, dass die Verwendung eines mutations-fördernden Agens zur Erzeugung von Organismen führen kann, die die Fähigkeit aufweisen, erhöhte Anteile an den gewünschten Antibiotika zu erhalten. Zum Beispiel führt Bestrahlung von Kulturen von Streptomyces olivaceus ATCC 21379, gefolgt von der Abtrennung des erhaltenen Stammes, welcher die grösste Zone an Aktivität beim KAG-Test zu produzieren scheint, zu der Isolierung von Streptomyces olivaceus ATCC 31126, wobei es sich um einen bevorzugten Stamm für die Zwecke dieser Erfindung handelt. ATCC 31126 wurde in den Niederlanden deponiert unter Bezeichnung von CBS 155.75'. Der vorerwähnte KAG-Test wird im nachfolgenden noch beschrieben werden.
In der Regel sollten alle Isolations- und Reinigungsverfahren für die erwähnten gewünschten Produkte stattfinden bei nicht erhöhten Temperaturen, z.B. unterhalb 20°C und noch besser nicht oberhalb 12°C.
Das erwünschte Produkt wird normalerweise überwiegend erhalten aus dem Kulturfiltrat, so dass der vorzugsweise anzuwendende erste Isolationsschritt die Abtrennung des festen Materials aus dem Fermentationsprodukt, z.B. durch Filtration, ist.
Eine unreine Zubereitung von MM 13902 oder eines Salzes davon kann erhalten werden aus dem geklärten Kulturfiltrat durch Absorbieren von MM 13902 oder seines Salzes an einem aktiven Material, wie Aktivkohle oder dergleichen, und nachfolgendes Eluieren der erwünschten Substanz aus dem aktiven Material unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie wässrigem Aceton. In der Regel wird dieses Verfahren angewendet mit dem dibasischen Salz von MM 13902.
Alternativ kann ein unreines Präparat von MM 13902 oder seines Salzes erhalten werden aus dem Kulturfiltrat durch s
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Extraktion unter Verwendung eines lipophilen Ammoniumsalzes und eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels. Dieses Vorgehen ist häufig wirksamer als der zuvor beschriebene Prozess (das MM 13902 kann erhalten werden als das substituierte Ammoniumsalz durch Eindampfen des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck). Vorzugsweise wird die derart zunächst erhaltene Lösung des substituierten Ammoniumsalzes von MM 13902 hernach zurückextrahiert in eine wässrige Phase unter Verwendung einer Lösung eines Alkalimetalljodids, wie Natriumjodid. Diese letztere Verfahrensvariante führt in der Regel zur Herstellung einer v/ässrigen Lösung eines unreinen dibasischen Salzes von MM 13902.
Nachfolgend werden die unreinen Formen von MM 13902 oder ihrer Salze zweckmässig und in der Regel den vorgeschriebenen chromatographischen Verfahren unterworfen, um das Material in geeignete Reinheit überzuführen.
Streptomyces olivaceus und verwandte Organismen haben die folgenden Charakteristika:
a) sie besitzen spurenbildende Mycelien in Luft, entweder in der gelben oder in der grauen Serie;
b) sie besitzen eine Sporenträgergestalt, entweder rectiflexibler oder spiraler Art;
c) sie besitzen Sporen mit glatter Oberfläche;
d) sie produzieren kein Melanin.
Species, welche die vorgenannten Charakteristika aufweisen, sind solche, die in den Tabellen 5 bis 9 aufgeführt sind.
Beschreibung 1
Bö-Bestimmung
Der Iso-Wert ist der Anteil an Material, welches erforderlich ist, eine 50%ige Inhibition der Hydrolyse von Ampicillin durch die ß-Lactamase von Escherichia coli Bll zu produzieren, einem Organismus, welcher eine R-Faktor-kontrollierte ß-Lactamase enthält. Diese ß-Lactamase wird klassifiziert als ein Typ IIIa-Enzym gemäss der Klassifizierung von Richmond und Sykes (Adv. in MicrobiologicalPhysiology, 9,31 [1973]).
Das Ausmass der ß-Lactamasehydrolyse von Ampicillin in seine Penicillosäure kann verfolgt werden durch einen Jod-Stärke-Test, bei welchem man die Büdung von Penicillosäure misst durch Verfolgen der Entfärbung eines Jod-Stärke-Komplexes. Diese Methode und die Herstellung von der ß-Lactamase sind beschrieben in einer Veröffentlichung von Cole M., ElsonS., und Fullbrook P.D. (Biochemical Journal 1972,127, 259-308). Eine leichte Modifikation der genannten Methode wurde verwendet insofern, als die Probe des Inhibitors vorin-kubiert wurde mit dem Enzym während 15 Minuten bei 37°C vor der Zugabe des Substrat-Ampicillins. Das Verfahren war das folgende:
Reagenzien
Puffer: 0,05-m Kaliumphosphatpuffer vom pH 7
Stärke/Jodlösung: hergestellt gemäss Novick, Biochemical
Journal (1962) 83,236 Substrat: Ampicillin 40 (xg/ml in Puffer
ß-Lactamase-Enzym: hergestellt aus E. coli Bll, wie beschrieben durch Cole und Mitarbeiter, Biochemical Journal (1972) 127,295. Die Verdünnung des Enzympräparates im Puffer war derart, dass sie einen Abfall von ungefähr 0,3 Einheiten der optischen Dichte in 100 Sekunden in der nicht-inhibierten Reaktion ergab. Andere ß-Lactamase produzierende Stämme von E. coli können verwendet werden, insbesondere derartige, welche einen R-Faktor von z. B. RTEM aufweisen.
Bedingungen
Die Reaktion wurde ausgeführt in einer 1-cm Küvette bei 37°C in einem Pye Unicam-Spectrophotometer SP 800. Dieses Instrument kann gleichzeitig vier Küvetten und die entsprechenden Blindproben tragen. Die erste Küvette wurde verwendet zur Kontrolle der Reaktion und enthielt keinen Inhibitor. Die zweite, dritte und vierte Küvette wurde verwendet für die verschiedenen Verdünnungen des Inhibitors.
Reagenzien
Probe
Blindprobe
Küvette
Küvette
Stärke/Iodreagens
1,0 ml
1,0 ml
E. coli-ß-Lactamase
0,1 ml
-
Inhibitor des Puffers
0,1 ml
0,1 ml
Puffer
0,3 ml
0,4 ml
Substrat (zugeführt nach Inkubation
der obigen Mischung während
15 Minuten bei 370 C)
1,0 ml
1,0 ml
Das Fortschreiten der Reaktion wurde verfolgt durch Registrieren der optischen Dichte bei 590 Nanometer und Messen der Geschwindigkeit der Reaktion durch Veränderung der optischen Dichte während drei bis sechs Minuten in Zeitintervallen von je 100 Sekunden. Die Inhibitorprobe wurde verdünnt, bis eine Verdünnung erreicht war, die 50% der Reaktionsgeschwindigkeit des Vergleichsversuchs ohne Inhibitor ergab.
Beschreibung 2
Der KAG-Test
Der KAG-Test ist eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart von ß-Lactamaseinhibitor in Fermentationslösungen oder während der Stadien der Isolation. Geschmolzener Nähragar wird bei 45°C bekeimt mit einem geeigneten ß-Lactamase-produzierenden Stamm von Klebsiella aerogenes und hernach vermischt mit einem genügenden Anteil einer sterilen Lösung von Penicillin G, so dass eine Konzentration von 6 (ig/ml Penicillin G im Agar erhalten wird. Der Agar wird hernach eingegossen in eine Petrischale und nach seiner Verfestigung in gleichmässigen Distanzen versehen mit zylindrischen Löchern unter Verwendung eines sterilen metallischen Schneidewerkzeuges. Die zu testenden Lösungen werden in diese Löcher eingefüllt. Die Schale wird hernach inkubiert bei einer konstanten Temperatur zwischen 27 und 37°C. Während der Inkubationsdauer diffundiert ein gegebenenfalls in den Testlösungen enthaltener Inhibitor aus dem Loch in den Agar und inhibiert dort die Wirkung von ß-Lactamase, die von den Klebsiellazellen produziert wird. Derart wird das Penicillin G geschützt vor der Zerstörung durch ß-Lactamase und ist in genügender Konzentration vorhanden, um das Wachstum von Klebsiella zu verhindern. In denjenigen Teilen des Agars, in welche der Inhibitor nicht in genügender Konzentration eindiffundieren konnte, wird das Penicillin G durch die ß-Lactamase zerstört, wobei sich demgemäss ein dichtes Wachstum der Klebsiella entwickelt. Es bilden sich so klare kreisförmige Inhibitionszonen des Klebsiellawachstums rund um die Inhibitor enthaltenden Löcher aus, wobei die Grösse der Zonen abhängig ist von der Konzentration des Inhibitors in der getesteten Lösung. Der Wirkungswert (willkürliche Einheiten pro ml) der Testlösungen wird erhalten durch Auftragen des Logarithmus der Inhibitorkonzentration gegen den Zonendurchmesser. Ein derartiges Testsystem kann gleichfalls verwendet werden für die Bioautographie.
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Beschreibung 3 Herstellung von MM 4550 (Komplex), vergleichbar zu demjenigen gemäss britischem Patent Nr. 1 363 075 Streptomyces olivaceus ATCC 21379 wurde gezüchtet währens sieben Tagen bei 28°C auf einer festen Agarschicht in einem Roux-Gefäss. Das Agarmedium hatte die folgende Zusammensetzung:
Bestandteil
Anteil (g/1)
Hefeextrakt
10,0
Glucosemonohydrat
10,0
Agar
15,0
Leitungswasser auf
1 Liter
(Der verwendete Hefeextrakt war «Yeatex», geliefert von Bovril Food Ingrédients, P.O. Box 18, Wellington Road, Bur-ton-on-Trent, U.K., und der Agar wurde geliefert von Oxoid Limited, Southwark Bridge Road, London, S.E.I., U.K.).
Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Sterilisierung auf 6,8 eingestellt. 50 ml steriles deionisiertes Wasser, welches 0,02% «Tween 80» (eingetragene Handelsmarke, Tween 80 ist ein Polyoxyäthylensorbitmonooleat) enthielt, wurde der Roux-Gefäss-Kultur hinzugegeben und die Sporen darin suspendiert durch Schütteln. Die Sporensuspension wurde hinzugefügt als Inoculum zu 75 Liter sterilisierten Keimmediums in einem Fermentator von 100 Litern aus rostfreiem Stahl. Die Zusammensetzung des Keimmediums war die folgende:
Bestandteil
Anteil (g/1)
Sojamehl
10,0
Glucosemonohydrat
20,0
Leitungswasser auf
1 Liter
(Das Sojabohnenmehl war «Arkasoy 50», geliefert von British Arkady Co., Ltd., Old Trafford, Manchester). Zur Eindämmung der Schaumbildung wurden 50 ml einer 10 Vol.-%igen Lösung von «Pluronic L81» (eingetragene Handelsmarke) in Sojaöl zum Fermentationsmedium vor der Sterilisation hinzugefügt. (Pluronic L81» wurde geliefert von Jacobsen van den Berg U.K. Ltd., 231 The Vale, London, W.3, U.K., und ist ein Blockpolymeres von Äthylenoxid und Propylen-oxid).
Das Medium wurde sterilisiert im Fermentator während 20 Minuten bei 120°C. Die Keimkultur wurde gerührt bei 340 Umdrehungen pro Minute mit einem 21 cm Flügelrührer, wobei 1501/Min, sterile Luft durch das offene Ende eines Einleitungsrohres eingeblasen wurden. Das Kulturgefäss war versehen mit Umlenkplatten. Die Temperatur wurde geregelt auf 28°C und nach der Inkubation unter den genannten Bedingungen während 45 Stunden wurden 7,5 Liter dieser Keimkul-tur hinzugefügt als Inoculum zu 150 Liter sterilem Fermentationsmedium in einem Fermentator von 300 Litern Inhalt aus rostfreiem Stahl. Das Fermentationsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:
Bestandteil Anteil (g/1)
Sojamehl («Arkasoy 50») 10,0
Glucosemonohydrat 20,0 Kalk (gefälltes Kalziumcarbonat) 0,2 Kobaltchlorid (C0CI2 • 6H2O) 0,001 Leitungswasser auf 1 Liter
300 ml einer 10%igen Lösung von «Pluronic L81» in Sojaöl wurden zur Verhinderung der Schaumbildung zugefügt. Das
Fermentationsprodukt wurde geerntet nach 48 Stunden und geklärt durch Zentrifugieren. Die geklärte Lösung ergab 50% Inhibition beim Enzymtest in einer Verdünnung von 1:100 000.100 Liter der geklärten Lösung wurden gerührt mit 12 kg Nassgewicht «Whatman DE32» (eingetragene Handelsmarke), einer Ionenaustauschcellulose in der Acetatform. (Geliefert von H. Reeve Angel & Co., 14 New Bridge Street, London E.C.4, U.K.; das Produkt ist eine mikrokristalline Celluose mit Diäthylaminoäthylgruppen als Substituenten).
Die Aufschlämmung wurde filtriert und der MM 4550 (Komplex) eluiert aus der Cellulose mit 12 Litern 0,5-m Kaliumsulfat. Der Extrakt wurde eingeengt auf 6 Liter in einem Dünnfilmverdampfer unter Vakuum und unterhalb 30°C. Der Hauptteil des Kaliumsulfates wurde ausgefällt durch Zugabe von 12 Litern Aceton. Die Lösung wurde filtriert und konzentriert auf 200 ml durch Eindampfen unter Vakuum unterhalb 30°C. Das Konzentrat wurde aufgegeben auf eine Säule von 76 mmX2maus «AmberliteXAD-4»-Harz (eingetragene Schutzmarke) (hergestellt von Rhöm & Haas Co., Philadelphia, USA; das Material ist ein nichtionisches Polystyrolharz). Die Säule wurde eluiert mit entionisiertem Wasser und das Eluat gesammelt in Fraktionen von je 140 ml. Die aktiven Fraktionen, entdeckt mit dem KAG-Test, wurden vereinigt (2,2 Liter) und konzentriert auf 275 ml durch Ultrafiltration unter Verwendung von «Amicon-UM-05-Membran» (150 mm Durchmesser) (eingetragene Handelsmarke) (geliefert von Amicon Ltd., 57 Queen's Road, High Wycombe) unter einem Stickstoffdruck von 3,6 kp/cm2. Das Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 2,2 g eines braunen Pulvers (I50 = 0,004 ng/ml). 1 g des Pulvers wurde aufgelöst in einem Liter 0,2-m Natriumsulfat und vermischt mit einem Liter 2%igem Tetra-n-butylammonium-hydrogensulfat (geliefert von AB Astra, Sodertalje, Schweden) in Dichlormethan. Die Dichlor-methanphase wurde abgetrennt, gekühlt auf -70°C, filtriert zur Abtrennung von Eis und eingeengt durch Eindampfen auf 20 ml. 400 ml Petroläther vom Siedebereich 40 bis 60°C wurden zum Konzentrat hinzugefügt und die Ausfällung abzentri-fugiert. Die Fällung wurde aufgelöst in 10 ml Dichlormethan und extrahiert mit 10 ml Wasser, welches 80 mg Bariumjodid und 70 mg Bariumcarbonat enthielt. Die Phasen wurden getrennt, die wässrige Phase filtriert und auf pH 6,5 eingestellt. Die Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab ein gelbes Pulver. Die feste Substanz wurde gewaschen mit Aceton zwecks Herauslösen von überschüssigem Bariumjodid und die hellgelbe feste Substanz zentrifugiert und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 13 mg (I50 = 0,0004 (xg/ml).
Beschreibung 4 Nachweis des Nutzens einer Aktivkohlebehandlung des Kulturfiltrates zur Herstellung eines Materials gemäss britischem Patent Nr. 1 361 075 Das gemäss Beschreibung 3 erhaltene Kulturfiltrat ergab einen Zonendurchmesser von 17 ml in dem Loch einer Agar-platten-Diffusion beim Test gegenüber Klebsiella aerogenes, einen Zonendurchmesser von 38 mm im KAG-Test und einen Iso-Wert bei einer Verdünnung von 1:100 000. Das geklärte Kulturfiltrat (170 Liter) wurde bei 5°C perkuliert im Auf-wärtsfluss durch eine Säule von 23 cm Durchmesser und 40 cm Höhe aus Aktivkohle («Farnell BO», geliefert von Dearborn Chemicals Ltd., Dilton, Widnes, Lancs., der Körner 0,25 bis 0,18 mm, vorgewaschen mit n HCl und gepuffert auf pH 6 mit Phosphat) bei einer Durchflussrate von 800 bis 1000 ml/ Minute. Die Brühe wurde von der Kohle hinuntergewaschen mit 10 Liter entionisiertem Wasser und die Säule hernach eluiert mit 20%igem Aceton bei 20°C. Die aktiven Fraktionen im Betrag von 10 Litern wurden konzentriert durch Eindampfen im Vakuum unter 30°C auf 6 Liter und gefriergetrocknet,
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wobei 282 g roher Komplex MM 4550 erhalten wurde. Der Komplex zeigte einen Iso-Wert von 0,05 (ig/ml. Die Ausbeute an enzyminhibitorischer Aktivität betrug 22%.
Alternativ kann mit ähnlichen Ergebnissen eine Aktivkohle der Bezeichnung «Darcogranularcarbon» verwendet werden (geliefert von Honeywill-Atlas Ltd., Mill Lane, Carshalton, Surrey).
Beschreibung 5 Nützlichkeit der Ionenaustauschharz-Chromatographie eines Kultur-Filtrates zur Herstellung von Material gemäss britischem Patent Nr. 1 363 075 Eine Säule von 1 cm innerem Durchmesser wurde gepackt auf eine Höhe von 6 cm (Bettvolumen = 4,7 ml) mit «Dowex 21K» Ionenaustauschharz (0,84 bis 0,30 mm Körnung in Chloridform) («Dowex 21K» wurde geliefert von B.D.H. Chemicals Ltd., Poole, Dorset, U.K. und ist ein Polystyrol-Divinylbenzol-Harz mit basischen Gruppen). Das Harzbett wurde hernach gewaschen mit ungefähr 4 X 4,7 ml 5 %igem wässrigem Methanol, gefolgt von 1X 4,7 ml destilliertem Wasser. Zwei Liter Kulturfiltrat wurden erhalten im wesentlichen gemäss Beschreibung 3 und auf die Kolonne gebracht. Das Harz wurde hernach gewaschen mit 5 %igem wässrigem Methanol zur Entfernung von Verunreinigungen.
Der MM 4550 (Komplex) wurde vom Harz eluiert mit 5%igem NaCl in 50%igem wässrigem Methanol. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Resultate in Einheitswerten an Aktivität. Der Gehalt an MM 4550 (Komplex) des Kulturfiltrates wurde willkürlich auf acht Einheiten pro ml festgesetzt. Die eluierten Fraktionen aus der Kolonne wurden getestet unter Verwendung einer antibakteriellen Diffusionsmethode gegen Klebsiella aerogenes, wobei die Wirkungseinheiten berechnet wurden unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, hergestellt durch Auftragen des Zonendurchmessers gegen Einheiten pro ml für verschiedene Konzentrationen des Kulturfiltrates (d.h. das Kulturfiltrat wurde als Standard benutzt).
Es ist ersichtlich, dass die Säule ein wirksames Mittel darstellt zur Konzentrierung des MM 4550 (Komplexes). Die Fraktionen 2 bis 5 enthielten 60% der Aktivität in einem Gesamtvolumen von nur 37 ml. Das gesamte Trockengewicht dieser Fraktionen betrug ungefähr 210 mg, wogegen 35 g Festsubstanzen auf die Säule aufgegeben wurden.
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1
Resultate der Chromatographie auf «Dowex 21K»
Probe pH
Volumen
Einheiten/ml
Totaleinheiten
(ml)
Eluat 7
7,6
14,2
66
937
Eluat 8
7,6
20,0
33
660
Total
13141
Probe pH
Volumen (ml)
Einheiten/ml
Totaleinheiten
Kulturfiltrat
6,5
1970
8
15760
Percolat 1
6,9
550
<1
<100
Percolat 2
7,0
525
<1
<100
Percolat 3
7,0
595
<1
<100
Percolat 4
7,0
300
<1
<100
Eluat 1
7,8
7,0
84
588
Eluat 2
7,8
7,0
328
2296
Eluat 3
7,7
8,5
440
3740
Eluat 4
7,7
10,0
320
2200
Eluat 5
7,6
11,5
160
1840
Eluat 6
7,5
11,0
80
880
10
Beschreibung 6 Nutzen der Ionenpaar-Extraktion des Kulturfiltrates zur Herstellung eines Materials gemäss britischem Patent Nr. 1363 075 15 248 g Natriumsulfat wurden hizugegeben zu 10 Liter eines geklärten Kulturfiltrates, welches hergestellt worden war gemäss Beschreibung 3 und die Lösung wurde extrahiert mit 2% Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogen-sulfat in 10 Litern Dichlormethan durch Rühren während 30 Minuten. Die Pha-20 sen wurden getrennt und die Dichlormethanphase auf 2°C abgekühlt. Ein geringer Anteil suspendierten Wassers wurde abfiltriert durch ein «Whatman Nr. 1 PS-Filter». Die Dichlor-methanlösung wurde eingeengt auf 20 ml durch Eindampfen im Vakuum unterhalb 30°C. Zugabe von 400 ml Petroläther 25 (40 bis 60°C) fällte ein Harz aus, welches den MM 4550 (Komplex) enthielt.
Das Harz wurde abzentrifugiert, gelöst in 50 ml Dichlormethan und extrahiert mit 50 ml Wasser, welches 1 g Bariumjodid und 1 g Bariumcarbonat enthielt, vermittels Schütteln 30 während zwei Minuten. Die vorhandenen festen Substanzen wurden abfiltriert und die zwei Phasen getrennt. Die wässrige Phase, welche den MM 4550 (Komplex) enthielt, in Form des Bariumsalzes, wurde auf pH 6,5 gebracht und gefriergetrocknet. Man erhielt 317 mg eines rohen Präparates von MM 4550 35 (Komplex) mit einem Iso-Wert von 0,001 [ig/ml).
Beschreibung 7 Herstellung von partiell gereinigtem antibiotischem 40 Komplex enthaltend M 4550 und MM 13902 unter Verwendung von Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat 12,5 g eines rohen Präparates MM 4550 (Komplex), hergestellt gemäss Beschreibung 7, wurde aufgelöst in 125 ml Wasser und extrahiert mit 125 ml 10%iger Tetra-n-butyl-ammo-45 nium-hydrogen-sulfat-Lösung in Dichlormethan. Die beiden Phasen wurden getrennt und das Dichlormethan zurückextrahiert mit 100 ml Wasser bei 2°C, wobei dieses Wasser 190 mg Natriumjodid enthielt, vermittels langsamen Hydrierens und Einstellens des pH-Wertes der wässrigen Phase mit 2%igem so Natriumbicarbonat auf 6,4. Die Lösung wurde gefriergetrocknet und die trockene feste Substanz gewaschen mit Aceton. Erhalten wurden 88 mg gemischter Natriumsalze von MM 4550 und MM 13902 mit einem Iso-Wert von 0,0002 (ig/ ml gegen Escherichia coli-ß-Lactamase. Die Wiedergewinnung 55 an Antibiotika betrug 70%.
Die antibakterielle Aktivität der Mischungen von Ampicillin und einem Material, hergestellt gemäss Beschreibung 7, wurde bestimmt vermittels der Verdünnungsreihenmethode in Nähra-gar. Die dabei erhaltenen minimalen inhibitorischen Konzen-60 trationen sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Synergistische Wirkung von Ampicillin und einem Material gemäss Beschreibung 7
Organismus
Ampicillin allein
Ampicillin + MM 4550 (Komplex) bei
0,1 ng/ml
1 [ig/ml
10 [ig/ml
E. coli Bll E. coli JT417
>500 250
>500 250
500 250
50 50
626 628
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Organismus
Ampicillin
Ampicillin + MM 4550 (Komplex) bei
allein
0,1 (ig/ml
1 ng/ml
10 ng/ml
E.coliJT39
>500
>500
500
25*
Shigella sonrei S239
125
125
125
25*
Klebsiella aerogenes A
125
25
5*
>0,1*
Klebsiella aerogenes IP 282
50
50
12,5
0,5*
Proteus mirabilis 889
>500
>500
50
0,5
Proteus mirabilis 247
>500
125
5,0
0,5
Proteus morganü F
50
50
25
0,5
Proteus rettgeri R110
250
125
25*
0,25*
Staph. aureus (Russell)
250
125
>0,1
0,25*
Staph. aureus (Russell H)
>500
>0,1
>0,1
>0,1
* partielle Inhibition durch MM 4550 (Komplex) allein bei diesen Konzentrationen; ähnliche synergistische Effekte wurden beobachtet für Gemische aus Amoxycillin und MM 4550 (Komplex).
Beschreibung 8 Herstellung eines partiell gerinigten antibiotischen Komplexes, enthaltend MM 4550 und MM 13902 unter Verwendung von Cetyldimethylbenzylammoniumchlorid Ein gefriergetrocknetes Produkt mit dem Iso-Wert von 0,02 [ig/ml aus einer «Farnell»-Kohle-Säule, eluiert mit Ace-ton/Wasser gemäss Beschreibung 4, wurde aufgelöst in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 13 mg/ml. Der pH-Wert der Lösung wurde eingestellt auf 6,5.
100 ml der Lösung wurden extrahiert mit einem gleichen Volumen von 0,1% Cetyldimethylbenzylammoniumchlorid in Dichlormethan. Die Phasen wurden getrennt durch Zentrifu-gieren und die organische Phase zurückextrahiert mit 100 ml 0,05%iger Natriumjodidlösung. Die Phasen wurden getrennt und in der wässrigen Phase zurückgebliebenes Dichlormethan entfernt durch Anwendung verminderten Druckes während 10 Minuten. Die wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet und das gefriergetrocknete Produkt dreimal mit 50 ml Aceton gewaschen. Das so gewaschene Produkt wurde in einem Vakuumexcikator getrocknet und ergab ein hellbraunes Pulver im Gewicht von 4,3 mg mit einem Iso-Wert von 0,002 [ig/ml.
Beschreibung 9 Herstellung eines partiell gereinigten antibiotischen Komplexes enthaltend MM 4550 und MM 13902 unter
Verwendung von Gelfiltration 1 g rohes MM 4550 (Komplex) vom Iso-Wert = 0,2 (ig/ml, hergestellt nach der Methode gemäss Beschreibung 4, wurde chromatographiert an «Sephadex G25» (fein) unter Verwendung von Aceton/Wasser 4:6 als Eluiermittel. Die Säulendimensionen betrugen 2,5 cm X 32 cm und das Eluieren wurde ausgeführt mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum unterhalb 30°C eingeengt und gefriergetrocknet. Erhalten wurden 22 mg amorphe lederfarbene feste Substanz mit einem I50-Wert von 0,005 ng/ml. Die Ausbeute betrug 88% und die Reinigung erfolgte auf den 40-fachen Wert.
Beschreibung 10 Herstellung eines gereinigten antibiotischen Komplexes, enthaltend MM 4550 und MM 13902 unter Verwendung von Cellulose-Chromatographie 610 mg MM 4550 (Komplex), hergestellt gemäss Verfahren 7, wurden chromatographiert auf einer Säule von 2,5 cm X 32 cm an Cellulose («Whatman CC 31») und eluiert mit einem Gemisch aus Isopropanol/Wasser 7:7 V/V bei 1,5 ml pro Minute Durchsatzgeschwindigkeit. Die antibakteriellen aktiven Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert im
Vakuum unterhalb 30°C und gefriergetrocknet. Erhalten wurden daraus 40 mg eines braunen amorphen festen Materials, Antibiotic complex mit einem Iso-Wert von 0,00007 [xg/ ml. Der sehr geringe Iso-Wert zeigt an, dass es sich um ein 25 aktives Material von verbesserter Reinheit handelt.
Bei einer anderen Gelegenheit ergab das vorgenannte Verfahren ein Material mit einem Iso-Wert von 0,001 (xg/ml. Dieses Material zeigte eine antibakterielle Aktivität gemäss der Tabelle 3, bestimmt nach einer Standard-Microtitrier-30 Methode in «Oxoid»-Empfindlichkeitsnährlösung unter Verwendung eines leichten Inoculums (1% Aufzucht über Nacht).
Tabelle 3
Antibakterielle Wirksamkeit eines Gemisches von MM 4550 35 und MM 13 902 mit einem Iso-Wert von 0,001 (xg/ml
Organismus
MIC in (ig/ml
Staphylococcus aureus (Oxford)
7,5
Staphylococcus aureus (Russell)
7,5
Streptococcus faecalis
125
Bacillus subtilis
0,9
Escherichia coli (10418)
3,7
Escherichia coli (Bll)
15
Klebsiella aerogenes
1,8
Enterobacter cloacae
62
Proteus mirabilis
7,5
Providentia stuartii
7,5
Acinetobacter anitratus
0,9
Pseudomonas aeruginosa
250
Serratia marcescens
7,5
Salmonella typhimurium
15
Shigella sonnei
7,5
ss Beschreibung 11
MM 4550
MM 4550 kann erkannt werden durch seine Eigenschaften der folgenden Art: MM 4550 ist eine saure, feste Substanz, die in Form eines Natriumsalzes die folgenden Charakteristika 60 aufweist:
1. Es ist hochgradig löslich in Wasser, löslich in Methanol und im wesentlichen unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen.
65 2. In wässriger Lösung zeigt es ein charakteristisches Ultraviolettspektrum mit Absorptionsmaxima bei ungefähr 238 Nanometer und bei ungefähr 287 Nanometer.
3. In einer Konzentration von 0,4 Gew.-% und in einer
9
626628
frisch hergestellten KBr-Scheibe zeigt es ein charakterisches Infrarotspektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei ungefähr 3450,2950,1765,1695,1510,1390 und 1260 cm-1. Sofern ' nach Verlauf von einer Woche die gleiche KBr-Scheibe erneut aufgenommen wird, zeigt das Spektrum beträchtliche Veränderungen, z.B. derart, dass der zuvor festgestellte starke Peak bei 1765 cm-1 beträchtlich reduziert oder vollkommen abwesend ist.
4. Die Substanz zeigt ein charakteristisches NMR-Spektrum, aufgenommen in D2O, welches u.a. ein Paar von Niederfeld-Dubletts aufweist, zentriert ungefähr bei 2,45 T und 3,65 T mit Kupplungskonstanten von ungefähr 15 Hz, ferner ein Dublett, zentriert bei ungefähr 8,55 T und ein scharfes Singu-lett bei ungefähr 7,95 T.
5. Bei einer Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachfolgend angegebenen Laufmitteln ergeben sich folgende ungefähre Rf-Werte:
a) Butanol/Isopropanol/Wasser- 7:7:6 V/V; Rf = 0,6
b) Isopropanol/Wasser - 7:3 V/V; Rf = 0,7
c) n-Butanol/Äthanol/Wasser - 7:7:6 V/V; Rf = 0,7
d) n-Propanol/Wasser-4:l V/V; Rf = 0,6.
6. Die Substanz besitzt antibakterielle Aktivität gegen verschiedene Species, u.a. gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens und Shigella sonnei.
7. Die Substanz besitzt enzyminhibitorische Wirksamkeit gegen die ß-Lactamasen, die von verschiedenen Stämmen produziert werden unter Einschluss von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Staphylococcus aureus. Sie hat einen Iso-Wert (wie im vorstehenden definiert) von weniger als 0,0001 (xg/ml gegen die ß-Lactamase von Escherichia coli BH.
8. Im Gemisch mit Ampicillin übt die Substanz synergistische Wirkung aus gegen Organismen unter Einschluss von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.
9. Aminosäureanalyse zeigt an, dass das Material kein Polypeptid oder Protein ist. Es wird keine a-Aminoadipinsäure gefunden nach saurer Hydrolyse.
10. Die Substanz reagiert mit Ehrlich's Reagens (300 mg von 4-Dimethylaminobenzaldehyd, aufgelöst in einem Gemisch von 54 ml n-Butanol, 9 ml Äthanol und 9 ml konzentrierte Salzsäure) unter Bildung blauer Farbe auf Papierchro-matogrammen und DCS-Platten.
11. Die Substanz ist kein allgemeines Enzymgift und inhibiert die folgenden Enzyme nicht bei Konzentrationen im Überschuss über diejenigen, die notwendig sind zur Inhibierung von ß-Lactamase von Escherichia coli, Monoaminoxidase, Carbonsäureanhydrase, Dopadecarboxylase, Trypsin, Chymo-trypsin oder Urease.
Beispiel 1
Herstellung von MM 4550 (Komplex) und Trennung in MM 4550 und MM 13902
Die in den vorstehenden Abschnitten angegebenen Isolierverfahren können auf verschiedene Weise angewendet werden. Eine besonders geeignete Folge ist die Adsorption an Kohle, Ionenpaarextraktion und Cellulosechromatographie in nachstehend beschriebener Weise:
340 Liter Kulturfiltrat, hergestellt gemäss Beschreibung 3, wurde percoliert im Aufwärtsfluss bei 800 bis 1200 ml/Minute durch eine Säule von 22,5 cm Durchmesser und 53 cm Höhe, gepackt mit «Farneil BO»-Kohle. Die Kohle wurde zuvor verwendet zur Adsorption von MM 4550 (Komplex) und wurde regeneriert durch Waschen mit den folgenden Reagenzien: 0,5-n NaOH, 0,2-n NaOH/Aceton (3:2), Wasser; n HCl, Wasser, Phosphatpuffer pH 6, Wasser. Die Säule wurde gewaschen mit 20 Litern Wasser zur Verdrängung des Kulturfiltrates und eluiert im Abwärtsfluss mit Aceton/Wasser 2:8 V/V bei 200 bis 250 ml Durchsatz pro Minute. Es wurde getrennt in Fraktionen von je einem Liter. Die den MM 4550 (Komplex) enthaltenden Fraktionen, bestimmt vermittels des antibakteriellen Diffusionstestes, unter Verwendung von Klebsiella aerogenes, wurden vereinigt (11 Liter) und konzentriert durch Eindampfen im Vakuum unter 30°C auf 5,5 Liter. Die Ausbeute an MM 4550 (Komplex) in diesem Stadium betrug 20%. Das Konzentrat wurde auf 2°C abgekühlt, versetzt mit 5,5 Liter einer 2 Vol.-Gew.-%igen Tetra-n-ammoniumhydro-gensulfat-Lösung in Dichlormethan bei -5°C und die beiden Phasen miteinander während 2 Minuten vermischt. Die Dichlormethanphase wurde abgetrennt und hinzugefügt zu einem Liter Natriumjodidlösung (0,6%) bei 0°C. Die beiden Phasen wurden gerührt und die wässrige Phase allmählich auf den pH-Wert 6,5 bis 7,0 mit 2% wässriger Lösung von NaHC03 eingestellt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und gefriergetrocknet. Die getrocknete feste Substanz wurde extrahiert mit trockenem Aceton zur Auflösung eines Überschusses an Natriumjodid, worauf das Aceton aus dem unlöslichen Rückstand im Vakuum abgetrieben wurde. Die Ausbeute an einer lederfarbenen pulverigen Substanz betrug 1,1 g. Die Gesamtausbeute an MM 4550 (Komplex) betrug in diesem Stadium 10%. Die berechnete Anreicherung an gesamten gelösten Festsubstanzen im Kulturfiltrat betrug das 125-fache.
Eine Kolonne mit dem Durchmesser 2,5 cm wurde bepackt mit Cellulosepulver («Whatman CC 31») in Isopropanol/ Wasser 7:3 V/V auf einer Höhe von 32 cm. 500 mg des lederfarbenen Pulvers wurden aufgelöst in 2 ml Isopropanol/Wasser 7:3 V/V und chromatographiert unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels bei einer Durchflussrate von 1,5 ml pro Minute. 3 ml Fraktionen wurden aus der Säule gesammelt und diejenigen, welche Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei ungefähr 285 Nanometer zeigten, wurden vereinigt. Sie wurden konzentriert und gefriergetrocknet und ergaben MM 4550 (Komplex). Vorgängige Versuche hatten ergeben, dass die Fraktionen bei ungefähr 285 Nanometer absorbierend das enzyminhibierende antibakteriell aktive Material enthielten.
Die Ausbeute an gefriergetrocknetem MM 4550 (Komplex) betrug 35 mg. Es handelte sich um eine braune amorphe Substanz mit einem Iso-Wert von 0,0001 (ig/ml. Die Ausbeute an aktivem Material betrug in diesem Stadium 3% insgesamt und der Reinigungseffekt das 600-fache.
Die antibakterielle Aktivität dieses Präparates wurde bestimmt durch die Standard-Microtiter-Methode in «Oxoid»-Emfindlichkeitstestlösung unter Verwendung eines leichten Inoculums. Die erhaltene minimale inhibitorische Konzentration lag in ähnlichen Bereichen wie in der Tabelle 3 zuvor aufgeführt.
Die Analyse der Substanz vermittels Dünnschichtchromatographie auf Cellulose (Eastman Kodak «Chromagram»-Platten) entwickelt mit n-Butanol:Isopropanol: Wasser 7:7:6 ergab zwei aktive Substanzen, eine mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,58, die dem MM 4550 zugeschrieben wurde und eine mit dem Rf-Wert von 0,72, zugeschrieben dem MM 13902. Beide dieser Materialien wurden bestimmt vermittels Bioautographie an einer Vielzahl von Organismen unter Einschluss von B. subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillinresistent), Escherichia coli (penicillinempfindlich und -resistent), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Klebsiella aerogenes. Einige der dabei erhaltenen Resultate sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.
In einem weiteren Versuch wurden die beiden Substanzen getrennt auf einer Dünnschichtplatte von Cellulose, entwickelt mitIsopropanol:Wasser 8:2 und extrahiert von der Cellulose mit Phosphatpuffer. Jeder Extrakt wurde getestet auf ß-Lacta-
s
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65
626 628
10
maseinhibition und es erwiesen sich beide Substanzen als Inhibitoren von Escherichia coli-ß-Lactamase. Beide Substanzen zeigten gleichfalls synergistische Wirkung mit Benzylpenicillin gegenüber Klebsiella aerogenes.
Tabelle 4
Antibakterielle Aktivität von MM 4550 und MM 13 902, bestimmt vermittels Bioautographie (Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit Butanol/Isopropanol/Wasser 7:7:6 V/V)
Organismus Zonendurchmesser bei Bioautographie
MM 4550 Zone in
MM 13 902 Zone in
mm bei Rf 0,58
mm bei Rf 0,70
Klebsiella aerogenes
20,0 mm
20,00 mm
Proteus mirabilis
17,5 mm
13,5 mm
Proteus morganü
16,00 mm
9,5 mm
Salmonella typhi
19,5 mm
21,00 mm
Escherichia coli 10418
20,0 mm
13,5 mm
Escherichia coli Bll
17,5 mm
10,5 mm
Enterobacter aerogenes
6,5 mm keine Zone
Styphylococcus aureus
(Oxford)
13,0 mm
4,0 mm
Staphylococcus aureus
(Russell)
12,0 mm
4,0 mm
Bacillus subtilis
24,0 mm
15,0 mm
Beispiel 2
Herstellung von MM 4550 (Komplex) und Trennung in MM 4550 und MM 13902
1100 Liter eines Kulturfiltrates aus der Fermentation von Streptomyces olivaceus ATCC 31126 bei pH 6,5 und 5°C wurden percoliert mit 3,2 Litern/Minute durch eine Säule (0,3 m X1 m), gepackt mit «Darco»-Kohle (die Kohle wurde bereits verwendet zur Adsorption von MM 4550 [Komplex] und wurde regeneriert vor der Verwendung durch Waschen mit den folgenden Reagenzien: 0,5-n NaOH; 0,2-n NaOH/ Aceton 3:2; Wasser; n HCl; Wasser; Phosphatpuffer, pH 6; Wasser). Die Säule wurde gewaschen mit 60 Litern Wasser zur Verdrängung des Kulturfiltrates und hernach eluiert mit Wasser/Aceton 2:8 V/V bei 30°C mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1,1 Litern pro Minute. Zunächst wurden 60 Liter gesammelt, gefolgt von Fraktionen von 5 X10 Litern. Diese Fraktionen, welche den MM 4550 (Komplex) enthielten, bestimmt vermittels des antibakteriellen Diffusionstestes unter Verwendung von Klebsiella aerogenes, wurden vereinigt (40 Liter) und konzentriert im Vakuum unterhalb 30°C auf 32 Liter. Die Ausbeute an MM 4550 (Komplex) betrug in diesem Stadium 15 %.
Das Konzentrat wurde auf 5°C abgekühlt, worauf 16 Liter einer 0,2%igen Cetyldimethylbenzylammoniumchloridlösung in Dichlormethan bei 5°C hinzugegeben wurde und worauf die beiden Phasen fünf Minuten lang gemischt wurden. Die Dichlormethanphase wurde abgetrennt und hinzugefügt zu 3,75 Litern Natriumjodidlösung (0,4%) bei 5°C. Die beiden Phasen wurden während fünf Minuten gemischt, dann die wässrige Phase abgetrennt und gefriergetrocknet. Die trockene feste Substanz wurde extrahiert mit trockenem Aceton zwecks Auflösung des Überschusses an Natriumjodid, worauf die wässrige feste Substanz im Vakuum getrocknet wurde. Erhalten wurden 2,87 g eines lederfarbenen Pulvers. Die Gesamtausbeute an MM 4550 (Komplex) betrug in diesem Stadium 6%. Der berechnete Reinigungseffekt in bezug auf das Kulturfiltrat war 160-fach.
Eine Säule von 63 mm Durchmesser wurde gepackt mit Cellulosepulver («Whatman CC 31») in Isopropanol-Wasser (7:3 V/V) auf einer Höhe von 300 mm. 2,0 g der lederfarbenen festen pulverigen Substanz wurden aufgelöst in 5 ml Isopropanol/Wasser (7:3 V/V) und chromatographiert im gleichen Lösungsmittel bei Durchflussgeschwindigkeiten von 3 ml/ Minute. Die den MM 4550 (Komplex) enthaltenden Fraktionen, bestimmt durch Test gegenüber Klebsiella aerogenes, wurden vereinigt, konzentriert durch Eindampfen im Vakuum unterhalb 30°C und gefriergetrocknet. Erhalten wurden 207 mg einer braunen festen Substanz. Die Ausbeute an MM 4550 (Komplex) in diesem Stadium betrug 51% und der Reinigungseffekt war fünffach.
Eine Säule von 16 mm Durchmesser wurde gepackt mit Cellulosepulver (Whatman CC 31) in Propanol/Wasser (4:1 V/V) auf eine Höhe von 300 mm. 198 mg der braunen festen Substanz wurden aufgelöst in Wasser/n-Propanol (1:1) und chromatographiert in n-Propanol/Wasser (4:1 V/V) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml pro Minute. Es wurden Fraktionen von je 6 ml gesammelt, im Biotest geprüft gegen Klebsiella aerogenes und das UV-Spektrum jeder Fraktion durchgemessen. Die Fraktionen 23 bis 28 mit UV-Maxima bei ungefähr 305 Nanometern enthielten das Dinatriumsalz von MM 13902. Diese Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert im Vakuum und gefriergetrocknet und ergaben 30 mg Festsubstanz. Diese Substanz zeigte lediglich eine Zone antibakterieller Aktivität bei Rf 0,77 bei Dünnschichtchromatographie und unter Verwendung von Eastman Kodak Celluloseplatten mit n-Propa-nol/Wasser (4:1 V/V) als Laufmittel. Die Zone wurde bestimmt durch Bioautographie gegenüber Bacillus subtilis. Die Fraktionen 29 bis 40 mit einem UV-Maximum bei ungefähr 285 Nanometer enthielten MM 4550. Diese wurden vereinigt, konzentriert unter Vakuum, gefriergetrocknet und ergaben 53 mg einer festen Substanz, welche ein Salz von MM 4550 enthielt, verunreinigt mit einem geringen Anteil eines Salzes von MM 13902.
Beschreibung 12
Organismen
Die Fähigkeit zur Produktion von MM 4550 (Komplex) wurde zuerst entdeckt an den Kulturen ATVV 21379, ATCC 21380, ATCC 21381 und ATCC 21382, welche aus Bodenproben isoliert wurden, die erhalten wurden aus Spanien, Neuseeland, Südafrika und Israel. Im Laboratorium schienen diese Kulturen identisch und alle wurden identifiziert als Streptomyces olivaceus von Dr. Bousfield, dem Actinomycet-Experten der National Collection of Industriai Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, unter Verwendung der weitgehend anerkannten Klassifikation 1967 von Hütter (Systematik der Streptomyceten, S. Karger, Basel, 382 pp). Die Produktion von MM 4550 wurde inzwischen auch bei anderen Streptomyces-Species festgestellt, wie dies aus der Tabelle 4 ersichtlich ist.
S. olivaceus wurde zuerst beschrieben von Waksman 1919 (Cultural Studies of Species of Actinomyces, Soil, Sei., 8, 71-215). In der Folge beschrieb 1960 eine Gruppe von russischen Bearbeitern eine Species mit sehr ähnlichen Charakteristika, die sie indessen Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis benannten (Kuchaeva und Mitarbeiter, Trud. Inst. Mikrobiol., Akad Nauk. SSSR., 8, 226-253, I960).
Mikroorganismen des Genus Streptomyces sind ausserordentlich verschieden in ihren morphologischen und physiologischen Charakteristiken in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter welchen sie gewachsen sind. Beschreibungen von manchen Species wurden veröffentlicht bevor die Existenz dieser extremen Vielgestaltigkeit erkannt worden war, was in der Folge zu Verdoppelungen und Synonymbezeichnungen führte. Hütter (1967) führt 25 Species an, als Synonyme mit S. olivaceus unter Einschluss von S. fulvoviridis. Zur Beseitigung der Konfusion in Nomenklatur und Klassifizierung wurde ein internationales Streptomyces-Projekt 1962 begonnen, Shirling
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
626 628
und Mitarbeiter, Int. J. Syst. Bacteriol, 18, 69-189 (1968). Mitarbeiter in diesem Projekt haben eine Serie von Studien durchgeführt, die geeignet sind zur Etablierung genauer Beschreibungen von Streptomyces species unter Standardbedingungen. In diesem Schema wurden Standardbeschreibungen produziert von Typen von Stämmen von einigen 400 namentlich genannten Species unter Einschluss von Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis.
Die I.S.P.-Beschreibung von S. olivaceus und S. fulvoviridis unterscheidet sich nur in zwei Charakteren: 1. in der Form der Sporophoren und 2. in der Fähigkeit zur Verwendung von Inosit als einzige Kohlenstoffquelle bei der Aufzucht.
S. olivaceus wird folgendermassen beschrieben: Sporenketten-Morphologie: Spirales-Sektionen mit offenen Spiralen zwischengeteilt durch gebogene Sporenketten, als Andeutung von Rectiflexibiles-Sektionen. Die reifen Sporenketten sind im allgemeinen lang, oft mit mehr als 50 Sporen pro Kette.
Kohlenstoffaufnahme aus D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, i-Inosit, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose findet bei der Aufzucht statt. Keine Aufzucht oder nur spurenhafter Wuchs erfolgt auf Sacharose und Raffinose.
S. fulvoviridis ist folgendermassen beschrieben: Sporenket-ten-Morphologie: Rectiflexibiles-Sektionen. Die reifen Sporen sind mässig kurz mit 10 bis 50 Sporen pro Kette. Kohlenstoffaufnahme: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose sind bei der Aufzucht geeignet. Die Aufnahme aus D-Sacharose ist zweifelhaft. Kein Wuchs oder nur spurenhafter Wuchs auf i-Inosit oder Raffinose.
Die Charakterisierung einer Anzahl von Kulturen, die als S. olivaceus oder S. fulvoviridis oder verwandte Species bezeichnet wurden, wurde bestimmt unter Verwendung der Standardmethoden und -medien, empfohlen im International Streptomyces Projekt (ISP) von Shirling und Mitarbeitern, Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, (1960).
Die Kulturen wurden hergeleitet von verschiedenen Quellen. ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 wurden isoliert aus Boden auf Basis der Herstellung von MM 4550 (Komplex). Die anderen Stämme wurden erhalten aus verschiedenen Kultursammlungen für Vergleichszwecke.
Die Ergebnisse der Versuche zur Herstellung von MM 4550 (Komplex), Farbe des Aeromyceliums, Sporophorengestalt, Farbe des Substratmyceliums, Produktion an löslichem Pigment, Melanin-Produktion und Ausnützung der Kohlenstoffquelle sind in der Tabelle 4 bis 8 zusammengestellt. Bei allen diesen Stämmen ist die Sporenoberfläche glatt, wie sich im Elektronenmikroskop erweist.
Aus der ISP-Beschreibung ist es klar, dass der Spiralwuchs der Sporophoren in S. olivaceus variablen Charakters ist. Wirkliche Spiralen wurden beobachtet mit verschiedener Häufigkeit im Typ Species S. olivaceus ATCC 3335. Die Mehrzahl der Sporophoren war lang. Keine wirklichen Spiralen wurden beobachtet aus den Kulturen ATCC 21379, 21380, 21381 oder 21382, obgleich die Sporophoren lang waren und eine Tendenz zur Spiralität zeigten, auf einem Hintergrund von Rectiflexibiles-Typen. Indessen waren in zwei S. olivaceus-StämmenNCEB 8238 undNCIB 8509, die Sporophoren in der Mehrzahl vom Rectiflexibiles-Typ. In NCIB 8238 waren sie von mittlerer Länge, wogegen diejenigen von NCIB 8509 lang waren.
Die bei ATCC 15863 beobachteten Sporophoren, d.h. der Species vom Typ S. fulvoviridis, waren kürzer als diejenigen, die gesehen werden können bei Isolaten ATCC 21379, 21380, 21381,21382 und 31126 und waren lediglich vom Rectiflexibiles-Typ. Mit Rücksicht auf diese Charakteristika stimmen die Isolate ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 und 31126 wohl gut, jedoch nicht exakt überein mit der S. olivaceus-Beschrei-bung.
Die Isolate ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 und 31126
zeigen eine gewisse Variabilität mit Rücksicht auf Inositaus-nützung, welches das andere differenzierende Charakteristikum gemäss der ISP-Typenbeschreibung zur Unterscheidung von S. olivaceus und S. fulvoviridis ist (Tabelle 8). ATCC 31126 und ATCC 21380 konsumieren Inosit, was charakteristisch ist für S. olivaceus, wogegen die anderen Stämme nur zweifelhafte oder negative Konsumation ausüben. Indessen ist es im allgemeinen nicht genügend zur Trennung verschiedener Species lediglich die Fähigkeit zur Konsumation eines einzelnen Kohlehydrates zu benutzen. Ein derartiger Unterschied kann erwachsen aus einer einzigen Genmutation und ist öfters lediglich nur einer Stammsignifikanz zuzuschreiben. Der Unterschied in der Zuckerkonsumation durch S. olivaceus-Stämme NCIB 8138, NCIB 8509, ATCC 21549, ATCC 12019 und ATCC 3335 führt zur Annahme, dass manche Autoritäten ihn nicht als Speciessignifikanz betrachten. So werden ATCC 21379, 21380, 21381 und 21382 und 31126 eigentlich als S. olivaceus bezeichnet.
Ohne dass weitere Studien bedeutendere Unterschiede zwischen den Kulturen aufdecken, die zur Zeit S. olivaceus und S. fulvoviridis genannt werden, ist es möglich, dass sie gegebenenfalls international anerkannt werden als ein und dieselbe Species. In diesem Fall wird aus Prioritätsgründen der korrekte Name S. olivaceus sein und es werden davon auch diejenigen Kulturen eingeschlossen, die Hütter als Synonyma mit S. olivaceus aufgeführt hat.
Prüfung der Kulturfiltrat e von Stämmen von S. olivaceus und verwandten Species zur Herstellung von MM 4550 (Komplex) können in folgender Weise ausgeführt werden:
Kulturfiltrate der aufgeführten Stämme wurden punktweise aufgetragen auf «Whatman Nr. 1»-Papierstreifen mit 20 |il und chromatographiert in n-Butanol/Isopropanol/Wasser (7:7:6) über Nacht in der Kälte. Ein anderer Satz von Streifen wurde gelaufen in n-Butanol/Eisessig/Wasser (12:3:5) gleichfalls über Nacht. Ein partiell gereinigtes Muster von MM 4550 (Komplex) wurde gelaufen in den beiden Systemen zur gleichen Zeit als Marke.
Alternativ ist es möglich, 25 ml einer geklärten Brühe zu extrahieren mit 12,5 ml einer 0,2%igen Cetylbenzylammoni-umchloridlösung in Dichlormethan, Auftrennung der Phasen, Abtrennung der organischen Phase, Zugabe von 2,5 ml Natri-umjodidlösung (0,5 %), Schütteln, Trennen der Phasen, Abtrennen der wässrigen Phase und ihrer chromatographischen Anwendung z.B. durch punktweise Auftragung von 5 ul auf Dünnschichtchromatographie-Streifen und Entwicklung in n-Butanol/Isopropanol/Wasser (7:7:6).
Tabelle 5
Befähigung von Kulturen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoridis und verwandten Species zur Erzeugung von MM 4550 (Komplex)
Kultur MM 4550 (Komplex)
Produktion
Streptomyces olivaceus
ATCC 21379
+
Streptomyces olivaceus
ATCC 31126
+
Streptomyces olivaceus
ATCC 21380
+
Streptomyces olivaceus
ATCC 21381
+
Streptomyces olivaceus
ATCC 21382
+
Streptomyces olivaceus
NCIB 8238
+
Streptomyces olivaceus
NCIB 8509
+
Streptomyces flavovirens
ATCC 3320
+
Streptomyces flavus
ATCC 3369
+
Streptomyces fulvoviridis
ATCC 15863
+
Streptomyces argenteolus
ATCC 11009
+
5
10
15
20
25
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45
50
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60
65
626628 12
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Kuimr
MM 4550 (Komplex) '
Produktion
Streptomyces sioyaensis
ATCC 13 989
+
Streptomyces lipmanü
NRRL3584
+
(Streptomyces olivaceus ATCC 21549, ATCC 12019 und ATCC 3335 produzierten keinen MM 4550 (Komplex); ATCC 15863 wurde gleichenfalls deponiert unter der Bezeichnung RIA 660).
Tabelle 6
Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Species — Farbe und Morphologie des reifen sporulierenden Mycéliums auf ISP-Media nach 14 Tagen Aufzucht
Kultur
SS
YM
GA
OM
Sporophorenmorphologie und -grosse
ATCC
21379
grau grau grau/weiss grau langRF
ATCC
31126
grau/braun grau/braun grau grau lang RF
ATCC
21380
grau grau grau grau langRF
ATCC
21381
grau grau hellgrau grau/weiss langRF
ATCC
21382
grau/weiss grau grau grau langRF
NCIB
8238
grau/weiss grau grau grau mittel RF
NCIB
8509
grau grau grau grau langRF
ATCC
21549
grau grau grau grau lang S
ATCC
12019
grau grau grau grau lang RF/S
ATCC
3335
grau grau grau grau lang RF/S
ATCC
15863
grau/weiss grau grau/weiss grau mittel RF
ATCC
3320
grau/blau grau grau/grün grau langRF
ATCC
3369
grau grau grau hellgrau/braun mittel RF/RA
ATCC
11009
hellgrau grau/braun grau/weiss weiss/grün mittel RF/RA
ATCC
13898
weiss/grau weiss weiss/gelb grau/weiss kurz S
SS = anorganische Salze - Stärke-Agar (ISP Medium 4) YM = Hefeextrakt - Malzextrakt-Agar (ISP Medium 2) GA = Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Medium 5) OM = Hafermehl-Agar (ISP Medium 3) RF = Rectiflexibiles RA = Retinaculiaperti S = Spirales
Tabelle 7
Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Species - Farbe und Substrat-mycelium von der Rückseite gesehen
Kultur
SS
YM
GA
OM
ATCC 21379
olive olivebraun grau/braun olivegrün
ATCC 31126
olivebraun olivebraun braun olivebraun
ATCC 21380
olive olivegrün olivebraun olivegelb
ATCC 21381
dunkelbraun dunkelbraun olivegrün olivegrün
ATCC 21382
olive olive braun olivegrün
NCIB 8238
braun olive/braun braun olivegelb
NCIB 8509
braun olive olivebraun olivegelb
ATCC 21549
lederfarben/schwarz braun/schwarz braun/schwarz lederfarben/grau
ATCC 12019
lederfarben lederfarben lederfarben lederfarben
ATCC 3335
braun braun braun braun
ATCC 15863
braun/grau dunkelbraun olivebraun olivegelb
ATCC 3320
gelb/braun olive/braun olive/braun orange/braun
ATCC 3369
lederfarben/grau gelb/braun lederfarben/grün gelb
ATCC 11009
schwarz schwarz/gelb schwarz/gelb grau/grün
ATCC 13989
orange gelb gelb farblos
13 626 628
Tabelle 8
Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Species - Produktion von Pigmenten im Kulturmedium
Kultur
lösliche nicht-melanoide Pigmente
* Melanin-
SS
YM
GA
OM
Produktion
ATCC
21379
_
_
+
—
schwach
gelb
ATCC
31126
—
-
-
-
-
ATCC
21380
—
—
—
-
-
ATCC
21381
—
-
-
-
ATCC
21382
—
—
-
-
-
NCIB
8238
+
—
+
-
schwach
schwach schwach
braun
braun braun
NCIB
8509
—
—
-
+
-
schwach
gelb
ATCC
21549
_
+
4-
-
schwach schwach schwach
braun rot/braun braun
ATCC
12019
—
—
-
-
-
ATCC
3335
—
-
-
-
-
ATCC
15863
—
-
-
-
ATCC
3320
+
_
—
-
-
schwach
rosa
ATCC
3369
—
—
-
-
-
ATCC
11009
—
+
-
-
-
schwach
braun
ATCC
13989
—
+
-
-
-
schwach
orange
+ = Pigment produziert - = Pigment nicht produziert
* = getestet auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP6), Tyrosin-Agar (ISP17) und Trypton-Hefe-Brühe (ISP1)
Tabelle 9
Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Species - Kohlenwasserstoffaufnahme-Versuche
0)
o
<L> cn o
a>
8
o
o
0>
o
Kultur es
S
ë
*c3
CÖ
■s
03 CO
Inosit o o s
O
Xylose o
0
1
Mannil
.5
■8 •3
ATCC 21379
+
—
—
±
+
+
+
+
+
ATCC 31126
+
-
—
+
+
+
+
+
+
ATCC 21380
+
—
—
+
+
+
+
+
+
ATCC 21381
+
—
—
—
+
+
±
+
+
ATCC 21382
+
+
—
—
+
+
+
+
+
NCIB 8238
+
—
—
—
+
+
+
+
+
NCIB 8509
+
±
—
+
+
+
±
+
ATCC 21549
-
-
—
+
+
+
+
+
+
ATCC 12019
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ATCC 3335
+
—
dt
+
+
+
+
+
+
ATCC 15863
+
—
—
—
+
+
+
+
+
ATCC 3320
+
—
-4~
—
+
+
+
+
+
ATCC 3369
+
—
±
±
+
+
+
+
+
ATCC 11009
+
—
—
+
+
+
+
+
+
ATCC 13 989
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+ bedeutet: die Verbindung wird verbraucht - bedeutet: die Verbindung wird nicht verbraucht ± bedeutet: Verbrauch zweifelhaft oder sehr gering
Beispiel 3 Bevorzugtes Isolationsverfahren zur Herstellung von MM 13902 4s Ein Stock von Sporen von S. olivaceus ATCC 31126 wurde gelagert in Rohren auf trockenem Boden in einem geschlossenen Behälter mit einem Trocknungsmittel bei einer Temperato von 20°C. Ein geringer Anteil des Bodens (ungefähr 20 mg) wurde aseptisch übergeführt in einen 500 ml Erlen-50 meyer, welcher 100 ml der folgenden Medien enthielt:
Bestandteil
Anteil (g/Liter)
Glucosemonohydrat
20,0
Sojamehl
10,0
deionisiertes Wasser auf
1 Liter
6o Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,5 eingestellt Das Sojamehl war «Arkasoy 50», geliefert von British Arkady Co. Ltd., Old Stafford, Manchester, England.
Der Erlenmeyer-Kolben wurde inkubiert auf einem Rotationsschüttler (240 Umdrehungen pro Minute) während unge-65 fähr 30 Stunden bei 28°C. 2 ml des erhaltenen Gewächses wurden hernach verwendet als Inoculât auf einer festen Agar-schicht in einem Rouxgefäss. Das Agarmedium hatte die folgenden Zusammensetzungen:
626 628
14
Bestandteil
Anteil
«V-8-Gemüsesaft»
20,0 ml
Agar
20,0 g deionisiertes Wasser auf
1 Liter
Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,0 eingestellt («V-8-Saft» ist erhältlich von Campbell's Soups Ltd., Kings Lynn, Norfolk, England).
Das Inokulat wurde verbreitet auf der Agaroberfläche durch Neigen der Flasche, worauf die letztere in Aufrechtstellung bei 30°C inkubiert wurde. Nach zwei Tagen Inkubationszeit wurde die überschüssige Flüssigkeit in der Flasche abpipettiert und die Inkubation während weiterer vier Tage fortgesetzt.
Zuvor hat sich erwiesen, dass die Entwicklung von Actino-phagen in der Zuchtkultur unterbleibt, wenn diese Methode der Präparation im Rouxgefäss angewendet wird.
50 ml sterilisierten entionisierten Wassers, welches 0,02% «Tween 80» enthielt, wurden in das Roux-Kulturgefäss eingebracht und die Sporen darin durch Schütteln suspendiert.
Diese Sporensuspension wurde hernach zugefügt als Inoculum zu 75 Litern eines sterilisierten Keimmediums in einem Fermentator von 100 Litern Inhalt aus rostfreiem Stahl. Die Zusammensetzung des Keimmediums war die folgende:
Bestandteil
Anteil (g/Liter)
Sojamehl («Arkasoy 50»)
10,0
Glucosemonohydrat
20,0
Leitungswasser auf
1 Liter
Zur Regelung der Schaumbildung wurden 50 ml einer 10 Vol.-%igen Lösung von «Pluronic L81» in Sojaöl zugegeben zum Fermentationsmedium vor der Sterilisierung.
Das Medium wurde mit Dampf sterilisiert im Fermentator während 20 Minuten bei 120°C. Die Keimkultur wurde gerührt mit 140 Umdrehungen pro Minute mit einem 19 cm Flügelrührer und belüftet mit 75 Litern pro Minute durch ein Einleitungsrohr mit offenem Ende.
Die Temperatur wurde auf 28°C geregelt und nach der Inkubation unter diesen Bedingungen während 48 Stunden der Inhalt des Gefässes hinzugegeben als Inoculum zu 1500 Litern eines sterilen Fermentationsmediums in einem mit Leitflächen versehenen Fermentator von 2000 Litern Inhalt aus rostfreiem Stahl. Das Fermentationsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:
Bestandteil Anteil (g/Liter)
Sojamehl («Arkasoy 50») 10,0
Glucosemonohydrat 20,0 Kalk (gefälltes Kalziumcarbonat) 0,2
Kobaltchlorid (CoCh-ómO) 0,001
Natriumsulfat (wasserfrei) 1,0
Leitungswasser auf 1500 Liter
Der pH-Wert wurde eingestellt auf 6,0 mit Natriumhydroxid vor der Sterilisation. Drei Liter einer 10%igen Lösung von «Pluronic L81» in Sojabohnenöl wurden vor der Sterilisation zur Verhinderung der Schaumbildung hinzugefügt. Nach der Sterilisation wurde der pH-Wert erneut auf 7,0 eingestellt mit steriler Lösung von Natriumhydroxid. Das Fermentationsgemisch wurde gerührt mit 106 Umdrehungen pro Minute, wobei ein Flügelrührer mit 47 cm Durchmesser verwendet wurde. Die Temperatur wurde geregelt auf 30°C und ein Luftdurch-fluss eingehalten von 1200 Litern pro Minute. Das Fermentationsprodukt wurde nach 60 Stunden geerntet und geklärt durch Zentrifugieren.
Dem auf diese Weise hergestellten Material wurde willkürlich eine Aktivität von 340 Einheiten pro ml zugeschrieben. Teste wurden durchgeführt, wie dies unter Beschreibung 2 vorstehend dargelegt wurde.
1050 Liter des Kulturfiltrates mit 340 Einheiten pro ml wurden bei 10°C und dem pH-Wert 8 extrahiert mit 310 Litern Dichlormethan bei 10°C, welche 1200 g Cetyldimethyl-benzylammoniumchlorid enthielten, indem die beiden Flüssigkeiten in vorausbestimmten Durchflussraten durch einen Ein-strom-Mischer gepumpt wurden. Die Phasen wurden in einer Sharples-Zentrifuge getrennt, nachdem sie zuvor während zwei Minuten gemischt worden waren. Die Dichlormethanphase in einer Menge von 300 Litern wurde zurückextrahiert mit wässrigem Natriumjodid. Die Rückextraktion wurde durchgeführt in vier Ansätzen unter Verwendung von insgesamt 7 Litern Wasser, welche 210 g Natriumjodid enthielten. Die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde vom pH 7,7 auf pH 7,0 mit Salzsäure eingestellt, worauf filtriert wurde. Die 7 Liter Natriumjodidextrakte enthielten 21 900 Einheiten pro ml.
Es wurde eine Ionenaustauschersäule präpariert durch Packen von «QAE Sephadex A25» (erhalten von Pharmacia Ltd.) in einem 0,5-molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 7, enthaltend 0,3-m Natriumchlorid, wobei eine Säule von 10 cm Durchmesser und einer Höhe von 40 cm angewendet wurde. Der Natriumextrakt im Betrag von 7 Litern wurde bei 5°C percoliert durch das «QAE Sephadex» mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 50 ml pro Minute. Die Säule wurde eluiert mit einer 0,7-molaren Lösung von NaCl in 0,05-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7, wobei gleichfalls bei 5°C gearbeitet wurde und eine Durchflussrate von 25 ml pro Minute eingehalten wurden. Zwei Liter des Eluates wurden verworfen und 90 Fraktionen von je 100 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden geprüft in einem Ultraviolett-spektrometer und diejenigen, welche Absorptionsmaxima bei ungefähr 305 Nanometer aufwiesen, wurden vereinigt. Ihr pH-Wert wurde auf 7 eingestellt (Fraktionen 50 bis 62, Totalvolumen 1440 ml, 71 000 Einheiten pro ml). Zuvor hatte sich erwiesen, dass die Fraktionen mit einem Maximum in dieser Region die Substanz MM 13902 enthielten.
5 g Natriumchlorid in 100 ml Wasser wurden zu den vereinigten Fraktionen hinzugefügt, wonach percoliert wurde bei 5°C durch eine Säule von 6,3 cm Durchmesser, gepackt mit «Amberlite XAD 4»-Harz (geliefert von Röhm und Haas) in einer Höhe von 30 cm, wobei eine Durchflussrate von 20 ml/ Minute eingehalten wurde. MM 13902 wurde adsorbiert am Harz unter diesen Bedingungen, wogegen die anorganischen Verunreinigungen dieses nicht wurden. Die Antibiotika wurden eluiert bei Zimmertemperatur mit 200 ml destilliertem Wasser, gefolgt von 50 %igem wässrigem Methanol. Das Eluat im Betrag von 1 Liter wurde eingedampft unterhalb 30 °C bei vermindertem Druck auf 70 ml, worauf der pH-Wert auf 7 eingestellt und gefriergetrocknet wurde. Erhalten wurden 1,62 g einer braunen festen Substanz, die ein partiell gereinigtes Salz von MM 13902 mit einer Aktivität von 37 000 Einheiten pro mg darstellten.
Das partiell gereinigte MM 13902 Dinatriumsalz (1,0 g, 37 000 Einheiten/mg) wurde chromatographiert an einer Cellulosesäule von 3,8 cm Durchmesser und 30 cm Länge an «Whatman CC30-Cellulose». Eluiert wurde mit n-Propanol/ Wasser (4:1 V/V) mit einer Durchflussrate von 2,5 ml/Minute. 170 ml Eluat wurden verworfen und 100 Fraktionen von je 15 ml gesammelt. Die Fraktionen, welche MM 13902 als Dinatriumsalz enthielten (Nr. 37 bis 43), bestimmt durch UV-Absorption, wurden vereinigt und ergaben 89 ml. Eindampfen unterhalb 30°C unter vermindertem Druck zur Entfernung von n-Propanol und Gefriertrocknen führte zu einer Ausbeute von s
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
15
626628
219 mg eines gelblichen Pulvers mit einer Aktivität von 73 000 Einheiten pro mg.
Das vorgenannte Material zeigte ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei ungefähr 308 Nanometer mit einem EJ®, von ungefähr 343. Dieses Material zeigte das IR- und NMR-Spektrum der Fig. 2 und 3. Die antibakterielle Aktivität des Materials ist in der Tabelle 10 dargestellt. Elementaranalysen des Produktes zeigten an, dass u.a. Stickstoff, Schwefel und Natrium, wahrscheinlich im Verhältnis N:S:NA = 2:2:2 enthielt. Die positiven und negativen Maxima der Circulardi-chroismus-Kurven für Dinatrium-MM 13902 wurden bestimmt auf einem Cary-61 registrierenden Spektropolarimeter bei Konzentrationen von 0,37 mg/ml und bei einer Schichtdicke von 1 cm. Es ergaben sich folgende Resultate:
k(nm)
AE/m
186 221 286 323
+ 67,24 X10-4 —67,24 X10-4 - 3,30 X10-4 —8,20 XlO"4
Tabelle 10
Antibakterielle Aktivität des Dinatriumsalzes von MM 13 902 (Microtiter-Methode - starkes Inoculum, 1/100 über Nacht)
Organismus
Bacillus subtilis A Staph. aureus Oxford Staph. aureus Russell io Strep. Faecalis
Enterbacter cloacae N1 E. coli 10418 E. coli JT410 Kleb, aerogenes A is Proteus mirabilis 13 Proteus vulgaris WO 90 Prov. stuartii Ps. aeruginosa A Salmonella typhimurium CT 10 20 Serratia marcescens US 39 Shigella sonnei Haemophilis influenzae P6 Neisseria gonorrhoeae
MIC(ng/ml)
0,15 0,30 0,60 3,10 25 0,15 5
0,03 0,60 0,60 0,07 50 0,30 2,50 0,6-0,3 0,08 0,08
Aus den vorstehend aufgeführten Daten ergibt sich, dass das neue Antibiotikum MM 13902 die folgende Strukturformel I hat:
(I)
C - NH - CO - CIL
3 Blatt Zeichnungen
Claims (4)
1»
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20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
626628
1. Es ist in hohem Grade löslich in Wasser, löslich in Methanol und im wesentlichen unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen.
1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums MM 13902 und seiner Salze mit folgenden ungefähren Rf-Werten des reinen Dinatriumsalzes bei Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit den nachgenannten Laufsystemen a) n-Butanol/Isopropänol/Wasser- 7:7:6 V/V Rf = 0,72
b) Isopropanol/Wasser - 7:3 V/V Rf = 0,85
c) n-Butanol/Äthanol/Wasser - 7:7:6 V/V Rf = 0,81
d) n-Propanol/Wasser - 4:1 V/V Rf = 0,75;
sowie einem Iso-Wert des reinen Dinatriumsalzes zwischen 0,001 ng/ml und 0,0001|xg/ml gegen die ß-Lactamase von Escherichia coli B 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein MM 13902 produzierender Stamm von Streptomyces kultiviert und MM 13902 oder ein Salz davon aus der Kultur abgetrennt wird.
2. In wässriger Lösung zeigt es ein chrakteristisches Ultraviolettspektrum mit Absorptionsmaxima, von welchen eines bei ungefähr 305 nm hegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass ein Stamm Streptomyces olivaceus oder ein damit verwandter Organismus kultiviert wird.
2
PATENTANSPRÜCHE
3
626 628
Magnesium, Aluminium, und den üblichen substituierten Ammoniumionen und dergleichen. Besonders geeignete Salze sind die Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz, z.B. das Dinatrium- oder Dikaliumsalz.
Geeignete Präparate von MM 13902 und seiner Salze, wie sie erfindungsgemäss hergestellt werden können, weisen mindestens 50% Reinheit, ja Reinheitsgrade zwischen 70 und 80 und sogar bis zu 100% auf.
Aus dem neuen Antibiotikum MM 13902 oder seinen Salzen lassen sich mit pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanzen pharmazeutische Zubereitungen herstellen. Auch hierin liegt die wirksame Verbindung zweckmässig in der Form des Dinatrium- oder Dikaliumsalzes vor. Derartige Zubereitungen können in einer Form hergestellt werden, die geeignet ist für orale, örtliche oder parenterale Anwendung. Es handelt sich dabei um Tabletten, Kapseln, Cremen, Sirupe, Pulver und sterile Präparate, die geeignet sind zur Injektion oder zur Infusion. Derartige Zubereitungen können übliche pharmazeutisch verträgliche Materialien, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farben, Geschmacksstoffe, Konzentrierungsmittel, Stabilisatoren und dergleichen enthalten, wie dies in der pharmazeutischen Praxis üblich ist und dem Fachmann bekannt ist bei der Formulierung antibiotischer Arzneimittel, wie Penicillinen oder Cephalosporinen.
MM 13902 oder seine Salze können in den pharmazeutischen Zubereitungen entweder als einziges therapeutisches Agens oder zusammen mit einem ß-Lactam-Antibiotikum enthalten sein. Geeignete ß-Lactam-Antibiotika sind u.a.
solche, die bekanntermassen der Einwirkimg von ß-Lactamase unterworfen sind, wie auch solche, die eine eigene Stabilität gegenüber ß-Lactamase aufweisen. Solche ß-Lactam-Antibiotika sind u.a. Ampicillin, Amoxycillin, Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Propicillin, Cephaloridin, Cefoxitin, Cephalothin, Cephalexin, Carbenicillin, Ticarcillin und in vivo hydrolysierbare Ester von derartigen Verbindungen, wie die Phenyl-, Tolyl- oder Indanylester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder die Acetoxymethyl-, Pivaloyloxymethyl- oder Phthalidylester von Ampicillin, Benzylpenicillin, Amoxycillin, Cephaloridin, Cephaloglycin und dergleichen.
Zweckmässig liegt das Verhältnis von MM 13902 oder eines Salzes davon zum ß-Lactam-Antibiotikum im Bereich von 10:1 und 1:10, z.B. zwischen 3:1 und 1:3.
In der Regel liegt der Anteil an antibakteriellem Agens in den Dosierungsformen normalerweise zwischen 50 und 1500 mg, präziser zwischen 100 und 1000 mg.
Vorzugsweise werden die dosierten Präparate gemäss der Erfindung ein oder mehrmals am Tag, z.B. zwei- bis viermal pro Tag, verabreicht bei der Behandlung von Erkrankungen der Harnwege, Atmungswege, Weichgewebe und dergleichen. Die Präparate können verwendet werden zur Behandlung von Erkrankungen wie Bronchitis, Gonorrhoe, Mittelohrentzündung, Mastitid und dergleichen.
Ein besonderer Aspekt der Erfindung besteht in der Herstellung von MM 13902 oder eines Salzes davon durch chromatographische Trennung einer Lösung von MM 4550 (Komplex), wie sie im nachfolgenden beschrieben ist, in Fraktionen, welche im wesentlichen aus einer Lösung von MM 13902 oder eines Salzes davon und Fraktionen anderer Anteile bestehen, worauf MM 13902 oder ein Salz davon aus der Lösung isoliert wird.
Mit dem Ausdruck «Fraktionen, die im wesentlichen aus einer Lösung von MM 13902 oder einem Salz davon» bestehen, ist gemeint, dass entweder das einzige antibiotische Material in der Lösung MM 13902 oder ein Salz davon ist, oder,
dass gegebenenfalls, wenn irgendein anderes antibiotisches Material zugegen ist, es dann in einem kleineren Anteil vorliegt als dies bei MM 13902 oder einem Salz davon zutrifft. Geeigneterweise ist der Anteil an MM 13902 oder seines
Salzes bei 70 bis 80 und vorzugsweise bei 90 bis 100% des antibiotischen Materials in der Fraktion. Es wurde gefunden, dass eine geeignete Methode zur Bestimmung der Fraktionen, welche im wesentlichen eine Lösung von MM 13902 oder Salzen davon darstellen, die Aufnahme eines Ultraviolett-Absorptionsspektrums jeder Probe darstellt. Diejenigen Fraktionen, welche ein Ultraviolettspektrum ähnlich demjenigen der Fig. 1 zeigen, enthalten normalerweise MM 13902 oder ein Salz davon im wesentlichen frei von anderem antibiotischem Material, wie MM 4550, wie nachfolgend beschrieben. In der Regel sind diejenigen Fraktionen, welche ein ausgeprägtes Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei ungefähr 305 Nanometer aufweisen, von der erwünschten Reinheit.
Normalerweise wird der vorerwähnte Prozess verwendet zur Isolierung von MM 13902 als zweibasisches Salz. Falls ein einbasisches Salz von MM 13902 oder die freie Säure MM 13902 selbst erwünscht wird, können diese Substanzen hergestellt werden durch Ansäuern des zweibasischen Salzes von MM 13902, da im allgemeinen die einbasischen Salze von MM 13902 und die freie Säure MM 13902 nicht genügend stabil sind, um sie aus den Mischungen mit MM 4550 (Komplex) der nachbeschriebenen Art zu isolieren. Die einbasischen Salze und die freie Säure lassen sich nicht leicht herstellen, zufolge ihrer geringen Stabilität.
Wie im vorhergehenden ausgeführt, wird angenommen, dass die chromatographische Isolierung von MM 13902 am besten durchgeführt wird unter Verwendung eines Salzes von MM 13902, wie dem Dinatriumsalz. Salze von MM 13902 sind in wässrigen Lösungsmitteln besser löslich als in hochgradig lipophilen Lösungsmitteln, weswegen vorgezogen wird, wäss-rige Lösungsmittelsysteme bei der chromatographischen Reinigung gemäss der Erfindung zu verwenden.
Es hat sich erwiesen, dass wässrige Lösungen von Elektrolyten, die ungefähr auf den Neutralwert gepuffert sind, sich eignen in Verbindung mit polaren Trägermaterialien, wie basischen Ionenaustauschharzen. So kann eine wässrige Lösung von Natriumchlorid, gepuffert auf ungefähr pH 7, mit einem typischen Puffer, wie einem Phosphatpuffer, verwendet werden zusammen mit einem Trägermaterial, welches tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Ammoniumgruppen aufweist. Es hat sich gezeigt, dass basische ionenaustauschende Cellulosen und basische ionenaustauschende vernetzte Dex-trane geeignete Trägermaterialien sind und dass insbesondere «QAE Cephadex A25» sich als Träger eignet, insbesondere wenn das Lösungsmittelsystem aus 0,7-m Natriumchlorid in einem Phosphatpuffer von pH 7 besteht («Cephadex» ist eine eingetragene Handelsmarke).
Anderseits haben sich Lösungsmittelsysteme, bestehend aus Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln sowie niederen Alkanolen als geeignet erwiesen, zusammen im Gebrauch mit inerten Trägermaterialien wie Silicagel oder Cellulose. Ein besonders geeignetes Lösungsmittelsystem für die Verwendung mit Cellulose ist ein Gemisch aus Wasser und Isopropanol, insbesondere im Verhältnis 7:3.
Indessen enthält das bei den vorgenannten Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauschharzen erhaltene Produkt häufig sehr hohe Anteile an Natriumchlorid, so dass es günstig ist, die vereinigten Chromatographielösungen zu entsalzen. Eine Entsalzung kann bewirkt werden vermittels Durchlaufenlassens der Lösung durch eine Säule, welche ein lipophiles Material enthält, worauf das MM 13902 adsorbiert ist, welche jedoch das Natriumchlorid nicht adsorbiert. Geeignete Säulenmaterialien sind Polystyrole, wie «Amberlite XAD 4». Alternativ lässt sich auch eine Gelfiltration anwenden, unter Verwendung von Filteragenzien, wie vernetzten Dextranen, wie z.B. «Sephadex G25» und Polyacrylamidgelen, wie z.B. «Biogel P2» (Amberlite, Sephadex und Biogel sind eingetragene Handelsmarken). Das Antibiotikum kann von der Kolonne
5
3. In einer Konzentration von 0,4 Gew.-% in einer frisch hergestellten KBr-Scheibe zeigt es ein charakteristisches IR-Spektrum mit Absorptionsmaxima unter anderem bei 3450, 2950,1750,1620,1510,1400 und 1260 cm-1.
4. Es zeigt ein charakteristisches NMR-Spektrum bei Aufnahme in D2O, welches u.a. a) ein Paar von Niederfeld-Dou-bletts aufweist, welches bei 2,85 T und 4,00 T zentriert ist mit Kupplungskonstanten von ungefähr 14 Hz; b) ein Doublett, zentriert bei ungefähr 8,55 T und c) ein starkes Singulett bei ungefähr 8,00 T aufweist.
5. Es besitzt antibakterielle Aktivität gegenüber verschiedenen Species, u.a. Stämme von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi und Pseudomonas aeruginosa.
6. Im Gemisch mit Ampicillin zeigt es synergistische Wirksamkeit gegenüber Organismen, wie Stämmen von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.
Das reine Dinatriumsalz von MM 13902 ist ein ß-Lactamase-inhibitor und hat einen Iso-Wert (wie nachfolgend definiert) zwischen 0,001 [ig/ml und 0,0001 jxg/ml gegenüber der ß-Lactamase von Escherichia coli B 11.
Das reine Dinatriumsalz von MM 13902 zeigt bei der Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit den nachstehend bezeichneten Laufmitteln die folgenden Rf-Werte:
a) n-Butanol/Isopropanol/Wasser - 7:7:6 v/v; Rf = 0,72
b) Isopropanol/Wasser- 7:3 v/v; Rf = 0,85
c) n-Butanol/Äthanol/Wasser - 7:7:6; Rf = 0,81
d) n-Propanol/Wasser - 4:1; Rf = 0,75
Unter einem anderen Gesichtspunkt kann MM 13902 charakterisiert werden als ein schwefelenthaltendes antibakterielles Agens, dessen Salze produziert werden während der Kulti-vation von Streptomyces olivaceus ATCC 31126 und das in Form einer wässrigen Lösung von 45,2 [ig/ml seines Dinatriumsalzes ultraviolette Absorptionsmaxima bei ungefähr 305 Nanometer und bei ungefähr 225 Nanometer aufweist, im wesentlichen gemäss der Darstellung in der Fig. 1.
Streptomyces olivaceus ATCC 31126 wurde am 18. Februar 1975 bei der American Type Culture Collection, 12301 Park-lawn Drive, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt.
Weiterhin kann MM 13902 charakterisiert werden als ein antibakterielles Agens, welches in Foim seines praktisch reinen Dinatriumsalzes ein IR-Absorptionsspektrum im wesentlichen gemäss der Fig. 2 aufweist, wenn es aufgenommen wird in einer frisch hergestellten KBr-Scheibe, die die Substanz in einer Konzentration von 0,4 Gew.-% enthält. Ausserdem zeigt das Dinatriumsalz ein NMR-Spektrum im wesentlichen gemäss der Fig. 3 bei Aufnahme in einer frisch hergestellten Lösung in D2O. Der mit X bezeichnete Peak ist einer Verunreinigung im Lösungsmittel (HOD) zuzuschreiben.
Das Material MM 13902 neigt zur Unstabilität, wenn es in Säure vorliegt. Demgemäss ist die Herstellung der Salze von MM 13902 vorzuziehen. Geeignete Salze von MM 13902 sind zweibasisch. Besonders vorteilhaft sind die Salze mit pharmazeutisch verträglichen Ionen, wie Natrium, Kalium, Kalzium,
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3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces olivaceus ATCC 31126 oder ein Mutant davon verarbeitet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Herstellung des neuen Antibiotikums MM 13902 und seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung von MM 4550-Komplex chromatographisch getrennt wird in Fraktionen, die im wesentlichen aus einer Lösung von MM 13902 oder einem Salz desselben sowie aus anderen Fraktionen bestehen, worauf
MM 13902 oder das Salz davon aus der Lösung isoliert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass ein zweibasisches Salz von MM 13902 hergestellt wird.;
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, ] dass ein Natrium- oder Kaliumsalz hergestellt wird.
Es wurde gefunden, dass ein neues Antibiotikum erhalten werden kann durch Fermentation gewisser Stämme von Streptomyces olivaceus und verwandter Organismen. Zusätzlich zu ihrer kräftigen antibiotischen Wirksamkeit zeigt dieses neue Produkt, welches mit MM 13902 bezeichnet wurde, synergistische Wirkung mit Penicillinen und Cephalosporinen.
Im britischen Patent Nr. 1 363 075 ist dargelegt, dass ein ß-Lactamaseinhibitor erhalten werden kann durch Fermentation gewisser Stämme von Streptomyces olivaceus. Bis zur vorliegenden Erfindung wurde angenommen, dass dieses im britischen Patent Nr. 1 363 075 beschriebene Produkt im wesentlichen rein war. Indessen hat sich gezeigt, dass dies nicht der Fall ist und dass ein kleinerer Anteil eines Stoffs mit starker antibakterieller Wirksamkeit daraus abgetrennt werden kann. Dieses neue Produkt wird bezeichnet mit MM 13902 und es wird angenommen, dass es zumindest für einen Teü der antibakteriellen Wirksamkeit im Produkt gemäss dem britischen Patent Nr. 1 363 075 verantwortlich ist, obgleich es nur für einen sehr kleinen Anteil der ß-Lactamase-inhibitorischen Wirksamkeit dieses Produktes verantwortlich gemacht werden kann. Selbstverständlich ist es nicht die Absicht der vorliegenden Anmeldung, das im britischen Patent Nr. 1 363 075 beanspruchte Material als solches hier wieder zu beanspruchen. Andere ß-Lactamaseinhibitoren können von Streptomyces-Stämmen produziert werden, z.B. diejenigen, welche im deutschen Patent Nr. 2 340 005 beschrieben sind. Jedoch zeigen diese Materialien nicht die hohe antibakterielle Wirksamkeit wie sie MM 13902 besitzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums MM 13902 sowie seiner Salze ist dadurch gekennzeichnet, dass ein MM 13902 produzierender Stamm von Streptomyces kultiviert und MM 13902 oder ein Salz davon aus der Kultur abgetrennt wird.
MM 13902 ist eine feste Carbonsäure, welche in Form des im wesentlichen reinen Natriumsalzes die folgenden Charakteristiken aufweist:
4
eluiert werden unter Verwendung von Wasser, wässrigem Methanol oder dergleichen.
Aus nach den vorgenannten Prozessen erhaltenen Lösungen kann das dibasische Salz von MM 13902 erhalten werden in fester Form vermittels Abscheiden aus der Lösung unter milden Bedingungen. Es hat sich gezeigt, dass eine geeignete Methode zur Erhaltung solchen festen Materials Eindampfen unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen der vereinigten Fraktionen ist.
Gewünschtenfalls kann das vorgenannte Verfahren in zwei oder mehr Verfahrensschritten durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine Lösung von MM 4550 (Komplex) in Fraktionen aufgetrennt werden, welche MM 13902 oder ein Salz davon enthalten und die bis zu ihrem Eigengewicht verunreinigt sind durch andere antibakterielle Agenzien, worauf die Fraktionen gefriergetrocknet werden können und ein Material ergeben, welches z.B. ungefähr 50 bis 60% MM 13902 oder sein Salz enthalten, worauf dieses Material chromatographiert werden kann und ein Material ergibt, welches 90 bis 100% MM 13902 oder ein Salz davon enthält.
In der vorliegenden Schrift wird der Ausdruck «MM 4550 (Komplex)» verwendet zur Beschreibung des Materials, wie es ursprünglich in dem britischen Patent Nr. 1 363 075 mit MM 4550 bezeichnet wurde. MM 4550 (Komplex), hergestellt durch Nacharbeiten der Beispiele des britischen Patents Nr. 1 363 075 ist ein unreines Material, welches in verschiedenen Anteilen Salze von MM 4550 (wie nachfolgend beschrieben) sowie Salze von MM 13902 und beträchtliche Anteile anderen Materials enthält. MM 4550 (Komplex) zeigt nicht das charakteristische Ultraviolettspektrum von MM 13902. Der Iso-Wert (wie nachfolgend definiert) von MM 4550 (Komplex), hergestellt durch Nacharbeiten der Beispiele des britischen Patents Nr. 1 363 075, liegt normalerweise unter 0,0004 ug/ml. Das Verhältnis von Salzen von MM 4550 und Salzen von MM 13902, wie es in MM 4550 (Komplex) vorliegt, ist vermutlich in hohem Grade veränderlich und hängt vermutlich von bestimmten Faktoren ab, wie vom verwendeten Stamm oder Organismus und/oder von der angewandten Isolationstechnik. Es hat sich jedoch gezeigt, dass in der Regel der Komplex mehr MM 4550 als MM 13902 enthält. Die Herstellung von MM 4550 (Komplex) wird im nachfolgenden beschrieben unter dem Abschnitt betitelt mit «Beschreibungen».
In der vorliegenden Schrift wird der Ausdruck «MM 4550» verwendet zur Beschreibung einer im wesentlichen reinen Verbindung, die ein ß-Lactamaseinhibitor ist und die gleichfalls in gewissem Ausmass antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Die Eigenschaften von MM 4550 sind im nachfolgenden beschrieben unter dem Abschnitt mit der Überschrift «Beschreibungen».
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