DE2560074C2

DE2560074C2 - Verfahren zur Gewinnung von Clavulansäure und deren Salze

Info

Publication number: DE2560074C2
Application number: DE2560074A
Authority: DE
Inventors: Martin Dorking Surrey Cole; Thomas Trevor Rudwick Sussex Howarth; Christopher Southwater Sussex Reading
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1974-04-20
Filing date: 1975-04-18
Publication date: 1985-03-28
Also published as: DK141254C; NO150838B; US4526783A; JPS533588A; NO145247C; DD121799A5; RO77320A; US4560552A; JPS533589A; SE7811200L; OA05203A; AR206627A1; NO751407L; HK54780A; LU72322A1; PH16474A; AR216430A1; NL7504621A; SE8105829L; DK141254B

Description

in der R' ein KohlenwasserstofYrest mit I bis 9 Kohlenstoffatomen 1st, der durch Halogenatome, niedermolekulare Alkoxyreste, Hydroxylgruppen oder durch in Salzform vorliegende NR²R³-Reste substituiert sein kann, wobei R² und R¹ gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome und/oder niedermolekulare Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- bis ögliedrigen Ring bilden können, oder In einen Ester der allgemeinen Formel X

CH₂OH

CO-O-CH-A₇

In der A7 ein Wasserstoffatom oder die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe und A» die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe bedeuten, überführt, den erhaltenen Ester an Kieseigel und anschließend an vernetztem Dextran oder erneut an Kieselgel als stationärer Phase und Äthylacetat, Mcthylenchlorld, Chloroform, Cyck.hexan oder ähnlichen Lösungsmitteln oder deren Gemischen als mobile Phase reinigt und anschließend den gereinigten Ester der allgemeinen Formeln V, VI oder IX in gepufferter wäßriger Lösung mit einem pH-Wert von 7 bis 7,5 hydrolysiert, oder den Ester der allgemeinen Formel X durch Hydrierung in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators in üblicher Welse spaltet und die gereinigte Clavulansäure oder das gewünschte. In üblicher Welse gebildete Salz Isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Variante a) als Lösungsmittel n-Butanol, n-Butylacetat, Äthylacetat oder Methyllsobutylketon verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Variante b) Austauscher der Handelsbezeichnung Amberllte IR4B, Zeollth FFIF, Permutlt Isopor Resin FF IP (SRA62) verwendet und mit wäßriger Natriumchloridlösung elulert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Variante c) als Lösungsmittel Methyllsobutylketon oder Trlchloräthylen verwendet, ein sekundäres oder tertiäres AmIn einsetzt. In ci;m einer de^r Substituenten einen aliphatischen Rest mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen und der andere Rest einen tertiären Alkyl rest durstellt, oder als AmIn bzw. flüssiges lonenaustauscherharz als Handelsprodukt Amberlite LA2 einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung der Clavulansäure mit Anlonenaustauschern der Handelsbezeichnung

a) Dir-Acldlte FF IP SRA 64,,Permutlt Isopor Resin FF IP (SRA 62),

b) DEAE-Cellulose,

c) Dläthylamlnoäthyl-Cellulose DE 52 oder

d) mlkrogranullerte CC 31-Cellulose

vorgenommen wird, wobei mit wäßriger Salzlösung von O bis 0,5 bzw. 0,7 molar im Fall a), mit wäßriger Salzlös'ing von O bis 0,2 molar In 0,01 Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7 be! b) bzw. 0 bis 0,1 molar bei c) elulert wird, während bei d) mit einem n-Butanol/Äthanol/Wassergemlsch Im Volumenverhältnis 4:1:5 elulert und die jeweils aktiven Fraktionen vereinigt werde;;.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Veresterung ein mit Clavulansäure beladenes Anlonenaustauscherharz der Handelsbezeichnung Amberlyst A 26 In Gegenwart vor Natrium jod Id und Dimethylformamid mit Benzylbromld behandelt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Clavulansäure, die die nachstehende Formel I besitzt:

CH₂OH

(D

10

15

25

30

35

40

•»5

50

60

CO₂H

- bzw. eines dieser Verbindungen enthaltenden Rohprodukts - und deren Salze. Clavulansäure wird bei der Kultivierung von Stereptomyces clavullgerus ATCC 27064 (DMS-738) gebildet und zeigt mlkroblclle Aktivitäten, wie später näher ausgeführt wird.

Der Mikroorganismus Streptomyccs clavullgerus Ist von lllggcns und Mitarbeitern In Int. J. Systematic Bsictcs rlology 21 (1971), S. 326, ausführlich beschrieben worden und Insofern interessant, als er bestimmte /i-Lnctani-Antlblotlka erzeugt, wie Penicillin N, 7-(5-Amlno-5-carboxyvalcramldo)-3-carbamoyloxyrnelhyl-3-ccphcm-4-carbonsäure und 7-(5-Amlno-5-carboxyvaleramldo)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäurc. Die Herstellung der vorgenannten Verbindungen wird In der Monographie »Cephalosporins and Penicillins«, herausgegeben von Edwin H. Flynn, Academic Press, N.Y./London, 1972. Selten 640 bis 643, beschrieben.

'ⁿ Danach wird das Flltrat mit den aktiven Stoffwcchselproduktcn aus der Kultlvlcrungsbrtlhe zuerst an einer Säule milt Aktivkohle, dann an einer Säule, die mit »Dowex IXI« aufgefüllt Ist und schließlich mit einer Säule mit neuer Aktivkohle chromatographisch gereinigt. Anschließend wird das Eluat gefriergetrocknet, das dann mit Methanol verrührt wird, um Unlösliches abfiltrieren zu können. In dem Flltrat wird durch Zugabe von Aceton die Aktivsubstanz ausgefällt, die nach dem Abflltrlcren getrocknet wird. Nun löst man den Feststoff In einer möglichst geringen Menge Wasser und chromatographlert die Lösung an einer SSuIc mit »Scphadcx ü-25«. Man entwickelt mit voll-cntsalztem Wasser. Die den Aktivstoff enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Im Anschluß daran findet eine weitere Chromatographie an einer Säule mit Slllcagcl statt, wobei als Elulerungsmittel ein 30prozentlges wäßriges Acetonitril dient. Nach dem Vereinigen der die Aktivsubsianzen enthaltenden Fraktionen wird das ACciüniifii abgcuärnjm und die wSßiigC Lösung gsii^rgsirocknet.

Zur Isolierung der einzelnen Antibiotika chromatographlert man an einer SSuIe mit mikrokristalliner Cellulose

und elulert mit 30prozentlgem Acetonitril. Mit Hilfe eines Bloautograms werden die einzelnen Substanzen In den Fraktionen ermittelt und entsprechend nach Vereinigen der betreffenden Fraktionen, dem Abdampfen des

Acetonitril und Gefriertrocknen Isoliert. Eine Kultur des Mikroorganismus Streptomyccs clavullgerus Ist bei der Agricultural Research Service Collec- H tion unter der Nummer NRRL 3585 und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC

27064, ferner bei der DSM (DSM-738) hinterlegt worden. Strcplomyces clavullgerus Ist auch in der US-PS 37 70 590 und In J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971), S. 2308, und In Antlmicrob. Agents Chemothcr. 1 (1972). S.

237 und 247 und In J. Antibiotics 27 (1974), S. 298, erwähnt word.*

/J-Lactamasen sind Enzyme, die den /!-Lactamrlng von Penicillinen und Cephalosporin öffnen, wobei

.wi Produkte entstehen, die keine antibakteriell Wirksamkeit mehr besitzen. Derartige F.nzymc werden von verschiedenen Bakterien erzeugt, z. B. Spezies oder Stämmen von Eschcricbia, Kclbslellc, Proteus, Pscudomonas, Enterobactcr und Staphylococcus. Diese Enzyme sind In vielen Fallen die Erklärung for eine Widerstandsfähigkeit bestimmter Stämme solcher Organismen gegenüber manchen Penicillinen und Cephalosporine^ Die Bedeutsamkeit einer /)-Lactamase-Blldung durch den betreffenden Mikroorganismus ergibt sich daraus, daß ein

¹S hoher Anteil von klinisch Isolierten phathogenen Organismen /Ϊ-Lactamasen erzeugen (vgl. z. B. M. Wilson und I. A. Freeman In Bacteriological Proceedings 80 (1969), wo In dem Aufsatz »Pencilling Inactivation by Gram· negaiivc Bacilli« die Autoren gezeigt haben, daß 84 Prozent der grarnnegaiiven Gtgsnbm&i, die in einem amerikanischen Krankenhaus Isoliert worden sind, /J-Lactamase bilden. In zahlreichen Fallen sind bestimmte Penicilline oder Cephalosporine selbst dann unwirksam bei der Behandlung von Krankheiten, die von keinen /J-Lactarnase erzeugenden Organismen ausgelöst werden, well durch einen /J-Lactamase bildenden Mikroorganismus *;lne SuperInfektion eintritt [vgl. z. B. R. May und Mitarbeiter In Brit. J. DIs. Chest. 66 (1972), S. 185]. Gemische von /NLactamase-Hemmsubstanzen mit einem lactamaseempflndllchen Penicillin oder einem Cephalosporin schützen nun vor einem Abbau durch bakterielle 0-Lactamase, so daß dadurch Ihre antibakteriell Wirksamkeit gegen zahlreiche pathogene Organismen erhalten bleibt oder gesteigert wird. Die Steigerung einer z. B. antl-

« bakteriellen Wirksamkeit nennt man Synergismus, wenn die antibakterielle Wirksamkeit des Gemisches über eine einfache Addition der Wirksamkelten der beiden Einzelsubstanzen hinausgeht. Die /i-Lactamase-Hemmsubstanz der Mischung kann daher als Synergist bezeichnet werden. Derartige Substanzen sind vorteilhaft zur Erhöhung der antibakteriell. Wirksamkeit von Penicillinen und Cephalosporin gegen roslstente Organismen. Es Ist eine Aufgabe der Erfindung, einen derartigen Synergisten bereitzustellen.

'•ο Anwendungsbeispiele von bestimmten 0-Lactamase-reslstenten halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporlnen als )S-Lactamase*Hemmstoffe und Synergisten für Penicilline und Cephalosporine sind bereits In der Literatur beschrieben worden, z. B. von Sutherland und Mitarbeiter In Nature 201 (1964), S. 868; Sabath und Mitarbeiter In Nature 204 (1964), S. 1066; O'Caliaghan und Mitarbeiter In Antlmicrob. Agents and Chemotherapy (1968), S. 67. Jedoch besitzt keine dieser bekannten Substanzen einen besonders eindrucksvollen Effekt auf das Spektrum des anderen. Im Gemisch vorliegenden ^-Lactam-Antlblotlkums.

Es sind auch einige Actlnomycetes-Stämme bekannt, die /J-Lactamase-Hemmstofle erzeugen, die mit Penicillinen oder Cephaiosporlnen synergistisch wirken, z. B. die In der GB-PS 13 63 075 und von Hata und Mitarbeitern In J. Antibiotics 25 (1972), S. 473. und Umezawa und Mitarbeitern In J. Antibiotics 26 (1973), S. 51, erwähnten Mikroorganismen. Die /f-Lactamase-Hemmstoffe von Actlnomycetcs sind jedoch bisher nicht

6» klinisch verwendbar gewesen. Besonders bemerkenswerte Merkmale, die Clavulansäure von anderen /?-Lactamase-Hemmstcffen, die von Actlnomyceten gebildet werden, unterscheiden, sind Ihre Extrahlerbarkelt In organische Lösungsmittel aus dem Nährmedium bei pH-Wert 2, Ihre hohe Stabilität In Menschenblut, Ihr breites Antibiotika-Spektrum, Ihr niedriges Molekulargewicht und Ihr hoher R/-Wert bei der Papierchromatographie bei Anwendung zahlreicher Lösungsmittelsysteme.

Es wurde nun gefunden, daß die aerobe Züchtung von Streptornycss clavullgerus In üblichen NShrmedlen bei etwa 25 bis 30° C unter annähernd neutralen Bedingungen eine /7-Lactamase-Hemmsubstanz erzeugt, die auch eine antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese neue Substanz wird als »Clavulansäure« bezeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Gewinnung der Clavulansäure der Formel I

ClI₂OIl

(I)

CC)₁H

b/w. eines diese Verbindung enlhaltcnden Rohproduktes und deren Sal/cn durch ZUchlung des Stammes Slrcplomvccs clavullgerus ATCC 27U64 (DSM-738) bei Tomperalu/en von 15 bis 40" C und einem pH-Wert von 5 bis 8,5 iicroi) auf oder In einem üblichen Nllhrmcdlum und Filtrieren des Kulturmediums, das dadurch gekennzeichnet Ist, daß man nach dem Züchten entweder

a) das C'lavulansilurckon/cntral aus dem l'Hlral des angcsilucrtcn Kiillurmcdiums mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei einem pll-Werl von 2 bis 3 extrahiert, nach Phasentrennung aus der organischen Losung In wäßrige Hlcnrbonallösung oder Kallumhydrogcnphosphat-Pufferlösung oder Calclumcarbonal-Suspenslon oder Natronlauge unter annithcrnd neutralen Bedingungen ruckexlrahlerl und das erhaltene clavulansaurchalllgc SaI/ aus der wäßrigen Losung durch Entfernen des Lösungsmittels Isoliert oder

h) das Clavulansüurckon/cnlral aus dem l'Hlral des Kulturmediums bei annithcrnd neutralem oder schwach saurem pH-Wert an ein .stark basisches oder ein schwach basisches Anloncnauslauscherhar/ adsorbiert und durch Llulcren mit einem hierfür Üblichen anorganischen SaI/ gewinnt oder

c) das ClavulanStturckon/entrat In Form eines Sal/es aus dem Flltral des Kulturmediums unter annähernd neutralen Bedingungen mit einem mil Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, In welchem ein wasserunlösliches llpophlles sekundäres oder lertlilres AmIn oder ein entsprechendes flüssiges lonenaustauschcrhar/ In der Sul/I'nrm gelost Ist. nach Phasentrennung die organische Phase mittels einer wäßrigen Salzlösung extrahiert und aus dieser witßrlgen l'hasc das betreffende rohe Clavulansüuresalz In üblicher Welse Isoliert und gegebenenfalls anschließend In an sich bekannter Welse die freie Säure oder ein SaI/ der Clavulansäure durch Anlonenauslauschchromalographlc mit oder ohne Gradlentenelutlon weiter reinigt oder das Rohprodukt oder Konzentrat der filtrierten Kulturbrühe oder aber das an ein polymeres mukrorcilkularcs Trägermaterial, welches die Anwendung von nlchtwaßrlgen Lösungsmlttelsyslemen gestattet, gebundene Clavulansaurcsal/ In an sich bekannter Welse mit einem üblichen Veresterungsmlttcl In einen F.sier der allgemeinen Formel V oder Vl

CIIjOH

(V)

C-X-CO-A₃

C H;OI 1

(VI)

In denen Ai ein Wasscrstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die Phenylgruppe, die durch ein Fluor- oder Chloralom oder die Methyl- oder Methoxygruppe substituiert sein kann, die Naphlhylgruppe oder einen durch cine Phenyl- oder Naphthylgruppe substituierter Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und A₂ ein Wasserstoffatom oder die Melhylgruppe bedeuten, Aj die gleiche Bedeutung wie Ai, Wasserstoffatom ausgenommen, besitzt. X und Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome darstellen und Z eine der Gruppen -CH₂-CH₂-. -CH=CH-,

50

darstellt, oder In einen lister der allgemeinen Formel IX

(IX)

In der R' ein Kohlenwassersioffresl mit I bis 9 Kohlenstoffatomen lsi, der durch Halogenatome, niedermolekulare Alkoxyreste, Hydroxylgruppen oder durch In Salzform vorliegende NR²R'-Reste substituiert sein kann, wobei R² und 8^J gleich oder verschieden sind und Wassersloffatome und/oder niedermolekulare Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- bis 6gllcdrlgcn Ring bilden können, oder In einen Ester der allgemeinen Formel X

CH₂OH

(X; CO-O-CM-A₇

In der A; ein Wasserstoffatom oder die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphcnyl- oder Mclhoxyphenylgruppc und A, die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppc bedeuten, überführt, den erhaltenen Ester an Kieselgel und anschließend an vemeiziem Dextran oder erneut an Kieselgel als stationärer Phase und Äthylacetat, Methylenchlorid. Chloroform, Cyclohexan oder ahnlichen Lösungsmitteln oder deren Gemischen als mobile Phase reinigt und anschließend den gereinigten Ester der allgemeinen Formeln V, VI oder IX In gepufferter wllQrlger Lösung mit einem pH-Wert von 7 bis 7,5 hydrollslert. oder den Ester der allgemeinen Formeln X durch Hydrierung In Gegenwart eines Übcrgangsmctallküialysaiors In üblicherweise spaltet und die gereinigte Clavulansäure oder das gewünschte. In üblicherweise gebildete Salz Isoliert.

Clavulansäure hat folgende Eigenschaften:

(a) sie Ist eine Carbonsaure;

(b) sie bildet ein Natriumsalz, das ein charakteristisches Infrarot-Spektrum besitzt, wie as Im wesentlichen aus der FI g. I hervorgeht;

ic) sie vermag das Wachstum von Staphylococcus aureus-SiSrnrncn zu hcnirncn;

(d) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber /M.actamase erzeugenden Stammen von Escherlchia coil, Klebslella acrogcncs und Staphylococcus aurcus SynergistIsch beeinflussen;

(e) sie kann die anilbakterlelle Wirksamkell von Cephaloridin gegenüber /i-l.aclama.se erzeugenden Stammen von Proteus mlrabllls und Staphylococcus aurcus synerglsllsch beeinflussen; und

(D sie bildet einen Melhylester, der aufgrund der Massenspckiroskoplc ein Molekulargewicht von 213,0635 entsprechend der Formel CH11 NO« besitzt.

Die Clavulansäure kann als einwertige Carbonsäure der Formel C.lUNO» betrachtet werden, die in Form des Natriumsalzes ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum besitzt, das dem In Flg. I gezeigten entspricht.

Die von Strcpiomyecs clavullgcrus erzeugte Verbindung mit den vorgenannten higensehaflen besitzt die Formel

Die Clavulansäure kann daher als 3-(/Mlydroxyathyllden)-7-oxo-4-oxa-l-azabIcyclo|3,2,0|hcplan-2-carbonsäure bezeichnet werden.

In stereochemischer Hinsicht sind die Kohlcnstoffatome In 2- und 5-Stellung der Clavulansäure gleich wie bei den natürlich vorkommenden Penicillinen und Ccphalosporlnen, so daß die Clavulansäure durch die nachstehende Slereoformel ilar^eslcHt werden kann:

CH₂OH

CO₂H

Deshalb Ist die vollständige chemische Bezeichnung für Clavulansäure Z-(2R,5R)-3-(ß-Hydroxyäthyllden)-7-oxo^-oxu-l-azablcycloU^.Ol-heptiin^-carbonsaure.

Die hervorragende Brauchbarkelt der Clavulansäure zeigt sich darin, daß bestimmte Stämme von Klebslella aerogencs Λ. deren Wachstum durch die Anwesenheit von 125 μg/ml Ampicillin, Amoxyclllln, Carbenclllln oder Benzylpenicillin oder durch die Anwesenheit von 10 pg/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorhandensein von unter 12,5 ug/ml der vorerwähnten Penicilline jedoch gehemmt werden, wenn gle.crueltlg 5 Hg/ml Clavulansäure vorhanden sind.

Stämme von Staphylococcus aureus Russell, deren Wachstum durch die Gegenwart von 100 pg/ml Ampicillin oder durch 5 μg/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, werden durch Konzentrationen von unter 10 μg/ml Ampicillin In Gegenwart von 1 μg/ml Clavulansäure gehemmt. Bei Untersuchungen an weiblichen Mäusen wurde festgestellt, daß beträchtlich Ober 5 Mg/m! liegende Mengen an Clavulansäure Im Blut und Gewebe durch eine subcutante Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erreicht werden können und daß therapeutisch ausreichende Mengen an Clavulansäure nach oraler Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erhalten werden können.

c < υ

Antlbukterlelles Spektrum der Clavulansäure und deren Natriumsalz

Die antibakteriell Wirksamkeit des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie es nach Beispiel 20 erhältlich Ist, iimj Her Clavulansäure gegenüber einer Reihe von Bakterien wird unter Anwendung der Mlkrotlter-Methode bestimmt. Rjlhenvcrdünnungen der Clavulansäure und des Natriumsalzes der Clavulansäure In einer Empfind- ^o Ik-hkelts-Tf.-Jboulllon, die In einer Mlkruilter-Kunststoffkuvette enthalten Ist, werden mit einer über Nacht bebrüteten Kulturlösung des jeweiligen Mikroorganismus beimpft, so daß die Endverdünnung des Impfstoffes 0,5 χ 10 ⁴ beträgt. Die Kulturen werden über Nacht bebrütet. Am nächsten Morgen werden die Punkte des bakteriellen Wachstums durch Beobachtung der Eintrübung der Kulturlösung beobachtet. Die Ergebnissse, ausgedrückt als angenäherte Mlndcst-Hemmkonzentratlonswerte In Mg/ml, sind In der Tabelle I aufgeführt, die 2S auch zeigt, daß die Verbindungen ein breites Spektrum hinsichtlich der antibakteriell Wirksamkeit besitzen.

Tubelie I

Antibakteriell S.iektrum des Natriumsalzes der Clavulansäure und der „ Clavulansäure

BakteriensUimm	minimale Hemmkonzentrution,	Clavulansäure
	Mg/ml
	Na-SaIz der	12,5
	Clavulansäure	12,5
Staphylococcus aureus (Oxford ii)	7,5	25
Staphylococcus uureus (Russcli)	7,5	250
Bacillus sublilis ATCC 6633	62	25
Streptococcus faecal is	>500	50
Streptococcus pyogenes CN 10	125	50
Escherichia coli NCTC 10418	31	-
Klebsieila aerogenes A	31-62	125
Klebsieila oxytocum	62	-
Enterobacter aerogenes T 624 bzw. T 765	31	-
Enterobacter cloacae N1	62	125
Acinetobacter anitratus	125	125
Providentia stuartii T 946	125	125
Serratia. marcescens US 32	125	125
Proteus mirabilis C 977	62	50
Proteus vulgaris W 090	31	50
Salmonella typhimurium	31	125
Shigella sonnei A	62
Pseudomonus aeruginosa NCTC 10662	500

/i-Lactamase-Hemmung durch das Natriumsalz der Clavulansäure

Clavulansäure hemmt fortschreitend und Irreversibel die /J-Lactamase von Escherichia coil. Die Methode des »Versuchs Nr. 1« zeigt, daß andere. In Tabelle II aufgeführte /J-Lactamasen ebenfalls durch Clavulansäure gehemmt werden.

IO

Tabelle II

Hemmung der /5-Lactamasen durch Clavulansäure

Quelle der /f-Lactamase

ungefährer Iso-Wert im Verhältnis zu Escherichia coli JT4= 1

Staphylococcus aureus (Russell) 1,0

Escherichia coli JT 4 1,0

Escherichia coli B 11 2,0

Klebsieila aerogenes A 0,6

Pseudomonas aeruginosa 1822 5,0 (R-Faktor)

Pseudomonas dalgleish OJ

S- Mit Penicillin G ais Substrat beirägi tier L₅₀-WeH des NairiünisaizcS der Clavulansäure gegenüber der ß-Lactamase von Staphylococcus aureus Russell annähernd 0,06 pg/ml.

Ein Vergleich zu Penicillin G mit vielen handelsablichen Cephalosporlnen gegenüber /J-Lactamase findet sich zum Beispiel In Tabelle 1 auf Seite 491 Im »Journal of Infectious Diseases« 137 (1978).

Tabelle III

- Minimale Hemmkonzentration (μg/ml) (jeweils angegeben die Menge an Ampicillin bzw. Na-SaIz in der unteisuchten Mischung; obere Zahl: Ampicillin, untere Zahl: Na-SaIz)

30

35

40

45

Stamm

Ampicillin Natrium- Ampicillin-Natriumclavulanat Cclazolin*)

clavulanat Verhältnis Verhältnis Verhältnis Verhältnis Verhältnis 10:1 3:1 1:1 1:3 I :

60

E. coli JT 39	640	20	6,25/0,6	4/1,25	2,5/2,5	1,25/4	1,25/12,5	2,5
E. coli JT 68	> 1280	20	25/2,5	8/2,5	5/5	2,5/8	1,25/12,5	5
E. coli JT 98	1280	20	12,5/1,25	8/2,5	5/5	2,5/8	1,25/12,5	5
E. coli E 112	1280	20	12,5/1,25	8/2,5	2,5/2,5	2,5/8	1,25/12,5	5
E. coli E 45	> 1280	20	50/5	30/10	10/10	5/15	1,25/12,5	40
Kleb. A	160	40	3,1/0,3	2/0,6	1,25/1,25	0,6/2	0,6/6	2,5
Kleb. E 70	320	20	6,25/0,6	4/1,25	2,5/2,5	2,5/8	1,25/12,5	5
Kleb. 62	640	160	6,25/0,6	2/0,6	1,25/1,25	1,25/4	1,25/12,5	2JS
Kleb. 9909	> 1280	20	12,5/1,25	8/2,5	5/5	2.5/8	1,25/12,5	40
Kleb. Ba 95	> 1280	20	50/5	30/10	10/10	5/15	2,5/25	80
Kleb. 11974	> 1280	40	25/2,5	15/5	10/10	5/15	1,25/12,5	20
Proteus Q 3618	320	640	6,25/0,6	4/1,25	2,5/2,5	1,25/4	2,5/25	640
Proteus Q 2879	> 1280	80	12,5/1,25	8/2,5	5/5	2,5/8	1,25/12,5	10
Proteus C 889	320	640	6,25/0,6	4/1,25	2,5/2,5	1,25/4	2,5/25	320
Proteus W 090	640	20	12,5/1,25	4/1,25	2,5/25	1,25/4	1,25/12,5	320
Staph. H	320	10	3,1/0.3	2/0,6	1,25/1,25	0,6/2	0,3/3	S \|,25
Staph. Russell	640	<5	3,1/0,3	1/0,3	0,6/0,6	0,6/2	0,3/3	S 1,25
Staph. Nobel	160	10	3,1/0,3	1/0,3	0,6/0.6	0,6/2	0,3/3	S 1,25
Staph, T 18	320	=i5	1,5/0,15	1/0,3	0,6/0,6	0,3/1	0,15/1,5	S 1,25
Staph. C 444	160	10	1,5/0,15	1/0,3	0,6/0.6	0,6/2	0.3/3	S 1,25

') 7-|l-(IHl-Telra7.olyl;KCIamidoh3-|2-(5-mclhyl-l..'.4-lhiiiiliiizi)lyl)-lhii)niclhyl|-.l-cc|ihcm-4-ciirh<)n%äiirc

Antibakteriell Synergismus zwischen Ampicillin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Die Mlndest-Hemmkonzentratloncn von Ampicillin, von dem Nalrlumsalz der ClavuliinsJlurc und von Ampicillin In Gegenwart von I Mg/ml des Notrlumsalzcs der Clavulansäure werden bei einer Reihe von /l-l.acliimascerzeugenden Bakterien bestimmt. Die Organismen werden In eine limpflndllchkcIts-TcslflUssIgkell ubcrlmpfl.

die sich In kleinen Löchern In einer Plastlkcuvette befinden und die unterschiedliche Konzentrationsgradienten von einmal Ampicillin, zum anderen von dem Natriumsalz der Clavulansäure und zum dritten von Ampicillin plus 1 μ§/ΐη1 des Natriumsalzes der Clavulansäure (Mlkrotiler-Methode) enthalten. Die Endverdünnung des Impfstoffes beträgt 0,5 χ ΙΟ-². Die Cuvette wird bei 37° C über Nacht bebrütet. Eine Aufzeichnung der Endpunkte des bakteriellen Wachstums wird am nächsten Morgen vorgenommen. Die Mlndest-Hemmkonzeniratlonswerte in μg/ml sind in der Tabelle IV verzeichnet, die auch aufzeigt, daß der Synergismus bei der niedrigen Konzentration von 1 ng/ml In bemerkenswerter Welse die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber bestimmten grampositiven und gramnegativen Bakterien steigert. Der Mechanismus dieses Synergismus besteht wahrscheinlich darin, die Hemmung der Amplclllln-zerstorenden /}-Lactamase-Enzyme nach sich zu ziehen, doch kann die Existenz anderer Mechanismen nicht ausgeschlossen werden.

Ähnliche Ergebnisse wie die in Tabelle VI angegebenen werden erhalten, wenn man Ampicillin durch Amoxyclllln oder durch den Phthalldylester des Amplcllllns ersetzt.

Tabelle IV

Antibaktericllcr Synergismus /.wischen Ampicillin und dem Natri-amsalz der Clavulansäure

Baktcricn.sUimm Mindest! lcmmkonzentrationen - ng/ml Natriumsal/ der Ampicillin Ampicillin in

x^iäVüiaitSSürC wCgCHiVuri VCii

1 ug/ml Natriumsalz der Clavulansäure

Escherichia coli NCTC 10418	31	1,8	<0,4
Escherichia coli B 11	62	>500	125
Klebsieila acrogencs A	31	125	<0,4
Klcbsiclla sp 62	31	125	<0,4
Enterobacter cloacae	62	250	62
Scrratia marcesccns	125	>500	62
Staphylococcus aureus (Russell)	15	500	<0,4
Staphylococcus aureus	62	250	7,5

Antibaktericllcr Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Die Mlndest-Hemmkonzentrailoncn von Cephaloridin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Cephaloridin In Gegenwart von 5ug/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure werden nach dem vor Tabelle IV beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse In Tabelle V zeigen, daß ein Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und Cephaloridin erhalten werden kann. Insbesondere beim /?-Lactamase-erzeugenden Stamm von Staphylococcus aureus (Russell).

Tabelle V

Antibakteriell·^ Synergismus /wischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

liaklcricnslunim

Mindosl-llcnimkon/enlrationcn - μg/ml

Natriumsal/. der Ccphalo- Cephaloridin in
Clavulansäure ridin Gegenwart von

5 μg/ml Natriumsalz
der Clavulansäure

l'roteus mirabilis 8W > 500 *)

Staphylococcus aureus (Russell) 15 Staphylococcus aureus 62

62
3,1
15

7,5

<0,03**)
3,7

*) Knilpiinkl
") Der gleiche Wen wiril erhallen, wenn I |ig/ml anslall 5 Mg/ml Synergist zugegeben wird.

Antibakteriell Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen

/- 65

Die In Tabelle Vl angegebenen Ergebnisse werden nach dem vor der Tabelle IV angegebenen Verfahren erhalten.

Tabelle VI

Antibakteriellcr Synergismus /wischen dem Nalriumsal/. der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen gegenüber Stämmen von Klcbsiella aerogencs

Stamm Amoxycillin Carbenicillin*) Benzylpenicillin

allein +5 (ig/ml allein 1-5 Hg/ml allein <5|ig/ml

Synergist Synergist Synergist

A 500 0,97 500 7,8 250 7,8

"' E 70 500 3,9 500 15 500 15,6

62 250 15.6 125 7,8 250 15,6

·) Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn Carbenicillin durch den Fnenyl-a-cstcr des Carbenicillin oder durch Ticarcillin ersetzt wird.

Salze der Clavulansäure sind die pharmakologlsch verträglichen Salze, wie das Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und das Ammoniumsalz, ferner substituierte Ammoniumsalze, wie das Trlmethylammoniumsalz, sowie weiterhin Benzathln-, Proceln- und ähnliche Salze, wie sie üblicherweise mit Penicillinen oder Ceprua'ssporlnen gebildet wenden. Pharmakologlsch nicht verträgliche Salze der Clavulansäure gehören

J₀ ;_ri30.»_cj. _ZUS! Gegenstand vorliegender Erfindung, daß sie wertvolle Zwischenprodukte bei der Herstellung von Estern der Clavulansäure sind. Zum Beispiel kann das Lithium- oder das Silbersalz der Clavulansäure mit Benzylbromld unter Bildung des wertvollen Benzylesters der Clavulansäure umgesetzt werden.

Die Salze der Clavulansäure sind gewöhnlich stabiler als die freie Saure und werden daher bevorzugt hergestellt. Besonders bevorzugte Salze der Clavulansäure sind das Natrium- und das Kaliumsalz der nachstehenden

ο Formet

CH₂OH

N-

O CO₁Na Ö CO₂K

Kristalline Formen derartiger Salze können Hydratwasser enthalten.
Beim erfindungsgemäßen Vtilahren wird der Stamm Slereptomyces clavullgerus ATCC 27064 (DSM-738) verwendet.

Das aerobe Wachstum kann auf einem Testen oder halbfesten Nährmedium oder In einem flüssigen Nährmedium auf einer aeroben Oberfläche oder mittels einer Submers-Kultur In Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff- und* Stickstoffquellen und Mineralsalzen stattfinden. In dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Nährmedium kann aus kompletten natürlichen Nährstoffen zusammengesetzt sein oder aus chemisch deftnlerten ElnzelstolTen bestehen. Es wurde diesseits gefunden, daß Medien mit komplexen Nährstoffen, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, besonders geeignet sind.

Die Nährmedlen, die zum Kultivieren von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064 verwendet werden können, können 0,1 bis 10 Prozent einer komplexen organischen Stlckstoffqucllc, wie Heieextrakt, M aisquell wasser, pflanzliches Protein, Saatprotein, Hydrolysale derartiger Proteine, Mllchprolcln-Hydrolysate, Fisch- und Flelschextrakte und Hydrolysate derartiger Peptone enthalten. Gegebenenfalls können chemisch definierte SUckstoff-• quellen, wie Harnstoff, Amide, einzelne oder Gemische von gewöhnlichen Aminosäuren, z. B. Valin, Asparaginsäure, Glutaminsäure. Prolin und Phenylalanin, eingesetzt werden. Kohlenhydrate In einer Menge von 0.1 bis 5 Prozent können In Nährmedien vorliegen, doch Ist Glukose In bestimmten Medien unerwünscht, da sie eine nachteilige Wirkung auf die Ausbeute der erwünschte Clavulansäure hat. Stärke oder Stärkehydrolysate, wie Dextrine, Saccharose, Lactose oder andere Zucker oder Glycerin oder Glycerlncster können ebenfalls eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann sich auch von pflanzlichen ölen oder tierischen Pellen ableiten. Carbonsäuren und Ihre Salze können als Kohlenstofiquelle für das Wachstum und die Erzeugung des /J-Lactamase-Hemmstoffs eingesetzt werden. Ein besonders geeignetes Medium, das preiswert Ist, enthält Sojabohenmehl. das unter dem Warenzeichen »Arkasoy« im Handel lsi, zusammen mit Malzdestlllat-Trockensafl, der unter dem Warcnzeichen »Scotasol« Im Handel Ist, sowie Dextrin.

Der Zusatz von Antischaummittel, wie Polyoxyalkylenderlvate von Propylenglykol, wie das unter dem Warenzeichen »Pluronlc L 81« bekannte Produkt, können zur Steuerung des Schäumens von bestimmten Medien Im Fermenter erforderlich sein.

Mineralsalze, wie NaCI, KCI, MgCI₂, ZnCI₁, FeCIj. Na₁SO₁, FeSO₄, MgSO₄ und Natrium- oder Kailumsalze w der Phosphorsäure können den vorgenannten Medien zugegeben werden, Insbesondere wenn sie chemisch definiert sind. CaCO. kann als Quelle für Ciilclumlonen oder zu Pufferungszwecken zugesetzt werden. Salze von Spurenelementen wie Nickel, Koball oder Mangan, können ebenfalls mil clngescl/.l werden. Vitamine kann man gegebenenfalls ebenfalls zusetzen.

Das Züchten von Strcpiomyces clavullgcru.s ATCC 27064 (DSM-738) rindet normalerweise bei Temperaturen (.5 von 15 bis 4O⁰C, gewöhnlich 20 bis 35" C und vorzugsweise 25 bis 30⁵C und bei einem pll-Wert von 5 bis 8.5, vorzugsweise von 6 bis 7,5, statt.

Der Stamm Streptomyces clavullgerus ATCC 27064 (DSM-738) kann In den oben gcnannien Medien In belüfteten konischen Glasflaschen durch Schütteln auf einem Drehschütllcr oder In mil Prallblechen ausgerüsteten

und mil Schelbenkrclselmlschern gerührten und mittels Zersläubereinrichtungen belüfteten Züchtungsgefäßen aus rostfreiem Stahl gezüchtet werden. Die Fermentation kann auch kontinuierlich durchgeführt werden,

Der Ausgangs-pH-Wert der Fermentation 1st 7,0. Die höchste Ausbeute an Clavulansäure erhält man In 2 bis 10 Tagen bei einer Temperatur von 20 bis 35° C. In einem RQhrzüchtungsgefäß aus rostfreiem Stahl unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Mediums mit Sojabohnenmehl, Malzdestlllat-Trockensaft und s Dextrin beträgt die bevorzugte Temperatur 26* C. Das Maximum an Clavulansäure wird Innerhalb 5 Tagen erhalten.

Die Clavulansäure kann aus dem Flltrat der Nährbouillon auf die verschiedensten Welsen extrahiert werden. Die LösungsmUiel-Extraktlon aus dem kalten, auf saure pH-Werte eingestellten Filtrat einerseits und die sich auf die anionische Natur der Stoffwechselprodukte beziehende Verfahren, wie die Verwendung von Anionehaustauscherharzen, andererseits haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Zellen des Streptomyces clavullgerus wenden normalerweise zuerst aus dem Züchtungsmedium durch Abfiltrieren oder Zentrifugleren entfernt, bevor man mit der Extraktion beginnt.

Beim Lösungsmittelextraktionsverfahren kühlt man das Filtrat der Nährboullloh und setzt durch Zugabe von Säuren den pH-Wert auf einen Bereich von 2 bis 3 herab, währenddessen das Flltrat gründlich mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Losungsmittel vermischt wird, wie n-Bütatylacelat, Methytlsobutyiketon, n-Butanol oder Äthylacetai. Die zur Herabsetzung des pH-Wfertes des Mediums verwendete Säure ISt jliwormllch eine Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder dergleichen. n-Butanol Ist ein besonders geeignetes Lösungsmittel zum Einsatz bei der Extraktion des angesäuerten Nährbouillon-Filtrats. Nach der Abtrennung der Phasen durch Zentrifugieren wird das die /J-LactamarjMnhlblerende 2b Stoffwechsetprodukt aus dem Lösungsmittel in wSßrigcr Bicarbonatlösung oder Kaüumhydrogenphosphat- _

Pufferlösung, Calciumcarbonat-Suspenslon ocür Wasser rückextrahiert, währenddessen der pH-Wert annähernd neutral gehalten wird. z. B. bei pH 7,0. Dieser wäßrige Extrakt nach der Trennung der Phasen kann unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet werden, um rln Rohprodukt eines Salzes der Clavulansäure zu erhalten. Dieses Rohprodukt Ist stabil, wenn es Im trockenen Zustand bei - 20° C gelagert wird. Ü

Bei dem Anionenaustauscherharz-Verfahren wird das geklärte Filtrat der Nährbouillon bei einem annähernd neutralen oder schwachsauren pH-Wert, z. B. bei pH 6 bis 7, durch eine Säule mit einem schwach- oder stark basischen Anionenaustauscherharz, wie »Amberllte 1R4B« oder »Zeollt FFIF«, durchlaufen gelassen, bis das Harz gesättigt 1st und die /i-Lactamase-hemme.ide Substanz am FuB der Säule austritt. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen und mit wäßriger Natriumchloridlösung elulert. Die /3-Lactamase-hemmenden Fraktionen » werden gesammelt, vereinigt, entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält ein festes Rohsalz der Clavulansäure.

Eine Alternative des Extrakilonsverfahrens besteht In einem In-Berührung-Brlngen des Filtrats der Nährbouillon - gewöhnlich bei annähernd neutralem pH-Wert -, das ein Salz der Clavulansäure enthält, mit einer organischen Phase, in der ein wasserunlösliches sekundäres oder tertiäres AmIn gelöst lsi. Beispiele geeigneter organischer Lösungsmittel sind die üblichen, mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungsmittel, wie Methyl-Isobutylketor oder Trichlorethylen. Beispiele geeigneter Amine sind solche. In denen einer der Substltuenten ein langkeitigcr allphatlschcr Rest, z. B. mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, und der andere Rest ein tertiärer Alkylrest Ist. so daß das Molekül llpophll 1st. Es Ist festgestellt worden, daß »Amberllte LA2« sich als erfolgreiches AmIn erwiesen hat. Üblicherweise wird das Amin als Säureadditionssalz eingesetzt.

Nach diesem Extraktionsverfahren liegt die Clavulansäure In der organischen Phase als Amfnsalz vor. Die organische Phase wird dann von dem Flltrai der Nährbouillon abgetrennt. Die Clavulansäure kann In die wäßrige Phase mittels einer Salzlösung, vorzugsweise einer konzentrierten Lösung von Natriumchlorid oder Natriumnitrat zurückcxtrahlcrt werden. Das rohe Salz der Clavulansäure kann beispielsweise durch Gefriertrocknen erhalten werden.

Weitere Grundverfahren zur Isolierung, die angewendet werden können, umfassen übliche Verfahren, wie die Adsorption an Aktivkohle. lonenpaar-Extraktlon, Ausfällen, Aussalzen und Molekularflltratlon, doch sind diese Verfahren gewöhnlich nicht so erfolgreich wie die zuvor beschriebenen Verfahren, die deshalb bevorzugt sind.

Eine weitere Reinigung der festen, nach den vorgenannten Verfahren erhaltenen Salze kann mittels zahlreicher Methoden erreicht werden, doch Ist die !onerwustausch-Säulenchromatographle besonders geeignet. Insbesondere unter Verwendung von »Isopor«, »De-Acldlte FFIP SRA64« oder »DEAE-Cellulose«. Die »De-Acldlte«-SAule wird nache'nander mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid, von 0- bis 0,5-molar elulert. Die Säule von »DEAE-Cellulose« In einer 0,01 m Phosphatpufferlösuns vom pH 7 wird mit einer Salzlösung, normalerweise einer Natriumchloridlösung von 9 bis 0,?. m-Nairiumchlorld In 0,01 m-Phosphatpufferlösung vom pH 7, elulcrt. Die aktiven Fraktionen können durch Ihre /i-Lactamase-Hemmwlrkung und Ihre antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Klcbslella aerogenes beim Agardlffusiunsversuch festgestellt werden, J3 Die die Masse dieser Aktivität enthaltenen Fraktionen werden dann vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt von einem Ciavulansäuresaiz wird zum Entsalzen durch eine Säule von »Blogel P2« durchlaufen gelassen. Die aktive entsalzte Substanz wird dann eingeengt, mit Äthanol vermischt und nochmals an einer Cellulosesaule unter Verwendung eines Gemisches von Butanol, Äthanol und Wasser Im Volumenverhältnis 4 :1 :5 In der oberen Phase als Lösungsmittel Chromatographien. <*

Die Fraktionen, die die Hscherlchla colN/J-Lactamase Inhibierende Substanz enthalten, werden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. In Wasser wieder aufgelöst und gefriergetrocknet. Man erhalt das Salz der Clavulansäure als weißen Feststoff.

Die Verfahren, die crflndungsgemäß bei der Feststellung der Clavulansäure In den Flltraten der Nährbouillon am besten geeignet sind, sind die Papicrchrorr.atographie und das bloautographlsche Bestimmungssystem. Die « Clavulansäure kann iia-,lurch geprüft werden, daß von Ihrer /i-Lactamase-Hemmwlrkung Gebrauch gemacht wird. Die Dünnschlcht-Chromatographle kann angewendet werden, um die Clavulansäure In festen Zubereitungen festzustellen. Diese Bcstimmungs- und Versuchsverfahren werden nachstehend beschrieben.

Eine Abwandlung des Verfahrens zur Herstellung der reinen Clavulansäure oder Ihrer Salze besteht In der Isolierung einer unreinen Clavulansäure oder Ihres Salzes, Herstellen eines Esters der CliivulunsAurc In üblicher Welse, Reinigen des Esters und anschließendes Wiedergewinnen der Clavulansäure oder deren ShIz »us dem Ester.

Die bei diesem Verfahren verunreinigte Clavulansäure oder Ihr SaI/. cnlhaii üblicherweise mindestens I Gewichtsprozent des Antibiotikums.

Geeignete Ester zur Verwendung bei diesem Verfahren sind solche, die durch Hydrogenolyse oder durch eine Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen gespalten werden können.

Leicht hydrolyslerbare Ester, die mittels milder alkalischer Hydrolyse, z. B. bei pH 7,5, In Salze der Clavulansäure umgewandelt werden können, sind die Ester der allgemeinen Formeln V und Vl,

CH₂OH

CO Ϊ¹

\q — C-X — CO — A₁

20 25 .10

CHjOH

40 45

In denen Ai ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die Phcnylgruppe, die durch ein Fluor- oder Chloratom oder die Methyl- oder Methoxygruppe substituiert sein kann, die Naphthylgruppc oder ein durch sins Phenyl- oder Naphthyigruppe substituierter Alkylrest mit I bis 6 Kohlenstoffatomen und Aj ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeuten, Aj die gleiche Bedeutung wie Ai, Wasserstoffatom ausgenommen, besitzt, X und Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome darstellen und Z dnc der Gruppen

— CH₂CHj- . — CH : CH-

60 65

darstellt.

Als Reste A₁ kommen beispielsweise die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Benzyl- oder die Phenylgruppe In Betracht.

Besonders zweckmäßige Ester der allgemeinen Formeln V und VI sind diejenigen. In denen Ai ein Vasserstoffatom oder die Methylgruppe, A₂ ein Wasserstoffatom, A₁ die Methyl-, tcrt.-Butyl- oder die Phenylgruppe und bei der Formel VI X und Y Sauerstoffatome und Z einen der Reste

oder

OCH₃

bedeuten.

Zahlreiche Ester der Clavulansäure unterscheiden sich von analogen Estern von Penicillinen oder Cephalosportnen darin, daß sie unter milden Bedingungen eine erhöhte Bereitschaft zur Hydrolyse zu Clavulansäure zeigen. So hydrolysleren z. B. einfache Alkylester, wie der Melhylcster, langsam auf pH 7 gepuffertem Wasser zu Clavulansäure. Ester, die schon unter milden Bedingungen In gewissem Grad eine Hydrolyse erleiden, sind solche der allgemeinen Forme! IX:

12

(IX) CO₂R¹

In du, R¹ ein Kohlenwassersioffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen lsi, der durch Halogenalome, niedermolekulare Alkoxyrestc, Hydroxylgruppen oder durch In Salzform vorliegende NR¹R'-Reste substituiert sein kann, wobei R² und R¹ gleich oder verschieden sind und Wasscrstoffaiome und/oder niedermolekulare Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder oglledrlgen Ring bilden können.

Geeignete Beispiele für Kohlenwasserstoffreste für R¹ sind Alkyl- und Aralkylreste mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen, substituiert durch Mcthoxygruppen oder durch die In Salzform vorliegenden NR²R'-Reste, wobei R¹ der Methyl- oder Äthylrest und R¹ der Methyl- oder Alhylresl Ist oder mit dem Rest R¹ unter Einschluß des Stlcksioffatoms zu einem Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morphollnrest verbunden Ist. is

Die zweckmäßigsten Alkylreste für R¹ sind gcradkctllge Reste mit I bis 6 Kohlenstoffatomen, die durch eine Methoxy- oder eine Hydroxylgruppe, einen In Salzform vorliegenden NR'R'-Rest oder ein Chlor-, gram- oder Jodatom substituiert sein können.

Am zweckmäßigsten Ist natürlich ein Ester, der durch Hydrierung spaiibar isi. Eine geeignete Gruppe von bei diesem Verfahren verwendeten Estern besitzt die nachstehende Formel X:

/CH₂OH

I (X)

s~ ^N A

O CO — O — CH-A₇

A,

in der A₇ ein WasscrstolTatom oder die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphcnyl- oder Methoxyphenylgruppe und Ai die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphcnyl- oder Methoxyphenylgruppe bedeuten.

Vorzugswelse 1st A? ein Wasserstoffatom und Α» die Phenylgruppe.

Die Ester der allgemeine Formel X können durch Hydrogenolyse gespalten werden, wodurch man die Clavulansäure oder ihr Salz erhalt. 3S

Im allgemeinen Ist die Art eines Substltuenten Im Esterrest ohne Bedeutung, solange er nicht bei der Spaltung durch Hydrierung stört.

Die verunreinigte Form der Clavulansäure oder deren Salz, die nach diesem Verfahren gereinigt werden muß, kann in Form eines Feststoffes oder einer Lösung vorliegen, und zwar gewöhnlich auch mit einem Gehalt von beträchtlichen Mengen anorganischer oder organischer Verunreinigungen. «

Die Clavulansäure oder deren Salz kann In einen Ester durch die nachstehend beschriebenen Veresterungsreaktloncn In üblicher Welse umgewandelt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Bildung eines erwünschten Esters der Clavulansäure besteht In der Reaktion eines Slazes der Clavulansäure mit einem Veresterungsmittel, wie einem reaktionsfähigen Halogenid, einem Sulfonatester oder dergleichen, wie nachstehend beschrieben wird. Derartige Reaktionen werden häufig In einem organischen Lösungsmittel mit einer hohen Dlelektrlzltätskonstanten durchgeführt, wie Dimethylformamid, einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton. In Dlmethylsulfoxld, N-Methylacetamld oder Hcxamcihylphosphoramld.

Gegebenenfalls kann das Salz der Clavulansäure in üblicher Welse In dem Lösungsmittel gelöst oder es kann an ein polymeres Tragermaterial gebunden werden. Geeignete Trügermaterialien zur Verwendung bei diesem Verfahren umfassen stark basische Anlonenauslauscherharzc, Insbesondere solche von makroretlkularer Natur, -° die die Anwendung von nlcht-wäßrlgen Lösungsmittelsystem gestalten. Es Ist gefunden worden, daß für diesen Zweck »Amberlyst A26« geeignet Ist. Das Clavulansauresalz kann an das Harz aus dem Fllirat der Nährlösung adsorbiert werden. Danach kann das Harz In Dimethylformamid mit einem Gehalt an Natriumiodid suspendiert oder gegebenenfalls In der Säule mit einer Lösung von Natriumiodid In Dimethylformamid oder In einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton elulert werden.

Einmal gebildet, wird der verunreinigte Ester der Clavulansäure chromatographisch gereinigt. Bei derartigen Verfahrensschrltten wird der Ester üblicherweise In einem organischen Lösungsmittel gelöst, wie Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Cyclohexan oder ähnlichen Lösungsmitteln. Die bei dem Chromatograph Ischen Verfahren verwendete stationäre Phase Ist normalerweise eine inerte Substanz, wie Slllkagel oder ähnliche, für chromatographische Zwecke geeignete Substanzen. ^M

Die aus der Säule austretenden Fraktionen können auf Ihren Gehalt an Clavulansäure untersucht werden. Indem von synergistischen Eigenschaften Gebrauch gemacht wird. Normalerweise vereinigt man die aktiven Fraktionen und dampft das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab.

Der bei diesem Verfahren erhaltene Ester weist gewöhnlich eine annehmbare Reinheit auf, doch kann die Substanz gegebenenfalls nochmals Chromatographien werden. ⁶-

Der gereinigte Ester der Clavulansäure kann in Clavulansäure oder deren Salz nach dem vorherbeschriebenen Verfahren umgewandelt werden.

Ein besonders zweckmäßiges Verfahren, um Clavulansäure oder deren Salz zu erhalten, ist die Hydrierung

einer Verbindung der allgemeinen Formel X, wie es zuvor angegeben worden Ist. Derartige Reaktionen finden Üblicherweise In Gegenwart eines Katalysators eines ÜbcrgangsmeWills unter Anwendung von niedrigen oder mittleren Wasserstoffdrücken statt. Die Reaktion kann bei erhöhten, normalen oder erniedrigten Temperaturen, z. B. bei 0 bis 100° C, durchgerührt werden. Besonders zweckmäßige Reaktionsbedingungen für derartige Hydrierungen verwenden einen geringen Überdruck an Wasserstoff bei annähernd Raumtemperatur von 12 bis 20° C. Die Reaktion kann In üblichen Lösungsmitteln, wie niederen Alkanalen, z. B. Äthanol, durchgeführt werden. Es Ist gefunden worden, daß ein besonders zweckmäßiger Katalysator Palladium auf Holzkohle Ist.

Falls die Hydrierung In Gegenwart einer Base durchgeführt wird, bildet sich ein Salz der Clavulansäure, /. B. das Natrium- oder Kaliumsalz, wenn die Reaktion In Gegenwart von Natrium- oder Kallumblcarbonal durchgeführt wird.

Die Clavulansäure oder deren Salze aus derartigen Reaktionen sind Im allgemeinen von guter Reinheit.

Bestimmungsmethoden der Clavulansäure
Versuch Nr. I

Bestimmung der Clavulansäure mittels Hydroxylamln-Vcrsuch
Grundlagen des Versuchs

Lösungen mit einem Gehalt von Clavulansäure (Flltrat der Nahrboulllon, Proben aus einem IsoMerungsverfahren oder dergleichen) werden 15 Minuten mit einem /3-Lactamasc-Präparat bei 37° C In einer 0,05 m-Phosphatpufferlösung von pH 7 bebrütet. Währenddessen tritt eine Enzymhemmung oder eine Inaktivierung auf. Dann wird ein Substrat (Benzylpenicillin) zugegeben und das Bebrüten bei 37° C 30 Minuten fortgesetzt. Die Menge des enzymatlschen Abbaus des Substrats zu Penlclllansaurc wird mittels des Hydroxylamln-Versuchs für Penicillin bestimmt. Die Menge der verwendeten /i-Lactamse errechnet sich aus einer 75pro/cntlgen Hydrolyse des Benzylpenicillin In 30 Minuten bei 37° C.

Das Ausmaß der Hydrolyse 1st der Einfluß der Menge des ungehemmt verbleibenden Enzyms. Die Ergebnisse werden ausgedrückt In Prozent Hemmung der Enzymaktlviiäi durch eine gegebene Verdünnung der Clavulansaure enthaltenden Lösung (z. B. des Flltrats der Nahrboulllon) oder durch die Konzentration der Clavulansäure In ug/ml bei gegebener 50prozentlgen Hemmung des Enzyms unter den vorstehend genannten Bedingungen Uso).

/J-Lactamase-Enzym

Es wird die mittels Escherlchla coil JT4 erzeugte /i-Lactamse als Enzym verwendet (vgl. Blochem. J. Bd. 98 (Ί966), S. 204-209). Diese Züchtung ist ein Ampiciiiiri-resisicmcf Stamm und verdankt seine Resistenz einer Erzeugung der den R-Faktor (vgl. Nature 1965, S. 239-242) steuernden /J-Lactamase. Gegebenenfalls können ähnliche den R-Faktor steuernde /}-Lactamasen verwendet werden.

Die auf einem Schrägagar gehaltene Züchtung wird In einem 400 ml sterilen Trypton-Medlum bebrütet, das In einer konischen Flasche von 2 Liter Inhalt enthalten Ist. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung: 32 g/Llter Trypton, 20 g/Llter Hefeextrakt, 5 g/Llter Natriumchlorid und 2,2 g/Lltcr Calciumchlorid mit 6 Mol Hydratwasser. Der pH-Endwert wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,4 eingestellt. Die Flasche wird 20 Stunden auf einem DrehschOttler mit 240 UpM bei 25° C geschüttelt.

⁴* Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugleren gesammelt, mit 0.05 m-Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewaschen (nochmals suspendiert und zentrifugiert) und dann In Wasser nochmals suspendiert, wodurch man eine 25fache Zellkonzentration In dem Kulturmedium erhalt. Diese Zeilsuspension wird dann bei 4° C In einem MSE-Ultraschall-Dlslntegrator zertrümmert. Die Zellbruchstucke werden durch Zentrifugieren entfernt, und aliquote Anteile der überstehenden Losung werden In tiefgefrorenem Zustand gelagert. Zur Verwendung bei dem Versuchsverfahren wird das Überstehende mit einer 0,005 m-Phosphalpufferlösung verdünnt, bis man eine etwa 75prozentlge Hydrolyse einer 1 mg/ml enthaltenden Lösung von Benzylpenicillin In 30 Minuten bei 37" C erhalt.

Versuchsverfahren

Geeignete Verdünnungen des Hemmpräparats und der /J-Lactamase-Lösung werden vermischt und 15 Minuten bei 37° C bebrütet (Test). Ein Kontrollversuch mit einer Pufferlösung anstelle des Inhibitorpräparats wird ebenfalls bebrütet. Dann wird eine Benzylpenlctllln-Lösung (Substrat) zu dem Test- und dem Kontrollgemisch gegeben. Dann wird die Bebrütung weitere 30 Minuten bei 37° C fortgesetzt. Es wird dann das restliche

μ Benzylpenicillin In jedem Gemisch unter Verwendung des Hydroxylaminversuchs bestimmt, wie er beschrieben Ist von Batchelor und Mitarbeitern In Proc. Roy. Soc. B 154 (1961). S. 498. Zu allen Tests werden 6 ml Hydroxylamln-Reagens zugegeben. Die Kontrollversuche und die Versuche mit den reinen Substanzen läßt man 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren, bevor man 2 ml eines Elsen(III)-ammonlumsulfat-Reagens zusetzt. Die Absorption der Endlösungen wird In einem R.X.L.-Colorimeter oder In einem Spektrophotometer bei 490 nm

*s gegenüber dem reinen Reagens gemessen. Die Zusammensetzungen der Rcaktlonslösungen, der Test'.ösungcr. und der reinen Substanzen vor dem Hydtcjylamln-Versuch sind wie folgt.

Bestandteile

(ulic gelöst in oder verdünnt mit 0,005 m-PhosphatpulTcr vom pll 7)

25	60 074	reines Benzyl penicillin, ml	Konlroll- versuch, ml	reines Reagens, ml
	Tesi	0,0	1,9	1,9
Ling	1,9	0.0	0,0	0,0
	0,1	0.5	0,5	0,0
	0,5	2,0	0,1	0,6
7	O₁O

Escherichiu coli-yS-Laetamase-Lösung

Inhibitor

Benzylpenicillin 5 mg/ml

0,005 m-PhosphatpulTer vom pll 7 - - - ·■ ~. ~- ">

Berechnung der Ergebnisse Die prozentuale Hemmung der /i-Lactaniase wird wie folgt berechnet: is

Absorption des reinen Benzylpenicillin« minus Absorption der Konirollösung (nicht gehemmte Reaktion) = x Absorption der Testlösung (gehemmte Reaktionslösung) minus Absorption der Kontrollösung (nicht gehemmte Reaktion) = y

Hertimung In % = ~ χ 100

Um den I₅₀-Weri zu erhalten, wird das Hcmmpraparal verdünnt, bis eine 50prozentlge Hemmung der · /J-Lactamse-Inaktivlerung des Ben/ylpcnlcllllns bei dem vorgenannten Verfahren erhalten wird.

25 Versuch Nr. 2

Paplerchromatogruphlschc Bestimmung der Clavulansäure

Das Flltrat der Nährbouillon und eine Bezugslosung der Clavulansäure (250 Mg/ml eines teilweise gereinigten Präparats) werden auf I cm breite Papierstreifen (Whatman No. 1) (20 μίΚβΓ der Ausgangslösung) getüpfelt. Die Chromatogrammc laufen bei absteigender Chromatographie 16 Stunden bei 5° C unter Verwendung eines Gemisches von n-Butanol/lsopropanol/Wasser Im Volumenverhältnis 7 : 7 : 6 als Losungsmittel. Die Streifen werden bei 40° C getrocknet und auf Agarplatten ausgelegt, die 6 pg/ml Benzylpenicillin enthalten und dann mit einem /?-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebslella acrogenes (synergistisches System) beimpft. Die Platten werden 3> Ober Nacht bei 30° C bebrütet, und die Clavulansäure zeigt sich als Zone eines gehemmten Wachstums. Der R_r Wert der Zone Ist 0,46. Die Menge von 6 μg/ml Benzylpenicillin allein Hegt unterhalb der erforderlichen Konzentration, um Klebslella aerogenes abzutöten. Jedoch In Gegenwart eines /(-Lactamase-Hemmstoffes wird diese Konzentration für den Mikroorganismus toxisch.

Die Verwendung des vorgenannten synergistlschcn Systems ermöglicht die Feststellung der Clavulansäure bei Konzentrationen unterhalb denjenigen, bei denen sie eine antibakteriell Wirksamkeit zeigt.

Versuch Nr. 3
Dünnschlchl-chromatographlsche Bestimmung des Natriumsalzes der Clavulansäure

Losungen von Präparaten des Natriumsalzes der Clavulansäure werden auf Glasplatten, die mit einer 0,25 mm dicken Schicht von Slllkagel (F254) beschichtet sind. In einer Menge von 5 pLiter von I mg/ml getüpfelt. Die Chromatogramme laufen bei 22° C unter Verwendung einer oberen Phase eines Gemisches von n-Butanol/Äthanol/-Wasser Im Volumenverhältnis von 4:1:5. Die Chromatogrammplatten werden bei 40° C getrocknet. Das so Natriumsalz der Clavulansäure wird durch Bioautographle auf Agarplatten mit einem Gehalt von 6 Mg/ml Benzylpenicillin angeordnet und mit Klebslella aerogenes beimpft (synergistisches System wie bei der vorstehend besprochenen Papicrchromatographle). Die Agaroberfläche wird mit einem feinen Filtertuch abgedeckt, bevor die Dünnschlcht-Chromatographleplatte darübergelegt wird. Nach 15- bis 30minütigem Ruhenlassen zum Befeuchten und Diffundieren wird die Dünnschlcht-Chromatographleplatte mit Hilfe des Filtertuches abgehoben und die Agarplatte Ober Nacht bei 30° C bebrütet, um die Zonen eines gehemmten Wachstums aufzuzeigen. Der R_rWert des Natrlumsalzes der Clavulansäure In dem vorgenannten Lösungsmittel beträgt annähernd 0,37. Zwei sprühbarc Reagentlcn, nämlich Ehrllch'sches Reagens und Trlphenyltetrazollum-chlorld, werden ebenfalls verwendet, um die Zone des Natrlumsalzes der Clavulansäure aufzuzeigen. Das erstgenannte Reagens besteht aus 300 mg p-Dlmethylaminobenzaidehyd, das In 9 ml Äthanol, 54 ml n-Butanol und 9 ml konzentrierter ChJorwas- &o serstoffsäure gelost Ist. Beim I- bis 2mln0tlgen Erhitzen der besprühten Dünnschlcht-Chromatographleplaue auf 120° C erscheint das Natriumsalz der Clavulansäure als rosaroter Flecken. Das Trlphenyltetrazollum-chlorld-Reagens besieht aus einem Gemisch von 1 Volumenteil einer 4prozentigen Lösung dieser Verbindung In Methanol und I Volumenteil meihanollscher Natronlauge. Nach dem Aufsprühen werden die Dünnschlcht-Chromatogninhleplatten auf 80° C erhitzt. Das Natriumsalz der Clavulansäure erscheint als roter Punkt auf weißem Unter- 6S grund.

Beispiel 1
Züchten von Slreptomyces clavullgerus ATCC 27064

Streptomyces clavullgerus ATCC 27064 wird bei 26" C und einem pH-Wert von 6,8 auf einem Schrflgagar gezüchtet, der Γ Prozent Hefeextrakt, 1 Prozent Glukose und 2 Prozent »Oxold«-Agar Nr. 3 enthalt. Es wird eine sterile öse verwendet, um das Mycel und die Sporen vom Schrflgagar In 100 ml einer Nahrboulllon In einem 500-ml-Erlenmeyerkolben zu Oberführen. Die Nahrboulllon hat die folgende Zusammensetzung:

■ο Malzextrakt 10 g/Llter

Bakteriologisches Pepton 10 g/ Liter Glyzerin 20 g/Llter Leitungswasser ad 1 Liter

H Die Nahrboulllon wird mittels Natriumhydroxidlosung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Dann werden jeweils 100 ml In Flaschen verteilt, die mit Schaumstöpseln verschlossen werden, bevor sie 20 Minuten einem Druck von l,05kg/cm^J im Autoklaven behandelt werden. Die beimpfte Flasche wird 3 Tage bei 26°C auf einem Drehschüttler mit 5 cm Ausschlag und einer Geschwindigkeit von 200 UpM geschüttelt. Die Flaschen der Produktionsstufe, die die vorgenannte Nahrboultlon enthalten, werden mit S Prozent eines vegetativen Impfstoffes geimpft und unter den gleichen Bedingungen wie bei der Anzuchtflasche wachsen gelassen. Die Proben des Fiitrais der Nährbouiiion werden auf die Hemmwifkung gegenüber der /"-Lactarnasc von Eschcrichia coil JT4 geprüft. Die höchste Aktivität wird nach 3 Tagen erhalten. Die Ergebnisse sind In der Tabelle I angegeben. Man sieht eine Zone der Clavulansäure beim R_rWert von 0,46, wenn das Flltrat der Nahrboulllon nach dem zuvor genannten paplerchromatographischen Verfahren geprüft wird. Eine Vergrößerung der Zone verlauft parallel mit einer Erhöhung beim /J-Lactamase-Hemmversuch.

Streptomyces clavullgerus ATCC 27064 wird auch In 2 Liter fassenden Schottel flaschen mit einem Gehall von 400 ml des Mediums (der Produktlonsstufe) unter Verwendung des gleichen Mediums und der gleichen Kultlvlerungsbedlngungen, wie sie zuvor In diesem Beispiel angegeben sind, gezOchtet. Bei diesen größeren Gefäßen verlauft das Wachstum des Organismus langsamer, und die höchste /J-Laclamasc-Hemmwlrkung wird

Xi 7 bis 9 Tage nach der Beimpfung mit dem vegetativen Impfstoff erreicht. Die Ergebnisse sind ebenfalls In der Tabelle VII angegeben.

Tabelle VII

yS-Lactamase-Hemmwirkung von in 500 ml- und 2000 ml-Flaschen gezüchtetem Streptomyces clavullgerus

Fermentationszeit, prozentuale Hemmung der Eschcrichui Tage coli-/7-Lactamase bei einer Endver-

dünnung von 1/2500 des Kulturfiltmts

500 ml-Schüllel- 2000 ml-Schüttelflasche flasche

-»5 50

1	15	Beispiel 2	-
2	30		-
3	55	IO
4	50	21
5	51	36
6	57	51
7	-	53
8	-	50
9	-

«) Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Aus einer Anzuchtllasche, deren Inhalt wie In Beispiel I zubereitet worden Ist, wird eine Probe zur Bclmpluni von konischen 500 ml-Flaschen verwendet, die 100 ml aliquote Anteile der nachstehenden Nahrboulllon Ii entsalztem Wasser enthalten:

Lösliche Starke 2 Gewichtsprozent Glyzerin 0,3 Gewichtsprozent Malzdestlllat-Trockensaft 0,1 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent FeSO₄ · 7H₂O 0,01 Gewichtsprozent

Die Nahrbouillon wird 20 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm^J In einem Autoklaven sterilisiert und durch Zugabe von 5 Prozent der vegetativen Anzuchtstufe beimpft. Die Flaschen werden wie in Beispiel 1 bei s 26° C auf einem Drehschattier geschüttelt. Der höchste Gehalt an Clavulansäure wird nach 3 und 5 Tagen erreicht. Eine VerdOnnung von 1/2500 der Nahrbouillon ergibt eine 60pro7.entlge Hemmung beim /8-Lactamase-Hemmversuch. Es wird eine Zone der Clavulansäure bei einem Ry-Wert von 0,46 ermittelt, wenn man das _: vorstehend angegebene paplerchromatographlsche (bloautographlsche) Verfahren anwendet. Diese Zone vergro- ■ Bert sich parallel mit einem Anstieg der Aktivität beim /J-Lactamase-Hemmversuch. ία

Beispiel 3
Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Es wird der Inhalt einer Anzuchtflasche, wie er In Beispiel 1 zubereitet worden 1st, zur Beimpfung von konisehen 500 ml-FIaschen verwendet, die 100 ml aliquote Anteile der nachstehenden NSHrboüllloh ertÜiiiteÜ die · mit entsalztem Wasser hergestellt und wie zuvor beschrieben sterilisiert worden Ist. Die Impfstoffmeng6 beträgt 5 Prozent.

LfCAtIUl Λ \JVVTIVI1U|JIU£GUI Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent Malzdestllla'.-Trockensaft 0,1 Gewichtsprozent FeSO₄ · 7H₂O 0,01 Gewichtsprozent

Die beimpften Flaschen werden bei 26° C geschüttelt. Die höchste /7-Lactamase-Hemmwlrkung wird zwischen _: 3 und 5 Tagen erreicht. Die Aktivität war gleich der In Beispiel 2 erreichten.

Beispiel 4 Bebrülung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Die wie In Beispiel 1 angegebene Anzucht wird zur Beimpfung von konischen 500-ml-Flaschen verwendet, die die nachstehende Nahrbouillon In entsalztem Wasser enthalten:

Dextrose 1 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent Malzdestlllat-Trockcnsaft 0,05 Gewichtsprozent CaCO) 1 Gewichtsprozent

Diese Raschen werden genauso wie In den vorstehenden Beispielen behandelt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Die /J-Lactamase-Hemmwlrkung wird zwischen 3 und 5 Tagen erreicht. Das FÜtrst der NShrboulllon bei einer End Verdünnung von 1/2500 ergibt eine 35- bis 45prozentlge Hemmung bei dem /3-Lactamase- , Hemmversuch. '■

Beispiel 5
Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Die der Clavulansäure zuzuschreibende /J-Lactamase-Hemmwlrkung wird unter Verwendung der nachstehen- ⁵⁰ den Nahrbouillon mit Identischen Anzucht- und Züchtungsbedingengen wie In Beispiel I erzeugt.

Glyzerin 2 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent MgSO₄ 0,1 Gewichtsprozent ⁵⁵ KiHPO₄ 0,1 Gewichtsprozent Die Nahrbouillon wird In entsalztem Wasser hergestellt.

Die //-Lactamase-Hemmwlrkung erreicht den Höchstwert bei 3 bis 5 Tagen und liegt In der gleichen Größenordnung wie die des Beispiels 4, ^ω

Beispiel 6
Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Die folgende Nahrbouillon erzeugt Clavulansäure, wenn die Bedingungen und die vegetative Anzucht wie In Belsplc! I angegeben angewendet werden.

Glukose 2 Prozent Lab 1 Prozent Hefeextrakt 0,3 Prozent CaCo₅ 0,3 Prozent

;s

Die Nahrbouillon wird In entsalztem Wasser hergestellt.

Die höchsten Werte werden In 3 bis 5 Tagen erreicht. Eine 1/2500-Verdünnung des Flltrats der Nahrboulllon ergibt eine 35- bis 45prozentlge Hemmung beim /J-Lactamase-Hemmversucri.

ίο Beispiel 7

Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Wie In den Beispielen 4, 5 und 6 ruft die nachstehetide Nahrbouillon eine 35- bis 45prozentlge Hemmung 15 (1/2500-Verdünnung) beim /J-Lactamase-Hemmversuch bei einer Höchstmenge hervor, die 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung erreicht wird. Alle Bedingungen sind bereits vorher genannt.

Glukose 2 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

²⁰ Ct£O₃ 0,02 Gewichtsprozent

CoCIj · 6HjO ö.öööl Gewichtsprozent

Die Nahrboulllon wird mit entsalztem Wasser hergestellt.
» ' Beispiel 8

Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064 Die nachstehende Produktlons-Nährboulllon liefert, wenn sie unter den wie In den vorhergehenden Beispielen

30 angegebenen Züchtungsbedingungen angewendet wird, eine 20- bis 30prozentlge Hemmung bei einer 1/2500-

Verdünnung oelm /J-Lactamase-Versuch, wobei die Höchstmenge an Clavulansäure 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung erreicht wird. Unt'-v Anwendung des zuvor genannten paplerchromatographlschen Verfahrens wird

eine Clavulansäureione bsi einem R^Weit von 0,46 festgestellt, wenn das Flltrat der Nahrboulllon geprüft wird.

^J5 Maizedestlllat-Trockensaft 2 Prozent Hefeextrakt I Prozent

Die Nahrboulllon wird mit Leitungswasser zubereitet
pH-Endwert 7,0

⁴O Beispiel 9

Züchtung von Streptonjyces clavullgerus ATCC 27064

Unter Standard-ZOchtungsbedlngungen erzeugt die nachstehende Nahrboulllon Clavulansäure Innerhalb 3 bis ■»⁵ 5 Tagen nach dem Beimpfen mit der vegetativen Anzucht. Eine Verdünnung von 1/2500 der Züchtung liefert eine 20- bis 30prozentlge Hemmung beim /J-Lactamase-Hemmversuch.

g/Liter

Glycerin 15

so Saccharose 20

Prolin 2,5

Mononatrlum-glutamat 1,5

NaCl 5,0

K₁HPO₄ 2,0

55 CaCl₁ 0,4

MnCl₁ · 4H₁O 0,1

FeCIj · 6H₁O 0,1

ZnCI₁ 0,05

MgSO₄-7H₁O 1,0

60

Die Nahrboulllon wird mit entsalztem Wasser hergestellt. pH-Endwert 7,1

Beispiel 10
⁶⁵ Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

Es wird ein Hefeextrakt-Glukose-Nähragar zur Beimpfung eines Hefeextrakt-Glukose-Schrflgagars In einer Roux-Flasche verwendet. Indem man eine Suspension des Myccls und der Sporen In sterilem Wasser herstellt.

Die schragllegende Roux-Flasche wird 10 Tage bet 26" C bebrütet. Zu diesem Schrägagar werden 100 ml steriles Wasser zugefügt und eine Mycel-Suspenslon hergestellt. Diese wird zur Beimpfung von 50 Liter eines dampfsterlllslerten Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung In Leitungswasser verwendet: ^;

Malzextrakt 1 Gewichtsprozent ..}

bakteriologisches Pepton 1 Gewichtsprozent

Glycerin 1 Gewichtsprozent

lOprozentlges Antischaummittel 0,05 Gewichtsprozent .

(»Pruronlc L81«) in Sojabohnenöl

Die Nährbouillon wird In einen 90 Liter fassenden, mit Prallblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben und mittels eines Schelbenkrelselmlschers mit 12,7 cm Leitschaufeln bei 240UpM gerührt. Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter/Min, zugeführt und das Gefäß bei 26° C bebrütet.

Nach 72 Stunden wird der Inhalt des Anzuchtfermenters zur Beimpfung von 150 Litern der gleichen Nährbouillon unter Verwendung eines 5volumenprozentlgen Zusatzmittels unter steriler Überführung verwendet. i% Diese Produktlons-Nährboulllon wird In einem 300 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der mittels eines Schelbenkrelselmlschers mit 21,6 cm Leitschaufeln bei 210UpM gerührt wird. Es wird sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 150 Llter/Mln. zngeführt. Die Fermentation wird bei 26° C gehalten. Gegebenenfalls wird ein Antischaummittel In 10-ml-Schüben zugegeben. ; In regelmäßigen Abständen werden zum /3-Lactamase-Hemmversuch Proben entnommen. Nach 4 bis 5 Tagen Mj hat der Fermenter das Maximum an einer /Ϊ-Lactamase-Hemmwirkung erreicht, wie aus Tabelle W'. hervorgeht. ^:

Tabelle VIII !

/J-Laclumase-Ilenimwirkung von Proben eines aus _2J

einem 300 Liler-Fermeniationsgelaßes von Streptomyces clavuligerus entnommenen Kulturfiltrats

Züchtung von Streptomyccs clavuligerus ATCC 27064

Es wird ein Anzucht-Fermenter unter den gleichen Bedingungen, wie sie In Beispiel 10 angegeben sind, und 50 unter Verwendung der gleichen Nährboulllon betrieben.

Nach 72 Stunden wird der Inhalt des Anzucht-Fermenters zur Lieferung eines 5vo!umenprozentlgen vegetativen Impfstoffes In einen 300 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fernenter aus rostfreiem Stahl mit einem Gehalt an 150 Liter einer dampfsterlllslerten Nährboui!io>i verwendet, die bei 210UpM mittels eines mit 21,6 cm großc.i Leitschaufeln versehenen Schelbenkrelselmlschers gerührt wird. Sterile Luft wird mit einer 55 Geschwindigkeit von 150 Llter/Mln. zugeführt. Die Fermentation wird bei 26⁰C gehalten. Gegebenenfalls wird i in Schüben von 10 ml ein Antischaummittel zugegeben.

Die In der Herstellungsstufe verwendete Nährboulllon entspricht der In Beispiel 3 angegebenen mit einem Zusatz von 0,05 Volumenprozent des In Beispiel 10 genannten AntlschaummliHs vor der Sterilisation.

Die /J-Lactamase-Hemmwlrkung der Fermentationsproben entspricht der des Beispiels 10 (vgl. Tabelle II). Die *o paplerchrömatögfäphlsehe Untersuchung zeigt eine Clavulansäurezone beim R/Wert von 0,46 unter Anwendung der zuvor beschriebenen bloautographlschen (synergistischen) Methode. Die Größe der Clavulansäwezone wachst mit einem Anstieg beim /J-Lactamase-Hemmversuch.

l-'ermeniaiionszcit. Tage	prozentuale Hemmung beim /J-Lactamase-Hcmmvcrsuch bei einer Endverdünnung von 1/2500
1,0	12
1.5	20
2,0	31
2,5	36
3,0	50
3,5	54
4,0	51
4,5	56
5,0	55
	Beispiel 11

Beispiel 12
Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

100 ml steriles Wasser werden zu einem Sporenmedium gegeben, das auf einem Benncttj-Agar In einer Roux-Flasche 10 Tage bei 26° C gewachsen Ist. Es wird eine Mycel-Sporen-Suspenslon erzeugt und zum Beimpfen von 75 Litern einer dampfsterlllslerten Nahrboulllon der folgenden Zusammensetzung In Leitungswasser verwendet:

Dextrin 2 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

das In Beispiel 10 genannte Antischaummittel 0,03 Volumenprozent

Der pH-Wert der Nahrboulllon wird auf 7,0 eingestellt.

is Die Nahrboulllon wird In einem 100 Liter fassenden, mit Leitblechen versehenen Fermenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der bei 140 UpM mittels eines mit 19 cm großen Leitschaufeln versehenen Schelbenkrelselmlschers gerührt wird. Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 75 Llter/Mln. zugeführt. Das Gefäß wird 72 Stunden bei 26° C bebrütet.
Der inhalt des AiiZüCm-renr.enters wird zur Scirnpfung von !500 Litern einer dampfsteriüsierteri NShrbcuÜ-lon der nachstehenden Zusammensetzung In Leitungswasser verwendet:

Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent Glycerin 1,0 Gewichtsprozent KH₂PO₄ 0,1 Gewichtsprozent

-5 das In Beispiel 10 genannte Antischaummittel 0,2 Volumenprozent

Der pH-Wert der Nahrboulllon wird auf 7,0 eingestellt.

Die Nahrboulllon wird In einen 2000 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben, der mittels eines mit zwei 48 cm langen Leitschaufeln versehenen Schelbenkrelselmlschers mit 106 UpM gerührt wird.

Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 1200 Lltern/Mln. eingeleitet. Erforderlichenfalls wird ein Antischaummittel - wie es In Beispiel 10 angegeben Ist - In Mengen von je 25 ml zugesetzt. Die Fermentation wird bei 26° C durchgeführt, bis die höchste Ausbeute an Clavulansäure nach 3 bis 5 Tagen erhalten worden Ist. 3* wenn nämlich 200 bis 300 ng/ml Clavulansäure erzeugt worden sind.

" Beispiel !3

Züchtung von Streptomyces clavullgerus ATCC 27064

In einer Anzuchtflasche, wie vorstehend angegeben, jedoch unter Verwendung der In Beispiel 3 genannten Nahrboulllon, deren pH-Wert auf 7,0 eingestellt worden Ist, wird ein Impfstoff erzeugt, der zum Beimpfen von konischen 500-mI-Flaschen mit einem Gehalt an 100 ml aliquoten Teilen der nachstehend angegebenen, In entsalztem Wasser hergestellten und sterilisierten Nahrboulllon verwendet wird. Die Impfstoffmenge beträgt 5 ■»; Prozent.

Trlglyzerld (»Prlchem P224«) 1 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent KH₂PO₄ 0,1 Gewichtsprozent Die Nahrboulllon wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

Die beimpften Flaschen werden bei 26° C geschüttelt, und die höchste /J-Lactamase-Hemmwlrkung wird nach 3 bis 5 Tagen erreicht. Man erhalt 300 bis 500 pg/ml Clavulansäure.

Beispiel 14
Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure

Die wie In Beispiel 10 erzeugte, angereicherte Kulturflüssigkeit wird durch kontinuierliches Zentrifugleren geklart. Das Mycel wird verworfen. Aus 150 Litern Fermentallonsflüsslgkelt erhalt man 120 Liter geklarte Kulturflüssigkelt. Dieses FlItrat weist bei einer Verdünnung 1/2500 eine 58prozentlge Hemmung beim /5-Lactamase-Hemmversuch auf. Das Flltrat wird auf 5° C gekühlt und mit 40 Liter n-Butanol vernetzt. Das Gemisch wird gerührt und mit 25prozentiger Schwefelsaure versetzt, bis der pH-Wert 2,0 betragt. Das angesäuerte Gemisch wird weitere 10 Minuten gerührt, bis durch Zentrifugieren die Phasen getrennt werden. Die wäßrige Phase wird verworfen. Zum n-Butanol-Exirakt gibt man 0,5 Prozent Aktivkohle (»NorIt GSX«) und rührt das Gemisch nochmals 15 Minuten. Nach dem Abfiltrieren der Kohle unter Zuhilfenahme von Diatomeenerde als Filtrierhilfe wird die Kohle verworfen. Zum n-Butanol wird ein Viertel seines Volumens entsalztes Wasser zuge-

geben und cJus Gemisch gerührt, währenddessen 20prozentlge Natronlauge zugesetzt wird, bis sich der pH-Wert auf 7,0 eingestellt hut. Durch Zentrifugleren trennt man die Phasen auf und verwirft die n-Butanol-Phase. Die walirlgc Phase wird unter vermindertem Druck auf 800 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet. Man erhalt 35 g einer festen Rohsubstanz von Clavulansäure mit einem ljo-Wert von 1,3 Mg/ml beim /i-Lactamase-Hemm- versuch. Dieser Feststoff wird Im trockenen Zustand bei -20° C gelagert, um dann einer weiteren Reinigung s unterwürfen zu werden.

Beispiel IS
Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure ι ο

1 Liter des wie In Beispiel 12 angegebenen erhaltenen Kulturflltrats mit einer S3prozentlgen Hemmung beim /"-Lactamase-Hemmversuch bei einer Verdünnung von 1/2500 wird an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 15,2 cm Lange mit einer Füllung von Permutlt (»Isoporc Resin FF IP (SRA 62)«] In der Chloroform perkollert.

Dem Kulturflltrat folgen 300 ml destilliertes Wasser, um die SBuIe zu waschen. Eine Elulerung des aktiven ß-Lactamase-Hemmstoffes erzielt man mit einer 0,2 m-Natrlumchlorldlösung. Es werden 20 ml-Fraktlonen gesammelt und bei einer Endverdünnung von 1/2500 beim /J-Laclamasc-Hcmmversuch geprüft. Aktive Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 20 ml eingeengt. Diese Lösung wird mittels Gelausschluß-Chromatographie an einer »Bio Rad Biogei P2«-Sauie von 3,S cm Durchmesser mit einer Geifüiiung von etwa 40 cm Höhe entsalzt und mit I Prozent n-Butanol enthaltendem Wasser elulert. Die aufgrund des /?-Lactamase-Hemmversuches festgestellten aktiven Fraktionen werden vereinigt. Nach dem Eluleren der Clavulansäure wler Natriumchlorid elulert, wie mittels einer Sllbernltratlösung festgestellt werden kann. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet.

Nach der vorgenannten Behandlung ergibt 1 Liter Kulturflltrat 0,45 g eines festen Rohprodukts der Clavulansäure mit einem lso-Werl von 0,92 μg/m!.

Dieser Feststoff wird bei -25° C gelagert und dann einer weiteren Reinigung unterworfen.

Beispiel 16

Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure

Ein 300 ug/ml Clavulansäure enthaltendes Kulturflltrat wird unter Anwendung eines kontinuierlichen Durchflußmlschers angesäuert und mit n-Butanol extrahiert. Die Clavulansäure wird bei neutralem pH-Wert in das Wasser zurückextrahiert. ^is

Auf 5 bis 10° C gekühltes Kulturflltrat wird zu einem Mischer In Rohrleitungen gepumpt, an dessen Einlaßende ausreichend 6volumenprozentlge Salpetersäure zugegeben wird, damit beim Austritt ein pH-Wert von 2,0 ± 0,i erzieh wird. Das angesäuerte Fiiirai wird rnit einer Geschwindigkeit von 4 Liier/Min, durch einen mii Glykol gekohlten Plattenwarmeaustauscher geschickt, der auf einer Temperatur von 2 bis 5° C gehalten wird. Der pH-Wert wird In der Fließzelle überwacht, bevor die Flüssigkeit durch einen 3stuflgen Gegenstromabschel- *° der geschickt wird.

Auf etwa 5^J C gekühltes, mit n-Butanol gesättigtes Wasser wird mit einer Geschwindigkeit von 3 Liter/Min. In den Gegenstromabschelder gepumpt.

Die aus dem Gegenstromabschelder austretende wäßrige Phase wird verworfen. Mitgeschlepptes Wasser wird aus dem Butanoi-Ablauf des Gegensiromabschelders unter Verwendung eines Flüsslg-Flüsslg-Zentrtfugalabscheiders entfernt. Das Butanol wird In einem mit einem Kühlmantel versehenen Gefäß aus rostfreiem Stahl gesammelt, wo es bei etwa 5° C gelagert wird.

Aus dem Gefäß werden 40 Liter aliquote Anteile entnommen und gründlich mit 2 Liter auf 5° C gekühltem Wasser, das mit n-Butanol gesättigt Ist, vermischt. Der pH-Wert dieses Gemisches wird auf 6,8 ± 0,1 unter Verwendung einer 20prozentlgen Natronlauge eingestellt.

Das Gemisch aus wäßrigem Extrakt und Butanol wird einem Flüsslg-Flüsslg-Zentrlfugalsabscnelder mil einer Geschwindigkeit von 2 Llter/Mln. zugeführt.

Aus 1800 Liter Kulturflüsslgkelt werden 20 Liter einer wäßrigen Phase gewonnen, die 39 Prozent der Im Kulturflltrat vorliegenden Clavulansäure enthalt.

15 Liter des wäßrigen Extrakts werden durch Zugabe von 60 g Natriumchlorid je Liter auf einen Gesamtfeststoffgehak von 2 bis 8 Prozent eingestellt und sprühgetrocknet. Die Bedingungen hierfür sind: Einspeisgeschwindigkeit 2 Liter/Stunde; Spannung des Zerstäubers 170 Volt; Heizeinstellung 6 bis 7; Einlaßtemperatur 150° C; Auslaßtemperatur 80° C.

Das Trockenprodukt Im Gesamtgewicht von 1 kg enthält 62 Prozent der Im Ausgangsmaterlal vorliegenden Clavulansäure. ^ω

Die restlichen 75 Liter des wäßrigen Extrakts werden unter Ultraflltrleren eingeengt (De Danske Sukkerfabrikker. Laboratoriumsmodul, Membrantyp 900). Die Arbeltswelse besteht in einem Zirkulieren in einem Gefäß aus rostfreiem Stahl, das mit einem Kühlsystem und einem Auslaßveniilsatz ausgerüstet Ist, wobei man über 40 Membranen einen Druckunterschied von 25 Atmosphären erzeugt. Die Temperatur wird bei 2 bis 5° C und erforderlichenfalls der pH-Wert bei 6,8 ± 0,1 durch Zugabe von 2 η-Salzsäure gehalten. Das Volumen wird auf 34 Liter eingeengt, die 72 Prozent der im Ausgangsmaterlal verhandenen Clavulansäure enthalten.

Das wäßrige Konzentrat wird bei 5° C geiagert, auf 8 Prozent Feststoffgehalt eingestellt und wie vorgenannt sprühgetrocknet.

Die getrocknete Substanz enthalt 75 Prozent der In dem Ausgungsmaterlul zum Sprühtrockner vorliegenden Clavulansäure.

Das Gesamtsprühtrockenprodukt aus 90 Liter wäßrigen Extrakts enthalt 69,4 g Clavulansäure, was 72 Prozent Clavulansäure Im Ausgangsmaterlal für die Sprühtrocknung und 21 Prozent Clavulansäure, die In 1800 Liter * Kulturflltrat vorhanden gewesen Ist, entspricht.

Beispiel 17
Vorreinigung der rohen Clavulansäure

Die gemäß Beispiel IS erhaltenen rohen Clavulansäure-Zubereltungen werden durch lonenaustausch-Chromatographle gereinigt. 18 g des gemäß Beispiel 15 hergestellten Materials mit einem l_!0-Wert von 1,3 Mg/ml (Endkonzentration) werden In 25 ml destilliertem Wasser gelost und auf ein 3,8 χ 40 cm großes Bett von »Permutlt Isopor Resin FF IP (SRA 62)-Harz« In der Chloridform aufgebracht. Die Säule wird einer Gradlenten-Elutlon mit Natrlumchlorld-Lösung, die durch Einleiten von 0,5 m-Natrlumchlorld In ein 1 Liter destilliertes Wasser enthaltendes Mischgefäß unter Schwerkraftelnfluß gebildet wird, wobei die erhaltene Mischung nach und nach der Chromatographiesäule zugeführt wird, unterworfen. Es werden 10-ml-Fraktlonen gesammelt. Die /J-Lactarrtase-Hemmwlrkung wird unter Verwendung einer 1/2500-Vcrdünnung der Fraktionen untersucht. Die aktiven Fraktionen werden aufgrund des Auftretens einer Haupt farhhande bei den Fraktionen 24 bis 30 elulert.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 30 ml eingeengt.

Diese Losung wird unter Verwendung eines 5 χ 46 cm Bettes von »Biorad Blogcl P2« entsalzt und mit 1 Prozent n-Butanol enthaltendem Wasser elulert. Die 20-ml-Fraktlonen werden unter Anwendung des /NLactamase-Hemmversuches auf einen Clavulansäure-Gehalt untersucht. Die Fraktionen werden auf Papierstreifen getüpfelt und entweder mit dem Im »Versuch Nr. 3« beschriebenen Ehrllch'schen oder dem Trlphenyltetrazollum-Spray-Reagenz besprüht. Die /3-Lactamase-Hemmwlrkung stimmt mit den rosaroten oder roten Flecken Oberein, die mittels dieser Reagentlen erzeugt werden. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, mit Ausnahme derjenigen, die Natriumchlorid enthalten, und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhalt 520 mg eines gereinigten Natriumsalzes der Clavulansäure mit einem Iso-Wert von 0,2 »ig/ml beim Standard-/(-Lactamase-Hemmversuch.

Die Dünnschlcht-Chromatographle an Slllkagel dieses Clavulansäurc-Präparals liefen die folgenden R,-Werte: Beim n-Butanol/Äthanol/Wasser-Gemlsch als obere Phase Im Volumcnverhaltnls von 4:1:5 einen R^Wen vor. 0,37;

beim n-Butanol/Esslgsäure/Wasser-Gemlsch vom Volumenverhältnis 12:3:5 einen R,-Wcrt von 0,44; und
beim Isopropanol/Wasser-Gemlsch Im Volumenverhältnis von 7:3 einen R_rWert von 0,78.

Die Zonen werden durch Besprühen mit Ehrllch'schem Reagens festgestellt.

Als Markierungsmittel läuft 6-Aminopenicillansäure mit; sie wird mit dem gleichen Spray bestimmt und weist RrWerte von 0.38. 0.39 bzw. 0.77 auf.

Beispiel 18

Vorreinigung des Natriumsalzes der Clavulansäure

Das gemäß Beispiel 12 erzeugte Kulturfiltrat wird, wie In Beispiel 14 angegeben, lösungsmiuelextrahlert und liefert einen Feststoff, der mittels Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Dläthylamlnoäthyl-

Cellulose »DE 52« welter gereinigt wird. 10 g dieses Feststoffes werden In 20 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine 3.8:<51-cm-Säule von »DE 52«-CelluIose, die zuvor mit 0,01 m-Natrtumphosphatpufferiösung vom pH 7,5 Ins Gleichgewicht gebracht worden Ist. aufgebracht. Die Säule wird einer Gradlenten-Elutlon mit Natriumchloridlosung unterworfen. Es werden 0,1 m-Natriumchlorld in 0,01 m-Natrlumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 einer Mischkammer zugeführt, die 1 Liter einer 0,01 m-Phosphatpufferlösung vom pH 7,5 enthält, die nach

und nach auf der Säule aufgebracht wird. Es werden 10-ml-Fraktlonen gesammelt, die bei einer Verdünnung von 1/2500 auf eine /3-Lactamase-Hemmwlrkung untersucht werden. Die Fraktionen werden auch auf Ihre antibakterielle Wirksamkeit mittels der Lochplatten-Versuchsmethode unter Verwendung von mit Klebslella aerogenes beimpften Nähragarplatten geprüft. Die Fraktionen, die die höchste /J-Lactamase-Hemmwirkung besitzen und die Hemmzonen beim Lochplattenversuch liefern, werden vereinigt, eingeengt-und dann an einer »Biorad

Biogel P2«-Säule entsalzt. Mittels Papierchromatographie und Dünnschlcht-Chromatographle kann man feststellen, daß diese Fraktionen Clavulansäure enthalten.

Beispiel 19
Isolierung des festen Natriumsalzes der Clavulansäure

500 mg des gemäß Beispiel 17 vorgereinigten festen Präparats von Clavulansäure werden auf eine SBuIc mit 2.5x5!-cm-Bettgröße gebracht, die mit mlkrogranullerter »CC 3I«-Cellulose beschickt Ist. Als chromatographisches Lösungsmittel wird als obere Phase ein n-ButanoI/Äthanol/Wasser-Gemlsch Im Volumenverhällnts von 4:1:5 verwendet. Die Säule läuft bei 4° C. Es werdet; --i-ml-Fraktlonen gesammelt. Die Fraktionen werden auf das Vorhandensein von Clavulansäure untersucht. Indem man Filterpapier mit den Fraktionen betüpfelt und dann Ehrilch'sches oder Triphenyltetrazollum-Sprflh-Reagens aufsprüht, die rosarote bzw. rote Flecken liefern. Diess Tüpfeltests werden durch die /J-Lactamase-Hemmversuche bei Verdünnungen von I/I25O bestätigt. Die

aktiven ί-raktlonen werden vereinigt und auf einem Drehverdampler unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird In einer geringen V.engc destilliertem Wassers gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält als weißen Feststoff 40 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure mit einem Ijo-Wert von 0,08 «ig/ml beim ^-Lactamase-Hemmversuch.

5 Beispiel 20

Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

6 Liter des aus der Ultrafiltration gemäß Beispiel 16 erhaltenen konzentrierten Ruckkonzentrats mit einem >o Gehalt von 10 g Clavulansäure, wie es gemäß dem /J-Lactamase-Hemmversuch nach der »Beschreibung 1« bestimmt worden Ist, werden mil einer Geschwindigkeit von 11 Lltcr-/Stunde durch eine 5,1 x61-cm-Säule eines Permutlt-Anlonauslauschharzes In der Chloridform (»lsopor Rosin FF IP SRA62«) laufen gelassen. Danach wird die Säule mil 2 Liter entsalztem Wasser vor einem Eluleren mit einem Natrlumchlorld-Gradlenten gewaschen. Dieser Natrlumchlorld-Gradlenl wird gebildet, Indern man aus einem Behalter mit 4 Litern einer 1,4 υ. m-Natrlumchlorldlösung einen Ruhrbehälter speist, der 4 Liter einer 0,7 m-Natrlumchlorldlösung enthalt und der wiederum mit einem Ruhrbehälter verbunden Ist. der 4 Liter entsalztes Wasser enthalt und der über eine Pumpe mit der Säule In Verbindung steht. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/Min, elulert. Man sammelt 25-ml-Frakilonen, die dem /J-Lactamase-Hemmversuch unterworfen werden. Die aktiven Fraktionen Nr. i40 bis 230 werden vereinigt und ünicf verfninderierri Drück bis nahe zur Trockne eingedampft. Der ™ Rückstand wird mit 500 ml Äthanol versetzt und nach kräftigem Schütteln der verbliebene Feststoff abfiltriert. Der ÄthanoleAirakt wird dann unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 40 ml entsalztem Wasser wieder aufgelöst. Mit dieser Lösung wird eine 5,1 x61-cm-Saule mit einer Füllung von »Biorad Blogel P2« beschickt. Dann wird die Säule m'·. 1 Prozent n-Butanol enthallendem Wasser elulert. Es werden 25-ml-Fraktlonen gesammelt, die auf die ^-Lactamase-Hemmwirkung bei einer 1/2500 Endverdünnung untersucht werden. Unter Verwendung einer Sllbernltratlösung wird der Natrlumchlorldgchalt bei einer l/2500-Verdünnung der Fraktionen untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einem Gehall an natrlumchlorldfreler Clavulansäure werden vereinigt, unter vermindertem Druck durch Abdampfen des Lösungsmittels auf 20 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet. Man erhält 4,8 g Natriumsalz der Clavulansäure mit einem l₅₀-^!^ert von etwa 0,06 μg/ml.

Beispiel 21
Herstellung des Methylesters der Clavulansäure

CH₂OM

J N k CHi

O CO₂Na

CO₂CH₃

19,8 mg des Nalrlumsalzcs der Clavulansäure werden in 0,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und « mit 0,25 ml Methyljodld behandelt. Nach 90mlnütlgem Stehenlassen bei Kaumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird mittels Dünnschlcht-Chromalographle an Kieselgel 60F254 gereinigt, wobei Eluleren mit Äthylacetat den Clavulansäure-methylester als farbloses öl mit einem R_rWert von 0,38 liefert. Mit 2,3,5-Trlphenyltetrazollum-chlorld-Sprüh-Reagens (TTC) liefert dieses öl eine rote Farbe. Die Verbindung hat die folgenden Eigenschaften:

Analyse für CH₁₁HO₅:

	C%	H*	N*
ber.:	50,70	5,20	6,57
gef.:	50,49	5,43	6,29

Ä_moT (Methanol): keine Absorption über 215 nm.

v_mcx (Film): 3300-3600 (breit), 1800, 1750, 1695 cm '.

Etwa 1. Ordnung-NMR-Spektrum (CDCI₃): 2,49 (breites s, 1, ausgetauscht mit D₂O); 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz);

3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J₂ = 2,5 Hz); 3,84 (s, 3); 4,24 (d, 2, J = 7 Hz); 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J₂ = 1,5 Hz); 5,07 (d, 1, J = 1,5 Hz); 5,72 (d, 1, J = 2,5 Hz).

Molekulargewicht (Massenspektrum): 213,0635;

berechnet für CH₁₁NO₅: 213,0637.

Die Dünnschichi-Chromatographle des Methylesters zeigt eine einzige Zone bei den folgenden Lösungsmittelsystemen: 65' Bütäfioi/Äthano'i/Wasser-Gernisch a!s obere Phase Im VolumenverhSitnis von 4:1:5 einen R_rWert von 0,75; Isopropanol/Wasser-Gemlsch Im Volumenverhältnis von 7:3 einen Ry-Wert von 0,95; und Äthylacetat/Äthanol-Gemlsch Im Volumenverhältnis von 8 : 2 einen Ry-Wert von 0,87.

23

Diese Zonen werden mittels Bloaulographle unter Verwendung von Klebslella aerogenes mit einem Zusatz von Benzylpenicillin (also unter Verwendung eines synergistischen Systems) bestimmt.

Beispiel 22
Herstellung des p-Nltrobenzylesters der Clavulansäure

,CH₂OH
>"ν. s

' ' „ /CH₂OH

I 1 r=^

CO₂Na

Die Behandlung des Natriumsalzes der Clavulansäure mit p-Nltrobenzylbromld In wasserfreiem Dimethylformamid liefert nach der Dünnschlcht-Chromatographle ein farbloses öl, das aus einem Gemisch von Chloroform und Äther kristallisiert und den p-Nltrobenzylester der Clavulansäure als weiße federartige Nadelchen vom ™ Fp. Ui bis 112°C Hefen, die nach dem Umkristallisieren einen Schmelzpunkt von !!7,5 bis 1!S°C hsben.

Beispiel 23
Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure

CH₂OH CH₂OH

CO₂Na

Unreines Natriumsaiz der 3-(^-Hydroxyathyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azablcyclo|3,2,0]heptan-2-carbonsaure, von der man annimmt, daß sie roh gerechnt 55 mg reine Substanz enthalt, wird In 6,4 ml wasserfreiem Dimethylformamid mit 0,18 ml Benzylbromld behandelt. Die Losung wird 3 Stunden unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur (etwa 17 bis 18° C) gehalten. Das Reaktionsgemisch wird an Slllkagel adsorbiert, mit Äthylacetat eiuiert und liefert Im wesentlichen In reiner Form den Benzylester der 3-(/?-Hydroxyäthyllden)-7-oxo-4-oxai-azablcyclo[3,2,0]heptan-2-carbons3ure als farbloses öl In einer Ausbeute von 63 mg.
«ο IR (Film): 1800, 1745, 1695 cm-';

NMR(CDCl₃): 2,25 (s, 1, austauschbar mit D₂O);

3,05 (d, 1.J= 17 Hz); 3,51 (dd. 1, J = 17 Hz. J₂ = 2.5 Hz);
4,24 (d, 2. J = 7,5 Hz); 4,92 (dt. 1. J = 7,5 Hz, J₂= 1,5 Hz);
5.15 (d, 1, J = 1,5 Hz); 5,24 (s, 2);
« 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz); 7,45 δ (s, 5).

Beispiel 24

Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure aus rohen Extrakten des Kulturflltrats
von Streptomyces clavullgerus

20 Liter des gemäß Beispiel 10 erhaltenen Kulturflltrats werden unter Einsatz eines Kletterverdampfcrs auf 5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird unter Verwendung eines Gefrlertrockenschranks gefriergetrocknet. Die derart erhaltenen 300 g Feststoff enthalten 3 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie mittels des /f-Lactamase-Hemmversuches festgestellt werden kann. Der Feststoff wird In 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 150 ml Benzylbromld versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 1 Liter Äthylacetat verdünnt. Dann wird das Rcaktlonsgemlsch filtriert, und das Flltrat wird auf ein möglichst geringes Volumen eingedampft. Der ollge Rückstand wird mit einem weiteren Liter Äthylacetat extrahiert. Nach dem Filtrieren des Extrakts wird das Flltrat wiederum eingedampft und man erhalt einen Ollgen Rückstand, der auf eine 7,6 χ 35,6 cm große Kieselgel-Säule (»Biogel Biosei Α« mit einer Teilchengröße von 0,15 mm) In Cyclohexan gegeben. Die Säule wird mit Cyclohcxan eiuiert, um Benzylbromld zu entfernen. Das Losungsmittel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fangt 20-ml-Fniktlonen auf. Die Fraktionen werden durch Tüpfeln auf mit Kieselgel beschichteten DUnnschlcht-Chromatographle-Glasplatten (Slllkagel 60F254) und Besprühen mit 2,3,5-Trlphenyl-tetrazoUum-chlorld-Spruh-Reagens (TTC) untersucht, um dns

Vorliegen des Benzylesters der Clavulansäure festzustellen.

Die Fraktionen, die mit diesem Reagens Intensive rote Decken liefern, werden weiterhin mittels Dünnschlcht-Chromatographle an Slllkagel-Platten unter Verwendung eines Chloroform-Äthylacetat-Gemlschcs Im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel und durch Sprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray geprüft. Der

Benzylesier der Clavulansäure zeigt bei 22" einen KyWert von 0,31. Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf 15 ml eingeengt. Diese Lösung wird nochmals Chromatographien an einer 3,8 χ 40 cm Kleselgel-Saule (»Slllkagel H, Typ 60«) mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch Im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel. Es werden 15-ml-Fraktlonen gesammelt und wie in der angegebenen Welse auf den Benzylester geprüft. Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden auf 8 ml eingeengt und nochmals durch Säulenchromatographle an einer 2,5x40 cm Kteselgel-Säule (»Slllkagel H, Typ 60«) mit einem Äthylacetat/Cyclohexan-Gemlsch Im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel gereinigt. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 160 ml reinen Benzylester als Öl.

Beispiel 25

Herstellung des Clavulansäure-benzylesters

3,3 kg eines sprühgetrockneten Feststoffes mit einem Gehall von 69,4 g Clavulansäure, wie durch den /J-Lactamase-Hemmversuch festgestellt worden Ist, werden wie in Beispiel 16 angegeben erhalten. Der Feststoff '5 wird In 5,5 Liter Dimethylformamid aufgeschlämmt und mit 500 ml Benzyibromld versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 12 Liter Äthylacetat zugesetzt. Die Feststoffe werden abfiltriert. Das föirat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Die erhaltenen 212 g Ollger Rückstand werden auf eine Säule mit einer Kieselgel-Beschickung von 10x33 cm In Cyclohexan gegeben. Die Säule wird mit 12 Liter Cyclohexan eluiert, um überschüssiges Benzytbromld zu entfernen. Das Elulerungsmlttel wird dann gegen Äthytacetat ausgetauscht. Man fängt 500-ml-Fraktlonen auf, die auf den Clavulansäure-Benzylester-Gehalt durch Tüpfeln auf Kleselgel-Dünnschlcht-Chromatographlcplattcn (»Slllkagel 60F254«) und Besprühen mit TTC-Sprüh-Reagens geprüft werden. Die intensive rote Flecken liefernden Fraktionen werden weiterhin mittels Dümwohlcht-Chromaiographle an Kieselgel mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemlsch Im Verhältnis 8 : 2 als Losungsmittel und Besprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray untersucht. Die Fraktionen Nr. 5 bis 13 enthalten den ^J5 Haupttell des Esters. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu 79,3 g öl eingedampft. Dieses öl wird dann an einer 10x46-cm-Säule von Kieselgel (»Slllkagel H, Typ 60«) mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemlsch Im Verhältnis 8:2 als Losungsmittel Chromatographien. Die Fraktionen werden wie zuvor angegeben gesammelt und ergeben beim Konzentrieren 45,9 g eines Öls, das einen Reinheitsgrad von 62% aufweist, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden Ist. *>

Dieses Produkt wird nochmals an einer 7 χ 46-cm-Säule von vernetztem Dextran (»Sephadex LH 20«) In einem Cyclohexan/Chloroform-Gemlsch Im Verhältnis 1 :1 Chromatographien. Nach der Auswahl der Fraktionen -und nach Einengen erhält man 27,6 g eines farblosen Öls, das den Clavulansäure-benzylester mit einem Reinheitsgrad von 95% darstellt, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden 1st.

Beispiel 26
Herstellung des Clavulansäure-benzylesters

150 Liter eines Kulturflltrats vom pH 7,0 mit einem Gehalt von 16,2 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, *° wie bei dem /t-Lactamase-Hemmversuch festgestellt worden Ist, werden mit 5 kg eines Anlonenaustauscherharzes in der Chloridform (»Amberlyst A 26«) I Stunde bei Raumtemperatur verrührt. Das Harz wird dann abfllirlen. Das Flltrat wird nochmals geprüft und zeigt, daß 6,4 g Clavulansäure entfernt worden sind. Das Harz wird mit 20 Liter entsalztem Wasser, dann mit 20 Liter Aceton und schließlich mit 10 Liter Dimethylformamid gewaschen. Nach nochmaligem Filtrieren wird das Harz In 2,3 Liter Dimethylformamid mit einem Gehalt von *^s 0,2 m-Natrlumjodld suspendlen. Ferner werden 200 ml Benzyibromld zugesetzt. Die Suspension wird gut j

gerührt. Nach lostUndlgcm Stehen bei Raumtemperatur fügt man 2 Liter Äthylacetat hinzu, filtriert dann das |

Harz, ab, wäscht es wiederum mit Äthylacetat und vereinigt die Waschwässer mit dem Flltrat. Der Fxtrakt wird ¥

dann auf ein geringes Volumen eingeengt und an einer 7,6x46-cm-Kleselgel-Säule (»Slllkagel H, Typ 60«) mit %

einem Älhylacetat/Cyclohcxan-Gemlsch Im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel Chromatographien. Die den ⁵⁰ fj

Clavulansäure-benzylcster enthaltenden Fraktionen werden ausgewählt. Indem man auf Kleselgel-DOnnschlchi-Chromatographleplatten tüpfelt und mit TTC-Reagens wie Im vorstehenden Beispiel 24 angegeben besprüht. Die ausgewählten Fraktionen werden dann auf 20 ml eingeengt und dann an einer 3,8x46-cm-Kieselgel-Säule (»Slllkagel H, Typ 60«) mit einem Chloroform/Äihylacetat-Gemlsch Im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel Chromatographien. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und zu einem farblosen öl eingedampft. Man erhält ^ss 440 mg Clavulansäurebenzylester mit einem Reinheitsgrad von 90%, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden Ist.

Beispiel 27

Herstellung des Clavulansäure-benzylesters aus rohen Extrakten eines Kulturflltrats
von Slreptomyces clavuligerus

Ein aliquoter Teil eines wäßrigen Ruckextraktes aus einem Butanol-Extrakt eines Kultuiflltrats, das wie In Beispiel 14 beschrieben erhallen worden Ist, wird In einem Gefrlertrockenschrank gefriergetrocknet. Ein Anteil von 24 g des erhaltenen Feststoffes weist einen Gehalt von 0,96 g des Natriumsalzes der Clavulansäure auf, die durch'den /J-Lactamuse-Hemmvcrsuch bestimmt worden Ist. Dieser Feststoff wird In 75 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert. Dunn werden 75 ml Benzyibromld zugegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Suspension mit 500 ml Äthylacetat verdünnt. Nach dem Filtrieren des Gemisches wird das Flltrat unter vermindertem Druck auf einem Drebverdampfer zu einem Ollgen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird auf eine 5 χ 35,5.Cm-KIeSeIgCl-SaUIe (»Blogel Blosll A« von einer Teilchengröße unter 0,15 mm) in Cyclohexan gegeben. Aus der Säule wird Benzylbromld eluleit. Dann wird das Lösungsmittel gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man sammelt 10-ml-FraktIonen, wobei man den mit einem Gehalt an Clavulansaure-benzylester wie in Beispiel 24 angegebenen auswählt. Eine weitere Reinigung wird auch durch S&ulenchromatographie, wie in Beispiel 24 angegeben, erreicht. Bei diesem Verfahren erhalt man 220 mg des reinen Benzylesters.

ίο Beispiel 28

Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure
,CH₂OH _ /CH₂OH

CO₂CH₂C₆H₅ O CO₂Na

281 mg Im wesentlichen reiner Clavulansaure-benzylester in 25 mi Äthanol mit einem Gehalt an 82 mg Natriumbicarbonat werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck In Gegenwart von 90 mg 10% Palladium auf Kohle hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und Waschen mit Wasser und Äthanol werden die vereinigten Filtrate unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingedampft. Der halbfeste Rückstand wird mit Aceton ι errieben, filtriert und mit Äther gewaschen. Man erhalt 135 mg df 5 Natriumsalzes der Clavulansäure.

Beispiel 29
Hydrolyse des Clavulans&ure-methylesters zu Clavulansäure

2.17 mg Clavulansavre-methylester werden In 0,1 ml Methanol gelöst und mit 0,208 ml einer 0,0482 n-Natrlumhydroxldlösung behandelt, "!lach 1 Stunde bei Raumtemperatur enthalt das Rcakllonsgemlsch verschiedene Produkte. Die Dünnschlcht-Chromatographle zeigt an, daß einer der Hauptbestandteile einen R_rWert besitzt, der mit dem des Natriumsalzes der Clavulansäure Identisch Ist. FarbreaktIonen und der biologische Versuch bestätigen, daß es sich um das Natriumsalz der Clavulansäure handelt.

Eine langsame Umwandlung des Esters In Clavulansäure wird dann festgestellt, wenn man 1 mg/ml der Verbindung bei 37° C In einer 0,05 m-Phosphatpufferlösung bei pll 7 stehen laßt. Der Rtaktjon schließt sich eine Papierchromatographie (bloautographlsches System) unter Verwendung eines Butanol/Äthanol/Wasser-Systems an, wobei die Reaktion Über einen Zeitraum von 2 Stunden beobachtet wird. Dabei verkleinert sich die Zone des Methylesters mit einem R_rWert von 0,79 und vergrößert sich die Zone der Clavulansäure mit dem Ry-Wert von 0,12.

Beispiel 30

Herstellung von Clavulansäure

100 mg Clavulansaure-benzylester In 5 ml Äthanol werden 45 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck In Gegenwart von 30 mg eines 10% Palladlum-auf-Kohlc-Katalysators hydriert. Der Katalysator wird abflltrlert und mit Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhalt 58 mg Clavulansäure als Instabiles viskoses öi.
NMR(CjDsN): 3,05 (d, 1, J= 18 Hz); 3,60 (dd, 1, J₁ = 18 Hz,
J₁ = 2.5 Hz); 4,75 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,58 (I, 1,
J = 7,5 Hz); 5,66 (s, 1); 6,0 <5 (d, I, j = 18 Hz).

Beispiel 31
Extraktion von Clavulansäure unter Verwendung von flüssigen Ionenaustauscherharzen

200 mg eines Kulturflltrats, das In ähnlicher Welse wie In Beispiel 3, jedoch unter Verwendung eines Mediums mit einem Gehalt an 0,1 Volumenprozent KHjPO« anstelle von 0,01% FeSO< · 7H₂O erhalten worden Ist, wird 30 Minuten bei 5" C mit 66 ml »Amberllte LA2« In der Chloroform mit 15 Volumenprozent Methyllsobutylketon extrahiert.
-Die Phasen werden durch 20mlnütlges Zentrifugieren mit 1660 g getrennt. Die Lösungsmittel phase (60 ml)

^A> wird mittels einer Pipette entnommen und In vier gleiche Anteile aufgeteilt. Jeder Anteil wird durch 2OmInUtI-ges Rühren bei 5" C mit einem Viertel des Volumens (3,75) eines wäßrigen Extraktlonsmlttels, wie es nachstehend In der Tabelle angegeben Ist, extrahiert. Das erhaltene Gemisch wird 15 Minuten zentrifugiert (1660 g). Aus jeder Extraktion werden 3,6 ml einer waUrlgen Phase gewonnen.

	25	60 074	Clavulansäure (mg)
Probe	Volumen	CIaV₁₁Ia₁₁SuU-C-
	(ml)	Konzentration
		(uS/ml)	25,4
geklärte Bouillon	200	128	3.0
extrahierte Bouillon	200	15	1,1
m-NaCI-Extrakt	3,6	305	2,5
2m-NaCI-Extrakt	3,6	598	2,3
m-NaNOj-Extrakt	3,6	638	2.73
2m-NaNO₁-Extrakt	3,6	758

Das mit 2-m Natriumnitrat erhaltene Ergebnis zeigt die Gewinnung von 4.« Prozent aus einer geklärten Nährbouillon an.

Das mit 2 m-Natrlumnltrat erhaltene Ergebnis zeigt die Gewinnung von 43% aus einer geklärten Nährbouillon an.

Beispiel 32
Extraktion der Clavulansäure unter Verwendung eines flüssigen Ionenaustauscherharzes

47 Liter der nach Beispiel 12 erhaltenen geklärten Bouillon werrfsn mit 12,5 Liter »Amberllte LA2« In der is Acetatform In 15 Volumenprozent Methyllsobutylketon durch lstündlges Rühren bei 17° C extrahiert. Nach Zusatz von 500 ml Octan-1-öl werden die Phasen In einer kontinuierlichen Zentrifuge separiert, wobei man 9,2 Liter der Lösungsmlttelphase erhält, die dann bei 5° C 90 Minuten mit 2,3 Liter einer 1 m-Natriumnltratlösung verrührt wird. Das Gemisch wird mittels einer kontinuierlichen Zentrifuge aufgetrennt und ergibt 2,4 Liter einer wäßrigen Phase (einschließlich des für Verdrängungszwecke verwendeten Wassers). Die wäßrige Phase, deren 30 ursprünglicher pH-Wert 8,0 war, wird mittels konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

Probe Volumen Clavulansäure- Clavulansäure (mg)

(Liier) Konzentration

C	H	N .
41,01	3,77	5,68*
40,86	1,64	5,51

geklärte Bouillon 47 146 6862

extrahierte Bouillon 47 1° 893 *°

m-NaNO_rExtrakt 2,4 1638 3931

Die üxtraklion.swirk.samkcil aus der geklärten llnuillon beim Nalriuninitral-Kxtrakl beträgt 57 Prozent.

BeISp¹Cl 33
Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

840 mg Clavulansäure-benzylester In 30 ml Äthanol und 5 ml Wasser werden 25 Minuten bei .Raurhtempera- 50 tür und Normaldruck In Gegenwart von 267 mg 10%lgem Palladium auf Kohle und 244 mg Natrlumblcarbonat hydriert. Der Katalysator wird abflltrlert und ml; Wasser und Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt wirf ims einem Gemisch von Wasser und Aceton umkrlstalllslert. Man erhält 565 mg Mikronadeln. Umkristallisieren aus einem Gemisch von Wasser und Aceton Hefen Nadeln, die nach 24stündlgem Trocknen über PjO₅ unter vermindertem Druck die nachstehende Analyse 5S₁ liefern:

IR (KBr-Platte): 1785, 1700, 1620 cm¹; NMR (D₂O): 3,06 (d, 1, J = 18,5 Hz); 3,57 (dd, 1, J, = 18,5 Hz, J₂ = 2,5 Hz); 4,15 (d, 2, J = 8 Hz); 5,3 (HOD); 4,9 (m);

5.71 (J, I, J = 2,5 Hz). 65

Beispiel 34
Clavulansaure-nalrlumsalz (als Tetrahydrat)

.5 Eine Losung von 93 g Clavulansäurc-benzylester In 2,! Liter eines Gemisches von Äthanol/Wasser im Verh&ltnls 6:1, das 27 g Natriumcarbonat enthalt, wird Ober 15 g IO%lgem Palladium auf Kohle 25 Minuten bei Raumtemperatur und Atmosphflrendruck hydriert. Der Katalysator wird durch ein Bett von fein verteilter Diatomeenerde abfiltriert, das Flltrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der kristallisierte Feststoff wird In etwa 300 ml Wasser aufgelöst und unter starkem Rühren mit 4 Liter Aceton verdünnt. Das Gemisch wird

ίο auf 2 bis 3° C abgekühlt, der kristalline Feststoff wird ges?mmelt. mit Aceton gewaschen und unter schwach vermindertem Druck getrocknet. Man erhalt 58 g Clavulansäure-natrlumsalz-tclrahydrat mit einer Reinheit gemäß der Hochdruck-Flüsslgchromatographle von 74,4% (75.8%= l00%iges Natriumsalz ■ 4MjO) und einem Wassergehalt von 24,3 ± 0,5%.

i) Bekannte Verunreinigungen:

IsoclavulansBure-natrlumsalz 1,3% Hochdruck- Desoxyclavulansaure-natrlumsalz 0,5% Flüssigchromatographie Lösungsmittel < 0,! %

optische Drehung a = 47.10° (c= I In Wasser)

Diese Reaktion kann man auch In anderen herkömmlichen Lösungsmitteln, wie Tetrahydrofuran, durchführen.

Beispiel 35

Clavulansaure-Ilthlumsalz

Eine Lösung von 1,68 g Clavulansäure-benzylester In 70 ml eines Gemisches von Äthanol/Wasser Im Verhältnis 6 1, das 0,43 g Lllhlumcarbonai enthalt, wird Ober IO%lgem Palladium auf Kohle 30 Minuten bei M Raumtemperatur und Atmosphärendruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, das Flltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird In 10 ml Wasser gelöst und mil '00 ml Aceton versetzt. Die Lösung wird abgekühlt, der kristalline Feststoff wird gesammelt, mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhalt 250 mg des gewünschten Llthlumsaizcs. Durch Verdünnen mit weiteren 100 ml Aceton erhalt man weitere 300 mg. Das Produkt Ist 96.6% rein (ausgenommen Wasser). |*]# = + 60* « (c = 0.2 In Wasser).

Diese Reaktion kann man auch in anderen herkömmlichen Lösungsmitteln durchführen, wie Tetrahydrofuran.

Das IR-Spektrum (KBr-Schelbe, Konzentration: 0.4 Gewichtsprozent) Ist In Flg. 1 wiedergegeben.

⁴» Beispiel 36

Clavulansäurc-kallumsalz Eine Lösung von 4,5 g Clavulansäure-benzylester In 110 ml Äthanol wird über 10%lgem Palladium auf Kohle

•>5 40 Minuten bei Raumtemperatur und Aimospharendruck hydriert. Der Katalysator wird abflltriert, die Lösung

wird mit einer Lösung von 1,65 g Kallumblcarbonat In 11 ml Wasser versetzt. Das Äthanol wird fast bis zur

Trockne unter vermindertem Druck entfernt. Der zurückbleibende Sirup wird In 200 ml 10%lgem wäßrigem Aceton gelöst und unter Kühlen und Rühren mit 500 ml Aceton versetzt. Das auskristallisierte Clavulansäure-

kaliumsalz (1,9 g) wird gesammelt, mit Aceton gewaschen und unter schwach vermindertem Druck getrocknet.

Dieses kristalline Salz hat eine Reinheit von 97,7% (ausgenommen der Wassergehalt von 1,5%). Das IR-Spektrum (KBr-Schelbe, Konzentration: 0,4 Gewichtsprozent) Ist In F1 g. 2 wiedergegeben. ·>

Beispiel 37
Herstellung des Clavulansäure-benzylesters durch Umsetzen von Clavulansaure-Illhiumsalz mit Benzylbromld

2,06 g Clavulansaure-Ilthlumsalz, 1,71 g Benzylbromld und 50 ml Dimethylformamid werden 130 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird bei einer Temperatur unter 30° C unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand wird mit 100 ml Äthylacetat verdünnt. Der Feststoff wird abfiltriert, das Flltrat ^Wl wird auf etwa IC ml eingeengt. Diese Lösung wird auf einer Säule, die einen Durchmesser von 2,54 cm und eine Länge von 45,72 cm hat und mit vernetzten) Dextran gefüllt Ist, mit Chloroform/Cyclohexan Im Verhältnis 1:1 Chromatographien. Die den gewünschten Clavulansaure-benzylesler enthaltenden Fraktionen (Dünnschlchtchromatographle) werden vereinigt und eingedampft. Man erhalt 3.5% des gewünschten Clavulansäurebenzyiesiers In reiner Form. (Das NMR-Spektrum entspricht dem des Produkts von Beispiel 23).

Beispiel 38
Clavulansaure-trlmtlhylamln.sal/

lilne I.Osung von 4,6 mMol Clavulansäure in 30 ml Tetrahydrofuran wird mit 1,0 ml einer Lösung von 25 g Trlmcthylamln In KK) ml Methanol (etwa 4,2 mMol) versetzt. Man erhalt eine schwach gelbe Lösung, die durch Beimpfen und Stehenlassen bei Raumtemperatur kristallisiert. Die Kristallisation erfolgt rasch, man erhalt feine Nadö?-', und Ist nach dem Stehenlassen über Nacht bei 4° C vollständig.

Das Produkt wird abflltrlert, mit etwa 5 ml frischem Lösungsmittel gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 0,9 g (75%), Fp. > 310° C, wobei das Produkt bei etwa 130° C langsam braun wird.

C % H % N %

C₁₁H₁₁N₁O, gef.: 51,32 7,15 10,68
ber.: 51,16 7,02 10.84

Beispiel 39
Herstellung von Clavulansüure-Illhiumsalz

Eine Lösung von 0,84 g Clavulansaure-benzylester In 30 ml Äthanol wild mit 5 ml einer wäßrigen Lösung von LlHCOi vermischt, die In der nachstehenden Welse hergestellt worden Ist.

14 g Llthlumcarbonal werden bei einer Temperatur von 5 bis 10° C In 480 ml Wasser suspendiert und dann !eitel man wahrend 8 Stunden einen standigen Strom von Kohlendloxid durch die Suspension, bis eine klare Lösung gebildet worden Ist. Anschließend wird mit Wasser, das mit Kohlendloxid gesattigt Ist, bis zu einem j

Volumen von 500 ml aufgefüllt. Diese Lösung enthält je 100 ml 5,15 Gewichtsprozent LIHCOj.

Das Lösungsgemisch wird 25 Minuten lang bei Umgebungstemperatur (etwa 20° C) Ober 0,27 g Aktivkohle, die 10% Palladium enthalt, hydriert. Mittels Dünnschlchtchromatographle wird zu diesem Zeitpunkt festgestellt, f

daß kein Ausgangsmaterlal mehr vorliegt. Der Katalysator wird abflltrlert, mit 5 ml Wasser und anschließend I

mit 5 ml Äthanol ausgewaschen und die Waschfiüsslgkelten mit dem Flltrat vereinigt. Man engt dieses Gemisch unter vermindertem Druck ein. Der sich ausscheidende kristalline Rückstand wird mit 25 ml Aceton angc.leben und der Feststoff abflltrlert, dann mit 10 ml Aceton gewaschen und über Phosphorpentoxld getrocknet. Man erhalt so 0,41 g eines festen Produktes.

Dieses Produkt wird In 3 ml Wasser aufgenommen und dann setzt man langsam Aceton hinzu, bis die Kristallbildung beginnt. Man kühlt 20 Minuten lang auf 2 bis 3⁰C und sammelt dann eine erste Kristallausbeute, die mit wenig Aceton ausgewaschen und Im Vakuum getrocknet wird. Die Ausbeute betragt 80 mg. Das Flltrat wird mit der gleichen Volumenmenge Aceton verdünnt und wiederum abgekühlt. Auf diese Welse erhalt man eine weitere Krlst.aHausbeute von 80 mg.

Die Analyse zeigt, daß die erste Krlstallausbeutc aus Clavulansäure-llthlumsalz mit einem Reinheitsgrad von 84.3% besteht, wahrend die zweite Ausbeule dem betreffenden Lithiumsalz einen Reinheitsgrad von 85.1% aufweist. *°

Beispiel 40
Herstellung von Clavulansaurc-Ilthlumsalz

Eine Lösung von 1 g Clavulansaure-benzylester In 50 ml Äthanol wird 30 Minuten bei Umgebungstemperatur und Umgebungsdruck Ober Aktivkohle mit 10% Palladium hydriert. Anschließend wird der Katalysator abflltrlert und das Flltrat mit 80 ml Wasser verdünnt.

Diese Clavulansaurelösung In einem Gemisch aus 50 ml Äthanol und 80 ml Wasser wird mit l,0molarer Lithiumhydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 7,5 titriert. Die Lösung wird dann unter vermindertem Druck bis auf etwa 2 ml eingeengt und der Rückstand mit 50 ml Aceton angerleben. Der sich ausscheidende Feststoff wird abflltrlert, mit Aceton und anschließend mit Diethylether gewaschen und dann an der Luft getrocknet. Man erhalt so 0,62 g praktisch farbloser Kristalle, file aus dem betreffenden Lithiumsalz mit einem Reinheitsgrad von 83,2% bestehen.

Diese Kristalle werden In 5 ml Wasser aufgelöst und dann gibt man sie auf eine Austauschersaule mit 50 g Cellulose und eluiert mit einem Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Äthanol und Wasser Im Verhältnis 4:1:5. Der Eluierungsvorgang wird mittels Dünnschlchtchromatographle unter Verwendung von Kieselgel und dem gleichen Lösungsmittelgemisch verfolgt. Die verschiedenen, die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen werden in zwei Fraktionsschnitten zusammgenfaßt. Die beiden Schnitte werden Im Vakuum getrennt zur Trockne gebracht, dann mit 10 ml Aceton angerleben, der Feststoff abflltriert und Im Vakuum getrocknet. Der erste Schnitt liefert 0,21 g Lithiumsalz der Clavulansäure mit einem Reinheitsgrad von 98,0% und der zweite Schnitt liefert 0,12 g des betreffenden Lithiumsalzes mit einem Reinheitsgrad von 98,5%.

Beispiel 41

Herstellung von Clavulansäure-llthiumsalz Lithlumsali mit einem schlechten Reinheitsgrad, das wesentliche Mengen an anorganischen Verunreinlgun-

gen enthalt, wird als Ausgangsmaterial verwendet. 2 g dieses verunreinigten Lithiumsalzes werden In IS ml entionisiertem Wasser aufgelöst und dann auf eine lonenaustauschersäulc (Blogel P2) aufgegeben, die mit entlonlslertem Wasser elulert wird, das 1% n-Butanol enthalt. Man arbeitel bei einer Temperatur von 10° C und sammelt jeweils Fraktionen von S ml. Proben dieser Fraktionen werden auf Filterpapier aufgetüpfelt und dann mit TTC-Reagens besprüht, um das Lithiumsalz festzustellen. Außerdem werden Proben von 0,1 ml entnommen und zu 0,5 ml Sllbernltratlösung zugesetzt, um die Chlorldfrclhelt festzustellen. Die keine Chlorionen enthaltenen Fraktionen Nr. 25 bis 31 werden vereinigt und auf 10 ml aufkonzentriert. Durch Zusatz von Aceton wirf dann das Lithiumsalz aufgefallt. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält so 0,93 g Salz. Die Analysenergebnisse bezüglich der Reinheit und Zusammensetzung des Ausgangsmaterials Im Vergleich zum Endprodukt sind nachstehend wiedergegeben.

	Beispiel 42	Ausgangs-	Endprodukt
	malcrial
Reinheitsgrad gemäß
a) Hochdruck-Flüssigchromatographie	68%	91,4%
b) gemäß Imidazol-Methodc	69,6%	94,45%
Lithiumgehalt	6,43%	3,62%
Wassergehalt	7,9%	1.2%

Herstellung des DlclavulansBure-calclumsalzes In der Dlhydratform

Eine Lösung von 2,89 g Clavulansäure-benzylester In einem Gemisch aus 103 ml Äthanol und 17 ml Wasser wird bei Umgebungstemperatur und Atmospharendruck über 0,92 g Aktivkohle mit 10% Palladium und In

3" Anwesenheit von 0,55 g Calelumcarbonat (10%lger Überschuß) hydriert. Der Verlauf der Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt (Äthylacetat bzw. Slllkagel) und nach 30 Minuten wird die Hydrierung beendet, da dann Im Dünnschlchtchromatogramm keine nlcht-umgesetzten Estermengen mehr festgestellt werden können. Die Mischung wird unter vermindertem Druck bei Umgebungstgemperatur auf etwa 25 ml eingeengt, mit 50 ml Wasser verdünnt und dann werden der Katalysator und überschüssiges Calclumcarbonat über einem Bett aus Calclumcarbonat abfiltriert.

Das Flltrat wird bei Umgebungstemperatur Im Vakuum zu einem Sirup eingeengt, der beim Ankratzen zu kristallisieren beginnt. Der größte TeIi des noch vorhandenen wassers wird unter vermindertem Druck langsam abgedampft, wobei eine pastenartige Masse aus Kristallen zurückbleibt. Diese wird mit 50 ml Aceton angerleben, dann wird das unlösliche Material abflltrlert, mit 25 ml Aceton und 25 ml Äther ausgewaschen und dann

*o bei Umgebungstemperatur an der Luft getrocknet. Man erhalt so 2,0 g eines schwach aprlkosenfarbenen, kristallinen Feststoffes. Pe-r Reinheitsgrad des Clavulansäure-calclumsalzes In der Dlhydratform wird zu etwa 92* bestimmt. Der Wassergehalt, bestimmt nach der Methode von Karl Fischer, betragt etwa 8,7%.

Beispiel 43

■ Herstellung von Clavulansöure-calclumsalz In der Dlhydratform

Eine Lösung von 1,6 g Clavulansäure-benzylester In 17 ml Methanol und 3 ml Wasser wird bei einer Temperatur von 25° C 25 Minuten l&ng über 0,8 g Calclumcarbonat mit einem Palladlumgehalt von 5% hydriert. Anschließend wird der Katalysator abflltrlert, mit 2 ml Wasser ausgewaschen und das Gemisch aus Waschwasser und Flltrat unter vermindertem Druck zu einem schwach strohfarbenen Sirup (weniger als 5 ml) eingeengt. Dieser Sirup wird allmählich mit Insgesamt 100 ml Acetonitril versetzt. Die kristalline Ausfallung wird abflltrlert. mit 5 ml Acetonitril und dann mit 5 ml eines Gemisches aus Aceton und Äther (1:1) gewaschen. Schließlich trocknet man an der Luft und erhalt so 0,9 g eines hell-strohfarbenen, nlcht-hygroskoplschen krlstalgj ⁵⁵ linen Feststoffes.

Der Reinheitsgrad wird zu etwa 91% bestimmt, wobei die Hauptverunreinigung Calclumcarbonat 1st. Der Wassergehalt, bestimmt nach der Methode von Karl Fischer, betragt etwa 7,4 Gewichtsprozent.

Beispiel 44

60

Herstellung des Diclavulansaure-calclumsalzes In der Form des Dihydrates

9 g durch Gefriertrocknen erhaltenes Clavulansaure-natrlumsalz mit einem Reinheitsgrad von etwa 60% werden In 100 ml entionisiertem Wasser aufgelöst. Df^ise Lösung wird durch ein Bett (310 ml) eines lonenaus-^(>* tauschcrharzes In der Chloridform (Permulll Zcrolll FF iP SRA-62) mit einer Geschwindigkeit von 5 rni pro Minute hindurchgeleitet. Nachdem die Säule mit der Lösung beladen Ist, wird sie mit einer dem Bettvolumen entsprechenden Menge an Wasser gewaschen. Anschließend wird die Säule mit O,25molarer Calclumchloridlösung mit einer Geschwindigkeit von 3 ml pro Minute eiulert. Es werden 15-ml-Fraktlonen gesammelt und die

das Clavulansäuresalz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Die Analyse auf das gewünschte Salz erfolgt mittels Papierchromatographie untei Verwendung von Ehrllch's Reagens. Die vereinigten Fraktionen mit einem Gesamtvolumen von 480 ml werden mit Calclumthlorldlösung bis zu einer 0,5molaren Endkonzentration behandelt und dann durch eine Säule durchlaufen gelassen, die mit 1240 ml eines Austauscherharzes (Typ XAD-4) beschickt Ist, das sich (n einer 0,5mola-en Calclumchlorldiösung befindet. Die Durchlaufgeschwlndlgkelt beträgt 10 ml/Mlnutc. Nachdem die gesamte Lösung von der Kolonne aufgenommen worden Ist, wird das Harzbett mit 100 ml 0,5molarer Calclumchlorldlösung gewaschen. Anschließend elulert man mit entionisiertem Wasser bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/Minute. Es werden 15-ml-Fraktlonen gesammelt und auf "vorliegendes Clavulansäuresalz In der angegebenen Welse getestet. Außerdem wird die Chloridfreiheit mittels Silbernitrat geprüft. Die das chlorlonenfrele Clavulansäuresalz enthaltenden Fraktionen werden zu einem ι» Gesamtvolumen von 1800 ml vereinigt und dann unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt. Zur Verhinderung der Schaumbildung setzt man 1 ml 1-Butanol hinzu und setzt das Einengen fort, bis sich eine ; pastenartige Masse gebildet hat. Beim Anreiben mit 25 ml Aceton bildet sich ein kristalliner Feststoff, der abgefiltert, m!t 10 ml Dläthylather ausßewaschen und bei Zimmertemperatur an der Luft getrocknet wird. Man erhält so 3,44 g kristallines Dlclavulansaure-calclumsalz In der Dlhydratform mit einem Reinheitsgrad von etwa is 79%.

Eine Probe von 1,3 g dieses Materials wird In der geringstmöglichen Menge Wasser (10 ml) aufgelöst und ■ diese Lösung gibt man auf eine Säule mit 80 g Cellulose, die von oben mit einem Gemisch aus n-Butap.q!/Äthanol/Wasser Im Verhältnis 5: ! : 5 beschickt worden !st. Man elulert die SSuIe mit dem gleicher. Lösungsmlttelfcemlsch. Man verfolgt den Elulerungsvorgang durch Dünnschtchtchromatographle auf Kieselgel M unter Verwer. iung des gleichen Lösungsmlttdgemlsches und Besprühen mit einer 0,02 m-Permanganatlösung.

(Als Lösungsmittelsystem für die Dünnschichtchromatographie kann man auch ein Gemisch aus Chloroform/Äthanol/Esslgsäure Im Verhältnis 7:7:1 verwenden.) Die mittleren Fraktionen werden entnommen, vereinigt und anschließend bei Umgebungstemperatur unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird In 70 ml Wasser aufgelöst, durch ein Bett aus Aktivkohle auf Kieselgur filtriert und das Fitrat » langsam unter vermindertem Druck eingeengt, bis die Kristallisation beginnt. Sobald eine pastenartige Kristallmasse zurückbleibt, wird diese mit 25 ml Aceton und anschließend mit 25 ml Äther angerleben. Man trocknet an der Luft und erhalt so 0,55 g kristallines Dlclavulansaure-calclumsalz In der Dlhydratform mit einem Reinheitsgrad von etwa 94*.

Beispiel 45
Herstellung von Dlciavulansäure-calclumsalz In der Dlhydratform

Die 480 ml kombinierte Gesamtfraktion, die gemäß Beispiel 41m aus der mit Zerollt FFIP-Harz gefüllten ^J5 Kolonne erhalten werden, konzentriert man unter vermindertem Druck bis auf 20 ml und gibt sie dann auf ein Bett, welches aus Bio Rad Biogel P2 aufgebaut Ist. Diese Kolonne wird mit entionisiertem Wasser elulert und es werden 15 ml-Fraktlonen gesammelt. Die das gewünschte Calclumsalz enthaltenden Fraktionen werden mittels Paplerchromatographle unter Verwendung von Ehrllch's Reagens ermittelt. Außerdem vird die Chloridfreiheit der Fraktionen mittels Sllbernitratlösung geprüft. Die chlorlonenfrelen, das Calclumsalz enthaltenden Fraktionen « werden vereinigt. Die weitere Behandlung erfolgt wie In Beispiel 44 angegeben. Man erhält so kristallines Clavulansäure-calclumsalz In der Dlhydratform, welches demjenigen von Beispiel 44 entspricht.

Beispiel 46

Herstellung von Clavulansäure-kallumsalz

Unreines Natriumsalz der Clavulansäure In einer Menge, welche 205 g reiner freier Säure äquivalent Ist, wird In 20 Liter Wasser aufgelöst und diese Lösung gibt man durch eine Sflule (Volumen 6 Liter), die aus einem : Austauscherharz In der Chloridform aufgebaut Ist (Zerollt KK Ip SRA 61), wöbe! die Durchflußgeschwindigkeit so 0,2 Liter/Minute beträgt. Das beladene Harz wäscht man mit einer 0,1 m-Kallumchloridlösung ?us und dann wird das Produkt mit 0,3 m-Kallumchlorldlösung bei einer Geschwindigkeit von 0,14 Liter/Minute elulert. Zu diesem Eluat gibt man so viel festes Kaliumchlorid hinzu, daß die Kallumchlorldkonzentratlon Insgesamt 1 molar 1st. Dann läßt man diese Lösung durch eine Säule (Volumen 20 Liter) laufen, die mit einem lonenaustauscherharz (Amberllte XAD-4) gefüllt Ist, das vorher mit 1,0 m-Kallumchloridlösung ins Gleichgewicht gesetzt worden Ist. Das Produkt wird unter Verwendung von entionisiertem Wasser mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,15 Liter/Minute elulert. Man erhält so 18 Liter Eluat, die 10 Minuten lang mit 80 g Aktivkohle kontaktiert werden. Anschließend filtriert man die Kohle ab. Die Lösung wird dann durch umgekehrte Osmose bis zu einem Volumen von 2,24 LUer aufkonzentriert und das Konzentrat gefriergetrocknet. Man erhält so 167 g eines festen Produktes.

100 g dieses Materials werden in 1,2 Liter Wasser aufgelöst und dann auf 5O⁰C abgekühlt. Man setzt abgekühltes Aceton solange hinzu, bis kein öliges, gelblich-gefärbtes Material mehr ausfällt. Hierzu sind 24 Liter Aceton erforderlich. Die ausgefällten Verunreinigungen werden abfiltriert und dann wird das Filtrat in zwei gleiche Teile aufgeteilt. Zu jedem Teil werden 10 Liter Aceton zugesetzt. Es fällt kristallines Kaliumsalz der Clavulansäure aus und wird abrutrtert, mit Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet. Der erste Anteil liefert ei 24,5 g des Salzes mit einem Reinheitsgrad von 98,6%. Der zweite Anteil liefert 26,0 g des Salzes mit einem Reinheitsgrad von 99,4*.

Beispiel 47 |

Herstellung von ClavulansSure-kallumsalz

Eine Lösung von 2,89 g Clavulansaure-benzvlester guten Reinheitsgrades In einer Mischung aus 100 ml Äthanol und 17 mi Wasser wird bei Umgebungstemperatur und Atmosphärendruck In Anwesenheit von 1,0 g fein verteilten Kaliumcarbonat Ober 0,92 g Holzkohle mit 10% Palladium hydriert. Nach 30 Minuten Hydrierzeit I bestätigt die dünnschlchtchromatographlsche Untersuchung, daß die Mischung nur noch Spuren ac nicht-umge- \· setztem Benzylester enthalt. %

Der Katalysator wird abfiltriert, mit 10 ml Wasser sowie 10 ml Äthanol ausgewaschen. Das vereinigte Flltrat %

und die Waschwässer, die einen pH-Wert von 7 aufweisen, werden unter vermindertem Druck und bei Umge- |

bungstemperetur unter Bildung eines schwach gelb färbenden Sirups eingedampft. Dieser Sirup wird in 17 mi %

Wasser gelost und mit 450 ml Aceton verdünnt. Die trübe Mischung wird Ober Kieselgur nitriert und das Flltrat f

mit 1 Liter Aceton verdünnt. Darauf beginnt die betreffende Verbindung auszukrlstalllsieren. Man laßt 30 |

^!S Minuten bei Raumtemperatur stehen und filtriert dann die gebildeten Kristalle ab, wascht sie mit 50 ml Aceton f

aus und Irocknet sie Im Vakuum. Man erhalt so 0,75 g des Kaliumsalzes in Form eines farblosen kristallinen rf

Feststoffes, der einen Reinheitsgrad von 98,5% aufweist und praktisch wasserfrei Ist (der Wassergehalt betrögt ;J

nur etwa 0,2 bis 0,3»). j

ie Beispiel 48

Herstellung von Cluvulansaure-trimethylammonlumsalz

Man stellt zunächst eine Losung von Trimethylammonlumcarbonat her. Indem man 5 g Trlmethylamln In 50 ' ml eiskaltem Wasser auflöst und dann solange Kohlendloxid In raschem Strom durch die Lösung leitet, bis der pH-Wert der Losung etwa 8,5 betragt. Durch Titration mit 1,0 m-Chlorwasserstoffsaure unter Verwendung von Methylorange als Indikator wird festgestellt, daß die Konzentration der Lösung an Blcarbonat 0,4 m Ist.

Zu einer Lösung von 2,89 g Clavulensäure-benzylester In 100 ml Äthanol setzt man 0,9 g Aktivkohle mit 10% Palladium sowie 25 ml der vorstehend angegebenen 0,4 m-Lösung von Trimethylammonlumblcarbonat hinzu. Diese Mischung wird bei Umgebungstemperatur und Atmosph&rendruck 30 Minuten lang hydriert. Zu diesem Zeltpunkt zeigt eine dünnschlchtchromatographlsche Untersuchung, daß kein Benzylester mehr vorliegt. Der Katalysator wird abfiltriert und mit 30 ml Äthanol sowie 10 ml Wasser ausgewaschen. Das Flltrat wird im Vakuum eingeengt unter Bildung eines braun gefärbten Öls. Das öl wird mit 50 ml Aceton angerleben und beginnt dann zu kristallisieren. Die Kristalle werden abfiltriert, mit 10 ml Aceton und 10 ml Äther ausgewasehen und Im Vakuum getrocknet. Man erhält so 0,84 g hellbraun gefBrbtes kristallines Clavulansaure-trlmethylammonlumsalz. Durch Hochdruck-FJQsslgchromatographle wird festgestellt, daß der Reinheitsgrad, bestimmt als freie SSure, 68,7% betragt und bentlmmt als Trlmethylammonlumsalz, 89,1%.

IR (KBr) ν : 3320 (breit, mit scharfer Spitze), 1775. 1690. 1590-1620 cm -'.

40

Mittels des NMR-Spektrums wird bestätigt, daß keine Deoxyverblndung vorhanden Ist.

Beispiel 49
vs Herstellung von Clavulansäure-alumlnumsalz

Eine Lösung von 2,89 g Cl&vulansaure-benzylester und 0,68 g Alumlnlumlsopropylat In 150 g trockenem redestilliertem Tetrahydrofuran wird 40 Minuten lang über 0,86 g Aktivkohle mit 10% Palladium hydriert. Zu diesem Zeltpunkt zeigt die dünnschichtchromatographlsche Untersuchung, daß kein nlchl-umgesetzter Benzyl-

so ester mehr vorliegt. Der Katalysator wird abfiltriert, mit 20 ml Tetrahydrofuran gewaschen und das Flltrat Im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit 100 ml Aceton angerleben und der sich ausscheidende Feststoff abfiltriert. Man trocknet über Phosphorpentoxld bei vermindertem Druck. Man erhalt so 0.3 g des Aluminiumsalzes In Form eines weißen Feststoffes. Die Prüfung mittels Hochdruck-FlUsslgchromatographle bestätigt einen Reinheitsgrad von 48%; der Alumlnlumgehalt wird zu 5,76*. bestimmt. Der Wasserge-

« halt wird mittels der Methode nach Karl Fischer zu 5,4% bestimmt.

IR v_m„ (KBr): 1790, 1695, 1615 cm-'.

Beispiel 50
«ι

Herstellung von ClavulansSure-magneslumsalz Eine Lösung von etwa 4,4 g Clavulansflure-natrlumsalz In 15 ml Wasser wird auf eine lonenaustauschersaule

gegeben (Zerollt FF(IP), SRA62) und diese Sflule mit einer dem Bettvolumen entsprechenden Wassermenge

« gewaschen. Die SBuIe wird dann mit 0.2 m-Magneslumchlorldlösung elulert und die Fraktionen gesammelt. Der

Verlauf der Elulerung wird paplerchromatographlsch unter Verwendung von Ehrllch's Reagenz verfolgt und die Fraktionen mit der größten Intensität vereinigt und Im Vakuum aufkonzentriert. Dieses rohe Magnesiumsalz laßt man durch cine SBuIe aus Biogel P2 laufen und entfernt damit Chlorloncn. Der Ablauf wird paplerchromatographlsch unter Verwendung von Ehrjich's Reagens verfolgt.

Das von Chlorid befreite Material wird dann aufkonzentriert, mit Äthanol vermischt und an einer Cellulosesäule, die von oben unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Butanol/Äthanol/Wasser Im VoIumenverhfiltnls 4:1:5 beschickt worden Ist, Chromatographien. Die die Hauptmenge des gewünschten Maler!- '. als enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und Im Vakuum zur Trockne eingedampft. Durch Anreiben mit' s Aceton und anschließendes Filtrieren erhalt man 0,58 g des gewünschten Salzes In Form eines weißen Feststoffes. Durch Hochdruck-FIQsslgchromatographle wird festgestellt, daß das Magnesiumsalz einen Reinheitsgrad von 91% aufweist. Durch Atomabsorptlonsspektrosople wird der Gehalt an Magnesiumionen zu 5,13% bestimmt. Der Wassergehalt betragt gemäß der Analysenmethode von Karl Fischer 6,8%.

IR v.^ (KBr): 1780, 1693, 1610 cnr¹. _;

Beispiel 51
Herstellung des Clavulansaure-N.N'-dlbenzylathylendjammonlumsalzes >5

Eine Losung von 5 g Clavuiansäure-benzylester pnd 2,46 g Benzathlncarbonat (Freiname für Dlbenzyldlath? lendlamln) In 120 ml Äthanol wird Ober 1,67 g Aktivkohle mit 10% Palladium hydriert. Dünnschlchtchromatographlsch wird festgestellt, daß die Hydrierung nach 40 Minuten praktisch beendet Ist. Der Katalysator wird abfiltriert und das Flltrat im Vakuum zu 8 g eines gelben Öls eingeengt. Das kernmagnetische Resonanzspek- *> trum bestätigt, daß dieses Öl 50 Gewichtsprozent Äthanol enthalt. Durch Hochdruck-Flüssigchromatographie wird ein Reinheitsgrad von 72,4% des betreffenden Clavulansäuresalze festgestellt, bezogen auf das Trockengewicht abzüglich des Äthanolanteils.

Das for die Herstellung des Salzes eingesetzte Benzathlncarbonat Ist In der folgenden Welse erhalten worden: 15 g N.N'-Dibenzyläthylendlammonlumacetat werden In 100 ml Wasser aufgelöst und dann mit Natrlumhydroxldlösung bis zu einem pH-Wert von 10 versetzt. Die ölartige freie Base wird mit 2mal 20 ml Äther extrahiert. Die Ätherextrakte werden Ober Natriumsulfat getrocknet und dann wird das Sulfat abfiltriert. Das Flltrat wird mit festem Kohlendloxid behandelt und dadurch das Innere Salz des Benzathlns In Form eines farblosen kristallinen Feststoffes ausgefallt. Dieser Feststoff wird abflltrlert, mit Ähter gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhalt IUg (Ausbeute: 95%). 30,

Beispiel 52
Herstellung des Clavulansaure-magnesiumsalzes

Eine LOsung von 4.34 g Clavuiansäure-benzylester und 1,61 g Magneslumacetat-tefrahydrat In 100 ml Äthanol wird uoer 1,45 g Aktivkohle mit 10% Palladium hydriert, bis kein weiterer Wasserstoff mehr aufgenommen wird (hierzu werden etwa 20 Minuten benotigt). Dünnschlchtchromatographlsch wird zu diesem Zeltpunkt festgestellt, daß die LOsung keinen nlcht-umgesetzten Benzylester mehr enthalt. Der Katalysator wird abflltrlert und mit 30 ml Äthanol sowie 10 ml Wasser ausgewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und man erhalt 5,2 g eines schwach gelben Gummis, der noch etwas Lösungsmittel enthält. Dieser gummiartige Rückstand wird mit 50 ml Aceton angerleben und der sich ausscheidende Feststoff abflltrlert. Der Feststoff wird mit 5 ml Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhalt so 2,4 g eines farblosen Feststoffe!». Durch Hochdruck-FIUsslgchromatographle wird festgestellt, daß der Reinheitsgrad des Magnesiumsalzes 75% betragt.

Beispiel 53
Herstellung von Clavumnsäure-ammonluniHalz

Eine Lösung von 4,34 g Clavulansaurc-benzylesler In 50 ml Aihanol wird mit 1,155 g Ammonlumacetat (1 Äquivalent) In 50 ml Äthanol versetzt und diese Mischung wird Iu Minuten lang über 1,4 g Aktivkohle mit 10% Palladium hydriert. Der Katalysator wird dann abfiltriert und das Losungsmittel Im Vakuum abgedampft, wobei ein Walbfester Stoff hinterbleibt. Der Rückstand wird In 5 ml Wasser aufgelöst und mit 75 ml Aceton behandelt. Dabei scheidet sich ein öl ab und die überstehende Flüssigkeit wird von diesem öl abdekantiert. Allmählich bilden sich aus dem öl 0,348 Nadeln. Die Hochdruck-FIUsslgchromatographle zeigt, daß das gebll- " dete Clavulansaure-ammonlumsalz einen Reinheitsgrad von 97,4% aufweist. Der Wassergehalt, bestimmt nach der Methode von Karl Fischer, betragt 0,44%.

IR v_mov (KBr): 1785, 1700 und 1595 cnr¹. Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

bzw. eines diese Verbindung enthaltenden Rohproduktes und deren Salze durch Züchtung des Stammes Streptomyces clavullgerus ATCC 27064 (DSM-738) bei Temperaluren von 15 bis 40⁰C In einem pH-Wert von S bis 8,5 aerob auf oder In einem üblichen Nährmedium und Filtrieren de> Kulturmediums, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Züchten entweder

a)

b) c)

das Clavulansäurekonzentrat aus dem Flllral des angesäuerten Kulturmediums mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Losungsmittel bei einem pH-Wert von 2 bis 3 extrahiert, nach Phasentrennung aus der organischen Lösung In wäßrige BlcarbonatlOsung oder Kallumhydrogenphosphat-Puffe'lösung oder Calclumcarbonai-Suspenslon oder Natronlauge unter annähernd neutralen Bedingungen ^ackextrahlert und das erhaltene davulansSurehaltige Salz aus der wäßrigen Losung durch Entfernen des Losungsmittels isoliert oder

das Clavulansäurekonzentrat aus dem Flltrat des Kulturmediums bei annähernd neutralem oder schwach saurem pH-Wert an ein stark basisches oder ein schwach basisches Anlonenaustauscherharz adsorbiert und durch Eluleren mit einem hierfür üblichen anorganischen Salz gewinnt oder

das Clavulansäurekonzentrat In Form eines Salzes aus dem Flltrat des Kulturmediums unter annähernd neutralen Bedingungen mit einem mit Wasser nicht mischbaren pplaren organischen Losungsmittel extrahiert, in welchem ein wasserunlösliches llpophlles sekundäres oder tertiäres AmIn oder ein entsprechendes flüssiges Ionenaustauschharz In der Salzform gelöst Ist, nach Phasenlrennung die organische Phase mittels einer wäßrigen Salzlösung extrahiert und aus dieser wäßrigen Phase das betreffende rohe Clavi'.lansäuresalz In üblicher Welse isoliert und gegebenenfalls anschließend in an sich bekannter Weise die freie Säure oder ein Salz der Clavulansäure durch Anlonenaustauschchromatographlc mit oder ohne Gradlentenelutfcm weitt/ reinigt oder das Rohprodukt oder Konzentrat der filtrierten Kulturbrühe oder aber das an ein polymeres vnakroretlkulares Trägermaterial, welches die Anwendung von nlchtwäßrlgen Lösungsmittelsystemen ^.stattet, gebundene Clavulansäuresalz In an sich bekannter Welse mit einem üblichen Veresterungsmittel In einen Ester der allgemeinen Formeln V oder Vl

CH₂OH

CO ?'

^XO—C —X-CO-

(V)

CHjOH

(Vl)

In denen Ai ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit I bis 6 Kohlenstoffatomen, die Phenylgruppe, die durch ein Fluor- oder Chloratom oder die Methyl- oder Methoxygruppe substituiert sein kann, die Näphthylgruppe oder einen durch dnc Phenyl- oder Naphlhylgruppe substituierten Alkylrest mit I bis 6 Kohlenstoffatomen und Ai ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeuten, A) die gleiche Bedeutung wie A₁, Wasserstoffatom ausgenommen, besitzt, X und Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome darstellen und Z eine der Gruppen -CHj-CH₂-, -CII=CH-,

OCII)

OCH,

darstellt, oder in einer. Ester der allgemeinen Formel IX

»Ox

,CH₂OH

-N-

X
CO₂R¹

σχ)