DK141254B - Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf. - Google Patents

Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf. Download PDF

Info

Publication number
DK141254B
DK141254B DK167275AA DK167275A DK141254B DK 141254 B DK141254 B DK 141254B DK 167275A A DK167275A A DK 167275AA DK 167275 A DK167275 A DK 167275A DK 141254 B DK141254 B DK 141254B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
clavulanic acid
salt
ester
lactamase
sodium
Prior art date
Application number
DK167275AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK141254C (da
DK167275A (da
Inventor
Thomas Trefor Howarth
Martin Cole
Christopher Reading
Original Assignee
Beecham Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27448389&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK141254(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB17410/74A external-priority patent/GB1508977A/en
Application filed by Beecham Group Ltd filed Critical Beecham Group Ltd
Publication of DK167275A publication Critical patent/DK167275A/da
Priority to DK287278A priority Critical patent/DK150488C/da
Priority to DK287078A priority patent/DK145543C/da
Priority to DK287178A priority patent/DK287178A/da
Priority to DK287378A priority patent/DK150489C/da
Publication of DK141254B publication Critical patent/DK141254B/da
Priority to DK286980A priority patent/DK157302C/da
Application granted granted Critical
Publication of DK141254C publication Critical patent/DK141254C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D503/00—Heterocyclic compounds containing 4-oxa-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxapenicillins, clavulanic acid derivatives; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

(11) FREMUE66ELSESSKRIFT 1Μ25^ DANMARK (5i) JntCI. C 12 dP4^/18 (21) Antegning nr. 1672/75 (22) Indleveret den 18. apr. 1975 mm (23) Ubadag 18. apr. 1975 (44) Antegningen fremlagt og fremlæggalseaskrfftet offentliggjort dan 11. f eb . 1 980 DIREKTORATET FOR % ^ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Pnoritet begæret fra den
20. apr. 1974, 17410/74, GB
21. Jun. 1974, 27715/74, GB
9- okt. 1974, 43651/74, GB
11. dec. 197¾ 55525/74, GB
(71) BEECHAM GROUP LIMITED, Beecham House, Great West Road, Brentford,
Middles ex, GB.
(72) opfinder: Martin Cole, "Mallows", 17 Glebe Road, Dorking, Surrey, GB: Thomas Trefor Howarth, "Pairlands", Somersbury Lane, Ellens Green, Rud“ wick, Sussex, TJB: Christopher Reading, 2 Cairo Cottages, Cripplegate Lane, Southwater, Sussex, GB.
(74) Fuldmægtig under sagena behandling:
Plougmann & Vingfcoft Patentbureau.
(54) Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf.
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt kemisk forbindelse med formlen I
^ £H~OH
0 \
COOH
kaldet clavulansyre, eller et salt eller en ester deraf. Clavulansyre og dens salte og estere har antibakteriel og β-lactamase-inhiberende virkning.
141254 2
Streptomyces clavuligerus er detaljeret beskrevet af Higgins et al.,
Int. J. Systematic Bacteriology, 21, 326 (1971). Denne streptomycet havde interesse, idet den producerede visse β-lactam-antibiotika såsom penicillin N, 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxy-methy1-3-cephem-4-carboxylsyre og 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)--3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre.
Denne streptomycet er deponeret i Agricultural Research Service Collection under nummer NRRL 3585 og i American Type Culture Collection under nummer ATCC 27064. Streptomyces clavuligerus er også omtalt i USA patentskrift nr. 3.770.590 og af Nagarajan et al., J. Amer. Chem. Soc., 93^, 2308 (1971), Brannon et al., Antimicrob. Agents Chemother., _1, 237 (1972), og Antimicrob. Agents Chemother· 1/ 247 (1972), og Higgins et al., J. Antibiotics, 27_, 298 (1974).
β-Lactamaser er enzymer, som åbner β-lactamringen i penicilliner og cephalosporiner, hvorved der fås produkter, som er uden antibakte-riel virkning. Disse enzymer produceres af mange bakterier, navnlig af arter eller stammer af Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter og Staphylococcus, og er i mange tilfælde forklaringen på resistensen hos visse stammer af sådanne organismer mod nogle penicilliner og cephalosporiner. β-Lactamaseproduktionens betydning er klar, når det erkendes, at en stor andel af klinisk isolerede organismer producerer β-lactamaser (jfr. f.eks. M. Wilson og I.A. Freeman, Bacteriological Proceedings, 80 (1969), hvor det i en artikel benævnt "Penicillin Inactivation by Gram-negative Bacilli" blev vist, at 84% af de gramnegative organismer, som blev isoleret på et amerikansk hospital, producerede β-lactamase). I mange tilfælde er nogle penicilliner eller cephalosporiner ikke i stand til at behandle sygdomme, som er forårsaget af ikke-B-lactamase-producerende organismer, på grund af den almindelige optræden af co-infektion forårsaget af en β-lactamase-producent (jfr. f.eks. R. May et al.; Brit. J. Dis. Chest., <56, 185 (1972)). Kombination af et β-lactamase-inhiberende stof med en penicillin eller cephalosporin kan ventes at beskytte sidstnævnte fra nedbrydning forårsaget af bakteriel β-lactamase, hvorved den antibakterielle virkning mod mange infektionsfremkaldende organismer forbedres. Denne fremgangsmåde til forbedring af den antibakterielle virkning kaldes synergisme, når den antibakterielle virkning af kombinationen ligger betydeligt over den blotte sammenlægning af de to stoffers virkning hver for sig. Den β-lactamase-inhiberende komponent i blandingen kaldes en synergist, og sådanne stoffer er værdifulde til at forøge den antibakterielle virkning af penicilliner og cepha- U1254 3 losporiner mod resistente organismer.
Eksempler på anvendelsen af visse β-lactamase-resistente semi-syn-tetiske penicilliner og cephalosporiner, (3-lactamase-inhibitorer og synergister for penicilliner og cephalosporiner er tidligere beskrevet i litteraturen, jfr. f.eks. Sutherland et al., Nature, 201 868 (1964); Sabath et al., Nature, 204, 1066 (1964) og O'Callaghan et al., Antimicrob. Agents and Chemotheraphy, 1968, 67 (1969). Imidlertid har ingen af de kendte midler voldsom virkning på spektret af de andre antibiotika, som forekommer i blandingen.
Visse actinomycetkulturer er blevet beskrevet som producerende (3-lactamase-inhiberende stoffer, som virker synergistisk med penicilliner eller cephalosporiner, f.eks. sådanne kulturer, som er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.363.075, og sådanne, som er beskrevet af Hata et al., J. Antibiotics, 2J3, 473 (1972) og Umezawa et al., J. Antibiotics, 2£, 51 (1973). Ingen af disse β-lactamase-inhibitorer af actinomycetal oprindelse har hidtil været fundet anvendelige i klinikken. Særlig bemærkelsesværdige træk, som adskiller clavulansyre fra andre β-lactamase-inhibitorer af actinomycetal oprindelse, er dens ekstraherbarhed i organiske opløsningsmidler fra kulturfiltrat med pH-værdi 2, dens store stabilitet i menneskeblod og dens bredspektrede antibakterielle og β-lactamase-inhiberende virkning, dens lave molekylvægt og dens høje R^-værdier ved papir-chromatografi under anvendelse af forskellige opløsningsmiddelsystemer.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af clavulansyre med den ovenfor angivne formel I eller et salt eller en ester deraf er ejendommelig ved, at en stamme af Streptomyces clavuligerus dyrkes, og clavulansyre eller et salt deraf isoleres, hvorefter der, om ønsket, dannes en ester på i og for sig kendt måde.
En foretrukken variant af fremgangsmåden ifølge opfindelsen går ud på, at der som stamme af Streptomyces clavuligerus anvendes Streptomyces clavuligerus ATCC 27064.
Clavulansyre har nedenstående egenskaber: a) Den er en carboxylsyre; b) den danner et natriumsalt, som har et karakteristisk IR-spektrum, i det væsentlige som anført i figuren; 141254 4 c) den kan inhibere væksten af stammer af Staphylococcus aureus; d) den kan synergisere den antibakterielle virkning af ampicillin mod β-lactamase-producerende stammer af Escherichia coli, Klebsiella aerogenes og Staphylococcus aureus; e) den kan synergisere den antibakterielle virkning af cephaloridin mod β-lactamase-producerende stammer af Proteus mirabilis og Staphylococcus aureus; f) den danner en methylester, som har en molekylvægt (ifølge masse-spektroskopi) på 213,0635, hvilket svarer til formlen CgH^NOg.
Clavulansyre kan derfor anses for at være en monobasisk carboxylsyre med formlen CQH NOc.
89 5
Clavulansyre kan illustreres ved den plane formel II
CH„OH
rfV-7
COOH
Clavulansyre kan således benævnes 3-(β-hydroxyethyliden)-7-oxo-4--oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylsyre.
Stereokemien ved carbonatomerne 5 og 2 i clavulansyren er den samme, som findes hos naturligt forekommende penicilliner og cephalosporiner, således at clavulansyre kan illustreres med strukturformlen I
CH_OH
rYV^ \
COOH
Således er et mere fyldestgørende kemisk navn for clavulansyre 2-- (2R, 5R) -3- (|3-hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo [3,2,0]hep-tan-2-carboxylsyre.
Clavulansyres virkning illustreres af, at visse stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstedeværelse af 125/Ug/ml ampicillin, amoxycillin, carbe- 141254 5 nicillin eller benzylpenicillin eller ved tilstedeværelse af 10^ug/ ml clavulansyre, inhiberes ved tilstedeværelse af mindre end 12,5^ug/ ml af de ovenfor anførte penicilliner, når der også forekommer 5^ug/ ml clavulansyre. Lignende resultater er iagttaget for kombinationer indeholdende forskellige estere af clavulansyre. F.eks. inhiberes stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes af 125^ug/ml ampicillin eller af lO^ug/ml clavulansyre-methylester, af mindre end 12,5^ug/ml ampicillin i nærværelse af 5^ug/ml clavulansyre-methylester. Det har også vist sig, at stammer af Staphylococcus aureus Russell, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstede-• værelse af 100^ug/ml ampicillin eller af 5^ug/ml clavulansyre, inhiberes ved tilstedeværelse af mindre end 10^ug/ml ampicillin i nærværelse af lyug/ml clavulansyre. Ved forsøg på hunmus har det vist sig, at blod- og vævsniveauer af clavulansyre på betydelig mere end 5^ug/ml let kan nås ved subcutan administration af 100 mg/ kg af natriumsaltet af clavulansyre, og at værdifulde niveauer af clavulansyre kan nås efter oral administration af 100 mg/kg af natriumsaltet af clavulansyre.
Antibakterielt spektrum for clavulansyre.
Den antibakterielle virkning af clavulansyre-natriumsalt mod en række bakterier bestemmes under anvendelse af mikrotitermetoden. Seriefortyndinger af clavulansyre-natriumsaltet i "Oxoid"-sensitivitetsforsøgsvæske i en mikrotiter plastbakke podes med en dyrkningskultur, der har stået natten over, af hver organisme, således at -4 den endelige fortynding af inokulet er 0,5 x 10 . Kulturerne in kuberes natten over, og punkterne med bakterievækst bestemmes næste morgen ved at observere kulturens uklarhed. Resultaterne, udtrykt som tilnærmelsesvise MIC-værdier (minimum inhiberingskoncentration ^ug/ml) er anført i nedenstående tabel III, som viser, at forbindelsen har bredspektret antibakteriel virkning.
141254 6
Tabel in.
Antibakterielt spektrum for clavulansyre-natriumsalt.
Bakteriestammer Minimum inhiberings- koncentration yug/ml
Staphylococcus aureus (Oxford H) .7,5
Staphylococcus aureus (Russell) 7,5
Bacillus subtilis 62
Streptococcus faecalis >500
Streptococcus pyogenes CN 10 125
Escherichia coli NCTC 10418 31
Klebsiella aerogenes 31 - 62
Klebsiella oxytocum 62
Enterobacter aerogenes T 624 31
Enterobacter cloacae 62
Acinetobacter anitratus 125
Providentia stuartii 125
Serratia marcescens 125
Proteus mirabilis C977 62
Proteus vulgaris W090 31
Salmonella typhimurium 31
Shigella sonnei 62
Pseudomonas aeruginosa A 500
Eksempler på β-lactamase-inhibering med clavulansyre-natriumsalt.
Clavulansyre inhiberer. progressivt og irreversibelt β-lactamasen hos Escherichia coli. Den nedenfor i "Beskrivelse 1" beskrevne metode viser, at de andre, i tabel IV viste β-lactamaser, også inhiberes af clavulansyre.
Tabel IV.
Inhibering af β-lactamaser med clavulansyre.
Kilde til β-lactamase Tilnærmelsesvis 150“ -værdi i forhold til _Escherichia coli JT 4 = 1
Staphylococcus aureus (Russell) 1,0
Escherichia coli JT4 1,0
Escherichia coli Bll 2,0
Klebsiella aerogenes A 0,6
Pseudomonas aeruginosa 1822 (R faktor) 5,0
Pseudomonas dalgleish 0,1 141254 7
Med penicillin G som substrat er I^Q-værdien for clavulansyre-na-triumsaltet imod β-lactamasen for Staphylococcus aureus (Russell) ca. 0,06^ug/ml.
Eksempler på aktivitet af clavulansyre-methylester.
Undersøgelser for antibakteriel virkning i dyrkningsvæske viser, at clavulansyre-methylester har bredspektret virkning, men af lavere orden end clavulansyre. Det er ikke klarlagt, om denne virkning er virkningen af selve forbindelsen eller af clavulansyre, som frigøres ved langsom vandig hydrolyse af esteren. Clavulansyre-methylester viser betydelig antibakteriel synergisme i kombination med ampicillin eller cephaloridin mod bakterier, som er resistente mod disse antibiotika. Således reduceres den minimale inhiberingskoncentration (MIC) for ampicillin mod Staphylococcus aureus (Russell) fra 500^,ug/ml til <0,4 i nærværelse af l,0^ug/ml clavulansyre-methylester. MIC-Værdien for cephaloridin reduceres fra 1,5yUg/ml til <0,03^ug/ml i nærværelse af l^ug/ml clavulansyre--methylester. MIC-Værdien for ampicillin mod Proteus mirabilis C889 reduceres fra 500^ug/ml til 31yug/ml i nærværelse af 5yug/ml clavulansyre-methylester.
Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og' clavulansyre-natrium-salt.
Den minimale inhiberingskoncentration (MIC-værdi) for ampicillin, clavulansyre-natriumsalt og ampicillin i tilstedeværelse af 1 ^/ug/ml clavulansyre-natriumsalt bestemmes for en række β-lactamase-produ-cerende bakterier. Organismerne podes i "Oxoid" sentivitetstests-dyrkningsvæske anbragt i små skakter i en plastbakke og indeholdende forskellige koncentrationsgradienter af ampicillin, clavulansyre--natriumsalt eller ampicillin plus l^ug/ml clavulansyre-natriumsalt (mikrotitermetode). Den endelige fortynding af inokulet i dyrknings- -2 væsken, dyrket natten over, er 0,5 x 10 . Bakken inkuberes ved 37°C natten over, og næste morgen bestemmes endepunkterne for bakterievæksten. MIC-værdierne i yug/ml er anført i tabel V, hvoraf det fremgår, at synergisten ved den lave koncentration på l^ug/ml på afgørende måde forbedrer den antibakterielle virkning af ampicil- δ U1254 lin mod visse grampositive og gramnegative bakterier. Mekanismen i denne synergisme antages at bestå i inhibering af ampicillin--nedbrydende β-lactamase-enzymer, men eksistensen af andre mekanismer kan ikke udelukkes.
Der fås lignende resultater som dem, som vises i tabel V, når am-picillin erstattes med amoxycillin eller med phthalidylesteren af ampicillin.
Tabel V.
Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og clavulansyre-natriumsalt.
Bakteriestamme Minimal inhiberingskoncentration ^ug/ml
Clavulansyre- Ampicillin Ampicillin i -natriumsalt tilstedeværelse af l.ug/ml cla-vulansyre-natri- _umsalt_
Escherichia coli NCTC 10481 31 1,8 <0,4
Escherichia coli B 11 62 >500 125
Klebsiella aerogenes A 31 125 <0,4
Klebsiella sp 62 31 125 <0,4
Enterobacter cloacae . 62 250 62
Serratia marcescens 125 >500 62
Staphylococcus aureus (Russell) 15 500 <0,4
Staphylococcus aureus 62 250 7,5 • (en methicillinresistent stamme)
Antibakteriel synergisme mellem cephaloridin og clavulansyre-natri-umsalt.
Den minimale inhiberingskoncentration af cephaloridin, clavulansyre--natriumsalt og cephaloridin i nærværelse af 5/Ug/ml clavulansyre--natriumsalt bestemmes på den ovenfor beskrevne måde. Resultaterne er anført i tabel VI og viser, at der kan opnås synergisme 141254 9 mellem clavulansyre-natrlumsalt og cephaloridin, især for den β-lactamase-producerende stamme af Staphylococcus aureus (Russell).
Tabel VI.
Antibakteriel synergisme mellem cephaloridin og clavulansyre-na-triumsalt.
Bakteriestamme Minimal inhiberingskoncentration yUg/ml
Clavulansyre- Cephaloridin Cephaloridin i nær--natriumsalt værelse af 5 .ug/ml clavulansyre^natr i - _____umsalt_
Proteus mirabilis 889 >500* 62 7,5
Staphylococcus aureus (Russell) 15 3,1 <0,03
Staphylococcus aureus (en methicillinresi- 62 15 3,7 stent stamme ) * "Tailing point" + Samme værdi opnået, når synergisten tilsættes med l^ug/ml i stedet for 5^ug/ml.
Antibakteriel synergisme mellem clavulansyre-natriumsalt og forskellige penicilliner.
De i tabel VII viste resultater er opnået med den ovenfor beskrevne metode.
Tabel VII.
Antibakteriel synergisme mellem clavulansyre-natriumsalt og forskellige penicilliner mod stammer af Klebsiella aerogenes.
Stamme Amoxycillin Carbenicillin* Bensylpenicillin alene +5 ,ug/ml alene +5,ug/ml alene +5 ,ug/ml _synergist_ synergiBt_synergist_ A 500 0,97 500 7,8 250 7,8 E 70 500 3,9 500 15 500 15,6 62 250 15,6 125 7,8 250 15,6 X Der fås lignende resultater, når carbenicillin erstattes med car-benicillin-phenyl-a-ester eller ticarcillin.
141254 ίο
Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og estere af clavulan-syre.
De i tabel VIII anførte resultater er opnået med den ovenfor beskrevne metode.
Tabel VIII.
Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og estere af clavulan-syre mod stammer af Klebsiella aerogenes.
Stamme Ampicillin Ampicillin +5/ug/ml af me- Ampcillin +5 ,ug/ml alene thylesteren af clavulansyre af benzylesteren _af clavulansyre A 500 1,9 1,9 E 70 500 3,9 3,9 62 500 3,9 3,9
Hverken clavulansyre-methylester eller clavulansyre-benzylester in-hiberer væksten af forsøgsorganismen ved en koncentration på 100yug/ ml.
Antibakteriel virkning af clavulansyreester.
Under anvendelse af den under "Antibakterielt spektrum for clavulansyre" beskrevne metode, men under anvendelse af en fortynding på 1/100 af væsken, der har stået natten over, fås de i tabel IX anførte MIC-værdier for visse estere af clavulansyre mod en række organismer.
Tabel IX.
Antibakteriel virkning af clavulansyreestere.
Organisme MIC-værdier for estere af clavulansyre MICS-vaerdi
Benzyl- Nonyl- Pivaloyl- Phthalidyl- for clavulan- ester ester oxymethyl- ester syre-natri- ________ester_umsalt_
Bacillus subtilis A 250 31 62 125 62
Staphylococcus aureus Oxford 62 31 31 31 15
Staphylococcus 125 31 62 15 15
Russell
Tabel IX fortsat 11 141254
Escherichia coli 10418 125 >500 125 125 125 * MIC-Værdien for clavulansyre-natriumsaltet er medtaget af sammenligningshensyn ; de høje MIC-værdier (hvis de sammenlignes med eksempel 30) skyldes de anvendte kraftige inokula.
Påvisning af synergisme mellem ampicillin og estere af clavulan-syre imod Staphylococcus aureus Russell.
Tabel X
MIC (yug/ml)_ R Ester Ampicillin Ampicillin alene alene +1yug/ml ester +5^ug/ml estei CH3 62 125 0,06 0,03 CH2CgH5 16 250 0,4 0,08 CH„C0CcHc 62,5 500 0,9 < 0,1 phthalidyl 62,5 500 4,0 1,6 CH2COCH3 31 250 0,8 <0,1 CH2CH2OCOCH3 125 500 1,25 0,08 CH2CH2Br 125 500 1,25 0,3 cyclohexyl 500 62,5 10 2,5 p-CH2C6H5CH3 62 500 1,25 0,3 CH2C=CH 62 500 0,6 0,16 CH2CH2OCH3 25 1000 2,5 0,6
CcHc 62,5 500 0,9 < 0,1
O D
6-methoxy 62 250 2,5 0,3 naphthylmethyl Påvisning af synergisme mellem natriumcarboxymethylclavulanat og cephalosporiner mod Staphylococcus aureus Russell.
Tabel XI
12 141254
Cephalosporin MIC (,ug/ml)
Cephalosporin Cephalosporin alene + 10^ug/rnl natri- umcarboxymethylcla- ___vulanat_
Cephaloridin > 10 0,156
Cephalothin 2,5 0,31
Cefazolin >10 0,6
Cephalexin >10 2,5
Cephradin >10 2,5
Cefuroxim 2,5 2,5
Cephamandol >10 2,5 Påvisning af synergisme med natriumcarboxymethylclavulanat og penicillin mod Staphylococcus aureus Russell.
Tabel XII
Penicillin _MIC (^ug/ml)__
Penicillin Penicillin + 10 ^ug/ml a^ene natriumcarboxymethyl- ____clavulanat_
Ampicillin >500 0,6
Amoxycillin 500 0,6
Carbenicillin 250 5
Ticarcillin 250 5
Sulbenicillin 62,5 5
Epicillin > 500 1,25
Cyclocillin > 500 2,5
Benzylpenicillin > 500 2,5 Påvisning af synergisme mellem ampicillin og benzylesteren af clavulansyre mod forskellige bakterier.
Tabel xm 13 141254 MIC (^ug/ml?_
Ampicillin Benzylester Ampicillin + 5,ug/ml alene alene benzylester '
Staphylococcus aureus Russell 125 62 < 0,03
Klebsiella A 500 250 0,23
Escherichia coli JT4 > 4000 250 4000 ± ± MIC = 250yug med 20 mg/ml synergist.
Påvisning af synergisme mellem ampicillin og methylesteren af clavulansyre mod forskellige bakterier.
Tabel χιν MIC (yug/ml)
Ampicillin Methylester Ampicillin + 5 ,ug/ml alene alene methylester '
Staphylococcus aureus Russell 250 31-62 <0,5
Proteus C889 > 500 125 8
Escherichia coli JT 39 > 500 125 16 Påvisning af synergisme mellem ampicillin og phthalidylesteren mod forskellige bakterier.
Tabel XV MIC (yug/ml)
Ampicillin Phthalidyl- * Ampicillin + 5yug/ alene ester alene ^ phthallayle'ster
Staphylococcus aureus Russel 500 62 1,6
Klebsiella E70 >500 125 3-6,2
Escherichia coli JT4 62 > 4000 2000 * hvilken som helst af isomerene.
Påvisning af synergisme mellem ampicillin og phenylesteren mod forskellige bakterier.
Tabel XVI
14 141254 MIC (^ug/ml)____
Ampicillin Phenylester Ampicillin + 5 ^,ug/ __alene__alene__ml phenylester_
Staphylococcus aureus Russell 62,5 62 <0,1
Klebsiella E70 500 62 6
Escherichia coli JT4 > 4000 62 250 Påvisning af synergisme mellem natriumclavulanat og cephalosporiner mod Klebsiella.
Tabel XVII MIC (/ug/ml) A 62 E 70 Ba 95
Cephaloridin alene 1,5 6,25 12,5 500
Cephaloridin + synergist l^ug/ml 3,1 6,25 6,25 15,6
Cephaloridin + synergist 5/ug/ml 3,1 1,5 1,5 12,5
Cephalothin alene 12,5 12,5 12,5 500
Cephalothin + synergist 1/Ug/ml 6,25 12,5 12,5 31,0
Cephalothin + synergist 5yUg/ml 6,25 6,25 6,25 25,0
Cephamandol alene 3,1 3,1 6,25 1000
Cephamandol + synergist l^ug/ml 0,78 1,5 6,25 31,0
Cephamandol + synergist 5 ^ug/ml 0,78 0,39 3,1* 6,25
Cefazolin alene 1,5 3,1 6,2 250
Cefazolin + synergist l^ug/ml 6,2 3,1 3,1 15,6
Cefazolin + synergist 5/Ug/ml 1,5 0,8 3,1 3,1
Cephalexin alene 6,2 12,5 6,2 62,5
Cephalexin + synergist 1^ug/ml 12,5 6,2 12,5 15,6
Cephalexin + synergist 5 yug/ml 6,2 1,5 6,2 12,5
Natriumclavulanat alene 125-162 31,0 31,0 62,5 141254 15 * Sidste endepunkt - partiel inhibering ved lavere niveauer.
Påvisning af synergisme mellem natriumclavulanat og penicilliner mod Klebsiella.
Tabel XVIII MIC (/Ug/ml) "A 62 E 70 ba 95 |1LO 7500
Ampicillin alene 250 500 2000 >4000 >8000
Ampicillin + synergist 0,5^ug/ml 0,39 1,56 0,39 >4000
Ampicillin + synergist 5/ug/ml <0,09 0,19 0,39-0,78 62 >8000
Amoxycillin alene 500 500 2000 >4000 >8000
Amoxycillin + synergist 0,5yUg/ml 0,39 6,0 1,56 >4000
Amoxycillin + synergist 5^ug/ml 0,19 0,39 0,39 250 >8000
Carbenicillin alene 31 250 500 >4000 >8000
Carbenicillin + synergist 0,5/Ug/ml 3,1 12 6,2 J>4000
Carbenicillin + synergist 5/Ug/ml 0,78 1,56-3,1 6,2 1000 >8000
Ticarcillin alene 52-125 125 500 >4000 >8000
Ticarcillin + synergist 0,5^ug/ml 1,56 6,2 3,1 >4000
Ticarcillin + synergist 5^,ug/ml 0,78 0,78 1,56 500 >8000
Benzylpenicillin alene 125 1000 1000 >4000 <8000
Benzylpenicillin + synergist 0,5^ug/ml 3,1 35 6,2 >4000
Benzylpenicillin + synergist 5yug/ml 1,56 6,2 12,5 250 8000
Natriumclavulanat alene 31 15 15 31 31 20^ug/ml natriumclavulanat anvendes også i kombination, men natriumclavulanat alene inhiberer vasksten af organismen.
16 T4T2S* oo σ\ 00 * 0\ 0\ O - ** 1^* ΓΟ *>» **· “» σ> o ι-l r~ ori o cni i H co o oh · “"j 0οί om vo cn cn m o ro oo h
O o o 10 rC
12 h_H_co H_^_ tn M co cn cn cn cn cn to as nj co ·. - » - - * ' in η o in h o m co on H m ro ο o r- h cm
Η ΙΟ O iH ο H inilCMI O |VO
p co 0 o cn in cn H cn ο as > H H * ' 7 Ο Λ Λ Η o Η °_ to______________
P
aj +) as as as as as as as as as as 0 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ M cm ο o in ο o mo o r-io ο mo w ^ A sC VO V V CNV V Η V V CO V V <NV V o i-t _ ’-l_ σν σν σ\ σν οί σ' as a oooo ^ μ. ^ * ** ** * in oo ο oH o in ο ο mo o or- H cn
i—I o VO CiV CN V V Ο I
<n in ο Η Η o jn H 1-1
. -HO H
§ n-3—--- I
as P oo cn co cn o co cn as as 00 X tn .. .. v m * - - n ο Poor-coor-cocNr-HtnoooHr-ip
H O oo o o i i cn vom I
a, S m ο o m cn Η ο H
h i—i cn H m 15 s 2 H /Λ /Λ 1-1 ° n HP ____——--.— -" i u \ <u-- K tn +1 0 os
u P 0 0 * N
m \ Si O OO in OO O OO H 00 <n 00 O ID
rj '— Ph >—! O O CN OH O OO CO O in OO O I
•H sc ο in ri 01 m 0 m 0 cn oo oh ^qODri HO Η Η ΗΗΗΠ H S £j Q Λ Λ Ο Λ Λ ΑΛ Η * S___ID----- Ο Η fl Λ * 1/1 Η
m (rt SO OO in OO H O CN in O CN CO OO H CN
fvtH Wo o in H OO CO OH H O CD i oin CO vo H 01 o cn o m 01 o m o cn
ι-r, H 00 pi ri H CN HHH
q ·Η O Λ Λ ΛΟ Λ _Λ_ ji π3 οο οο οο οο ο ti Si - * ' “ ΙΟ r* ii on o cn in om r- ο H r- o H r- ο cn γ- η
S ε I- Ο Ο Η O CN ΟΓΟ I ΟΓΟ I ΟΟ I I
Jj cn ο oh ocnocnocnm
rl IQ CM ,—1 ri Η -Η -Η - CN
ft P A A ACOACOACOH
,5 -P- vo 10 m m n O q . ^ ^ ^
g Ji oinmoinHoornooinooinH
5 OicnocNHocNcoooHomHomHfO
co o 1 oh om o cn o CN
u OOrimH Η Η H
Jj A CN Λ Λ Λ Λ α ο ri _ ——--- +3 5 ~~~L 1
c tn cn y M
1 -P-PHH-P-PgSS!
Jj jj jj ω tn tn tn tntntupPP
^ 0) tn -ri H Si Si HH pj j>! >1 Q)
m -ri -ri tu tu tUQ) tn tn <D M tn H
s tn tn MPtUPP }-i S-1 -H , ni M ii <D <D fi >1 >1 0) 0) Cd + + tu <υ<1)<1)βΰ<1,ωϋϊΪΕΙ^ηηηΜ
β d) β β C >ι >1 H
m cj>,>i<DintnitJ+ + <utntnHHHg ,_i OJtntnH h HHHio
Cn Η P+ + PC P ltj+ + Η Η Η H
c. (ts + + HHH Η Η Η Η Η P
S rtCfjHHHqccuoeog> <u C HG fi HH H HH Η Η Η Η Η Η \ Η \ P g EL ^J^^HHHHHHHHHCPtPCbiH g m hhhhhhouohhhcdqjpojpo § i—i rH ι-j rH rH ·Η ·Η ι-I ·ιΗ r—I ·Η Ή Η ·Η Η ·Η ·Η rH ·Η · i Dj ^‘'s ft N, S -p H HHSHgOOgOSCtigfiSOOgOgHHHHmg tn (rt ϋ o \ 0 \ >1 ίό\ >i\ 0) ®\ Q) \ M ii \ Si \ >1 >1 >i H |
m cuapftpoopoPSiMPPPooPOPPPcnfHtn-P
- gS\g\gg\g\njRj\HjN.HHVsH\<Utt)Ha)H(e H 3SH<m^<qH<mouHamEiEiHEimcQm&ipqbiS hk ΰ tn
H
> ο(ΰ ft 141254 17 Påvisning af synergisme mellem natriumclavulanat og penicilliner mod Staphylococcus aureus.
Tabel XX
MIC ( /Ug/ml)__^_ __Russell__H__5275__Nobel_
Ampicillin alene 1000 1000 500 500
Ampicillin + synergist 0,6 1,25 2,5-1,25 0,6 1/Ug/ml
Ampicillin + synergist 0,019 0,3 0,15 0,03 ug/ml
Amoxycillin alene 1000 1000 500 500
Amoxycillin + synergist 1,25 1,25 2,5 0,6 l^ug/ml
Amoxycillin + synergist 0,15-0,07 0,3 0,15 0,15 5^, ug/ml
Carbenicillin alene 62,5 62,5 62,5 31
Carbenicillin + synergist 5,0 5,0 5,0 2,5 1/ug/ml
Carbenicillin + synergist 0,6 2,5 0,6 1,25 5 yug/ml
Ticarcillin alene 31 62,5 62,5 31-15,6
Ticarcillin + synergist 5,0 2,5 5,0 2,5 l^ug/ml
Ticarcillin + synergist 0,6 1,25 1,25 2,5 5 ^ug/ml
Benzylpenicillin alene 1000 1000 1000 500
Benzylpenicillin + syner- 5,0 2,5 10 1,25 gist l^,ug/ml
Benzylpenicillin + syner- 0,03 0,15 0,3 0,07 gist 5^ug/ml
Natriumclavulanat alene 15,6 7,8 7,8 7,8 141254 18 Påvisning af synergisme mellem natriumclavulanat og anti-Pseudomo-nas penicilliner mod Pseudomonas aeruginosa.
Tabel XXI
MIC (^ug/ml)__ PU 11 P 22 Dalgleish 1822
Carbenicillin alene 15,6 >4000 >4000 >4000
Carbenicillin + syner- 15,6 500-250 500 2000 gist 5yUg/ml
Carbenicillin + syner- 15,6 250 250-125 125 gist 20yUg/ml
Ticarcillin alene 15,6 >4000 >4000 4000
Ticarcillin + syner- 15,6 250-125 250 2000 gist 5yug/ml
Ticarcillin + syner- 15,6 62 125 31 gist 20/,ug/ml
Natriumclavulanat alene 62,5 250 250 250 19 U1284 •ri £
O ,—IOO CT> O O 10 O O O O O Η ΟΙΛ H H
y. 0 - - o m - o o - oo ro o cn ro m
u ÉhoCNHoCNmoOCNOU·) OH
M I-J^vo Ν' Η^ΗνΟΊ· "'J'
® Λ Λ Λ A
Λ_______ o ’ μ co ° o 3! cn ο m σι oo oo oo H oo Η ο o m in
n o CN - o tn - O CN CO OH CO O 10 *· CN
m —vBOH η Ο (N Γ- Ol Ol O CN CN H
r5 H b O' 'Cf O' Ο O' O -=3* VOl
H g Λ Λ ΛΟ ΛΟ CN
n-t \ om m η tn _ _——-Η—, --—— g 3 Ο Ο
^ Ν. [·>. IT) LO
u η- ο cn co oo H oo cn oo m oo cn m S ol - oo <o oo i oo cn oo *- c· OE-iomr-oo oo in oo H om cn cn
5 H b -N* CN <1 CN Tf CN Tf Tf f VOVO
Jlj s Λ H_Λ Λ_Η Λ_Q____ Π f\j
i oo v N
n ooo m oo o oo o oo o oo m ko oo - oo cn oo o oo o oo - l
V Eh O O CN O O CN oo LD OO m OO CN H
§ hl -^r CN cd τΤ TT T Tf O' 'S' O' CN CD ΓΠ
Pj Λ_A Λ A ΛΑ
Cn 0 cn
η coooioooinooooomoomH
T. i_i oo - oo - oo cn oo cn oo - cn
ΰ M FHOO m OO cn OO CN OO H OO CN
s * X 7T
H At........... " ....... ...... '
^ a SooooooinooLnoomoomH
o oo - oo - oo - oo - oo - n n re E-too t" oo cn oo cn oo n oo cm
g Fh 1-) -4· h ·Ν* CN 10 If N 10 O' O' ΙΟ "O' Η ID
g A_A__A_A__Λ___ •ri H cn ο o O OO O OO O OO O OO Ο Η
Μ OOOOOOOOOOOOOOOCO
ri FHOO ο οο ο οο ο οο ο οο ο
" b^*^'H'N''l'H^'^'H,*l,'N,H'jl,*J,H
g ΛΑ Λ ΑΛ Α ΛΑ Λ ΛΑ Λ_A_Λ-Λ 0
Hl ·ν<ο ο ο οο ο οο ο οο σ οο ο ιη m οο ο οο ο οο ο οο ο οο ο -
e ΕΗΟΟ O OO Ο OO Ο ΟΟ Ο ΟΟ Ο CN
R Ρ3^'«ίΐΗ'^Ι,'«3,Η·Ν··Ν,Η·<1'·Ν'Η·Ν'·Ν·Ηνθ (μ A A_ΛΑ A A Λ Λ_Δ-Δ-Δ-Δ-Δ_-
m I I
tø U Li ·£, α) α) α) ff +)+) II 0) c c c cn CflB] Ml-I C« >1 >t tt) g -HH II 2¾ I J “ “ ” ^ sL enen M n 0 C C Μ Μ h 0 m S-t M <D 0 S >i >i 0 0 ø + + øøøcgømmøcg + lu m O fli fl+ i>i 1—I G ^-t G G G 0
d G>i>iØMMØ+ + ØMM-HHHG
mrn-rnr—J r-i i—i i—) r*4 tu
w, ,!!{ «++ G« ««»+ + HH Η H
d (d + + H HHtHH-HH Η Η -Η Η Η Η H G
.5 acscgHHeHgccaceuoeue> d £ β G -Η·Η\·Η\ΗΗ\Η\·ΗΗ\τΙ\-Η·Η\·Η\ίΟ
rn -H-H H r—IHOHt7)HHtT'HlT'HHCnHtnGGtPG|nH
“ Η Η H HHGHGOOGOGHHGHGØØGØGO
w J ,-ipj pip] ^ rj \τ| \t| *H \τ| \τ| Ή \*H \ &i
HHgHg O UH um C CH cm p UH O inHHHHinS
o. U U\ U\ >t >i >i Ød) 0 MM Μ >ί>ι >ι Η
QtCltø Pli 0 00 OM M mm MM U OM OM C fiO) SM-M
g g \ g \ g fi*H S*H Π3 (diH fd'r!*ri *rf *ri »ri *H d) d)*H d)*H dj
S < H (¾ in 3 3tP,2tnO U bl U tji Eh Eh^Eh^CQ
U125 A
20 m
* M
o oo σι o vo σι o oi cn e ® ^ ·"* oo ο*· »· o *· *· o »· » *·*· * · μη o r-~ m om ο ο m o mo ο o •μ co cn cmh cn vh (η Λ Λ Λ Μ os α
Cn____________
:—I
> moioiocncTiocNCNmcNCNco C\j *. *. ο ^ * Ifl * * CN ** ** U1 ri; HO m m η H cn ο ο ho ο m ρ V V V V Η Φ jj--—---- o * # μ ooo oo o oo co o cn μ* o cn n* o n. o - - O - - o - - o - *-o h on- r- or' r-> om o oo o m σι cm cn cn cn λ
Ο λ Λ A A
is 2 co dj ooo σι ο σι σι ocn σι ocn σι * 4j ο ο “ - ο - *· ο - ο * - m ο σι or- mom mom η om η Η μ ο Η Η Η m ft IS Λ Τ3--------- § .μ οσισιοσισιο'^'ο’οσισιΐη Η Ο Ο - «-Ο» - Ο - - ο - » *· μ floo om Horn hoo ο oh o cn
0) (8 m CN CN CN CN CO
fi g1 Jd__*-£-—---m—
O i 00 CN
ft * H co M
oj 05 oo o oo o r-· co m mm m I 0)
o p o m m o m m i *· i *»^m P
H (UoOCNCNmCNCNCOt^mCNCNCNCN 05 Π5μ -p H HA Λ Λ Λ - - CO CO CO - Φ ,ρ h0 D m cn h > & S Η M Q H co m -d Φ £ g ft c ° * --- O)
hi Η p moi0000010l010lCN01'>3*CNm M
O 0 V %► ·* * »* V % * *·► ·* ** ** -- CN u) n ’ G\ CN 00 Γ* Γ"* r—{ CO CO O O HO O «Η ζ
+i (8 00 co V P
li Eh O °o M
P H o 5 s -2----—--1 > -Η « * n _ ο) Λ ocoeomoioiooo^i'cocooim Di
,-1 05 o - '•CN·' - O- * - - - CN C
o μ σι om r- h m m m r~ o m r- o Η H
g -H r- cn h -* y P S co Λ ffl •H CN Λ M 05 σ .... 'd
p . p---—!----- -S
p φ
β -P m ΊΚ S
Oco oo cn mm m o σι σι σι οι σι cn
g Moom - CN CN CN O'· - - * ' *> H
m Qj'a’ocNHHHHmHmHHmH ¢) h oo cn m v m ·Η Η O A £ CD PI ___y a _ · - to +1 4J ft a) 05 05 -p -p 2
g Η H 05 05 C I
to tJipi-P-P-r-ΙΉ-Ρ-ΡΦ
H MM 05 05 p> D> 05 05 Η M
jr> (1) Ο) H H M M H -H P 2
μ d)PC DiDiiUQ) D>Di +J
ω C>1>1 μμφββ μμ+^^
g tu o5 05 α)(ϋβ>ι>ι 222S
>1 H (UPPtUOSOlPCClCP
05 P+ + P>i>iH C>i>iPft (1)M 05 P+ + (1)05 05 H 0)
lu CGCH H pO
nj ·ιΗ·ΗΗΡ+ + ΗΗΗΡ+ + !> P
idTiO 0 0 0 P Φ
D> Η Η Η P P G Ό 'D 'D 6 6 6 H
p μ μ μ ·Η Η -Η Ρ Ρ Ρ -Η Η ·Η Ο φ -μ 0 0 Η Ο Η Η Η Η Η ΗΡΡΗΡΗΕ^ ^Η ^Η£ +5 ρ η HE Hg Ο Og Og g EE Eg Ο ΟΕ Οβ 3 » 05 (βίβ\ρ\ΝΝ\Ν\ρρ\ρ\μμ\μ\·μ ό •μ X|XiDirPDiPPbip&iÆ>P&'>P&,PP21!:,DiM Η > ft Ο,ρ ftp CM CH Ρ ιμ ρ &, Οι Ρ ftp Ή Μ 3 Μ-Ι Ρ -Ρ 05 on) α)φ\ο)\(ΐ)α)\φ\ΦΦ'νχΦνΝΦΦ\Φ\Ρ ft U UH om ο υ Η om ο OH om ο OH om 3 « 141254 21 Særlig velegnede salte af clavulansyre er farmaceutisk tolerable salte såsom natrium-, kalium-, calcium-, magnesium-, aluminium-, ammonium- og substituerede ammoniumsalte såsom trimethylammonium-, benzathin-, procain- og lignende salte, som sædvanligvis dannes med penicilliner eller cephalosporiner. Fremstilling af ikke-farmaceutisk tolerable salte af clavulansyre er også omfattet af nærværende opfindelse, da de er værdifulde mellemprodukter ved fremstillingen af estere af clavulansyre, f.eks. kan således lithium- eller sølvsalte af clavulansyre omsættes med benzylbromid til dannelse af den værdifulde benzylester af clavulansyre.
Salte af clavulansyre synes at være mere stabile end selve syren. Særlic velegnede salte af clavulansyre er natrium- og kaliumsaltene, som har de nedenstående formler III og IV
r-f^V/CH2°H n^WCHz°"
/"Y
\:OONa COOK
III IV
krystallinske former af sådanne salte kan indeholde hydratvand.
Egnede estere af clavulansyre er sådanne, som rent teoretisk er afledt af alkoholer såsom methanol, ethanol, propanol, butanol, 2,2,2-trichlorethanol, 2,2,2-trifluorethanol, benzylalkohol, p-nitro-benzylalkohol, phenol, acetoxymethanol, pivaloyloxymethanol og 2-di-methylaminoethanol.
1Λ12 ε Λ 22
Forskellige estere af clavulansyre er værdifulde mellemprodukter ved visse fremgangsmåder til rensning af clavulansyre. Mange cla-vulansyreestere er værdifulde synergistiske forbindelser. Sådanne esteres aktivitet kan skyldes hydrolysen af esteren til dannelse af den oprindelige syre.
I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "ester" estere, som rent teoretisk er afledt af en alkohol eller thiol med den almene formel ROH eller RSH, hvor R betegner en organisk rest. Egnede grupper R er f.eks. alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl eller arylalkyl, som, om ønsket, kan være substituerede. For ikke at forøge molekylvægten til et urimeligt omfang, omfatter grupperne R normalt ikke mere end 16 carbonatomer, især ikke mere end 12 carbonatomer og navnlig ikke mere end 8 carbonatomer.
Gruppen R er fortrinsvis, rent teoretisk, afledt af en alkohol ROH eller (mindre fordelagtigt) en thiol RSH, som er farmaceutisk tolerabel .
Egnede substituenter, som kan omfattes af gruppen R, er f.eks. halogenatomer, og lavere alkoxy-, hydroxy-, lavere acyloxy-, lavere alkylamino- og lavere dialkylaminogrupper. Udtrykket "lavere" betyder, at gruppen indeholder højst 6 carbonatomer, fortrinsvis højst 4 carbonatomer. Således kan R f.eks. være methyl, ethyl, n-pro-pyl, isopropyl, ligekædet eller forgrenet butyl, pentyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, vinyl, allyl, butenyl, cyclo-propyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclo-hexenyl, cyclohexadienyl, methylcyclopentyl, methylcyclohexyl, benzyl, benzhydryl, phenylethyl, naphthylmethyl, phenyl, naphthyl, propynyl, tolyl, 2-chlorethyl, 2,2,2-trichlorethyl, 2,2,2-trifluorethyl, acetylmethyl, benzoylmethyl, 2-methoxyethyl, 2-dimethylaminoethyl, 2-diethylaminoethyl, 2-piperidinoethyl, 2-morpholinoethyl, 3-dime-thylaminopropyl, p-chlorbenzyl-, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, p-brom- 1A12 5 Λ 23 benzyl, m-chlorbenzyl, 6-methoxynaphthyl-2-methyl, p-chlorphenyl eller p-methoxyphenyl, lige som de kan være sådanne grupper, som er kendt fra penicillin- eller cephalosporinteknikken til dannelse af estere, som vides let at kunne hydrolyseres in vivo til dannelse af det oprindelige antibiotikum.
Let hydrolyserbare estere omfatter estere med de almene formler V og VI
/CH20H r—S\ Z*2™ QO I 3 0 vcp
^°-C“X-C0-A ^O-CH—Z
2 I I
A X -C = Y
V VI
1 2 hvor A betegner hydrogen, alkyl, aryl eller aralkyl, A betegner hydro- 3 gen eller methyl, A betegner alkyl, aryl eller aralkyl, X betegner oxygen eller svovl, Y betegner oxygen eller svovl, og Z betegner en divalent organisk gruppe. Estere med de almene formler V og VI, som ret let frigør clavulansyren i blodstrømmen efter administra- 1 2 tion, omfatter sådanne, hvor A er hydrogen, A er hydrogen eller 3 methyl, og A er methyl, ethyl, propyl, butyl, benzyl eller phenyl, og sådanne, hvor X er oxygen, Y er oxygen, og Z er -CH2CH2-, -CH:CH-, opw AJ eller AAoch3 I forbindelse med disse formler betegner udtrykket "alkyl" alkyl-grupper med op til 6 carbonatomer? udtrykket "aryl" betegner phenyl, naphthyl eller phenyl, som er substitueret med en inert substituent, f.eks. fluor, chlor, methyl eller methoxy, og udtrykket "aralkyl" betegner en alkylgruppe substitueret med en arylgruppe.
Særlig velegnede estere med formlerne V og VI er sådanne, som har de almene formler VII og VIII
24 1A1254
CH-OH
/0 ÆOH Ztx/ CO-O-CH-O-CO-A5 VI1 °Υ^Κ* o
VIII
4 5 hvor A betegner hydrogen eller methyl, A betegner methyl, tert.bu- g tyl eller phenyl, og A betegner hydrogen eller methoxy.
Mange estere af clavulansyrer adskiller sig fra analoge estere af penicilliner eller cephalosporiner, idet de viser forøget tendens til at hydrolyseres til clavulansyre under milde betingelser. F.eks. hydrolyseres enkle alkylestere såsom methylesteren langsomt til clavulansyre i vand, som er pufret til pH-værdi 7. Estere, som undergår nogen hydrolyse under milde betingelser, er omfattet af den almene formel IX
CH-OH
0 ^COOR1 hvor R1 betegner en carbonhydridgruppe med 1-9 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med halogen, lavere alkoxy, hydroxy eller eventuelt til salte omdannede basiske grupper med den almene formel NR2R3, 2 3 hvor R betegner hydrogen eller lavere alkyl, R betegner hydrogen 2 2 3 eller lavere alkyl eller er knyttet til R , således at NR R er en 5- eller 6-leddet ring. * I forbindelse med den almene formel IX betegner udtrykket "lavere", at gruppen indeholder 1-4 carbonatomer.
Egnede grupper R"*" er alkyl og aralkyl, som eventuelt er substitueret 2 3 med.halogen, methoxy, hydroxy eller til salt omdannede NR R -grup- 2 3 per, hvor R betegner methyl eller ethyl, og R betegner methyl el- 2 2 3 ler ethyl eller et knyttet til R , således at NR R er en pyrrolidin-, piperidin- eller morpholingruppe.
1Λ12 5 4 25 i Særlig velegnede alkylgrupper R er ligekædede grupper med højst 6 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med en methoxy-, hydroxy- 2 3 eller til et salt omdannet NR R -gruppe eller med et chlor-, brom- eller iodatom eller med en CC13- eller CF^-gruppe.
De estere af clavulansyre, som er særlig værdifulde som synergister, er sådanne, som i pattedyrvæv, fsær i humant blod, hydrolyseres til dannelse af clavulansyre eller et saft deraf, idet det antages, at clavulansyre og salte deraf synes af være-noget nyttigere synergistiske midler end esterne i sig selv. Mange af esterne med de almene formler V - IX er værdifulde til dette formål.
En yderligere gruppe af særlig velegnede estere, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er sådanne værdifulde mellemprodukter, som let omdannes til clavulansyre eller et salt deraf ved kemiske eller biologiske teknikker, som fra penicillin- eller cephalosporln-teknikken vides at være tilstrækkelig milde til ikke at nedbryde reaktive syre-labile β-lactamrinqé.
Særlig velegnet er en ester, som kan fjernes ved hydrogenolyse.
Sædvanlige estere til en sådan proces er f.eks. benzyl-, substituerede benzyl-, benzhydryl-, substituerede benzbydryl- og trityleste-re. Benzylesteren har vist sig at være særlig værdifuld til dette formål.
Som tidligere anført har clavulansyre og salte og estere deraf værdifulde terapeutiske egenskaber. Der kan derfor fremstilles et farmaceutisk præparat, som indeholder clavulansyre eller et salt eller en ester deraf sammen med et farmaceutisk tolerabelt bærestof.
Sådanne præparater foreligger i en form, som er egnet til oral, topisk eller parenteral anvendelse, og de kan anvendes til behandlingen af infektioner hos pattedyr, herunder mennesker.
Egnede præparatformer er f.eks. tabletter, kapsler, cremer, sirupper, suspensioner, opløsninger, rekonstituerbare pulvere og sterile former, som er egnet til injektion eller infusion. Sådanne præparater 26 161254 kan indeholde sædvanlige farmaceutisk tolerable materialer såsom fortyndingsstoffer, bindemidler, farvestoffer, smagsstoffer, konserveringsmidler og desintegranter i overensstemmelse med sædvanlig farmaceutisk praksis på den måde, som er kendt af fagmanden til formulering af antibiotika.
Injicerbare eller infunderbare præparater af clavulansyre eller salte deraf er særlig velegnede, da høje vævsniveauer af forbindelsen af clavulansyre kan optræde efter administration ved injektion eller infusion. Et foretrukket præparat indeholder clavulansyre eller et salt deraf i steril form.
Under visse betingelser kan effektiviteten af orale præparater af clavulansyre og salte og estere deraf forbedres, hvis sådanne præparater indeholder et pufferstof eller et enterisk overtræksmiddel, således at de omhandlede forbindelser ikke har forlænget kontakt med stærkt sur mavesaft. Sådanne pufrede eller enterisk overtrukne præparater kan fremstilles i overensstemmelse med sædvanlig farmaceutisk praksis.
Clavulansyren eller salte eller estere deraf kan forekomme- i præparatet som eneste terapeutiske middel eller kan forekomme sammen med andre terapeutiske midler såsom et β-lactam-antibiotikum. Egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i sådanne synergistiske præparater omfatter ikke kun sådanne, som vides at være stærkt modtagelige for β-lactamaser, men også sådanne, som vides at have god grad af modstandsdygtighed i sig selv over for β-lactamaser. Sådanne egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i disse præparater omfatter benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin, carbenicillin, methi-cillin, propicillin, ampicillin, amoxycillin, epicillin, ticarcillin, cyclacillin, 6-aminopenicillansyre, 7-aminocephalosporansyre, 7-amino-desacetoxycephalosporansyre, cephaloridin, cephalothin, cefazolin, cephalexin, cefoxitin, cephacetril, cephamandol, cephapirin, cephradin, cephaloglycin og andre velkendte penicilliner og cephalosporiner eller "pro-drugs" dertil, f.eks. hetacillin, metampicillin, acetoxymethyl-, pivaloyloxymethyl- eller phthalidylesterne af benzylpenicillin, ampicil-lin, amoxycillin eller cephaloglycin eller phenyl-, tolyl- eller indanyl-a-estere af carbenicillin eller ticarcillin.
Det er klart, at hvis den i præparatet værende penicillin eller cephalosporin ikke er egnet til oral administration, skal præparatet tilpasses parenteral administration.
141254 27 Når clavulansyren eller et salt eller en ester deraf forekommer 1 et farmaceutisk præparat sammen med et β-lactam-antibiotikum, kan forholdet mellem clavulansyren eller et salt eller en ester deraf og Ø-lactam-antibiotiket være f.eks. 20:1 - 1:12, især 10:1 - 1:10 og navnlig 3:1-1:3.
Den totale mængde antibakterielle midler i en hvilken som helst enhedsdosisform vil normalt være mellem 50 og 1500 mg og vil sædvanligvis være mellem 100 og 1000 mg.
De omhandlede præparater kan anvendes til behandling af infektioner i bl.a. luftvejene, urinvejene og bløde væv hos mennesker.
Præparaterne kan også anvendes til behandling af infektioner hos husdyr, f.eks. til behandling af mastitis hos kvæg.
Der skal normalt administreres mellem 50 og 6000 mg af præparaterne på hver behandlingsdag, sædvanligvis mellem 500 og 3000 mg praqparat/ dag. Til behandling af alvorlige systemiske infektioner eller infektioner af særlig svært bekæmpelige organismer kan der imidlertid anvendes større doser i overensstemmelse med klinisk praksis.
Den nøjagtige form af præparaterne afhænger i nogen udstrækning af de mikroorganismer, som skal behandles. Til behandling af de fleste infektioner indrettes de omhandlede præparater normalt således, at de fremkalder et spidsblodniveau på mindst 0,l^ug/ml, hensigtsmæssigt mindst 0,25yUg/ml og fortrinsvis mindst l^ug/ml synergist, f.eks.
2,5 - 5yug/ml synergist.
Penicillinen eller cephalosporinen i synergistiske præparater vil normalt forekomme i op til eller næsten den mængde, som sædvanligvis anvendes, når den pågældende penicillin eller cephalosporin er det eneste terapeutiske middel, som anvendes til behandling af infektionen.
Særlig foretrukne præparater indeholder 150 - 1000 mg amoxycillin, ampicillin eller et "pro-drug" dertil og 50 - 500 mg clavulansyre eller et salt eller en in vivo hydrolyserbar ester deraf, især 200 - 500 mg amoxycillin, ampicillin, eller et "pro-drug" dertil og 50 - 250 mg clavulansyre eller et salt eller en in vivo hydrolyserbar ester deraf.
1Λ12 5 Λ 28
De stoffer, som forekommer i sådanne præparater kan, om nødvendigt, hydratiseres. Vægten af de i sådanne præparater tilstedeværende antibiotika udtrykkes på basis af det antibiotikum, som teoretisk er tilgængeligt i kompositionen, og ikke på basis af vægten af "pro-drug".
I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "dyrkning" den bevidste aerobe vækst af en clavulansyre-producerende organisme i nærværelse af assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte. En sådan aerob vækst kan finde sted i et fast eller halvfast næringsmedium eller i et flydende medium, hvor næringsstofferne er opløst eller suspenderet. Dyrkningen kan finde sted på en aerob overflade eller ved submers kultur. Næringsmediet kan være sammensat af com-plexe næringsstoffer eller kan være kemisk defineret. Vi har fundet medier indeholdende complexe næringsstoffer såsom gærekstrakt eller sojabønnemel særlig velegnede.
Næringsmediet, som kan anvendes til dyrkning af Streptomyces clavu-ligerus, kan indeholde 0,1 - 10% complex organisk nitrogenkilde såsom gærekstrakt, majsstøbevand, vegetabilsk protein, frøprotein, hydrolysater af sådanne proteiner, mælkeproteinhydrolysater, fiske-og kødekstrakter og hydrolysater såsom peptoner. Alternativt kan der anvendes kemisk veldefinerede nitrogenkilder såsom urinstof, amider, enkelte eller blandinger af almindelige aminosyrer såsom valin, asparagin, glutaminsyre, prolin og phenylalanin. Carbonhydrater (0,1 - 5%) kan forekomme i næringsmediet, men glucose er i visse medier uønsket, da den har en negativ effekt på udbyttet af den ønskede clavulansyre. Stivelse eller stivelsehydrolysater såsom dextrin, saccharose, lactose eller andre sukkerarter eller glycerol eller glycerolestere kan også anvendes. Carbonkilden kan også være afledt af vegetabilske olier eller animalske fedtstoffer. Carboxylsyrer og salte deraf kan anvendes som carbonkilde til vækst og produktion af β-lactamase-inhibitorer. Et særlig velegnet, billigt medium er et medium indeholdende sojabønnemel ("Arkasoy") plus tørret maltdestillationsvæske ("Scotasol") plus dextrin.
29 U1254 (r)
Det kan være nødvendigt at tilsætte antiskurnmidler såsom "Pluronic^ L81" for at regulere skumdannelse i visse medier i fermenteringsbeholdere.
Mineralsalte såsom NaClf KC1, MgC^/ ZnC^r FeCl^, Na2S0^, FeSO^,
MgSO^ og Na+- eller K+-salte af· phosphorsyre kan sættes til det ovenfor beskrevne medium, især hvis dette er kemisk defineret; CaCO, ++ ^ kan tilsættes som en kilde til Ca -ioner eller på grund af sin puffervirkning. Salte af sporgrundstoffer såsom nikkel, cobalt eller mangan kan også tilsættes. Om ønsket kan der tilsættes vitaminer .
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus finder normalt sted i et temperaturområde på 15 - 40°C, sædvanligvis 20 - 35°C og fortrinsvis 25 - 30°C, og ved en pH-værdi mellem 5 og 8,5, fortrinsvis mellem 6 og 7,5.
Streptomyces clavuligerus kan dyrkes i de ovenfor anførte medier i koniske glaskolber, som luftes ved rystning på et roterende rysteapparat, eller i med prelplader forsynede rustfri stålfermenteringsbehol-dere, som omrøres med en vingeskiverotor og luftes med et luf tind -blæsningshoved. Fermenteringen kan også udføres på kontinuerlig måde.
Udgangs-pH-værdien ved fermentationen ligger typisk ved 7,0, og et maksimumudbytte af clavulansyre fås i løbet af 2 - 10 dage ved 20 - 35°C. I en omrørt rustfri stålfermenteringsbeholder under anvendelse af "Arkasoy"/"Scotasol"/"Dextrin"-mediet, som ovenfor anført, er den foretrukne temperatur 26°C, og spidsudbytter af clavulansyre fås i løbet af 5 dage.
Clavulansyre kan ekstraheres fra kulturfiltratet på mange forskellige måder. Opløsningsmiddelekstraktion fra koldt kulturfiltrat, som er indstillet på sure pH-værdier og metoder baseret på den anioniske natur af metaboliten, f.eks. anvendelsen af en anionbytterharpiks, 141254 30 har vist sig at være særlig værdifuld. Cellerne af Streptomyces clavuligerus fjernes normalt først fra fermenteringsbeholderen ved filtrering eller centrifugering, før sådanne ekstraktionsfremgangsmåder påbegyndes.
Ved opløsningsmiddelekstraktionsprocessen afkøles kulturfiltratet, og pH-værdien sænkes til ca. 2 - 3 ved tilsætning af syre, medens der blandes grundigt med et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel, f.eks. n-butylacetat, methylisobutylketon, n-bu-tanol eller ethylacetat. Den syre, som anvendes til at sænke pH-vær-dien i mediet, er normalt en mineralsyre såsom saltsyre, svovlsyre, salpetersyre eller phosphorsyre. n-Butanol er et særlig velegnet opløsningsmiddel til anvendelse til ekstrahering af det syrnede kulturfiltrat. Efter fraskillelse af faserne ved centrifugering reeks-traheres den β-lactamase-inhiberende metabolit fra opløsningsmiddelfasen i en vandig natriumhydrogencarbonat- eller kaliumhydrogen-phosphatpuffer, CaCOg-suspension eller vand, medens pH-værdien holdes på næsten neutralt niveau, f.eks. på 7,0. Den vandige ekstrakt kan efter fraskillelse af faserne inddampes under reduceret tryk og frysetørres, hvorved der fås et råprodukt af et salt af clavulan-syre. Dette produkt er stabilt, når det oplagres som et tørt fast stof ved -20°C.
Ved anionbytterharpiksprocessen percoleres det klarede kulturfiltrat ved en omtrentlig neutral eller let sur pH-værdi, f.eks. ved pH-værdi 6-7, ned over en søjle af en svag eller stærk baseanion-•bytterharpiks, f.eks. "Amberlite” © jr 43 eller "Zerolite" ® FFIP, indtil harpiksen er mættet, og det β-lactamase-inhiberende stof trænger ud fra bunden. Søjlen vaskes derefter med vand og elueres med vandigt natriumchlorid. De β-lactamase-inhiberende fraktioner opsamles, sammenhældes, afsaltes og frysetørres, hvorved der fås et råt, fast salt af clavulansyre.
"Amberlite IR 4B" er et eksempel på en svagt basisk anionbytterhar-piks med polyamin-aktive grupper og tværbundet polystyren-divinyl--benzen-matrix. "Zerolite FFIP” er en stærk basisk anionbytterharpiks med kvaternære ammonium-aktive grupper og en tværbundét polyvinyl-di-vinyl-benzen-matrix. Harpikser, som er i lighed med "Zerolite FFIP", er 141254 31 "Isopor" ®FFIP og "DeAcidite" ®FFIP SRA.64. Disse harpikser markedsføres af BDH Chemicals Limited, Poole, Dorset, Storbritannien.
En alternativ ekstraktionsproces består i at bringe kulturfiltratet (sædvanligvis ved omtrentlig neutral pH-værdi) indeholdende et salt af clavulansyre i kontakt med en organisk fase, i hvilken der er opløst en i vand uopløselig amin. Egnede organiske opløsningsmidler er f.eks. sædvanlige, med vand ikke-blandbare polære opløsningsmidler såsom methylisobutylketon og trichlorethylen. Egnede aminer er sekundære eller tertiære aminer, i hvilke en af substituentgrupperne er en langkædet aliphatisk gruppe, f.eks. med 12 - 16 carbonatomer, og den anden er en tertiær alkylgruppe, således at molekylet er li-pofilt. "Amberlite LA2" har vist sig at være en velegnet amin. Aminen anvendes normalt i form af dets syreadditionssalt.
Efter ekstraheringen forekommer clavulansyren i den organiske fase i form af aminsaltet. Den organiske fase skilles derefter fra kulturfiltratet. Clavulansyren kan reekstraheres i en vandig fase ved reekstrahering med en saltopløsning, fortrinsvis en koncentreret opløsning af natriumchlorid eller natriumnitrat. Det rå salt af clavulansyre kan derefter isoleres ved frysetørring eller på lignende måde.
Andre primære, anvendelige isoleringsmetoder er sædvanlige metoder såsom adsorption på kul, udfældning, udsaltning og molekylfiltre-ring, men disse metoder er normalt ikke så hensigtsmæssige som de ovenfor beskrevne metoder, der er de foretrukne.
Yderligere rensning af de rå faste stoffer, som er fremstillet på den ovenfor beskrevne måde, kan udføres på mange forskellige måder, men ionbytningssøjlechromatografi er særlig velegnet, især når der anvendes "Isopor", "DeAcidite FFIP SRA64" eller DEAE-cellu-lose. "DeAcidite"-søjlen kan gradientelueres med en vandig opløsning af et salt såsom natriumchlorid (0 - 0,5M). Søjlen af DEAE--cellulose i 0,01N phosphatpuffer med pH-værdi 7 kan elueres med en saltopløsning, normalt en NaCl-opløsning (0 - 0,2M NaCl i 0,01M phosphatpuffer, pH-værdi 7). Aktive fraktioner kan påvises ved deres β-lactamase-inhiberende virkning og deres antibakterielle virkning 141254 32 mod Klebsiella aerogenes ved et agar-diffusionsforsøg. Fraktionerne med denne aktivitet sammenhældes derefter og inddampes til et lille rumfang under vakuum. Dette råpræparat af clavulansyresaltet afsal-tes ved percolering over en søjle med "Bio Gel"® P2. ("Bio Gel P2" er et eksempel på en stærkt lipofil harpiks, på hvilken organiske stoffer kan adsorberes, men som ikke tilbageholder uorganiske salte.
"Bio Gel P2" er en polyacrylamidgel, som markedsføres af Bio Rad, 32nd and Griffen Avenue, Richmond, Ca 94804, U.S.A.). Det aktive af-saltede materiale inddampes derefter, blandes med ethanol og chroma-tograferes yderligere på en cellulosesøjle, hvor der som opløsningsmiddel anvendes butanol/ethanol/vand i v/v-forholdet 4/1/5 topfase.
Fraktioner indeholdende materiale, som inhiberer Escherichia coli--β-lactamase, sammenhældes, inddampes til tørhed under vakuum, genopløses i vand og frysetørres, hvorved der fås et salt af clavulan-syre i form af et hvidt fast stof.
De metoder, som har vist sig mest anvendelige til påvisning af cla-vulansyre i kulturfiltrater, er papirchromatografi og et bioauto-grafisk påvisningssystem. Clavulansyre kan påvises ved at gøre brug af dens β-lactamase-inhiberende virkning. Tyndtlagschromatogra-fi kan anvendes til at påvise clavulansyre i faste præparater.
Disse påvisnings- og undersøgelsesteknikker beskrives nedenfor.
Ved en anden fremgangsmåde til fremstilling af en ren form af clavulansyre eller salte deraf isoleres en uren form af clavulansyre eller et salt deraf, omdannes til en ester af clavulansyre på sædvanlig måde, hvorefter esteren renses, og clavulansyre eller et salt deraf gendannes fra esteren.
Den urene clavulansyre eller et salt deraf, som anvendes ved denne fremgangsmåde, vil normalt indeholde mindst 1 vægtprocent antibiotikum.
Egnede estere til anvendelse ved denne fremgangsmåde omfatter sådanne, som kan spaltes ved hydrogenolyse, enzymatiske metoder eller ved 141254 33 hydrolyse under meget milde betingelser.
En velegnet gruppe estere til anvendelse ved denne fremgangsmåde er en sådan, som har den almene formel X
AK' ^bo-O-CH-A7 A8 7 å hvor A betegner et hydrogenatom eller en eventuelt substitueret
Q
phenylgruppe, og A betegner en eventuelt substitueret phenylgruppe.
7 Særlig hensigtsmæssigt er A et hydrogenatom eller phenyl, tolyl,
O
chlorphenyl eller methoxyphenyl, og A er phenyl, tolyl, chlorphe-nyl eller methoxyphenyl.
7 8 A er fortrinsvis et hydrogenatom, og A er fortrinsvis en phenylgruppe .
Esterne med formlen X kan spaltes ved hydrogenolyse, hvorved der fås clavulansyre eller et salt deraf.
Andre grupper af estere, som kan anvendes ved denne fremgangsmåde, er sådanne, som har de almene formler V og VI som ovenfor beskrevet. Sådanne estere kan omdannes til salte af clavulansyre ved mild basisk hydrolyse, f.eks. ved pH-værdi 7,5.
Den urene form af clavulansyre eller et salt deraf, som skal renses ved denne fremgangsmåde, kan være i form af et fast stof eller en opløsning, som sædvanligvis også vil indeholde betydelige mængder organiske eller uorganiske urenheder.
Clavulansyren eller et salt deraf kan omdannes til en ester ved esterificeringsreaktioner, som nedenfor beskrives. Den foretrukne metode til fremstilling af den ønskede ester af clavulansyre er omsætning af et salt af clavulansyre med et esterificeringsmiddel, 34 14125« f.eks. et reaktivt halogenid eller en sulfonatester. Sådanne reaktioner udføres hyppigt i et organisk opløsningsmiddel med høj dielektricitetskonstant, f.eks. dimethylformamid, dimethylformamid/ acetone, dimethylsulfoxid, N-methylacetamid eller hexamethylphosphor-amid.
Om ønsket kan saltet af clavulansyre opløses i opløsningsmidler på sædvanlig måde, eller det kan bindes til et polymerbærestof.
Egnede bærestoffer til anvendelse ved denne fremgangsmåde er stærke baseanionbytterharpikser, især sådanne, som har en makroretikulær natur, som tillader anvendelsen af ikke-vandige opløsningsmiddelsystemer. Det har vist sig, at "Amberlyst" ®A26 er anvendelig til dette formål. Clavulansyresaltet kan adsorberes på harpiksen fra kulturfiltratet, og harpiksen kan derefter suspenderes i dimethylformamid indeholdende natriumiodid, eller det kan elueres som en søjle med en opløsning af natriumiodid i dimethylformamid eller i en blanding af dimethylformamid og acetone.
Når den urene ester er dannet, renses den normalt chromatografisk.
Ved sådanne fremgangsmåder opløses esteren normalt i et organisk opløsningsmiddel såsom ethylacetat, methylenchlorid, chloroform eller cyclohexan. Den faste fase, som anvendes ved den chromatografiske proces, er normalt et inert materiale såsom silicagel eller chromatografisk lignende materialer.
De fraktioner, som forlader søjlen, kan undersøges for tilstedeværelse af clavulansyre ved at gøre brug af dens synergistiske egenskaber. Aktive fraktioner sammenhældes normalt, og det organiske opløsningsmiddel afdampes under reduceret tryk.
Den ester, som fås ved denne fremgangsmåde, er sædvanligvis af acceptabel renhed, men materialet kan, om ønsket, genchromatogra-feres.
Den rensede ester af clavulansyre kan omdannes til clavulansyre eller et salt deraf på de ovenfor beskrevne metoder.
En særlig velegnet metode til fremstilling af clavulansyre eller et salt deraf er hydrogenering af en forbindelse med den almene formel 141254 35 X som ovenfor beskrevet. Sådanne reaktioner finder normalt sted i nærværelse af en overgangsmetalkatalysator under anvendelse af lave eller middelhøje hydrogentryk. Reaktionen kan udføres ved høj temperatur, stuetemperatur eller lav temperatur, f.eks. ved 0 -100°C. Særlig velegnede reaktionsbetingelser til sådanne hydrogeneringer er at anvende hydrogentryk lidt over atmosfæretryk og en omtrentlig stuetemperatur (12 - 20°C). Reaktionen kan udføres i sædvanlige opløsningsmidler såsom lavere alkanoler, f.eks. ethanol.
Det har vist sig, at en særlig velegnet katalysator er palladium på kul.
Hvis hydrogeneringen udføres i nærværelse af en base, fås et salt af clavulansyre, f.eks. fås natrium- eller kaliumsaltet, hvis reaktionen udføres i nærværelse af natrium- eller kaliumhydrogencarbonat.
Clavulansyren eller saltet deraf, som fås ved sådanne reaktioner, er sædvanligvis af god renhed.
Estere af clavulansyre kan fremstilles ved esterificering af clavulansyre eller et salt deraf på sædvanlig måde.
Egnede metoder til esterdannelse omfatter a) omsætning af et salt af clavulansyre med en forbindelse med den almene formel Q - R, hvor Q betegner en let udskiftelig gruppe, og R betegner en organisk gruppe; b) omsætning af clavulansyre med diazoalkan, og c) omsætning af clavulansyre med en alkohol ROH i nærværelse af et kondensationsfremmende middel såsom carbodiimid.
Egnede salte af clavulansyre, som kan omsættes med forbindelser R - Q, er f.eks. alkalimetalsalte såsom natrium- eller kaliumsalte eller andre sædvanlige salte, f.eks. sølvsaltet.
Egnede grupper Q omfatter sådanne atomer eller grupper, som vides at være udskiftelige med carboxylatanioner, og omfatter chlor-, brom- og iodatomer, sulfonsyreestere såsom OSt^CHj- eller OSC^Cg^CH-j--grupper, aktive estergrupper såsom OCOH- eller OCOCF^-grupper og andre sædvanlige grupper, som kan udskiftes med nucleofile grupper.
16125Λ 36
Den ovenfor anførte reaktion udføres normalt i et organisk opløsningsmiddel med relativt høj dielektricitetskonstant såsom dimethylfor-mamid, acetone, dioxan eller tetrahydrofuran og ved ikke-ekstreme temperaturer, f.eks. mellem -5 og +100°C, sædvanligvis mellem +5 og +30°C, f.eks. ved stuetemperatur.
Omsætningen af clavulansyre med en diazoforbindelse er en mild fremgangsmåde til fremstilling af alkyl- eller aralkylestere eller lignende estere. Diazoteringsreaktionen kan udføres under sædvanlige reaktionsbetingelser, f.eks. ved ikke-ekstreme temperaturer og i et sædvanligt opløsningsmiddel. Sådanne reaktioner udføres normalt ved en temperatur mellem -5 og +100°C, især mellem +5 og +30°C, f.eks. ved stuetemperatur. Egnede opløsningsmidler til denne reaktion omfatter lavere alkanoler såsom methanol og ethanol og opløsningsmidler såsom tetrahydrofuran eller dioxan. Ethanol har vist sig at være et særligt anvendeligt opløsningsmiddel ved denne omsætning.
Omsætningen mellem clavulansyre og en alkohol eller thiol i nærværelse af et kondensationsfremmende middel finder normalt sted i et inert organisk opløsningsmiddel med relativt høj dielektricitetskonstant, f.eks. acetonitril. Reaktionen udføres sædvanligvis ved stuetemperatur eller sænket temperatur, f.eks. ved en temperatur mellem -10 og +22°C, især mellem -5 og +18°C, f.eks. i starten ved 0°C og derefter under gradvis opvarmning til ca. 15°C. Det anvendte kondensationsfremmende middel er normalt et middel, som fjerner vand fra reaktionsblandingen. Egnede midler er f.eks. carbodiimider, carbodiimidazoler eller ækvivalente reagenser. Dicyclo-hexylcarbodiimid har vist sig at være et særlig velegnet kondensationsfremmende middel til anvendelse ved denne fremgangsmåde. For at undertrykke clavulansyrens indre kondensation udføres denne omsætning normalt i nærværelse af et betydeligt overskud af alkoholen eller thiolen,
Andre egnede metoder til esterdannelse er f.eks.
d) fjernelse af carbondioxid-elementerne fra en forbindelse med
den almene formel XI
M1254 37 Λνχ( CO-O-CO-O-R4 4 hvor R betegner en inert organisk gruppe? og e) omsætning af en forbindelse med formlen XI med en alkohol ROH (eller mindre fordelagtigt med en thiol RSH).
Elementerne af carbondioxid kan fjernes fra forbindelsen med formlen XI spontant under fremstillingen deraf eller alternativt ved opvarmning af forbindelsen med formlen XI i et inert opløsningsmiddel. Egnede inerte opløsningsmidler er f.eks. etheropløsnings-midler såsom diethylether, tetrahydrofuran eller dioxan. I mange tilfælde dekomponeres forbindelsen med formlen XI spontant, selv ved lav temperatur, f.eks. ved -5°C, hvorved der fås en ester med den almene formel \ 4
COOR
4 hvor R er en inert gruppe, som ligger inden for definitionen for R.
Når forbindelsen med den almene formel XI skal omsættes med en alkohol (eller mindre fordelagtigt med en thiol), udføres denne reaktion sædvanligvis i et inert opløsningsmiddel såsom et etheropløs-ningsmiddel i nærværelse af et overskud af alkoholen (eller thiolen) for at forhindre indre kondensation af clavulansyrederivatet.
Sådanne esterificeringsmetoder er i almindelighed ikke så anvendelige som dem, som består i omsætning af et salt af clavulansyre med R - Q som ovenfor beskrevet.
Forbindelsen med den almene formel XI kan fremstilles ved omsætning 4 af et salt af clavulansyre med C1C00R eller et kemisk ækvivalent deraf. Normalt udføres denne omsætning ved lav temperatur, f.eks.
38 1Λ12 5 Λ ved en temperatur ikke over 5°C, og i et inert opløsningsmiddel, f.eks. diethylether, tetrahydrofuran eller dioxan. Særlig hensigtsmæssigt anvendes saltet af clavulansyre ved denne omsætning i form af et lipofilt salt, således at det vil opløses i opløsningsmiddel, selv om det mindre fordelagtige natriumsalt, om ønsket, kan anvendes ved at suspendere det i reaktionsmediet.
Beskrivelse 1.
Prøver, som kan anvendes til påvisning af clavulansyre. Undersøgelsesprincip.
Opløsninger indeholdende clavulansyre (kulturfiltrat, prøver fra isoleringsprocedurer og lignende) inkuberes i 15 minutter med et β-lactamase-præparat i 0,05M phosphatpuffer ved pH-værdi 7 og ved 37°C. I løbet af denne tid optræder enzyminhibering eller inaktivering. Substrat (benzylpenicillin) tilsættes derefter, og inkuberingen fortsættes i 30 minutter ved 37°C. Omfanget af enzymatisk nedbrydning i substratet til penicilloinsyre (penicilloic acid) bestemmes ved hydroxylaminprøven for penicillin. Den anvendte mængde β-lactamase er sådan, at den giver 75%'s hydrolyse af benzyl-penicillinet på 30 minutter ved 37°C.
Hydrolysegraden er en afspejling af den mængde af enzym, som forbliver uinhiberet. Resultaterne udtrykkes som procent inhibering af enzymaktiviteten ved en given fortynding af den clavulansyreholdige opløsning (f.eks. kulturfiltrat) eller den koncentration af clavulansyre (yUg/ml), som giver 50%'s inhibering af enzymet under de ovenfor anførte betingelser (I^g)· β-Lactamase-enzym.
Som enzym anvendes β-lactamase, som er produceret af Escherichia coli JT4. Denne kultur er en ampicillinresistent stamme, og dens resistens skyldes produktionen af en R-faktor-bestemt β-lactamase.
Andre lignende R-faktor-bestemte β-lactamaser kan anvendes, om ønsket.
141254 39
Kulturen holdes på næringsagarskråkultur og podes i 400 ral sterilt trypton-medium i en 2-liters konisk kolbe. Dette medium har nedenstående sammensætning:
Trypton (oxoid) 32 g/liter gærekstrakt (oxoid) 20 g/liter
NaCl 5 g/liter
CaCl26H20 2,2 g/liter.
Den endelige pH-værdi indstilles på 7,4 ved hjælp af fortyndet natriumhydroxid. Kolben rystes ved 25°C i 20 timer på et roterende rysteapparat ved 240 omdrejninger pr. minut.
Bakteriecellerne indhøstes ved centrifugering, vaskes med 0,05M phos-phatpuffer med pH-værdi 7 (resuspenderes og centrifugeres) og re-suspenderes i vand, hvorved der fås en cellekoncentration, som er 25 gange så stor som i dyrkningsmediet. Denne cellesuspension udrives derefter i en MSE-ultrasonic desintegrator ved 4°C. Celleresterne fjernes ved centrifugering, og alikvoter af den overstående væske oplagres i dybfrost. Til anvendelse i undersøgelsesteknikken fortyndes den overstående væske i 0,005M phosphat-puffer, indtil der fås ca. 75% hydrolyse af en 1 mg/ml opløsning af benzylpenicillin på 30 minutter ved 37°C.
Forsøgsteknik.
Egnede fortyndinger af inhibitorpræparater og (3-lactamase-opløsning blandes og inkuberes ved 37°C i 15 minutter (test). En konstrolprøve med puffer i stedet for inhibitorpræparat inkuberes også. Benzyl-penicillinopløsningen (substrat) sættes derefter til test- og kontrolblandingerne, og inkuberingen fortsættes i yderligere 30 minutter ved 37°C. Den resterende benzylpenicillin i hver blanding bestemmes derefter under anvendelse af hydroxylaminforsøget som beskrevet af Batchelor et al., Proc. Roy. Soc., B 154, 498 (1961).
6 ml hydroxylaminreagens sættes til alle forsøgsprøverne, kontrolprøver og blindprøver, og de lades reagere i 10 minutter ved stuetemperatur før tilsætning af 2 ml ferriammoniumsulfatreagens. Absorptionen af den endelige opløsning måles i et EEL-colorimeter eller spektrofotometer ved 490 nanometer mod reagensblindprøven. Sammensætningen af reaktionsblandingerne, testblandinger og blindprøver 141254 40 før hydroxylaminforsøget er anført i nedenstående tabel:
Komponenter Test Benzylpeni- Kontrol, Reagens, (alle opløst i eller for- cillin, ml. blind, ml tyndet med 0,005M phos- blind, ml pha tpuf fer, pH-værdi 7)_
Escherichia coli β-lactamaseopløsning 1,9 0,0 1,9 1,9
Inhibitoropløsning 0,1 0,0 0,0 0,0
Benzylpenicillin 5 mg/ml 0,5 0,5 0,5 0,0 0,005M phosphatpuffer, pH-værdi 7 0,0 2,0 0,1 0,6.
Beregning af resultater.
Den procentvise inhibering af β-lactamase beregnes på følgende måde:
Absorption af benzylpenicillin blind minus absorption af kontrolprøven (ikke-inhiberet reaktion) = X
absorption af test (inhiberet reaktion) minus absorption af kontrolprøven (ikke inhiberet reaktion) = Y
Y
procent inhibering = — 100
X
For at få l5Q-værdien fortyndes inhibitorpræparatet, indtil der er opnået 50%'s inhibering af β-lactamase-inaktiveringen af benzylpenicillin ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.
Beskrivelse 2.
Papirchromatografisk påvisning af clavulansyre.
Kulturfiltrat og en referenceopløsning af clavulansyre (250^ug/ml delvis renset præparat) sættes som prøver (20^ug/oprindelse) på Whatman nr. 1 papirstrimler, 1 cm. brede. Chromatogrammerne laves ved nedadgående chromatografi i 16 timer ved 5°C under anvendelse af n-butanol/isopropanol/vand i v/v-forholdet 7:7:6 som opløsningsmiddel. Strimlerne tørres ved 40°C og lægges på agarplader indeholdende 6^ug/ml benzylpenicillin og podes med en β-lactamase-produ-cerende stamme af Klebsiella aerogenes (synergismesystem). Pladerne inkuberes natten over ved 30°C, og clavulansyre viser sig som en 141254 41 zone med inhiberet vaskst. R^-Værdien for zonen er 0,46. 6^ug/ml benzylpenicillin alene er under den koncentration, som er nødvendig for at dræbe Klebsiella aerogenes, men ved tilstedeværelse af en 0-lactamase-inhibitor bliver denne koncentration toxisk, hvilket vil sige, at der er synergisme.
Anvendelse af det ovenfor anførte synergismesystem gør det muligt at bestemme clavulansyre ved koncentrationer, som er under de koncentrationer, hvor den viser antibakteriel virkning.
Beskrivelse 3.
Tyndtlagschromatografisk påvisning af natriumsaltet af clavulansyre.
Opløsninger af natriumsaltet af clavulansyre-præparater sættes (5^ul af 1 mg/ml) på glasplader, som er dækket med et 0,25 mm lag af silicagel (F254), markedsført af E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland. Chromatogrammerne lades løbe ved 22°C under anvendelse af topfasen af blandingen n-butanol/ethanol/vand i volumenforholdet 4:1:5. Chromatogrampladerne tørres ved 40°C, og natriumsaltet af clavulansyre bestemmes ved bioautografi på agarplader indeholdende 6^ug/ml benzylpenicillin og podet med Klebsiella aerogenes (synergismesystem, jfr. afsnittet om papirchromatografi). Agaroverfladen dækkes af et fint filterklæde, før tyndtlagschromatogrampladen placeres på den. Efter 15 - 30 minutters tid til fugtning og diffusion løftes tyndtlagschromatogrampladen af ved hjælp af filterklædet, og agarpladen inkuberes natten over ved 30°C'for at afsløre zonerne med inhiberet vækst. Rf-Værdien for natriumsaltet af clavulansyre i det ovenfor anførte opløsningsmiddel er ca. 0,37. To spraymidler, "Ehrlich" og triphenyltetrazoliumchlorid anvendes også til at vise zonen for natriumsaltet af clavulansyre. Det førstnævnte reagens består af 300 mg p-dimethylaminobenzaldehyd opløst i 9 ml ethylal-kohol, 54 ml n-butanol og 9 ml koncentreret HCl. Ved opvarmning af den sprøjtede tyndtlagschromatografiske plade til 120°C i 1 - 2 minutter kommer natriumsaltet af clavulansyre til syne som en lyserød plet. Triphenyltetrazoliumchloridreagenset består af en blanding af 1 volumendel af en 4%'s opløsning af denne forbindelse i methanol og 1 volumendel methanolisk natriumhydroxid. Efter påsprøjtning opvarmes tyndtlagschromatografipladerne til 80°C. Natriumsaltet af clavulansyre kommer til syne som en rød plet på hvid baggrund.
42 U1254
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:
Eksempel 1.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 dyrkes ved 26°C på agarskråkultur indeholdende 1% "Yeatex" (gsrekstrakt), 1% glucose og 2% "oxoid" agar nr. 3, pH-værdi 6,8. Et sterilt øje anvendes til at overføre mycelium og sporer fra skråkulturen i 100 ml af et flydende medium i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe. Det flydende medium har nedenstående sammensætning: "Oxoid" maltekstrakt 10 g/liter "Oxoid" bakteriologisk pepton 10 g/liter
Glycerol 20 g/liter
Ledningsvand 1 liter.
Mediet indstilles på pH-værdi 7 ved tilsætning af natriumhydroxid- opløsning, og 100 ml's rumfang fordeles i kolberne, som lukkes med 2 skumpropper før autoklavering ved 1,0545 kg/cm i 20 minutter. En podet kimkolbe rystes i 3 dage ved 26°C på et rotationsrysteapparat med en slaglængde på 5 cm. og en hastighed på 240 omdrejninger/mi-nut. Produktionstrinskolber indeholdende det flydende medium som ovenfor beskrevet podes med 5%'s vegetativt inokulum og dyrkes under samme betingelser som kimkolben. Prøver af kulturfiltrat undersøges for inhibitorvirkning mod β-lactamase fra Escherichia coli JT4. Optimal aktivitet fås efter 3 dages forløb. Resultaterne er anført i nedenstående tabel I. En zone af clavulansyre ved -værdi 0,46 afsløres, når kulturfiltratet undersøges ved den ovenfor beskrevne papirchromatografiske metode. Væksten i zonens størrelse svarer til væksten i β-lactamase-inhibitorstyrkebestemmelsen.
Streptomyces clavuligerus dyrkes også i 2-liters rystekolber indeholdende 400 ml af medium (produktionstrin) under anvendelse af samme medium og dyrkningsbetingelser som beskrevet tidligere i dette eksempel. I disse større beholdere er organismens vækst langsomme- 43 1412SÅ re, og den optimale β-lactamase-inhiberende virkning fås 7-9 dage efter podningen med den vegetative kim. Resultaterne er også anført i tabel I.
Tabel i.
β-Lactamase-inhiberende virkning af Streptomyces clavuligerus.
Vækst i 500 ml's og 2000 ml's kolber.
% inhibering af Escherichia coli-β-lactamase ved en endelig fortynding på Fermenteringstid (dage) 1/2500 af kulturfiltratet 500 ml*s rystekolbe 2000 ml1s rystekolbe 1 15 2 30 3 55 - 4 50 10 5 51 21 6 57 36 7 - 51 8-53 9 - 50.
Eksempel 2.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
En kimkolbe fremstillet som beskrevet i eksempel 1 anvendes til at pode 500 ml's koniske kolber indeholdende 100 ml alikvoter af nedenstående medium i deioniseret vand:
Opløselig stivelse 2 vægt/volumenprocent
Glycerol 0,3 vægt/volumenprocent .
"Scotasol" 0,1 vægt/volumenprocent "Arkasoy" 1 vægt/volumenprocent
FeS04.7H20 0,01 vægt/volumenprocent.
2
Mediet steriliseres ved autoklavering ved 1,0545 kg/cm i 20 minutter og podes ved tilsætning af det 5%'s vegetative kimstadium. Kolberne 141254 44 rystes ved 26°C i et roterende rysteapparatur som beskrevet i eksempel 1. Den optimale titer af clavulansyre fås efter mellem 3 og 5 dage. En fortynding på 1/2500 af kulturfiltratet giver 60%'s inhibering ved β-lactamase-inhiberingsforsøget. En zone af clavulansyre observeres ved Rf-værdi 0,46, når der anvendes den ovenfor beskrevne papirchromatografiske (bioautografiske) metode. Denne zone vokser i størrelse svarende til aktivitetsstigningen i β-lactama-se-inhibitorforsøget.
(Opløselig stivelse markedsføres af British Drug Houses -Limited,
Poole, Storbritannien; "Scotasol" er tørret destillationsvæske, som markedsføres af Thomas Borthwich Limited, 60 Wellington Street, Glasgow, Storbritannien; "Arkasoy" er sojabønnemel markedsført af British Arkady Company,
Old Trafford, Manchester, Storbritannien).
Eksempel 3.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
En kimkolbe fremstillet som beskrevet i eksempel 1 anvendes til at pode 500 ml's koniske kolber indeholdende 100 ml alikvoter af nedenstående medium fremstillet i deioniseret vand og steriliseret som ovenfor beskrevet. Inokulumniveauet er 5%.
Dextrin 2 vægt/volumenprocent "Arkasoy" 1 vægt/volumenprocent "Scotasol" 0,1 vægt/volumenprocent
FeSO^.7H2O 0,01 vægt/volumenprocent.
De podede kolber rystes ved 26°C. Optimal β-lactamase-inhiberende virkning opnås efter mellem 3 og 5 dage. Aktiviteten er i lighed med den, som beskrives i eksempel 2.
(Dextrin markedsføres af CPC (UK) Limited, Trafford Park,
Manchester, Storbritannien).
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
Eksempel 4.
45 141254
Kimstadiet som beskrevet i eksempel 1 anvendes til at pode 500 ml koniske kolber indeholdende nedenstående medium fremstillet i deioniseret vand.
Dextrose 1 vægt/volumenprocent
Sojabønnemel 1 vægt/volumenprocent "Scotasol" 0,05 vægt/volumenprocent
CaCC>2 1 vægt/volumenprocent.
Disse kolber behandles på nøjagtig samme måde som beskrevet i de tidligere eksempler og dyrkes under identiske betingelser. β-Lae-tamase-inhiberende virkning produceres på mellem 3 og 5 dage. Kulturfiltratet ved en endelig fortynding på 1/2500 viser 35 - 45%rs inhibering ved β-lactamase-inhiberingsprøven.
Eksempel 5.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
β-Lactamase-inhiberingsvirkningen knyttet til clavulansyre fremstilles under anvendelse af nedenstående medium med identisk kimfremstilling og dyrkningsbetingelser som beskrevet i eksempel 1.
Glycerol 2 vægt/volumenprocent
Sojabønnemel 1,5 vægt/volumenprocent
Mgso^ 0,1 vægt/volumenprocent K2HP04 0,1 vægt/volumenprocent.
Mediet fremstillet i deioniseret vand.
Den β-lactamase-inhiberende virkning når et maksimalt niveau mellem 3 og 5 dage og er af lignende størrelsesorden som den, som produceres i eksempel 4.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
Eksempel 6.
46 141254 I nedenstående medium produceres clavulansyre, når der anvendes betingelser og vegetativt kiminokulum som beskrevet i eksempel 1.
Glucose 2 % "Oxoid" kødekstrakt 1 % "Oxoid" gærekstrakt 0,3%
CaC03 0,3%
Mediet fremstilles i deioniseret vand.
Optimale titre nås på 3 - 5 dage, og en 1/2500 fortynding af kulturfiltratet giver 35 - 45%'s inhibering i β-lactamase-enzyminhiberings-forsøget.
Eksempel 7.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
På lignende måde som beskrevet i eksemplerne 4, 5 og 6 giver dyrkning i nedenstående medium 35' - 45%'s inhibering (1/2500 fortynding) i β-lactamase-forsøget ved optimal titer, som nås 3-5 dage efter podningen. Alle betingelser er som ovenfor beskrevet.
Glucose 2 vægt/volumenprocent "Arkasoy" 1 vægt/volumenprocent
CaCO^ 0,02 vægt/volumenprocent
CoC12*6H20 0,0001 vægt/volumenprocent.
Mediet fremstilles i deioniseret vand.
Eksempel 8.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
141254 47
Ved anvendelse af nedenstående produktionstrinsmedium, som anvendes under standarddyrkningsbetingelser som beskrevet i de foregående eksempler, fås 20 - 30%’s inhibering ved en fortynding på 1/2500 i β-lactamaseforsøget 3-5 dage efter podningen. Under anvendelse af den ovenfor beskrevne papirchromatografiske metode ses en zone af clavulansyre ved R^-værdi 0,46, når kulturfiltratet undersøges.
"Scotasol" 2% "Oxoid" gærekstrakt 1%
Mediet, fremstilles i ledningsvand, endelig pH-værdi 7,0.
Eksempel 9.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
Under standarddyrkningsbetingelser giver nedenstående medium clavulansyre 3-5 dage efter podning med de vegetative kim. En 1/2500 fortynding af kulturfiltratet giver 20 - 30%'s inhibering ved β-lac-tamaseinhiberingsforsøget.
Mediet har nedenstående sammensætning: g/liter
Glycerol 15
Saccharose 20
Prolin 2,5
Mononatrium glutamat 1,5
NaCl 5,0 K2HP04 2,0
CaCl2 0,4
MnCl2.4H20 0,1
FeCl3.6H20 0,1
ZnCl2 0,05
MgS04-7H20 1,0
Mediet fremstilles i deioniseret vand, endelig pH-værdi 7,1.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
U125A
Eksempel 10.
48
En "Yeatex"/glucose-stam-agarskråkultur af Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 anvendes til at pode en "yeatex"/glucose-agarskråkultur i en Roux-flaske ved fremstilling af en mycelium/sporesuspension i sterilt vand. Roux-flasken's skråkultur inkuberes ved 26°C i 10 dage. Til denne skråkultur sættes 100 ml sterilt vand, og en myceliesuspension fremstilles. Denne anvendes til at pode 50 liter dampsteriliseret kimmedium med nedenstående sammensætning i ledningsvand: "Oxoid" maltekstrakt 1 vægt/volumenprocent "Oxoid" bakteriologisk pepton 1 vægt/volumenprocent
Glycerol 1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic" ® LSI antiskum- middel i sojabønneolie 0,05 vægt/volumenprocent.
('Pluronic" markedsføres af Jacobs and Van den Berg UK Ltd., 231 The Vale, London, W3, og indeholder en polypropylen-polyethylen blokpolymer, og sojabønneolie markedsføres af British Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, Storbritannien).
Mediet er i en 90 liters rustfri stålfermenteringsbeholder med prelpla-der og omrøres af en 12,5 cm vingeskiverotor ved 240 omdrejninger/ minut. Der ledes steril luft ind med en hastighed på 50 liter/minut, og tanken inkuberes ved 26°C.
Efter 72 timers forløb anvendes kimfermentet til at pode 150 liter af samme medium under anvendelse af en 5 volumen/volumenprocents tilsætning ved en steril overførsel. Dette produktionstrinsmedium er i en 30 liters rustfri stålfermenteringsbeholder, helt forsynet med prelplader, og omrørt af en 21,6 cm's vingeskiverotor med 210 omdrej ninger/minut. Steril luft indblæses i en mængde på 150 liter/ minut. Fermenteringen bibeholdes ved 26°C. Der tilsættes, når det er nødvendigt, antiskummiddel i 10 ml's portioner (10% "Pluronic L81" i sojabønneolie). Med regelmæssige mellemrum udtages prøver til bestemmelse af β-lactamase-inhibering. Det fermenterende stof 141254 49 høstes mellem 4. og 5. dag på det optimale niveau for (3-lactamase-inhi-berende virkning, og resultaterne er anført i tabel II.
Tabel II.
β-Lactamase-inhiberende virkning i prøver af kulturfiltrat udtaget fra en 300-liters fermenteringsbeholder med Streptomyces clavuligerus.
Fermenteringstid % inhibering ved β-lactamase-inhiberings- (dage)_forsøg i en endelig fortynding på 1/2500 1,0 12 1.5 20 2.0 31 2.5 36 3.0 50 3.5 54 4.0 51 4.5 56 5.0 55.
Eksempel 11.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
Kimfermentet behandles på nøjagtig samme måde som beskrevet i eksempel 10 og under anvendelse af samme medium.
Efter 72 timer anvendes kimfermentet til at give et 5 volumen/ volumenprocents vegetativt inokulum til en 300 liters rustfri stålfermenteringsbeholder, som fuldstændig er forsynet med prelplader, og indeholdende 150 liter dampsteriliseret medium, omrørt af en 21,6 cm's vingeskiverotor med en hastighed på 210 omdrejninger/minut.
Steril luft indblæses i en mængde på 150 liter/minut. Fermenteringen foretages ved 26°C. Når det er nødvendigt, tilsættes antiskum-midler i 10 ml's portioner (10% "Pluronic L81" i søjabønneolie).
Det medium, som anvendes på produktionstrinnet, er som beskrevet i eksempel 3, og der tilsættes 0,05 volumen/volumenprocent 10% "Pluronic L81"/sojabønneolie-antiskummiddel før sterilisation.
50 161254
Den β-lactamase-inhiberende virkning i fermentationsprøverne er i lighed med dem, som beskrives i eksempel 10 (jfr. tabel II).
Ved papirchromatografisk undersøgelse ses en zone af clavulansyre ved R^-værdi 0,46 under anvendelse af den ovenfor beskrevne bioautograf iske (synergisme) metode. Størrelsen af clavulansyrezonen stiger svarende til stigningen i β-lactamase-inhiberingsprøven.
Eksempel 12.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
100 ml sterilt va$d sættes til en sporekultur af Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, som er dyrket på Bennetts-agar i en Roux-flaske i 10 dage ved 26°C. Der fremstilles en mycelium/sporesuspension, og den anvendes til at pode 75 liter dampsteriliseret medium med nedenstående sammensætning i ledningsvand:
Dextrin 2. vægt/volumenprocent "Arkasoy 50" 1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic L81" i sojabønneolie 0,03 volumen/volumenprocent.
pH-Værdien i mediet indstilles på 7,0.
Mediet er i en 100-liters rustfri stålfermenteringsbehoIder med prelplader og omrøres af en 19,05 cm's vingeskiverotor ved 140 omdrej ninger/minut. Der tilføres steril luft i en mængde på 75 liter/ minut, og tanken inkuberes i 72 timer ved 26°C.
Indholdet af kimfermenteringsbeholderen anvendes til at pode 1500 liter dampsteriliseret medium med nedenstående sammensætning i ledningsvand: "Arkasoy 50" 1,5 vægt/volumenprocent
Glycerol 1,0 vægt/volumenprocent K^PO^ 0,1 vægt/volumenprocent .
10% "Pluronic L81" i sojabønneolie 0,2 volumen/volumenprocent.
U125A
51 pH-Værdien i mediet indstilles på 7,0.
Dette medium indeholdes i en 2000 liters rustfri stålfermenteringsbeholder, som fuldstændig er forsynet med prelplader, og som omrøres af to 48,4 can's vingeskiverotorer med 106 omdrejninger/minut.
Steril luft ledes ind i en mængde på 1200 liter/minut. Når det er nødvendigt, tilsættes antiskummidler i 25 ml's portioner. (10% "Pluronic L81" i sojabønneolie). Fermenteringen holdes ved 26°C, indtil der er nået et maksimalt udbytte af clavulansyre efter 3 -5 dages forløb, hvor der er produceret 200 - 300yUg/ml clavulansyre.
Eksempel 13.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
På den ovenfor beskrevne måde fremstilles et podemateriale i en kimkolbe, men der anvendes det i eksempel 3 beskrevne medium (med pH-værdien i mediet indstillet på 7,0). Dette anvendes til at pode 500 ml's koniske kolber indeholdende 100 ml prøver af nedenstående medium fremstillet i deioniseret vand og steriliseret. Inokulumniveauet er 5%.
"Prichem P224" 1 vægt/volumenprocent "Arkasoy 50" 1,5 vægt/volumenprocent KI^PO^ 0,1 vægt/volumenprocent.
pH-Værdien i mediet indstilles på 7,0.
De podede kolber rystes ved 26°C, og en optimal β-lactamase-inhi-berende virkning nås på mellem 3 og 5 dage. Der opnås niveauer på 300 - 500yUg/ml clavulansyre.
"Prichem P224" er et triglycerid markedsført af Prices Limited, Brom-borough, Bebington, Wirral, Cheshire, Storbritannien. "Prichem P224" er baseret på 65% oliesyre, 11% palmitinsyre og andre lignende syrer.
Eksempel 14.
Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.
141254 52
Indhøstet kulturvæske, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 10, klares ved kontinuerlig flydende centrifugering, og myceliet kasseres. Af 150 liter fermentationsvæske fås 120 liter klaret kulturvæske. Dette filtrat viser 58%'s inhibering i β-lactamase--inhiberingsforsøget i en fortynding på 1/2500. Filtratet afkøles til 5°C, og der tilsættes 40 liter n-butanol. Blandingen omrøres, og der tilsættes 25%'s ^SO^, indtil pH-værdien er 2,0. Den syrnede blanding omrøres i yderligere 10 minutter, før faserne adskilles ved centrifugering. Den vandige fase kasseres. Til n-butanolekstrakten sættes 0,5% "Norit"® GSX (aktivkul), og blandingen omrøres i 15 minutter. Kullet kasseres efter fjernelse ved filtrering under anvendelse af diatoméjord som filterhjælpestof. Til n-butanolet sættes en fjerdedel rumfang deioniseret vand, og blandingen omrøres, medens der tilsættes 20%'s NaOH-opløsning, indtil pH-værdien har indstillet sig på 7,0. Faserne adskilles ved centrifugering, og n-butanolfasen kasseres. Den vandige fase inddampes under reduceret tryk til 800 ml, hvorefter den frysetørres. Derved fås 35 g af et råt fast clavulansyreprodukt med en I5Q-værdi på l,3yug/ml ved β-lactamase-inhiberingsforsøget. Dette faste præparat oplagres tørt ved -20°C, inden det renses yderligere.
Eksempel 15.
Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.
1 liter kulturfiltrat med 53%'s inhibering ved 1/2500 i β-lactamase-inhiberingsforsøget og fremstillet som beskrevet i eksempel 12 per-coleres ned over en 2,54 cm x 15,24 cm søjle af "Permutit"® Isopore harpiks FF IP (SRA 62) i Cl -form (markedsført af Permutit Co.
Ltd., 632 - 652 London Road, Isleworth, Middlesex, Storbritannien). Kulturfiltratet efterfølges af 300 ml destilleret vand for at vaske søjlen. Eluering af den aktive β-lactamase-inhibitor udføres med 0,2M NaCl-opløsning. Der opsamles 20 ml's fraktioner, og de undersøges i en endelig fortynding på 1/2500 ved β-lactamase-inhiberingsfor- 53 141254 søg. Aktive fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum til 20 ml. Denne opløsning afsaltes ved geludelukkelseschromatografi på en "Biorad Biogel P2"-søjle med en diameter på 3,81 cm og et gelleje på 40,64 cm og elueres med 1% n-butanol i vand ("Biogel P2" markedsføres af Biorad Laboratories, 32nd and Griffin Avenue, Richmond, California, U.S.A.). De aktive fraktioner, bestemt ved 8-lactamase-inhiberingsforsøget, sammenhældes. Natriumchlorid elueres efter clavulansyre og bestemmes under anvendelse af sølvnitratopløsning. De kombinerede aktive fraktioner inddampes og frysetørres.
Af 1 liter kulturfiltrat fås ved den ovenfor angivne behandling 0,45 g råt fast clavulansyreprodukt med en I5Q-værdi på 0,92 y-ug/ml. Dette faste stof oplagres ved -20°C inden yderligere rensning.
Eksempel 16.
Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.
Kulturfiltrat indeholdende 300yug/ml clavulansyre og opnået som beskrevet i eksempel 13 syrnes under anvendelse af et "in-line"-mixersystem og ekstraheres med n-butanol, og clavulansyre tilbageekstraheres i vand ved neutral pH-værdi.
Afkølet kulturfiltrat (5 - 10°C) pumpes til en "in-line"-mixer, ved hvis tilledning der sættes en tilstrækkelig mængde 6 volumen/volumén-procent salpetersyre til at holde en udgangs pH-værdi på 2,0 - 0,1.
Det syrnede filtrat ledes med en hastighed på 4 liter/minut gennem en glycolkølet pladevarmeveksler (A.P.V. Ltd.) for at holde en temperatur mellem 2 og 5°C. pH-Værdien måles i en gennemstrømningscelle, før væsken ledes ind i en tretrinsmodstrømSseparator (Westfalia Separator Ltd., model EG 1006).
Med afkølet vand mættet n-butanol (ved ca. 5°C) pumpes med en hastighed på 3 liter/minut ind i modstrømsseparatoren.
Det vandige udløb fra modstrømsseparatoren ledes bort. Indledt vand fjernes fra butanoludstrømningen fra modstrømsseparatoren under anvendelse af en væske/væske-centrifugalseparator (Alfa Laval Ltd., model 3024X - G). Butanolet opsamles i en rustfri stål- 141254 54 tank forsynet med en kølekappe, i hvilken det oplagres ved ca.
5°C.
Fra tanken fjernes 40 liter prøver, og de blandes grundigt med 2 liter afkølet vand (5°C) mættet med n-butanol. pH-Værdien i denne blanding indstilles på 6,8 - 0,1 under anvendelse af 20%'s natriumhydroxidopløsning .
Denne vandige ekstrakt/butanolblanding ledes ind i en væske/væskecen-trifugalseparator (Sharpies Centrifuge Ltd., model M35PY - 5 PH) med en tilpumpningshastighed på 2 liter/minut.
Af 1800 liter kulturfiltrat isoleres 90 liter vandig fase indeholdende 39% af den clavulansyre, som er i kulturfiltratet.
15 liter af den vandige ekstrakt indstilles fra 2% til 8% totalfaststof ved tilsætning af 60 g natriumchlorid/liter og forstøvningstør-res (Anhydro, København, type Lab. S 1). Betingelserne er: fødehastighed 2 liter/time; forstøverspænding 170 volt; heaterstilling 6 -7; indgangstemperatur 150°C; udgangstemperatur 80°C.
Det tørrede produkt med en totalvægt på 1 kg indeholder 62% af den clavulansyre, som er i den tilledte opløsning.
De resterende 75 liter vandig ekstrakt koncentreres ved ultrafiltrering (De Danske Sukkerfabrikker, laboratoriemodul, membrantype 900). Driftsteknikken er at recirkulere retentatet fra en rustfri ståltank forsynet med et kølesystem og med en udgangsventil sat på en sådan måde, at der fås et differentialtryk hen over 40 membraner på 25 atmosfærer. Temperaturen holdes ved 2 - 5°C, og pH-vær-dien holdes ved 6,8 - 0,1 ved tilsætning af 2N saltsyre efter behov. Rumfanget reduceres til 34 liter, som indeholder 72% af den clavulansyre, som er i den tilledte opløsning.
Det vandige koncentrat oplagres ved ca. 5°C, indstilles på et faststofindhold på 8% og forstøvningstørres som ovenfor beskrevet. Det tørrede materiale indeholder 75% af clavulansyren i dén til forstøv- 141254 55 ningstørringsapparaturet ledte opløsning.
Det totale forstøvningstørrede produkt fra 90 liter vandig ekstrakt indeholder 69,4 g clavulansyre, hvilket er 72% af clavulansyren i forstøvningstørringstilgangsvæsken og 21% af clavulansyren i de 1800 liter kulturfiltrat.
Eksempel 17.
Partiel rensning af rå clavulansyre.
Rå clavulansyrepræparater fremstillet som beskrevet i eksempel 15 renses ved ionbytterchromatografi. 18 g materiale fremstillet som beskrevet i eksempel 15 med en I50-værdi på l,3^,ug/ml (endelig koncentration) opløses i 25 ml destilleret vand og hældes på et 3,81 cm x 40,64 cm leje af "Permutit FF IP (SRA 62)" harpiks i Cl -form. Søjlen elueres med en natriumchloridgradient dannet ved tyngdekrafttilledning af 0,5M natriumchlorid til et blandekar indeholdende 1 liter destilleret vand, som igen ledes til chroma-tografisøjlen. 10 ml's fraktioner opsamles, og den β-lactamase-in-hiberende virkning undersøges under anvendelse af en 1/2500 fortynding af fraktionerne. Aktiviteten elueres efter et hovedfarvebånd mellem fraktionerne 24 og 30. De aktive fraktioner sammenhældes og koncentreres til 30 ml.
Denne opløsning afsaltes under anvendelse af et 5,08 cm x 45,72 cm leje af "Biorad Biogel P2" og elueres med 1% n-butanol i vand.
20 ml's fraktioner undersøges for clavulansyreindhold under anvendelse af β-lactamaseinhiberingsforsøg. Fraktionerne sættes også på papirsstrimler, og der forstøves med enten "Ehrlich"- eller triphe-nyltetrazolium-forstøvningsreagenser som beskrevet i beskrivelse 3. Den β-lactamase-inhiberende virkning korreleres med henholdsvis lyserøde og røde pletter, som fremkaldes af disse reagenser. Aktive fraktioner sammenhældes, med undtagelse af sådanne, som indeholder natriumchlorid, og inddampes til tørhed under vakuum. Derved fås 520 mg partielt renset clavulansyre-natriumsalt med en I50 -værdi på 0,2^ug/ml ved standard β-lactamase-inhiberingsforsøget.
141254 56
Tyndtlagschromatografi (silicagel) af dette clavulansyrepræparat giver følgende R^-værdier: n-butanol/ethanol/vand i forholdet 4:1:5 volumen/volumen/ topfase, R^-værdi 0,37; n-butanol/eddikesyre/vand i forholdet 12:3:5 volumen/volumen, R^-vær-di 0,44; isopropanol/vand i forholdet 7:3 volumen/volumen, Rf-værdi 0,78.
Disse zoner bestemmes ved påsprøjtning af "Ehrlich"-reagens. 6-Ami-nopenicillansyre lades løbe med som markeringsstof og bestemmes med samme sprøjtemiddel og har R^-værdier på henholdsvis 0,38, 0,39 og 0,77.
Eksempel 18.
Partiel rensning af clavulansyre-natriumsalt.
Kulturfiltrat fremstillet som beskrevet i eksempel 12 opløsnings-middelekstraheres som beskrevet i eksempel 14, hvorved der fås et fast præparat, som yderligere renses ved ionbytningschromatografi under anvendelse af "Whatman" diethylaminoethylcellulose DE 52.
Dette faste stof (10 g) opløses i 20 ml destilleret vand og hældes på en 3,81 cm x 50,80 cm søjle af DE 52-cellulose, som i forvejen er ækvilibreret med 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,5.
Søjlen elueres med en NaCl-gradient. 0,1M NaCl i 0,01M natriumphospha tpuf fer med pH-værdi 7,5 ledes ind i et mixerkammer indeholdende 1 liter 0,01M phosphatpuffer med pH-værdi 7,5, som igen ledes på søjlen. 10 ml's fraktioner opsamles, og de undersøges for β-lactamase-inhiberende virkning ved fortynding på 1/2500. Fraktionerne undersøges også for antibakteriel virkning ved hul-pladeforsøgsmetoden under anvendelse af næringsagarplader, på hvilke der er udpodet Klebsiella aerogenes. Fraktionerne med den højeste β-lactamase-inhiberende virkning og med inhiberingszoner i hulpladeforsøget sammenhældes, inddampes og afsaltes på en "Biorad Biogel P2“-søjle. Disse fraktioner vises ved hjælp af papirchro-matografi og tyndtlagschromatografi at indeholde clavulansyre.
Isolering af fast clavulansyre-natriumsalt.
Eksempel 19.
57
U125A
Et partielt renset fast præparat af clavulansyre (500 mg) fremstillet som beskrevet i eksempel 17 hældes på en "Whatman" mikrokry-stallinsk CC 31-cellulosesøjle med en lejestørrelse på 2,54 can x 50,80 cm. Det chromatografiske opløsningsmiddel er n-butanol/ethanol/ vand i volumen/volumen-forholdet 4:1:5, topfase. Søjlen drives ved 4°C, og der opsamles fraktioner på 4 ml. Fraktionerne undersøges for tilstedeværelse af clavulansyre ved at blive sat på filterpapir og sprøjtet med "Ehrlich" (lyserøde prøver)- eller triphenyltetrazolium (røde prøver)-forstøvningsreagens. Disse pletprøver bekræftes ved β-lactamase-inhiberingsforsøg i en fortynding på 1/1250. Aktive fraktioner sammenhældes og tørres under vakuum på en roterende fordamper. Det faste stof opløses i et ringe volumen destilleret vand og frysetørres. Der fås 40 mg af et hvidt fast præparat af natriumsaltet af clavulansyre med en I50-værdi på 0,08yug/ml i β-lactamase-inhiberingsforsøget.
Eksempel 20.
Isolering af fast clavulansyre-natriumsalt.
Koncentreret reekstrakt (6 liter) (fra ultrafiltrering ifølge eksempel 16) indeholdende 10 g clavulansyre ifølge β-lacta-mase-inhiberingsforsøget som ovenfor beskrevet. Dette percoleres med en hastighed på 1 liter/time på en 5,08 cm x 60,96 cm søjle af "Permutlt Zerolit FF 1 P SRA 62"-anionbytterharpiks i chlorid-form. Søjlen vaskes derefter med 2 liter deioniseret vand før eluering med en natriumchloridgradient. Gradienten dannes af et reservoir indeholdende 4 liter 1,4M NaCl, som ledes til et omrørt reservoir indeholdende 4 liter 0,7M NaCl, som igen føres til et omrørt reservoir indeholdende 4 liter deioniseret vand, som via en pumpe er forbundet med søjlen. Søjlen elueres med· en hastighed på 2,5 ml/ minut, og der opsamles fraktioner på 25 ml. Fraktionerne undersøges ved hjælp af (3-lactamase-inhiberingsforsøget.
58 1A1254
De aktive fraktioner (numrene 140 - 230) sammenhældes og inddampes i vakuum til næsten tørhed. 500 ml ethanol tilsættes, og det faste stof frafiltreres efter kraftig rystning. Ethanolekstrakten inddampes derefter i vakuum til tørhed på en rotationsfordamper og genopløses i 40 ml deioniseret vand. Dette hældes på en 10,16 cm x 60/96 cm søjle med "Biorad Biogel P2" og elueres med en 1%'s n-bu-tanolopløsning. Der opsamles fraktioner på 25 ml, og de undersøges for β-lactamase-inhiberende virkning i en endelig fortynding på 1/2500. Undersøgelser for natriumindhold i 1/25-fortyndinger af fraktionerne udføres under anvendelse af sølvnitratopløsning. Fraktionerne indeholdende clavulansyre uden natriumchlorid sammenhældes, koncentreres til 20 ml ved afdampning af opløsningsmidlet under reduceret tryk og frysetørres. Derved fås 4,8 g af natriumsaltet af clavulansyre (I50-værdi ca. 0,06yug/ml).
Eksempel 21.
Fremstilling af en ester af clavulansyre (methylester).
^ .CH_OH . CH OH
rf\=/
/~V
coot,a cooch3 19,8 mg af natriumsaltet af clavulansyre (fremstillet som beskrevet i eksempel 20), opløses i 0,5 ml tørt dimethylformamid og behandles med 0,25 ml methyliodid. Efter henstand ved stuetemperatur i 1 1/2 time under vandfrie betingelser fjernes opløsningsmidlerne i vakuum. Remanensen renses ved preparativ lag-chromatografi (P.L.C.) på silicagel (Kieselgel 60F254, markedsført af E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) og eluering med ethyl-acetat, hvorved der fås clavulansyre-methylester i form af en farveløs olie (R^-værdi 0,38; rød farve med triphenyltetrazoliumchlo-ridspray), og olien har nedenstående egenskaber: 141254 59
Analyse;
Beregnet for CgH^NOgt C 50,70 H 5,20 N 6,57 Fundet: C 50,49 H 5,43 N 6,29.
UV-spektrum (methanol: λ ; ingen absorption >215 nm; max IR-spektrum: v (film): 3300 - 3600 (bredt), 1800, 1750, 1695 cm-1.
lUaX
Tilnærmet første ordens NMR-spektrum (CDClg): 2,49 (bred S, 1, udskiftet med D20), 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 3,84 (S, 3) 4,24 (d, 2, J = 7 Hz), 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,07 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,72 (d, 1, J = 2,5 Hz).
Molekylvægt (massespektrum): 213,0635.
Beregnet for CgH^NOg: 213,0637.
Tyndtlagschromatografi på methylesteren viser en enkelt zone i hver af de nedenstående opløsningsmiddelsystemer: butanol/ethanol/ vand i volumen/volumen-forholdet 4:1:5, topfase R^-værdi 0,75; iso-propanol/vand i volumen/volumen-forholdet 7:3, R^-værdi 0,95; ethyl-acetat/ethylalkohol i volumen/volumen-forhoIdet 8:2, R^-værdi 0,87.
Disse zoner bestemmes ved bioautografi under anvendelse af Klebsiella aerogenes med tilsat benzylpenicillin (synergismesystem).
Eksempel 22.
Fremstilling af en ester af clavulansyre (p-nitrobenzylester) ·
rrwv .rrv/H20H
/-•k/ -» COONa ^ COOCH2~~-^ ^—N02 141254 60
Behandling af natriumsaltet af clavulansyre (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 20 fremstillede salt) med p-nitro-benzylbromid i tørt dimethylformamid giver, efter P.L.C., en farve·!· løs olie, som krystalliserer af chloroform-ether, hvorved der fås p-nitrobenzylesteren af clavulansyre i form af hvide fjeragtige nåle med smeltepunkt 111 - 112°C, som efter omkrystallisation har smeltepunkt 117,5 - 118°C.
Eksempel 23.
Fremstilling af en ester af clavulansyre (benzylester).
CH-OH
I 2 ch2oh rf COOMa y 11 ^COOCH.-Ph u o 1
Urent 3-(β-hydroxyethylidin)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan--2-carboxylsyre-natriumsalt (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 19 fremstillede salt) (antages at være ca. 55 mg rent stof) i 0,64 ml tørt dimethylformamid behandles med 0,18 ml benzylbromid. Opløsningen holdes ved stuetemperatur (ca. 17 - 18°C) i 3 timer under vandfrie betingelser. Reaktionsblandingen fraktioneres på . silicagel og elueres med ethylacetat, hvorved der fås 63 mg af en i det væsentlige ren form af benzylesteren af 3-(β-hydroxyethylidin)--7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylsyre i form af en farveløs olie.
IR-spektrum (film): 1800, 1745 og 1695 cm "S
NMR-spektrum (CDCl^): 2,25 (s, 1, udskiftelig med D20), 3,05 (d, 1, J = 17 Hz), 3,51 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,92 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,15 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,24 (s, 2), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz") , 7,456 (s, 5) .
Eksempel 24.
61 141254
Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre ud fra råekstrakter af kulturfiltratet fra Streptomyces clavuligerus.
4 20 liter kulturfiltrat fremstillet som beskrevet i eksempel 10 inddampes under vakuum til 5 liter under anvendelse af en "opstigende film"-inddamper. Koncentratet frysetørres under anvendelse af en "Edwards E.F.6" skalfrysetørrer fremstillet af Edwards High Vacuum Ltd.. 300 g af det således fremstillede faste stof indeholder 3 g natrium-clavulansyre som bestemt ved enzyminhiberingsforsøget.
Det faste stof suspenderes i 900 ml tørt dimethylformamid, og der tilsættes 150 ml benzylbromid. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur og fortyndes derefter med 1 liter ethylacetat. Reaktionsblandingen filtreres, og filtratet inddampes til mindst muligt rumfang. Den olieagtige remanens ekstraheres med yderligere 1 liter ethylacetat, og ekstrakten filtreres. Filtratet koncentreres igen, og den resulterende olieagtige remanens hældes på en 7,62 cm x 35,56 cm silicagelsøjle ("Biogel Biosil A" 100 mesh) i cyclohexan. Søjlen elueres med cyclohexan til fjernelse af benzylbromid, og opløsningsmidlet ændres derefter til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 20 ml. Fraktionerne undersøges for tilstedeværelse af benzylesteren af clavulansyre ved at sætte dem pletvis på glas-bårne silicageltyndtlagschromatografiplader (Merck precoated sili-cagel 60 F 254) og påsprøjtning af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlo-rid (TTC) sprayreagens. Fraktioner, som viser intense røde pletter med dette reagens, undersøges yderligere ved tyndtlagschromatografi på silicagelplader under anvendelse af chloroform-ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel og ved at sprøjte de fremkaldte plader med TTC-spray. Benzylesteren af clavulansyre løber med en R^-værdi på 0,31 ved 22°C. Fraktioner indeholdende denne ester sammenhældes og koncentreres til 15 ml, og denne opløsning chromato-graferes yderligere på en 3,81 cm x 40,64 cm silicagelsøjle (Merck silicagel H, type 60) med chloroform/ethylacetat 8:2 som opløsningsmiddel. Der opsamles fraktioner på 15 ml, og de undersøges for benzylester på den ovenfor beskrevne måde. De fraktioner, som indeholder esteren, koncentreres til 8 ml og renses endelig ved søjle-chromatografi på en 2,54 cm x 40,64 cm silicagelsøjle (Merck sili- 141254 62 cagel H, type 60) med ethylacetat/cyclohexan i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Udvalgte fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum, hvorved der fås 160 mg af den rene benzylester i form af en olie.
Eksempel 25.
Fremstilling af clavulansyre-benzylester.
3,3 kg forstøvningstørret faststof indeholdende 69,4 g clavulan-syre ifølge enzyminhiberingsforsøget fremstilles som beskrevet i eksempel 16. Det faste stof opslæmmes i 5,5 liter dimethylformamid, og der tilsættes 500 ml benzylbromid. Efter omrøring ved stuetemperatur i 2 timer tilsættes 12 liter ethylacetat, og de faste stoffer fjernes ved filtrering. Filtratet inddampes under vakuum,hvorved der fås 212 g af en olieagtig remanens. Remanensen hældes på en søjle med et leje af 10,16 cm x 33,02 cm silicagel (Hopkins & Williams MFC) i cyclohexan. Søjlen elueres med 12 liter cyclohexan til fjernelse af overskydende benzylbromid. Eluenten ændres derefter til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 500 ml. Disse undersøges for benzylclavulanatindhold ved at sættes i pletter på silicageltyndtlagschromatografiplader (Merck precoated silicagel 60 F 254) og påsprøjtes 2,3,5-triphenyltetrazolium-chlorid (TTC) sprayreagens. Fraktioner, som giver intense røde pletter, undersøges yderligere ved tyndtlagschromatografi på silicagel .med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel og sprøjtning af de fremkaldte plader med TTC-spray. Fraktionerne 5 - 13 indeholder størstedelen af esteren, og disse sammenhældes og inddampes i vakuum, hvorved der fås 79,3 g olie. Dette præparat chromatograferes derefter på en 10,16 cm x 45,72 cm søjle af silicagel (Merck silicagel H type 60) med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Fraktioner udvælges som ovenfor beskrevet, og ved inddampning fås 45,9 g af en olie, som er af 62%'s renhed bestemt ved NMR-spektroskopi.
Dette produkt chromatograferes til slut på en 6,99 cm x 45,72 cm søjle af "Sephadex LH 20" i cyclohexan/chloroform i forholdet 1:1.
Efter udvælgelse af fraktioner og inddampning fås 27,6 g af en farveløs olie, som viser sig at være 95% ren benzylester af clavulansyre 63 141254 bestemt ved NMR-spektroskopisk undersøgelse. ("Sephadex LH 20" er et hydroxypropylderivat af "Sephadex Q 25", markedsført af Pharmacia Great Britain, 75 Uxbridge Road, London W5, Storbritannien).
Eksempel 26.
Fremstilling af clavulansyre-benzylester.
150 liter kulturfiltrat med pH-værdi 7,0 indeholder 16,2 g clavulan-syre-natriumsalt ifølge enzyminhiberingsforsøg og er fremstillet analogt med det ifølge eksempel 10 fremstillede salt. Dette filtrat omrøres med 5 kg "Amberlyst"® A.26-anionbytterharpiks i Cl -form (Rohm & Hass Company, Philadelphia, U.S.A) i 1 time ved stuetemperatur. Harpiksen filtreres derefter, og filtratet undersøges igen, hvorved det ses, at 6,4 g clavulansyre er fjernet. Harpiksen vaskes med 20 liter deioniseret vand efterfulgt af 20 liter acetone og 10 liter dimethylformamid. Efter genfiltrering suspenderes harpiksen i 2,3 liter dimethylformamid/0,2M natriumiodid. Til dette sættes 200 ml benzylbramid, og suspensionen omrøres grundigt. Efter henstand ved stuetemperatur i 16 timer tilsættes 2 liter ethyl-acetat, hvorefter harpiksen filtreres, og yderligere ethylacetat-vaskevæsker fra harpiksen sammenhældes med filtratet. Ekstrakten inddampes til et lille rumfang og chromatograferes på en 7,62 cm x 45,72 cm silicagelsøjle (Merck silicagel H type 60) med ethylacetat/ cyclohexan i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Fraktioner indeholdende benzylclavulanat udvælges ved pletprøver på silicageltyndtlags-chromatografiplader og påsprøjtning med TTC-reagens som beskrevet i eksempel 24. De udvalgte fraktioner inddampes til 20 ml og chromatograferes derefter på en 3,81 cm x 45,72 cm silicagelsøjle (Merck silicagel H type 60) med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Udvalgte fraktioner sammenhældes og inddampes, hvorved der fås 440 mg af en farveløs olie, som ifølge NMR--spektroskopi er 90% benzylclavulanat.
Eksempel 27.
Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre ud fra råekstrakter af kulturfiltratet af Streptomyces clavuligerus.
141254 64
En alikvot af et vandigt reekstrakt af butanolekstrakten fra kulturfiltratet, som er fremstillet som beskrevet i eksempel 14, frysetørres under anvendelse af et "Edwards" kammertørreapparat. En portion på 24 g af det vundne faste stof indeholder 0,96 g natrium-clavulanat ifølge enzyminhiberingsforsøget. Dette faste stof suspenderes i 75 ml tørt dimethylformamid, og der tilsættes 75 ml benzylbromid. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Suspensionen fortyndes derefter med 500 ml ethylacetat, og blandingen filtreres. Filtratet inddampes på en roterende vakuuminddamper, hvorved der fås en olieagtig remanens. Denne remanens hældes på en 5,08 cm x 35,56 cm silicagelsøjle ("Biogel Biosil A" 100 mesh) i cyclohexan. Benzylbromid elueres fra søjlen, og derefter ændres opløsningsmidlet til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 10 ml. Fraktioner indeholdende benzylesteren af clavulan-syre udvælges som beskrevet i eksempel 24. Yderligere rensning udføres som beskrevet i eksempel 24 ved hjælp af søjlechromatografi.
Ved denne fremgangsmåde fås 220 mg ren benzylester.
Eksempel 28.
Fremstilling af clavulansyre-natriumsalt.
Π-*.}/*2™ ^ ^2011 COOCE-CÆ- b)ONa 2 6 5 281 mg i det væsentlige rent benzylclavulanat (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 23 fremstillede) i 25 ml ethanol indeholdende 82 mg natriumhydrogenearbonat hydrogeneres over 90 mg 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur og under atmosfæretryk. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med vand og ethanol, og de samlede filtrater inddampes under reduceret tryk ved stuetemperatur. Det som remanens vundne halvfaste stof tritu-reres med acetone, filtreres og vaskes med ether, hvorved der fås 135 mg natriumclavulanat.
Eksempel 29.
65 141254
Hydrolyse af clavulansyre-methylester til dannelse af clavulan-syre.
2,17 mg clavulansyreester (fremstillet som beskrevet i eksempel 21) opløses i 0,1 ml methanol og behandles med 0,208 ml 0,0482N natriumhydroxidopløsning. Efter 1 time ved stuetemperatur indeholder reaktionsblandingen adskillige produkter. Tyndtlagschromato-grafisk analyse viser, at en af de overvejende komponenter har en R^-værdi, som er identisk med værdien for natriumsaltet af clavulansyrej farvereaktioner og biologisk undersøgelse er i overensstemmelse med dette stof, som er natriumsaltet af clavulansyre.
Langsom omdannelse af esteren til clavulansyre ses, når 1 mg/ml af forbindelsen inkuberes ved 37°C i 0,05M phosphatpuffer ved pH-værdi 7. Reaktionen følges af papirchromatograf1 (bioautografisk system). Under anvendelse af butanol/ethanol/vandsysternet til at følge reaktionen over en periode på 2 timer, aftager methylester-zonen ved en R^-værdi på 0,79 i størrelse, medens zonen for clavulansyre ved Rf~værdi 0,12 stiger.
Eksempel 30.
Fremstilling af pivaloyloxymethylclavulanat.
Til en' omrørt opløsning af 0,37 g brommethylpivalat i 5 ml tørt dimethylformamid sættes 0,49 g natriumclavulanat (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 28 fremstillede salt). Efter 2 timers henstand ved stuetemperatur behandles reaktionsblandingen med 20 ml ethylacetat, 10 ml cyclohexan og 20 ml vand. Blandingen adskilles i to faser, og den ikke-vandige fase fraskilles, vaskes med 20 ml vand og tørres over natriumsulfat. Den tørrede opløsning inddampes, hvorved det ønskede produkt fås i form af 500 mg af en lysegul olie.
NMR-spektrum (CDC13): 1,26 (s, 9), 3,13 (d, 1, J = 17 Hz), 3,62 (dd, 1, J = 17 Hz, Jx - 2,5 Hz), 4,3 (d,2, J » 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 * 1,5 Hz), 5,16 (d, 1, J * 1,5 Hz), 5,79 (d, 1, J = 2,5 Hz), 5,926 (s, 2) .
_ι 66 141254 IR-Spektrum (flydende film): v β-lactam C.O 1800 cm , ester C=0 1760 cm-1.
Eksempel 31.
Fremstilling af clavulansyre-phthalidestere.
Til en omrørt opløsning af 0,43 g 3-bromphthaiid i 5 ml tørt dime-thylformamid sættes 0,5 g natriumclavulanat (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 28 fremstillede salt), og opløsningen lades henstå ved stuetemperatur i 2 timer. Opløsningen behandles med 20 ml ethylacetat, 10 ml cyclohexan og 30 ml vand og rystes grundigt.
Den ikke-vandige fase vaskes med 20 ml vand, tørres over natriumsulfat og inddampes, hvorved der fås en lysegul gummi. De to diaste-reomere estere adskilles under anvendelse af højtryksvæskechroma-tografi på en 40 cm x 10 mm søjle af silicagel (Merckosorb SI 60, 5^u) og elueres med ethylacetat med en strømningshastighed på 3 ml/ minut.
Den første phthalidester (retentionstid 7,15 minutter) krystalliserer af ethylacetat i form af nåle med smeltepunkt 102°C og har følgende spektrer: IR-spektrum (nujol mull) v β-lactam C=0 1790 cm \ ester C=0 1755 -1 cm NMR-spektrum (CD-jCOCD^) : 3,14 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,76 (dd, 1, J = 17.5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,25 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, - 7.5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,4 (s, 1, J = 1,5 Hz), 5,82 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,7 (s, 1), 8,06 δ (m, 4).
Molvægt (massespektometri): 331,0696 svarer til C^gH^NOy (beregnet 331,0692).
Den anden diastereoisomere (retentionstid 8,85 minutter) har følgende spektrer: IR-spektrum: (CH2Cl2~opløsning): v β-lactam C=0 1800 cm \ ester C=0 1780 'cm-1.
141254 67 NMR-spektrum (CDC13): 2,42 (bred S, 1, udskiftelig med D20), 3,12 (d, 1, J = 18 Hz), 3,60 (dd, 1, Jx = 18 Hz, J2 * 2,5 Hz), 4,30 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, ^ * 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,12 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,76 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,52 (S, 1), 7,856 (m, 4) .
1^^ yCE2°u py -lyy I + COONa
-1''*’ i\=/CH20H
O I
0=00 y""1···0 'Ό
Eksempel 32.
Fremstilling af nonylclavulanat.
44 mg natriumclavulanat (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 28 fremstillede salt) i 2 ml tørt dimethylformamid behandles med 76 mg nonyliodid og lades henstå ved stuetemperatur i 2 timer. Opløsningen inddampes, og remanensen fraktioneres på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forholdet 2:1, hvorved produktet fås i form af en olie.
IR-spektrum (film) : 1800, 1745 og 1690 cm
Molvægt (massespektrometri) = 325,1890, hvilket svarer til C,.,H„-NOc 17 27 o (beregnet 325,1889).
Eksempel 33.
68 141254
Fremstilling af clavulansyre.
100 mg benzylclavulanat (fremstillet analogt med den ifølge eksempel 26 fremstillede ester) i 5 ml ethanol hydrogeneres over 30 mg 10%'s palladium/kul i 45 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med ethanol, og de samlede filtrater inddampes i vakuum, hvorved der fås 58 mg clavulansyre i form af en ustabil, viskos olie.
NMR-spektrum (C^N) : 3,05 (d, 1, J = 18 Hz), 3,60 (dd, 1, ^ = 18 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,75 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,58 (t, 1, J = 7,5 Hz), 5,66 (S, 1), 6,0 δ(d, 1, J = 2,5 Hz).
Eksempel 34.
Fremstilling af methylclavulanat.
130 mg clavulansyre (fremstillet analogt med den ifølge eksempel 33 fremstillede syre) i 10 ml ethanol behandles med en overskydende mængde diazomethan i ether. Efter 2 minutter ved stuetemperatur vises reaktionen ved hjælp af tyndtlagschromatografi at være fuldstændig. Opløsningen inddampes i vakuum, og remanensen renses ved chromatografi på silicagel og elueres med ethylacetat. Fraktionerne indeholdende methylclavulanat sammenhældes og inddampes, hvorved der fås 104 mg af en klar olie.
Eksempel 35.
Fremstilling af methylclavulanat.
200 mg clavulansyre (fremstillet analogt med den ifølge eksempel 33 fremstillede syre) i 5 ml acetonitril afkøles og omrøres ved 0°C. 0,5 ml methanol og derefter 206 mg dicyclohexylcarbodiimid tilsættes, og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås råt methylclavulanat. Råproduktet renses ved chroma-tografi på silicagel og elueres med ethylacetat, hvorved der fås 140 mg af en klar olie.
Eksempel 36.
69 141254
Fremstilling af phenylclavulanat.
100 mg clavulansyre (fremstillet analogt med den ifølge eksempel 33 fremstillede syre) i 5 ml acetonitril afkøles og omrøres ved 0°C.
Til opløsningen sættes 0,94 g phenol og 100 mg dicyclohexylcarbodi-imid, og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes. Remanensen fraktioneres på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forholdet 1:1, hvorved der fås 70 mg phenylclavulanat.
IR-spektrum (film): 1800, 1770 og 1690 cm NMR-spektrum (CDC13): 2,18 (bred s, 1), 3,06 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 0,9 Hz), 3,54 (dd, 1, = 17 Hz, J2 » 2,6 Hz), 4,29 ( d, 2, J = 7,5 Hz), 5,1 (dt, 1, ^ « 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,29 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,76 (dd, 1, = 2,6 Hz, J2 » 0,9 Hz), 7,35 6 (m, 5).
Molvægt (massespektrometri) = 275,0 777, hvilket svarer til C^H^NOtj (beregnet 275,0794).
Eksempel 37.
Fremstilling af 2,2,2-trichlorethylclavulanat.
221 mg natriumclavulanat (fremstillet analogt med det ifølge eksempel 28 fremstillede salt) suspenderes i 5 ml tørt tetrahydro-furan og omrøres ved 0°C. 211 mg chlormyreayretrichlorethylester i 1 ml tørt tetrahydrofuran sættes til den ovenfor anførte suspension i løbet af 20 minutter. Blandingen lades opnå stuetemperatur og omrøres natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen chromatograferes på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forholdet 2:1, hvorved der fås det ønskede produkt i form af en olie.
IR-spektrum (film): 1800, 1760 og 1690 cm NMR-spektrum (CDC13): 1,56 (bred S, 1), 3,07 (dd, 1, J1 = 17,5 Hz, J2 = 0,7 Hz), 3,56 (dd, 1, = 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,69 (d, 1, J = 12 Hz), 4,92 (d, 1, J = 12 Hz), 5,02 (dt, 141254 70 1, Jx = 7,5 Hz, J2 = 1,3 Hz), 5,19 (d, 1, J = 1,3 Hz), 5,73 δ (dd, 1, = 2,5 Hz, J2 = 0,7 Hz).
Molvægt (massespektrernetri) = 328,9621, hvilket svarer til cioHiON05C^3 (beregnet 328,9625).
A /H2oh ^ /h2oh C1C0-0R..> [—[-*%=/ 0^Νν( 0>-γ^
åoONa / I
/ CO-O-CO-O-R
^ CH-OH
n^\=/ E=CH2C13
COOR
Eksempel 38.
Fremstilling af natriumclavulanat.
840 mg benzylclavulanat (fremstillet analogt med den ifølge eksempel 26 fremstillede ester) i 30 ml ethanol og 5 ml vand hydrogeneres over 267 mg 10%'s palladium/kul og 244 mg natriumhydrogencarbonat i 25 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med vand og ethanol, og de samlede filtrater inddampes i vakuum. Produktet omkrystalliseres af en vand-ace-tone-blanding i form af 565 mikronåle. Ved omkrystallisation af vand-acetone fås nåle, som efter tørring over P2Oj- *· vakuum i 24 timer viser nedenstående analyse: C 41,01, 40,86; H 3,77, 3,64; N 5,68, 5,51.
IR-spektrum (KBr-skive): 1785, 1700 og 1620 cm ^.
NMR-spektrum (D20): 3,06, (d, 1, J = 18,5 Hz), 3,57 (dd, 1, J = 18,5 Hz, J2 - 2,5 Hz), 4,15 (d, 2, J = 8 Hz), 5,3 (HOD), 4,9 (m), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz).
Eksempel 39.
141254 71
Ekstraktion af clavulansyre under anvendelse af flydende ionbytter-harpiks.
200 ml kulturfiltrat (fremstillet på lignende måde som beskrevet i eksempel 3, men under anvendelse af et medium indeholdende 0,1 volumen/ volumenprocent KI^PO^ i stedet for 0,01% FeS0^.7H20) ekstraheres med "Amberlite1 LA2+) (Cl -form, 15 volumen/volumenprocent i methyl-isobutylketon, 66 ml) i 30 minutter ved 5°C.
Faserne adskilles ved centrifugering (1660 g i 20 minutter). Opløsningsmiddelfasen (60 ml) isoleres med en pipette og deles i fire lige store portioner. Hver portion ekstraheres ved omrøring ved 5°C i 20 minutter med en fjerdedel volumen (3,75 ml) vandigt ekstraktant som vist i den nedenfor anførte tabel. Den resulterende blanding centrifugeres (1660 g i 15 minutter). Der fås 3,6 ml vandig fase fra hver ekstrahering.
Tabel XXIV.
Prøve Rumfang (ml) Clavulansyrekoncentration Clavulansyre (..ug/ml 1) (mg) ________/ ..... .
Klaret dyrkningsvæske 200 128 25,4
Ekstraheret dyrkningsvæske 200 15 3,0 1M NaCl-ekstrakt 3,6 305 1,1 2M NaCl-ekstrakt 3,6 598 2,5 1M NaN03-ekstrakt 3,6 638 2,3 2M NaNOg-ekstrakt 3,6 758 2,73
Det resultat, der er opnået med 2M NaNO^, svarer til en genvinding på 43% fra den klarede dyrkningsvæske.
"Amberlite LA2" markedsføres af Rohm and Haas (UK) Ltd., Croydon.
U1254 72
Eksempel 40.
Ekstrahering af clavulansyre under anvendelse af flydende ionbytter-harpiks.
47 liter klaret dyrkningsvæske (fremstillet som beskrevet i eksempel 12) ekstraheres med "Amberlite LA2" (acetatform, 15 volumen/volumen--procent i methylisobutylketon, 12,5 liter) ved omrøring i 1 time ved 17°C. Efter tilsætning af 500 ml octan-l-ol adskilles faserne i en gennemstrømningscentrifuge, hvorved der fås 9,2 liter opløsningsmiddelfase, som derefter omrøres ved 5°C i 1 1/2 time med 2,3 liter 1M natriumnitratopløsning. Blandingen adskilles ved gennemstrømningscentrifugering, hvorved der fås 2,4 liter vandig fase (inklusive vand, som anvendes til fortrængning). Den vandige fases pH-værdi, som i starten er 8,0, indstilles på 7,0 ved tilsætning af koncentreret saltsyreopløsning.
Tabel XXV.
Prøve Rumfang (liter) Clavulansyrekoncentration Clavulansyre _· _(^ug/ml)_(mg)_
Klaret dyrkningsvæske 47 146 6862
Ekstraheret dyrkningsvæske 47 19 893 1M NaNO,-eks- .trakt -3 2,4 1638 3931
Ekstraktionsvirkningsgraden fra den klarede dyrkningsvæske til na-triumnitratekstrakten er 57%.
ie "
Eksempel 41.
73 141254
Fremstilling af lithiumsalt af clavulansyre.
En opløsning af 0,84 g benzylclavulanat (fremstillet analogt med den ifølge eksempel 26 fremstillede ester) i 30 ml ethanol blandes med en opløsning af lithiumhydrogencarbonat (fremstillet som nedenfor beskrevet) i 5 ml vand. Denne opløsning hydrogeneres over 0,27 g 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur (,v20oC), hvorefter der ifølge tyndtlagschromatografi (Si02-ethyl-acetat:KMn04~spray) ikke kan påvises udgangsmateriale. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 5 ml vand og 5 ml ethanol, og de samlede filtrater inddampes under reduceret tryk. Den krystallinske remanens tritureres med 25 ml acetone, og det faste stof frafiltreres, vaskes med 10 ml acetone og tørres over P205, hvorved der fås 0,41 g produkt. Produktet optages i 3 ml vand, og der tilsættes langsomt acetone, indtil krystallisation begynder.
Efter afkøling i 20 minutter til 2 - 3°C kan der ved filtrering fås et krystaludbytte, som vaskes med en lille mængde acetone og tørres i vakuum (80 mg). Filtratet fortyndes med et lige så stort rumfang acetone og afkøles igen, hvorved der fås yderligere 80 mg udbytte.
Analyse: første udbytte = 84,3% rent lithiumclavulanat andet udbytte = 85,1% rent lithiumclavulanat.
(Lithiumhydrogencarbonatopløsningen fremstilles ved at suspendere 14 g lithiumcarbonat i 480 ml vand ved 5 - 10°C og lede en konstant strøm af carbondioxidgas gennem suspensionen i 8 timer, hvorefter der er dannet en klar opløsning. Opløsningens volumen fyldes op til 500,0 ml med vand, der er mættet méd C02< Denne opløsning indeholder derefter 5,15 vægt/volumenprocent L1HC03).
Eksempel 42.
Fremstilling af lithiumsalt af clavulansyre.
En opløsning af clavulansyre i 50 ml ethanol og 80 ml vand titre-res til pH-værdi 7,5 under anvendelse af 1,0M lithiumhydroxidopløs-ning. Opløsningen inddampes under lavt tryk til et lille rumfang 74 141254 (ca. 2 ml), og remanensen tritureres med 50 ml acetone. Det resulterende faste stof frafiltreres, vaskes med acetone og derefter med diethylether og lufttørres, hvorved der fås 0,62 g næsten farveløse krystaller, som ifølge analyse er 83,2% rent lithiumsalt.
Dette materiale opløses i 5 ml vand og hældes på en cellulosekolonne (50 g cellulose) fremstillet i butanol-ethanol-vand i forholdet 4:1:5 (topfase) og elueres med dette opløsningsmiddel.
Kolonnen undersøges ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af silicagel og samme opløsningsmiddel. Fraktioner indeholdende forbindelsen sammenhældes i to portioner. Portionerne inddampes i vakuum til tørhed, tritureres med 10 ml acetone, filtreres og tørres i vakuum. Af første portion fås 0,21 g 98,0% rent lithiumsalt af clavulansyre, og af den anden portion fås 0,12 g 98,5% rent lithiumsalt af clavulansyre.
(Den opløsning, som neutraliseres, fremstilles ved hydrogenering af 1 g benzylclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) i 50 ml ethanol i 30 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk over 10%'s palladium/kul. Derefter fjernes katalysatoren ved filtrering, og filtratet fortyndes med 80 ml vand).
Eksempel 43.
Fremstilling af kaliumsalt af clavulansyre.
En opløsning af 2,89 g benzylclavulanat (med god renhed) (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) i 100 ml ethanol og 17 ml vand hydrogeneres ved stuetemperatur og atmosfæretryk over 0,92 g 10%'s palladiseret kul (Engelhard 4505) i nærværelse af 1,0 g fint formalet kaliumhydrogencarbonat. Efter 30 minutters forløb viser tyndtlagschromatografi kun spor af tilbageværende benzylester.
Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml vand og 10 ml ethanol. De samlede filtrater og vaskevæsker (som er neutrale, ^ pH-værdi 7) inddampes under reduceret tryk ved stuetemperatur, hvorved der fås en lysegul sirup. Denne opløses i 17 ml vand og fortyndes med 450 ml acetone. Den uklare blanding filtreres gennem kiselgur, og filtratet fortyndes til 1,0 liter med acetone. Forbindelsen krystalliserer, og efter 30 minutter ved stuetemperatur isoleres den ved filtrering, vaskes U1254 75 med 50 ml acetone og tørres 1 vakuum, hvorved der fås 0,75 g af det ønskede kaliumclavulanat i form af et farveløst krystallinsk fast stof, som er 98,5% rent kaliumclavulanat-anhydrat (indeholdende ca. 0,2 - 0,3% vand).
Eksempel 44.
Trimethylammoniumclavulanat.
En trimethylammoniumhydrogencarbonatopløsning fremstilles ved at opløse 5 g trimethylamin i 50 ml iskoldt vand og lede COj gennem opløsningen i en hurtig strøm, indtil pH-værdien i opløsningen er ca. 8,5. Denne opløsning analyseres ved titrering med 1,0M saltsyre under anvendelse af screened methylorange som indikator og viser sig at være 0,4M.
Til en opløsning af 2,89 g benzylclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) i 100 ml ethanol sættes 0,9 g 10%'s pal-ladiseret kul og 25 ml 0,4M trimethylammoniumhydrogencarbonat.
Blandingen hydrogeneres i 30 minutter ved stuétemperatur og atmosfæretryk; tyndtlagschromatografi viser, at der ikke er udgangsmateriale tilbage. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 30 ml ethanol og 10 ml vand. Filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås en brun olie. Olien tritureres med 50 ml acetone, hvorefter den krystalliserer. Krystallerne isoleres ved filtrering, vaskes med 10 ml acetone og 10 ml ether og tørres i vakuum, hvorved der fås 0,84 g lysebrunt trimethylammoniumclavulanat. Analyse (ved højtryksvæskechromatografi) viser 68,7% som fri syre; 89,1% som trimethylammoniumclavulanat.
IR-Spektrum (KBr): v = 3320 (bred, med skarp spids), 1775, 1690 og 1590 - 1620 cm-1 (bred).
Intet deoxy synligt i NMR-Spektret.
Eksempel 45.
Fremstilling af aluminiumclavulanat.
141254 76
En opløsning af 2,89 g benzylclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) og 0,68 g aluminiumisopropoxid i 150 ml tørt, gende-stilleret tetrahydrofuran hydrogeneres over 0,86 g 10%'s palladise-ret kul i 40 minutter (tyndtlagschromatografi viser intet ureageret benzylclavulanat efter dette tidsrum). Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 20 ml tetrahydrofuran, og filtratet inddampes til tørhed i vakuum. Den faste remanens tritureres med 100 ml acetone, og det resulterende faste stof frafiltreres og tørres i exsiccator over phosphorpentoxid. Aluminiumsaltet fås på denne måde i form af 0,3 g hvidt fast stof. Analyse ved højtryksvæskechromatografi viser 48% clavulanat; aluminiumindholdet ifølge EDTA-titrering er 5,76%; Karl Fischer-bestemmelse viser 5,4% H20.
IR-Spektrum (KBr): v = 1790, 1695 og 1615 cm
IuclX
Eksempel 46.
Fremstilling af magnesiumclavulanat.
En opløsning indeholdende natriumclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 28) (bedømt som ca. 4,4 g) i 15 ml vand hældes på en ionbyttersøjle, Zerolit FF(1P), SRA62, og søjlen vaskes med ét rumfang vand. Søjlen elueres med 0,2M magnesiumchloridopløsning, og de opsamlede fraktioner undersøges ved papirchromatografi (påvisning med Ehrlich's reagens), og de mest intense fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum til et lille rumfang.
Dette rå præparat af magnesiumsaltet afsaltes ved percolering gennem en søjle af "Biogel" P2 (papirchromatografi-Ehrlich's spray).
Det afsaltede materiale inddampes derefter, blandes med ethanol og chromatograferes på en cellulosesøjle under anvendelse af butanol/ethanol/vand i forholdet 4:1:5 v/v topfase som eluant.
Fraktioner indeholdende størstedelen af materialet sammenhældes og inddampes til tørhed i vakuum. Ved triturering med acetone efterfulgt af filtrering fås det ønskede salt i form af 0,58 g hvidt fast stof. Højtryksvæskechromatografi-undersøgelse viser 91% rent magnesiumclavulanat. Atomabsorption viser 5,13% Mg 141254 77
Karl Fischer-analyse viser 6,8% vand.
IR-Spektrum (KBr): vmax = 1780, 1693 og 1610 cm \
Eksempel 47.
Magnesiumclavulanat.
En opløsning af 4,34 g benzylclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) og 1,61 g magnesiumacetat-tetrahydrat i 100 ml ethanol hydrogeneres over 1,45 g 10%'s palladiseret kul, indtil der ikke yderligere optages hydrogen (ca. 20 minutter). På dette tidspunkt viser tyndtlagschromatografi intet ikke-omsat benzylclavulanat. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 30 ml ethanol og 10 ml vand. Filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås 5,2 g lysegul gummi indeholdende noget opløsningsmiddel. Denne tritureres med 50 ml acetone, og det resulterende faste stof frafiltreres, vaskes med 5 ml acetone og lufttørres, hvorved der fås 2,4 g farveløst fast stof. Højtryksvæskechromatografi-undersøgelse viser 75% rent magnesiumsalt.
Eksempel 48.
Fremstilling af ammoniumclavulanat.
4,34 g benzylclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) i 50 ml ethanol behandles med 1,155 g ammoniumacetat (1 ækvivalent) i 50 ml ethanol og hydrogeneres over 1,4 g 10%'s palladium/kul i 10 minutter. Katalysatoren frafiltreres, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum, hvorved der fås et halvfast stof. Remanensen opløses i 5 ml vand og behandles med 75 ml acetone. Den overstående væske dekanteres fra den oprindeligt dannede olie og stilles til side, hvorved der fås 0,348 g nåle. Højtryksvæskechromatografi-undersøgelse viser, at ammoniumclavulanatindholdet er 97,4%. Karl Fischer-analyse viser 0,44% vand.
IR-Spektrum (KBr): v = 1785, 1700 og 1595 cm max
Eksempel 49.
78 141254
Fremstilling af krystallinsk natrium-, kalium- og lithiumclavulanat.
i) En opløsning af kaliumclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 43) i butanol-ethanol-vand (4:1:5, topfase) indeholdende ca. 50 mg i 5 ml inddampes til tørhed i vakuum på rotationsfordamper ved stuetemperatur (ca. 20°C). Det vundne farveløse faste stof er synligt krystallinsk for det blotte øje og under mikroskopisk undersøgelse.
ii) En opløsning af lithiumclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 41 og 42) i butanol-ethanol-vand (4:1:5, topfase) indeholdende ca. 50 mg i 5 ml inddampes til tørhed i vakuum på rotationsfordamper ved stuetemperatur (ca. 20°C). Det vundne farveløse faste stof undersøges mikroskopisk og viser sig at være en masse af korte nålekrystaller.
iii) En opløsning af natriumclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 38) i butanol-ethanol-vand (4:1:5, topfase) indeholdende ca. 35 mg i 5 ml inddampes til tørhed i vakuum på rotationsfordamper ved stuetemperatur (ca. 20°C). Det vundne faste farveløse stof undersøges mikroskopisk og viser sig at bestå af masser af lange, fine nålekrystaller.
Eksempel 50.
Fremstilling af krystallinsk kaliumclavulanat.
En opløsning af 2,89 g benzylclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 27) i 100 ml ethanol indeholdende 1,0 g kaliumhydrogen-carbonat hydrogeneres over 0,93 g 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk. På dette tidspunkt viser tyndt-lagschromatografi intet ikke-reduceret benzylclavulanat. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml ethanol og derefter med 150 ml vand. Filtratet inddampes til et halvfast stof under reduceret tryk på rotationsfordamper. Til denne remanens sættes 800 ml acetone. Efter omrøring fås krystaller. Det krystallinske produkt fra-filtreres, vaskes med 20 ml ether og tørres i vakuum, hvorved der fås 1,75 g krystallinsk kaliumclavulanat.
141254 79
Analyse (ved højtryksvæskechromatograf1): 89,1 vægt/vægtprocent i form af kaliumclavulanat.
NMR- og IR-Spektrer: I det væsentlige de samme som for tidligere fremstillet rent krystallinsk kaliumclavulanat). (NMR-Spektret viser forekomst af <3% deoxy, <0,5% acetone).
Eksempel 51.
Fremstilling af benzylester af clavulansyre.
En opløsning af 0,55 g rent lithiumclavulanat (fremstillet som beskrevet i eksempel 42) i 3 ml varmt vand sættes dråbevis i løbet af 5 minutter til en omrørt opløsning af 1,8 ml benzylbromid i 8 ml di-methylformamid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur (20°C) i 2 timer. Tyndtlagschromatografi (ethylacetat-SiC^) viser derefter, at en stor andel af clavulanatsaltet er blevet esterificeret. Reaktionsblandingen hældes på toppen af en søjle af 200 g silicagel fremstillet i cyclohexan-ethylacetat i forholdet 10:1 og elueres med cyclohexan og ethylacetat, gradueret fra et forhold på 10:1 til 1:1, derefter med rent ethylacetat. Fraktioner indeholdende ben-zylclavulanat sammenhældes og inddampes under reduceret tryk, hvorved der fås en olie, fra hvilken de resterende opløsningsmidler af-dampes under højt vakuum, hvorved der fås 0,37 g (47% af det teoretiske) rent benzylclavulanat.
Eksempel 52.
Kaliumsaltet af clavulansyre.
Et urent frysetørret fast præparat (10 g af ca. 30%'s renhed, fremstillet på lignende måde som beskrevet 1 eksempel 17, men under anvendelse af ækvivalente mængder kaliumsalt) af kaliumsaltet af clavulansyre opløses i 15 ml vand og hældes på en ionbytterkolonne (7 cm x 35 cm) af "Zerolit" FF (IP) SRA 62 på chlorid-form, og kolonnen vaskes med et rumfang vand. Kolonnen elueres derefter med 0,2M kaliumchlorIdopløsning. De opsamlede fraktioner (30 ml) bedømmes ved papirchromatografi (påvisning med Ehrlich’s reagens) og 80 1412.64 tyndtlagschromatografi (påvisning med kaliumpermanganat-spray).
Den β- lactamase-inhiberende aktivitet i de positive fraktioner måles under anvendelse af en 1/1000 fortynding af fraktionerne.
De aktive fraktioner sammenhældes og inddampes til et ringe rumfang (ca. 10 - 15 ml) under vakuum.
Det resulterende præparat af kaliumsaltet afsaltes ved perkolering ned over en kolonne (7,5 cm x 48 cm) af "Biogel" ® P2 og eluering med II n-butanol i vand. De opsamlede fraktioner bedømmes som ovenfor beskrevet, og de kraftige fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum til ca. 10 ml. Der tilsættes ca. 10 ml ethanol, og opløsningen chromatograferes på en cellulosekolonne (7 cm x 30 cm) under anvendelse af butanol/ethanol/vand, 4:1:5, topfase, som eluant. Fraktioner indeholdende størstedelen af materialet (kraftige fraktioner identificeret som ovenfor anført) sammenhældes og inddampes under vakuum. På dette trin fremkommer noget gul olie og noget krystallinsk materiale. Den gule olie fraskilles ved dekantering, og ca. 20 ml n-hutanol sættes til den resterende næsten farveløse overstående væske. Opløsningen inddampes til ca. 50 ml under vakuum. Det krystallinske faste stof i kolben skrabes ned i hele opløsningen, som derefter lades henstå natten over i køleskab. Det resulterende krystallinske kaliumsalt af clavulan-syren frafiltreres, vaskes med ether og tørres, hvorved der fås 1,1 g af det ønskede materiale.
IR-Spektrum (nujol mull): 3320, 1790, 1700 og 1595 cm IR-Spektrum (KBr): 3315, 3005, 2955, 2905, 2868, 1790, 1700, 1595, 1486(w), 1408(w), 1383, 1353(w), 1302, 1264, 1258, 1204(w), 1190, 1150, 1125, 1085, 1063, 1040, 1020(w), 1006, 988(w), 942, 906(w), 898, 840, 808, 788, 768, 710, 695(w), 660, 602, 576, 542, 505, 490, 420, 368 og 299 cm"1.
NMR-Spektrum (D20, acetonitril ή 2,0 som intern standard): 3,03 (IH, d, J, 17,5Hz, ββ-CIl) , 3,5 (IH, dd, J 3 og 17,5Hz, 6a-CH) , 4,1 (2H, d, J 8Hz, CH2OH), 4,88 (IH, s, 3-CfI), 4,85 (IH, dt, J 1,5 og 8Hz, CHCH2OH, delvist forstyrret af signal ve.d 4,88), 5,66 (IH, d, J 3Hz, 5 -CH) .
Højtryksvæskechromatografiforsøg: Angivne værdier på 75,4 og 76,3 vægt/vægtprocents renhed udtrykt som ren fri clavulansyreækvivalent,
DK167275AA 1974-04-20 1975-04-18 Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf. DK141254B (da)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK287278A DK150488C (da) 1974-04-20 1978-06-26 Fremgangsmaade til isolering af et clavulansyresalt
DK287078A DK145543C (da) 1974-04-20 1978-06-26 Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbare estere af clavulansyre
DK287178A DK287178A (da) 1974-04-20 1978-06-26 Fremgangsmaade til fremstilling at et antibiotikum
DK287378A DK150489C (da) 1974-04-20 1978-06-26 Fremgangsmaade til fremstilling af et clavulansyresalt
DK286980A DK157302C (da) 1974-04-20 1980-07-02 Estere af clavulansyre til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af clavulansyre eller farmaceutisk tolerable salte deraf

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1741074 1974-04-20
GB17410/74A GB1508977A (en) 1974-04-20 1974-04-20 Beta-lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus
GB2771574 1974-06-21
GB2771574 1974-06-21
GB4365174 1974-10-09
GB4365174 1974-10-09
GB5352574 1974-12-11
GB5352574 1974-12-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK167275A DK167275A (da) 1975-10-21
DK141254B true DK141254B (da) 1980-02-11
DK141254C DK141254C (da) 1980-08-11

Family

ID=27448389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK167275AA DK141254B (da) 1974-04-20 1975-04-18 Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf.

Country Status (26)

Country Link
US (5) US4427690A (da)
JP (7) JPS5246957B2 (da)
AR (3) AR206627A1 (da)
CA (1) CA1059050A (da)
CH (2) CH629252A5 (da)
CY (1) CY1078A (da)
DD (2) DD132297A5 (da)
DE (4) DE2560074C2 (da)
DK (1) DK141254B (da)
FI (1) FI54144C (da)
FR (1) FR2267778B1 (da)
HK (1) HK54780A (da)
IE (1) IE41109B1 (da)
IL (1) IL47087A (da)
IN (1) IN140042B (da)
KE (1) KE3076A (da)
LU (1) LU72322A1 (da)
MY (1) MY8100195A (da)
NL (1) NL163824C (da)
NO (3) NO145247C (da)
NZ (1) NZ177159A (da)
OA (1) OA05203A (da)
PH (1) PH16474A (da)
RO (2) RO77320A (da)
SE (8) SE422063B (da)
YU (3) YU39941B (da)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK152296B (da) * 1977-03-16 1988-02-15 Beecham Group Ltd Fremgangsmaade til fremstilling af en pille, der kan anvendes ved testning af mikroorganismer
DK156069B (da) * 1979-08-24 1989-06-19 Beecham Group Ltd Anvendelse af tert.butylaminsaltet af clavulansyre som mellemprodukt ved fremstillingen af clavulansyre og farmaceutisk tolerable salte og estere deraf

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE41109B1 (en) 1974-04-20 1979-10-24 Beecham Group Ltd Novel -lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus
YU40452B (en) * 1975-02-07 1986-02-28 Beecham Group Plc Process for the elimination of contaminating impurities from clavulinic acid
JPS596796Y2 (ja) * 1975-04-04 1984-03-01 株式会社東芝 脱水兼用洗濯機
US6051703C1 (en) * 1975-04-17 2001-10-06 Smithkline Beecham Plc Purified clavulanic acid and salts thereof
US6218380B1 (en) * 1975-04-17 2001-04-17 Smithkline Beecham P.L.C. Pharmaceutical compositions
GB1563103A (en) * 1975-10-13 1980-03-19 Beecham Group Ltd Process for the preparation of clavulanic acid
US4230622A (en) * 1975-12-17 1980-10-28 Glaxo Laboratories Limited Halogen derivatives of clavulaic acid
GB1515241A (en) * 1976-01-27 1978-06-21 Beecham Group Ltd Beta-lactam antibiotics
NL7706242A (nl) * 1976-06-08 1977-12-12 Glaxo Lab Ltd Werkwijze voor de bereiding van clavamderivaten.
GB1562802A (en) * 1976-06-26 1980-03-19 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions containing containing clavulanic acid
GB1562902A (en) * 1976-06-30 1980-03-19 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions containing clavulanic acid
GB1578739A (en) * 1976-07-23 1980-11-05 Beecham Group Ltd Amine salts of clavulanic acid methods for their preparation and compositions containing them
GB1582884A (en) * 1977-05-19 1981-01-14 Beecham Group Ltd Clavulanic acid derivatives their preparation and use
DE2912511C2 (de) * 1977-06-07 1982-06-24 Pfizer Inc., 10017 New York, N.Y. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Penicillansäure
JO984B1 (en) * 1977-10-11 1979-12-01 بيتشام غروب ليمتد A dry pharmaceutical compound with a suitable dosage unit for oral administration
JPS54126735A (en) * 1978-03-24 1979-10-02 Toyama Chem Co Ltd Bactericidal composition for medical use
DE2964817D1 (en) * 1978-09-06 1983-03-24 Beecham Group Plc Pharmaceutical compositions containing two beta-lactam derivatives
JPS5545906U (da) * 1978-09-21 1980-03-26
US4202819A (en) * 1979-05-04 1980-05-13 Hoffman-La Roche Inc. 2-(3-Alanyl)clavam antibiotic
DK330880A (da) * 1979-08-03 1981-02-04 Beecham Group Ltd Fremgangsmaade til fremstilling af clavulansyrederivater
NZ199061A (en) * 1980-12-09 1984-10-19 Beecham Group Ltd 9-(n-tetrazolyl)-deoxyclavulanic acids,salts,esters,and pharmaceutical compositions
NZ199200A (en) * 1980-12-23 1984-07-31 Beecham Group Ltd Clavulanic acid derivatives and pharmaceutical compositions
JPS58361A (ja) * 1981-06-22 1983-01-05 Kurosaki Refract Co Ltd 溶融金属鋳造用ノズル
US4533542A (en) * 1983-08-22 1985-08-06 Eli Lilly And Company Pharmaceutical compositions for storage in plastic containers and process therefor
US4684643A (en) * 1983-08-22 1987-08-04 Eli Lilly And Company Pharmaceutical compositions for storage in plastic containers and process therefor
IT1207982B (it) * 1983-10-07 1989-06-01 Lisapharma Spa Composizioni farmaceutiche adattivita' antibiotica.
JPS60151610U (ja) * 1984-03-22 1985-10-08 住友重機械工業株式会社 回転ホイ−ル式連続金属押出装置におけるアバツトメント
JPS6155889A (ja) * 1984-08-28 1986-03-20 松下電器産業株式会社 高周波加熱装置
US4757066A (en) * 1984-10-15 1988-07-12 Sankyo Company Limited Composition containing a penem or carbapenem antibiotic and the use of the same
DE3725375A1 (de) * 1987-07-31 1989-02-09 Bayer Ag Stabile oxapenem-3-carbonsaeuren
GB9009446D0 (en) * 1990-04-26 1990-06-20 Beecham Group Plc Veterinary composition
DE4027928A1 (de) * 1990-09-04 1992-03-05 Bayer Ag Neue 2-tert.substituierte methyl-oxapenem-3-carbonsaeuren und -ester, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE4030706A1 (de) * 1990-09-28 1992-04-02 Bayer Ag Neue 3-substituierte cephalosporine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
GB9201639D0 (en) * 1992-01-25 1992-03-11 Smithkline Beecham Plc Pharmaceutical formulations
AT400033B (de) * 1992-03-10 1995-09-25 Biochemie Gmbh Neues verfahren zur isolierung und reinigung von clavulansäure und zur herstellung von pharmakologisch verträglichen salzen derselben
AT399155B (de) * 1992-03-26 1995-03-27 Lek Tovarna Farmacevtskih Neue alkylendiammonium-diclavulanat-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung
DE69425131T2 (de) * 1993-01-22 2001-03-15 Smithkline Beecham Plc Verwendung von clavulansäure und einem antibiotikum zur behandlung von infektionen
US5760218A (en) * 1993-03-26 1998-06-02 Gist-Brocades N.V. Diamine salts of clavulanic acid
RO112113B1 (ro) * 1993-03-26 1997-05-30 Gist Brocades Nv Saruri diaminice ale acidului clavulanic si procedeu pentru prepararea acestora
US5821364A (en) * 1993-03-26 1998-10-13 Gist-Brocades N.V. Diamine salts of clavulanic acid
US5741903A (en) * 1993-03-26 1998-04-21 Gist-Brocades N.V. Diamine salts for purification of clavulanic acid
GB9315393D0 (en) * 1993-07-24 1993-09-08 Smithkline Beecham Plc Novel product
US20030219867A1 (en) * 1993-07-24 2003-11-27 Smithkline Beecham Plc Clavulanic acid dehydrogenase, preparation and use for the production of clavulanic acid
SI9400107A (en) * 1994-03-02 1995-10-31 Lek Tovarna Farmacevtskih New process of the isolation of clavulanic acid and its pharmaceutical salts from fermented broth of streptomyces sp.p 6621 ferm p 2804.
US20030109503A1 (en) * 1995-06-06 2003-06-12 Smithkline Beecham P.L.C. Pharmaceutical formulations comprising clavulanic acid alone or in combination with other beta-lactam antibiotics
GB9515809D0 (en) * 1995-08-02 1995-10-04 Smithkline Beecham Plc Process
SI9500265A1 (en) * 1995-08-28 1997-02-28 Lek Tovarna Farmacevtskih Process for purification of the aqueous fermented broth filtrate of streptomyces sp. p 6621 ferm p 2804 by ultrafiltration
AR004510A1 (es) * 1995-09-07 1998-12-16 Smithkline Beecham Plc Composiciones que comprenden amoxicilina y clavulanato, procedimientos para su preparacion y el uso de las composiciones para la fabricacion de unmedicamento
AT403375B (de) * 1995-11-15 1998-01-26 Biochemie Gmbh Verfahren zur fällung von alkalisalzen der clavulansäure
US20030124187A1 (en) * 1997-02-14 2003-07-03 Smithkline Beecham Laboratoires Pharmaceutiques, Pharmaceutical formulations comprising amoxycillin and clavulanate
PT970236E (pt) * 1997-02-20 2006-08-31 Dsm Ip Assets Bv Producao fermentativa de compostos valiosos a escala industrial utilizando meios quimicamente definidos
AR015825A1 (es) * 1997-05-28 2001-05-30 Gist Brocades Bv Produccion fermentativa de acido clavulanico bajo condiciones controladas de fosfato
CA2336363A1 (en) * 1998-07-03 2000-01-13 Dsm N.V. Fermentation process to produce clavulanic acid at a low concentration of free amino acids
US6294199B1 (en) * 1999-04-13 2001-09-25 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Method of treating a bacterial infection comprising administering amoxycillin
US6878386B1 (en) 1999-04-13 2005-04-12 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Method of treating a bacterial infection comprising amoxycillin and potassium clavulanate
US7250176B1 (en) * 1999-04-13 2007-07-31 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Method of treating a bacterial infection
US6544555B2 (en) 2000-02-24 2003-04-08 Advancis Pharmaceutical Corp. Antibiotic product, use and formulation thereof
US6565882B2 (en) 2000-02-24 2003-05-20 Advancis Pharmaceutical Corp Antibiotic composition with inhibitor
WO2002030392A2 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Formulation containing amoxicillin
US6756057B2 (en) 2000-10-12 2004-06-29 Beecham Pharmaceuticals (Pte) Limited Amoxicillin and potassium clavulanate dosage form
US20020068078A1 (en) 2000-10-13 2002-06-06 Rudnic Edward M. Antifungal product, use and formulation thereof
US6541014B2 (en) 2000-10-13 2003-04-01 Advancis Pharmaceutical Corp. Antiviral product, use and formulation thereof
IL150907A (en) * 2002-07-25 2007-07-04 Stephan Cherkez Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate
WO2005009364A2 (en) 2003-07-21 2005-02-03 Advancis Pharmaceutical Corporation Antibiotic product, use and formulation thereof
WO2005009368A2 (en) 2003-07-21 2005-02-03 Advancis Pharmaceutical Corporation Antibiotic product, use and formulation thereof
WO2005009365A2 (en) 2003-07-21 2005-02-03 Advancis Pharmaceutical Corporation Antibiotic product, use and formulation thereof
WO2005016311A1 (en) 2003-08-11 2005-02-24 Advancis Pharmaceutical Corporation Robust pellet
AU2004264356B2 (en) 2003-08-12 2011-01-27 Shionogi, Inc. Antibiotic product, use and formulation thereof
WO2005023184A2 (en) 2003-08-29 2005-03-17 Advancis Pharmaceuticals Corporation Antibiotic product, use and formulation thereof
WO2005027877A1 (en) 2003-09-15 2005-03-31 Advancis Pharmaceutical Corporation Antibiotic product, use and formulation thereof
WO2006014427A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 Advancis Pharmaceutical Corporation Tablet for pulsed delivery
US20060194285A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-31 Wei Lian Biological production of clavulanic acid and related compounds
DE102005009277B4 (de) * 2005-02-25 2008-07-31 Johnson Controls Interiors Gmbh & Co. Kg Halterung für eine Komponente
PL1965798T3 (pl) * 2005-12-07 2012-02-29 Basilea Pharmaceutica Ag Użyteczne antybiotyki monobaktamowe
US8357394B2 (en) 2005-12-08 2013-01-22 Shionogi Inc. Compositions and methods for improved efficacy of penicillin-type antibiotics
US8778924B2 (en) 2006-12-04 2014-07-15 Shionogi Inc. Modified release amoxicillin products
US20070218038A1 (en) 2006-03-17 2007-09-20 Pegasus Biologics, Inc. Stabilized, sterilized collagen scaffolds with active adjuncts attached
US8299052B2 (en) * 2006-05-05 2012-10-30 Shionogi Inc. Pharmaceutical compositions and methods for improved bacterial eradication
WO2011152809A2 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Bilgic Mahmut Effervescent formulations comprising cephalosporin and clavulanic acid
RU2654692C2 (ru) 2012-12-07 2018-05-22 Венаторкс Фармасьютикалс, Инк. Ингибиторы бета-лактамаз
WO2014110442A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
EP2970340B1 (en) 2013-03-14 2020-02-12 Venatorx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
US9511142B2 (en) 2014-06-11 2016-12-06 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
US20150361108A1 (en) * 2014-06-11 2015-12-17 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Orally bioavailable beta-lactamase inhibitors
RU2686740C2 (ru) 2014-06-11 2019-04-30 Венаторкс Фармасьютикалс, Инк. Ингибиторы бета-лактамазы
CN108472284A (zh) 2015-09-11 2018-08-31 维纳拓尔斯制药公司 β-内酰胺酶抑制剂
WO2017100537A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Beta-lactamase inhibitors
SG11201811345TA (en) 2016-07-14 2019-01-30 Achaogen Inc Combination of ceftibuten and clavulanic acid for use in the treatment of bacterial infections
WO2018027062A1 (en) 2016-08-04 2018-02-08 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Boron-containing compounds
CN110959008A (zh) 2017-05-26 2020-04-03 维纳拓尔斯制药公司 青霉素结合蛋白抑制剂
US11267826B2 (en) 2017-05-26 2022-03-08 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Penicillin-binding protein inhibitors
WO2021080598A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Instrumentation Laboratory Company Biocide compositions compatible with enzyme biosensors and methods of use thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3801464A (en) 1972-02-09 1974-04-02 Lilly Co Eli Antibiotic a16886 and process for production thereof
IE41109B1 (en) * 1974-04-20 1979-10-24 Beecham Group Ltd Novel -lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus
US4123540A (en) * 1974-12-18 1978-10-31 Beecham Group Limited Isoclavulanic acid as an antibacterial and a β-lactamase inhibitor
US4140764A (en) * 1974-12-18 1979-02-20 Beecham Group Limited β-Lactamase inhibitors and process for their preparation
YU40452B (en) * 1975-02-07 1986-02-28 Beecham Group Plc Process for the elimination of contaminating impurities from clavulinic acid
US4144242A (en) * 1975-02-07 1979-03-13 Glaxo Laboratories Limited Process for the purification of clavulanic acid
JO984B1 (en) * 1977-10-11 1979-12-01 بيتشام غروب ليمتد A dry pharmaceutical compound with a suitable dosage unit for oral administration

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK152296B (da) * 1977-03-16 1988-02-15 Beecham Group Ltd Fremgangsmaade til fremstilling af en pille, der kan anvendes ved testning af mikroorganismer
DK156069B (da) * 1979-08-24 1989-06-19 Beecham Group Ltd Anvendelse af tert.butylaminsaltet af clavulansyre som mellemprodukt ved fremstillingen af clavulansyre og farmaceutisk tolerable salte og estere deraf

Also Published As

Publication number Publication date
DK141254C (da) 1980-08-11
NO150838B (no) 1984-09-17
US4526783A (en) 1985-07-02
JPS533588A (en) 1978-01-13
NO145247C (no) 1982-02-10
DD121799A5 (da) 1976-08-20
RO77320A (ro) 1981-08-17
US4560552A (en) 1985-12-24
JPS533589A (en) 1978-01-13
SE7811200L (sv) 1978-10-27
OA05203A (fr) 1981-02-28
AR206627A1 (es) 1976-08-06
NO751407L (da) 1975-10-21
HK54780A (en) 1980-10-03
LU72322A1 (da) 1975-08-20
PH16474A (en) 1983-10-25
AR216430A1 (es) 1979-12-28
DE2560074C2 (de) 1985-03-28
NL7504621A (nl) 1975-10-22
SE8105829L (sv) 1981-10-02
DK167275A (da) 1975-10-21
SE8306328L (sv) 1983-11-16
SE435286B (sv) 1984-09-17
IL47087A0 (en) 1975-06-25
SE7811203L (sv) 1978-10-27
CH630631A5 (de) 1982-06-30
SE8605405L (sv) 1986-12-16
IE41109B1 (en) 1979-10-24
JPS532495A (en) 1978-01-11
SE422063B (sv) 1982-02-15
DE2559411A1 (de) 1976-10-21
IL47087A (en) 1979-07-25
FR2267778A1 (da) 1975-11-14
YU90875A (en) 1982-05-31
YU42744B (en) 1988-12-31
NL163824C (nl) 1980-10-15
US4427690A (en) 1984-01-24
NL163824B (nl) 1980-05-16
IN140042B (da) 1976-09-04
JPS50142789A (da) 1975-11-17
JPS5549832B2 (da) 1980-12-15
JPS50142591A (da) 1975-11-17
AR219050A1 (es) 1980-07-31
SE446687B (sv) 1986-10-06
NO801852L (no) 1975-10-21
FI54144C (fi) 1978-10-10
KE3076A (en) 1980-10-03
JPS532494A (en) 1978-01-11
SE8605405D0 (sv) 1986-12-16
DD132297A5 (de) 1978-09-20
SE443562B (sv) 1986-03-03
RO69984A (ro) 1980-12-30
SE435287B (sv) 1984-09-17
MY8100195A (en) 1981-12-31
YU274481A (en) 1983-06-30
JPS533590A (en) 1978-01-13
DE2517316C2 (de) 1985-03-07
NO145247B (no) 1981-11-02
US4560552C1 (en) 2001-10-16
FR2267778B1 (da) 1978-11-17
CY1078A (en) 1980-12-27
IE41109L (en) 1975-10-20
US4525352A (en) 1985-06-25
YU274381A (en) 1983-06-30
SE7811202L (sv) 1978-10-27
YU39941B (en) 1985-06-30
SE7504541L (da) 1975-12-19
JPS521996B2 (da) 1977-01-19
FI751133A (da) 1975-10-21
YU42745B (en) 1988-12-31
JPS5246957B2 (da) 1977-11-29
JPS5549830B2 (da) 1980-12-15
JPS5549833B2 (da) 1980-12-15
SE453600B (sv) 1988-02-15
SE7811201L (sv) 1978-10-27
JPS5549831B2 (da) 1980-12-15
US4556559A (en) 1985-12-03
DE2559410A1 (de) 1976-09-23
NO150838C (no) 1985-01-09
NZ177159A (en) 1978-03-06
DE2517316A1 (de) 1975-10-23
DE2559411C2 (de) 1982-07-01
SE8306328D0 (sv) 1983-11-16
FI54144B (fi) 1978-06-30
CH629252A5 (de) 1982-04-15
CA1059050A (en) 1979-07-24
NO791956L (no) 1975-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK141254B (da) Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf.
US4110165A (en) Process for the production of clavulanic acid
US6218380B1 (en) Pharmaceutical compositions
US4529720A (en) Antibiotic from Streptomyces clavulicerus
US6048977A (en) Clavulanic acid and salts thereof
CS231157B2 (en) Processing method of klavulan acid and corresponding salts and esters
US4235882A (en) Antibiotic MM 4550A
DK141099B (da) Fremgangsmåde til rensning af clavulansyre eller et salt deraf med en base.
US4189473A (en) Antibiotic MM 13902
US4525353A (en) Antibiotics
US4060530A (en) Clavulanic acid amides
US4140764A (en) β-Lactamase inhibitors and process for their preparation
EP0017246B1 (en) Antibiotic pa-31088-iv, its salts with bases, a process for its manufacture, pharmaceutical compositions containing this antibiotic, streptomyces tokunonensis pa-31088 and its mutants
US4146610A (en) Antibiotics mm13902
US4123540A (en) Isoclavulanic acid as an antibacterial and a β-lactamase inhibitor
US4061649A (en) Clavulanic acid sulphates
US4172129A (en) Antibiotics
US4113856A (en) Antibiotic mm 13902
CA1074325A (en) Clavulanic acid and its salts
CA1076120A (en) Clavulanic acid esters
JPS6253157B2 (da)
JPS6210640B2 (da)
US4203973A (en) Antibiotics
DK150489B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af et clavulansyresalt
CA1055395A (en) Antibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired