DK150489B - Fremgangsmaade til fremstilling af et clavulansyresalt - Google Patents

Description

160489

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et clavulansyresalt, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at et kulturfiltrat indeholdende clavulansyre efter tilsætning af syre til en pH-værdi på ca. 2 - ca. 3 ekstraheres med et med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, faserne adskilles, og clavulansyren reekstraheres i en vandig fase, medens pH-værdien holdes på omtrentlig neutralt niveau, hvorhos den vandige fase eventuelt indeholder alkalimetalhydi;ogencarbonat-eller -phosphatpuffer eller en CaCO^-suspension, hvorefter saltet af clavulansyren isoleres derfra. Det er et foretrukket aspekt af opfindelsen, at kulturfiltratet indeholdende clavulansyre er et ved dyrkning af en stamme af Streptomyces clavuligerus vundet kulturfiltrat.

2 150489

Streptomyces clavuligerus er detaljeret beskrevet af Higgins et al., Int. J. Systematic Bacteriology, 21, 326 (1971). Denne streptomycet havde interesse, idet den producerede visse β-lactam-antibiotika såsom penicillin N, 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxy-methyl-3-cephem-4-carboxylsyre og 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)--3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre.

Denne streptomycet er deponeret i Agricultural Research Service Collection under nummer NRRL 3585 og i American Type Culture Collection under nummer ATCC 27064. Streptomyces clavuligerus er også omtalt i USA patentskrift nr. 3.770.590 og af Nagarajan et al., J. Amer. Chem. Soc., 93, 2308 (1971), Brannon et al., Antimicrob. Agents Chemother., 3^, 237 (1972) og Antimicrob. Agents Chemother· 1/ 247 (1972) og Higgins et al., J. Antibiotics, 2T_, 298 (1974).

Det har nu vist sig, at den aerobiske dyrkning af Streptomyces clavuligerus i sædvanligt næringsmedium ved ca. 25 - 30 C under stort set neutrale betingelser fremkalder et Ø-lactamase-inhiberende stof, som også har antibakteriel virkning. Dette hidtil ukendte stof kaldes -"clavulansvre".

Den forbindelse, som produceres af Streptomyces clavuligerus, og som har de ovenfor anførte egenskaber, ha-r formlen II

CHo0H

„AT

COOH

Clavulansyre kan således benævnes 3-(β-hydroxyethyliden)-7-oxo-4--oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylsyre.

Stereokemien ved carbonatomerne 5 og 2 i clavulansyren er den samme, som findes hos naturligt forekommende penicilliner og cephalosporiner, således at clavulansyre kan illustreres med strukturformlen I

3 150489

CHo0H

lYy/ J-w \

COOH

Således er et mere fyldestgørende kemisk navn for clavulansyre Z--(2R,5R)-3-(β-hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]hep-tan-2-carboxylsyre.

Clavulansyres store nytte kan let forstås, når man indser, at visse stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstedeværelse af 125 ^,ug/ral ampicillin, amoxycillin, carbe-nicillin eller benzylpenicillin eller ved tilstedeværelse af 10^ug/ ml clavulansyre, inhiberes ved tilstedeværelse af mindre end 12,5^ug/ ml af de ovenfor anførte penicilliner, når der også forekommer 5yug/ml clavulansyre. Ved forsøg på hunmus har det vist sig, at blod- og vævsniveauer af clavulansyre på betydelig mere end 5^ug/ml let kan nås ved subcutan administration af 100 mg/ kg af natriumsaltet af clavulansyre, og at værdifulde niveauer af clavulansyre kan nås efter oral administration af 100 mg/kg af natriumsaltet af clavulansyre.

Særlig velegnede salte af clavulansyre er farmaceutisk tolerable salte såsom natrium-, kalium-, calcium-, magnesium-, aluminium-, ammonium- og substituerede ammoniumsalte såsom trimethylammonium-, benzathin-, procain- og lignende salte, som sædvanligvis dannes med penicilliner eller cephalosporiner. Ikke-farmaceutisk tolerable salte af clavulansyre er også interessante, da de er værdifulde mellemprodukter ved fremstillingen af estere af clavulansyre, f.eks. kan således lithium- eller sølvsalte af clavulansyre omsættes med benzylbromid til dannelse af den værdifulde benzylester af clavulansyre.

Salte af clavulansyre synes at være mere stabile end selve syren.

Særlig velegnede salte af clavulansyre er natrium- og kaliumsaltene, som har de nedenstående formler III og IV

4 150489

/Η2°Η _^^^^yCH20H

COOiMa COOK

III Iv krystallinske former af sådanne salte kan indeholde hydratvand.

Clavulansyre og dens salte er desuden værdifulde mellemprodukter ved fremstilling af antibakterielt virksomme estere, hvilket er beskrevet i dansk patent nr. 141.254.

Egnede estere af clavulansyre er sådanne, som rent teoretisk er afledt af alkoholer såsom metharfol, ethanol, propanol, butanol, 2,2,2-trichlorethanol, 2,2,2-trifluorethanol, benzylalkohol, p-nitro-benzylalkohol, phenol, acetoxymethanol, pivaloyloxymethanol og 2-di-methylaminoethanol.

Injicerbare eller infunderbare præparater af clavulansyre eller salte deraf er særlig velegnede, da høje vævsniveauer af forbindelsen af clavulansyre kan optræde efter administration ved injektion eller infusion. Et foretrukket præparat indeholder clavulansyre eller et salt deraf i steril form.

Enhedsdosispræparater indeholdende clavulansyre eller et salt eller en ester deraf og bearbejdet til oral administration er en særlig foretrukket form.

Clavulansyren eller salte eller estere deraf kan forekomme i præparatet som eneste terapeutiske middel eller kan forekomme sammen med andre terapeutiske midler såsom et β-lactam-antibiotikum. Egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i sådanne synergistiske præparater omfatter ikke kun sådanne, som vides at være stærkt modtagelige for β-lactamaser, men også sådanne, som vides at have god grad af modstandsdygtighed i sig selv over for β-lactamaser. Sådanne egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i disse præparater omfatter benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin, carbenicillin, methi- 5 150489 cillin, propicillin, ampicillin, amoxycillin, epicillin, ticarcillin, cyclacillin, 6-aminopenicillansyre, 7-aminocephalosporansyre, 7-amino-desacetoxycephalosporansyre, cephaloridin, cephalothin, cefazolin, cephalexin, cefoxitin, cephacetril, cephamandol, cephapirin, cephradin, cephaloglycin og andre velkendte penicilliner og cephalosporiner eller "pro-drugs" dertil, f.eks. hetacillin, metampicillin, acetoxymethyl-, pivaloyloxymethvl- eller phthalidylesterne af benzylpenicillin, ampicillin, amoxycillin eller cephaloglycin eller phenyl-, tolyl- eller indanyl-a-estere af carbenicillin eller ticarcillin.

Når clavulansyren eller et salt eller en ester deraf forekommer i et farmaceutisk præparat sammen med et β-lactam-antibiotikum, kan forholdet mellem clavulansyren eller et salt eller en ester deraf og β-lactam-antibiotiket være f.eks. 20:1 - 1:12, især 10:1 - 1:10 og navnlig 3:1 - 1:3.

Pen totale mængde antibakterielle midler i en hvilken som helst enhedsdosisform vil normalt være mellem 50 og 1500 mg og vil sædvanligvis være mellem 100 og 1000 mg.

De omhandlede præparater kan anvendes til behandling af infektioner i bl.a. luftvejene, urinvejene og bløde væv hos mennesker.

Et kulturfiltrat indeholdende clavulansyre er fortrinsvis et sådant, som er vundet ved dyrkning af Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 eller en højtydende mutant deraf.

I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "dyrkning" den bevidste aerobe vækst af en clavulansyre-producerende organisme i nærværelse af assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte. En sådan aerob vækst kan finde sted i et fast eller halvfast næringsmedium eller i et flydende medium, hvor næringsstofferne er opløst eller suspenderet. Dyrkningen kan finde sted på en aerob overflade eller ved submers kultur. Næringsmediet kan være sammensat af com-plexe næringsstoffer eller kan være kemisk defineret. Vi har fundet medier indeholdende complexe næringsstoffer såsom gærekstrakt eller sojabønnemel særlig velegnede.

6 150489 Næringsmediet., som kan anvendes til dyrkning af Streptomyces clavu-ligerus, kan indeholde 0,1 - 10% complex organisk nitrogenkilde såsom gærekstrakt, majsstøbevand, vegetabilsk protein, frøprotein, hydrolysater af sådanne proteiner, mælkepro-teinhydrolysater, fiske- og kødekstrakter og hydrolysater såsom peptoner. Alternativt kan der anvendes kemisk veldefinerede nitrogenkilder såsom urinstof, amider, enkelte eller blandinger af almindelige aminosyrer’ såsom valin, asparagin, glutamsyre, prolin og phenyl-alanin. Carbonhydrater (0,1 - 51) kan forekomme i næringsmediet, men glucose er i visse medier uønsket, da den har en negativ effekt på udbyttet af den ønskede clavulansyre. Stivelse eller stivelse-hydrolysater såsom dextrin, saccharose, lactose eller andre sukkerarter eller glycerol eller glycerolestere kan også anvendes. Carbonkilden kan også være afledt af vegetabilske olier eller animalske fedtstoffer. Carboxylsyrer og salte deraf kan anvendes som carbonkilde til vækst og produktion af β-lactamase-inhibitorer. Et særlig velegnet, billigt medium er et medium indeholdende søjabønne-mel ("Arkasoy") plus tørret maltdestillationsvæske ("Scotasol") plus dextrin.

Det kan være nødvendigt at tilsætte antiskummidler såsom "Pluronic L81" for at regulere skunidannelse i visse medier i fermenteringsbeholdere.

Mineralsalte såsom NaCl, KC1, MgCl2/ ZnCl2, FeClg, Na2S04, FeSC>4,

MgS04 og Na+- eller K+-salte af· phosphorsyre kan sættes til det ovenfor beskrevne medium, især hvis dette er kemisk defineret; CaC0? kan tilsættes som en kilde til Ca -ioner eller på grund af sin puffervirkning. Salte af sporgrundstoffer såsom nikkel, cobalt eller mangan kan også tilsættes. Om ønsket kan der tilsættes vitaminer.

Dyrkning af Streptomyces clavuligerus finder normalt sted i et tem-pe'raturområde på 15 - 40°C, sædvanligvis 20 - 35°C og fortrinsvis 25 - 30°C, og ved en pH-værdi mellem 5 og 8,5, fortrinsvis mellem 6 og 7,5.

Streptomyces clavuligerus kan dyrkes i de ovenfor anførte medier i koniske glaskolber, som luftes ved rystning på et roterende rysteapparat, eller i med prelplader forsynede rustfri stålfermenteringsbehol 7 150489 dere, som omrøres med en vingeskiverotor og luftes med et luftind-blæsningshoved. Fermenteringen kan også udføres på kontinuerlig måde.

Udgangs-pH-værdien ved fermentationen ligger typisk ved 7,0, og et maksimumudbytte af clavulansyre fås i løbet af 2 - 10 dage ved 20 - 35°C. I en omrørt rustfri stålfermenteringsbeholder under anvendelse af "Arkasoy"/"Scotasol"/"Dextrin"-mediet, som ovenfor anført, er den foretrukne temperatur 26°C, og spidsudbytter af clavulansyre fås i løbet af 5 dage.

Clavulansyre kan ekstraheres fra kulturfiltratet på forskellig måde.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvor der fremstilles et clavu-lansyresalt, gås der frem ved opløsningsmiddelekstraktion fra fortrinsvist koldt kulturfiltrat, som er indstillet på sure pH-værdier. Cellerne af Streptomyces clavuligerus fjernes normalt først fra fermenteringsbeholderen ved filtrering eller centrifugering, før sådanne ekstraktionsfremgangsmåder påbegyndes.

Ved opløsningsmiddelekstraktionsprocessen afkøles kulturfiltratet, normalt først, og pH-værdien sænkes til ca. 2 - ca. 3 ved tilsætning af syre, medens der blandes grundigt med et vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel, f.eks. n-butylacetat, methylisobutylketon, n-bu-tanol eller ethylacetat. Den syre, som anvendes til at sænke pH-vær-dien i mediet, er normalt en mineralsyre såsom saltsyre, svovlsyre, salpetersyre eller phosphorsyre. n-Butanol er et særlig velegnet opløsningsmiddel til anvendelse til ekstrahering af det syrnede kulturfiltrat. Efter adskillelse af faserne, f.eks. ved centrifuge^ ring, reekstraheres clavulansyren fra opløsningsmiddelfasen i vandig fase, fortrinsvis en natriumhydrogencarbonat- eller kaliumhydrogen-phosphatpuffer, CaCOg-suspension eller vand, medens pH-værdien holdes på næsten neutralt niveau, f.eks. på 7,0.

Vand kan anvendes, hvis saltet er opløseligt i det organiske op-· løsningsmiddel, hvilket f.eks. er tilfældet ved aminsaite. Den vandige ekstrakt kan efter fraskillelse af faserne inddampes under reduceret tryk og frysetørres, hvorved der fås et råprodukt af et salt af clavulansyre. Dette produkt er stabilt, når det oplagres som et tørt fast stof ved -20°C.

150489 8

Yderligere rensning af de rå faste stoffer, som er fremstillet på den ovenfor beskrevne måde, kan udføres på mange forskellige måder, men ionbytningssøjlechromatografi er særlig velegnet, især når der anvendes "Isopor", "DeAcidite FFIP SRA64" eller DEAE-cellu-lose. "DeAcidite"-sØjlen kan gradientelueres med en vandig opløsning af et salt sååom natriumchlorid (0 - 0,5M). Søjlen af DEAE--cellulose i 0,01N phosphatpuffer med pH-værdi 7 kan elueres med en saltopløsning, normalt en NaCl-opløsning (0 - 0,2M NaCl i 0,01M phosphatpuffer, pH-værdi 7). Aktive fraktioner kan påvises ved deres β-lactamase-inhiberende virkning og deres antibakterielle virkning mod Klebsiella aerogenes ved et agar-diffusionsforsøg.

De metoder, som har vist sig mest anvendelige til påvisning af cla-vulansyre i kulturfiltrater, er papirchromatografi og et bioauto-grafisk påvisningssystem. Clavulansyre kan påvises ved at gøre brug af dens β-lactamase-inhiberende virkning. Tyndtlagschromatogra-fi kan anvendes til at påvise clavulansyre i faste præparater.

Den foretrukne metode til fremstilling af en ønsket ester af clavulansyre er omsætning af et salt af clavulansyre med et esterificeringsmiddel.

Egnede metoder til esterdannelse omfatter omsætning af et salt af clavulansyre med en forbindelse med den almene formel Q - R, hvor Q betegner en let udskiftelig gruppe, og R betegner en organisk gruppe.

Egnede salte af clavulansyre, som kan omsættes med forbindelser R - Q, er f.eks. alkalimetalsalte såsom natrium- eller kaliumsalte eller andre sædvanlige salte, f.eks. sølvsaltet.

Egnede grupper Q omfatter sådanne atomer eller grupper, som vides at være udskiftelige med carboxylatanioner, og omfatter chlor-, brom- og iodatomer, sulfonsyreestere såsom 0S02CH3- eller cSc^Cgl^CHg--grupper, aktive estergrupper såsom OCOH- eller OCOCF^-grupper og andre sædvanlige grupper, som kan udskiftes med nucleofile grupper.

9 150489

Den ovenfor anførte reaktion udføres normalt i et organisk opløsningsmiddel med relativt høj dielektricitetskonstant såsom dimethylfor-mamid, acetone, dioxan eller tetrahydrofuran og ved ikke-ekstreme temperaturer, f.eks. mellem -5 og +100°C, sædvanligvis mellem +5 og +30°C, f.eks. ved stuetemperatur.

I nedenstående beskrivelser er der beskrevet testmetoder til påvisning af clavulansyre eller et salt deraf og dyrkning af Strep-tomyces clavuligerus.

Beskrivelse 1.

Tyndtlagschromatografisk påvisning af natriumsaltet af clavulansyre.

Opløsninger af natriumsaltet af clavulansyre-præparater sættes (5^,ul af 1 mg/ml) på qlasplader, som er dækket med et 0,25 mm lag af silicagel (F254), markedsført af E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland. Chromatogrammerne lades løbe ved 22°C under anvendelse af topfasen af blandingen n-butanol/ethanol/vand i volumenforholdet 4:1:5. Chromatogrampladerne tørres ved 40°C, og natriumsaltet af clavulansyre bestemmes ved bioautografi på agarplader indeholdende 6^ug/ml benzylpenicillin og podet med Klebsiella aerogenes (synergis-mesystem, jfr. nedenfor om papirchromatografi). Agaroverfladen dækkes af et fint filterklæde, før tyndtlagschromatogrampladen placeres på den. Efter 15 - 30 minutters tid til fugtning og diffusion løftes tyndtlagschromatogrampladen af ved hjælp af· filterklædet, og agarpladen inkuberes natten over ved 30°C for at afsløre zonerne med inhiberet vækst. R^-Værdien for natriumsaltet af clavulansyre i det ovenfor anførte opløsningsmiddel er ca. 0,37. To spraymidler, "Ehrlich" og triphenyltetrazoliumchlorid anvendes også til at vise zonen for natriumsaltet af clavulansyre. Det førstnævnte reagens består af 300 mg p-dimethylaminobenzaldehyd opløst i 9 ml ethylal-kohol, 54 ml n-butanol og 9 ml koncentreret HCl. Ved opvarmning af den sprøjtede tyndtlagschromatografiske plade til 120°C i 1 - 2 minuttej kommer natriumsaltet af clavulansyre til syne som en lyserød plet. Triphenyltetrazoliumchloridreagenset består af en blanding af 1 volumendel af en 4%'s opløsning af denne forbindelse i methanol og 1 volumendel methanolisk natriumhydroxid. Efter påsprøjtning opvarmes tyndtlagschromatografipladerne til 80°C. Natriumsaltet af clavulansyre kommer til syne som en rød plet på hvid baggrund.

150489 ίο

Papirchromatografisk påvisning af clavulansyre.

Testopløsning og en referenceopløsning af clavulansyre (250yUg/ml delvis renset præparat) sættes som prøver (20^,ug/oprindelse) på Whatman nr. 1 papirstrimler, 1 cm. brede. Chromatogrammerne laves ved nedadgående chromatografi i 16 timer ved 5°C under anvendelse af n-butanol/isopropanol/vand i v/v-forholdet 7:7:6 som opløsningsmiddel. Strimlerne tørres ved 40°C og lægges på agarplader indeholdende 6^,ug/ml benzylpenicillin og podes med en Ø-lactamase-produ-cerende stamme af Klebsiella aerogenes (synergismesystem). Pladerne inkuberes natten over ved 30°C, og clavulansyre viser sig som en zone med inhiberet vækst. Rf-Værdien for zonen er 0,46. 6yUg/ml benzylpenicillin alene er under den koncentration, som er nødvendig for at dræbe Klebsiella aerogenes, men ved tilstedeværelse af en Ø-lactamase-inhibitor bliver denne koncentration toxisk, hvilket vil sige, at der er synergisme.

Anvendelse af det ovenfor anførte synergismesystem gør det muligt at bestemme clavulansyre ved koncentrationer, som er under de koncentrationer, hvor den viser antibakteriel virkning.

Prøver, som kan anvendes til påvisning af clavulansyre. Undersøgelsesprincip.

Opløsninger indeholdende clavulansyre (kulturfiltrat, prøver fra isoleringsprocedurer og lignende) inkuberes i 15 minutter med et Ø-lactamase-præparat i 0,05M phosphatpuffer ved pH-værdi 7 og ved 37°C. I løbet af denne tid optræder enzyminhibering eller inaktivering. Substrat (benzylpenicillin) tilsættes derefter, og inkuberingen fortsættes i 30 minutter ved 37°C. Omfanget af enzymatisk nedbrydning i substratet til penicilloinsyre (penicilloic acid) bestemmes ved hydroxylaminprøven for penicillin. Den anvendte mængde 0-lactamase er sådan, at den qiver 75%'s hydrolyse af benzvl-penicillinet på 30 minutter ved 37°C.

Hydrolysegraden er en afspejling af den mængde af enzym, som forbliver uinhiberet. Resultaterne udtrykkes som procent inh'ibering af enzymaktiviteten ved en given fortynding af den clavulansyreholdige op- 11 150489 løsning (f.eks. kulturfiltrat) eller den koncentration af clavulan-syre (^ug/ml), som giver 50%'s inhibering af enzymet uilder de ovenfor anførte betingelser (I50).

β-Lactamase-enzym.

Som enzym anvendes β-lactamase, som er produceret af Escherichia coli JT4. Denne kultur er en ampicillinresistent stamme, og dens resistens skyldes produktionen af en R-faktor-bestemt β-lactamase. Andre lignende R-faktor-bestemte β-lactamaser kan anvendes, om øn sket.

Kulturen holdes på næringsagarskråkultur og podes i 400 ml sterilt trypton-medium i en 2-liters konisk kolbe. Dette medium har nedenstående sammensætning:

Trypton (oxoid) 32 g/liter gærekstrakt (oxoid) 20 g/liter

NaCl 5 g/liter

CaCl26H20 2,2 g/liter.

Den endelige pH-værdi indstilles på 7,4 ved hjælp af fortyndet natriumhydroxid. Kolben rystes ved 25°C i 20 timer på et roterende rysteapparat ved 240 omdrejninger pr. minut.

Bakteriecellerne indhøstes ved centrifugering, vaskes med 0,05M phos-phatpuffer med pH-værdi 7 (resuspenderes og centrifugeres) og re-suspenderes i vand, hvorved der fås en cellekoncentration, som er 25 gange så stor som i dyrkningsmediet. Denne cellesuspension udrives derefter i en MSE-ultrasonic desintegrator ved 4°C. Celleresterne fjernes ved centrifugering, og alikvoter af den overstående væske oplagres i dybfrost. Til anvendelse i undersøgelsesteknikken fortyndes den overstående væske i 0,005M phosphat-puffer, indtil der fås ca. 75¾ hydrolyse af en 1 mg/ml opløsning af benzylpenicillin på 30 minutter ved 37°C.

150489 12

Forsøgsteknik.

Egnede fortyndinger af inhibitorpræparater og β-lactamase-opløsning blandes og inkuberes ved 37°C i 15 minutter (test). En konstrolprøve med puffer i stedet for inhibitorpræparat inkuberes også. Benzyl-peiiicillinopløsningen (substrat) sættes derefter til test- og kontrolblandingerne, og inkuberingen fortsættes i yderligere 30 minutter ved 37°C. Den resterende benzylpenicillin i hver blanding bestemmes derefter under anvendelse af hydroxylaminforsøget som beskrevet af Batchelor et al., Proc. Roy. Soc., B 154, 498 (1961).

6 ml hydroxylaminreagens sættes til alle forsøgsprøverne, kontrolprøver og blindprøver, og de lades reagere i 10 minutter ved stuetemperatur før tilsætning af 2 ml ferriammoniumsulfatreagens. Absorptionen af den endelige opløsning måles i et EEL-colorimeter eller spektrofotometer ved 490 nanometer mod reagensblindprøven. Sammensætningen af reaktionsblandingerne, testblandinger og blindprøver før hydroxylaminforsøget er anført i nedenstående tabel:

Komponenter Test Benzylpeni- Kontrol, Reagens, (alle opløst i eller for- cillin, ml. blind, ml tyndet med 0,005M phos- blind, ml phatpuffer, pH-værdi 7)_

Escherichia coli β-lactamaseopløsning 1,9 0,0 1,9 1,9

Inhibitoropløsning 0,1 0,0 0,0 0,0

Benzylpenicillin 5 mg/ml 0,5 0,5 0,5 0,0 0,005M phosphatpuffer, pH-værdi 7 0,0 2,0 0,1 0,6.

Beregning af resultater.

Den procentvise inhibering af β-lactamase beregnes på følgende måde:

Absorption af benzylpenicillin blind minus absorption af kontrolprøven (ikke-inhiberet reaktion) = X

absorption af test (inhiberet reaktion) minus absorption af kontrolprøven (ikke inhiberet reaktion) = Y

Y

procent inhibering = — 100

X

13 150489

For at få Igg-værdien fortyndes inhibitorpræparatet, indtil der er opnået 50%'s inhibering af β-lactamase-inaktiveringen af benzyl-penicillin ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.

Beskrivelse 2.

Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.

Streptomyces clavuligerus dyrkes ved 26°C på agarskråkultur indeholdende 1% "Yeatex" (gærekstrakt), 1% glucose og 2% "oxoid" agar nr. 3, pH-værdi 6,8. Et sterilt øje anvendes til at overføre mycelium og sporer fra skråkulturen i 100 ml af et flydende medium i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe. Det flydende medium har nedenstående sammensætning : "Oxoid" maltekstrakt 10 g/liter "Oxoid" bakteriologisk pepton 10 g/liter

Glycerol 20 g/liter

Ledningsvand 1 liter.

Mediet indstilles på pH-værdi 7 ved tilsætning af natriumhydroxidopløsning, og 100 ml's rumfang fordeles i kolberne, som lukkes med 2 skumpropper før autoklavering ved 1,0545 kg/cm i 20 minutter. En podet kimkolbe rystes i 3 dage ved 26°C på et rotationsrysteapparat med en slaglængde på 5 cm. og en hastighed på 240 omdrejninger/mi-nut. Produktionstrinskolber indeholdende det flydende medium som ovenfor beskrevet podes med 5%'s vegetativt inokulum og dyrkes under samme betingelser som kimkolben. Prøver af kulturfiltrat undersøges for inhibitorvirkning mod β-lactamase fra Escherichia coli JT4. Optimal aktivitet fås efter 3 dages forløb. Resultaterne er anført i nedenstående tabel I. En zone af clavulansyre ved R^-værdi 0,46 afsløres, når kulturfiltratet undersøges ved den ovenfor beskrevne papirchromatografiske metode. Væksten i zonens størrelse svarer til væksten i β-lactamase-inhibitorstyrkebestemmelsen.

Streptomyces clavuligerus dyrkes også i 2-liters rystekolber indeholdende 400 ml af medium (produktionstrin) under anvendelse af samme medium og dyrkningsbetingelser som beskrevet tidligere i dette eksempel. I disse større beholdere er organismens vækst langsomme- 150489 14 re, og den optimale β-lactamase-inhiberende virkning fås 7-9 dage efter podningen med den vegetative kim. Resultaterne er også anført i tabel I.

Tabel I.

β-Lactamase-inhiberende virkning af Streptomyces clavuligerus.

Vækst i 500 ml's og 2000 ml's kolber.

% inhibering af Escherichia coli-β-lactamase ved en endelig fortynding på Fermenteringstid (dage) 1/2500 af kulturfiltratet ________500 ml's rystekolbe 2000 ml's rystekolbe 1 15 2 30 .

3 55 4 ' 50 10 5 51 21 6 57 36 7 - 51 8 - 53 9 - 50.

Beskrivelse 3.

Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.

En "Yeatex"/glucose-stam-agarskråkultur anvendes til at pode en "yeatex"/glucose-agarskråkultur i en Roux-flaske ved fremstilling af en mycelium/sporesuspension i sterilt vand. Roux-flaskens's skråkultur inkuberes ved 26°C i 10 dage. Til denne skråkultur sættes 100 ml sterilt vand, og en myceliesuspension fremstilles.

Denne anvendes til at pode 50 liter dampsteriliseret kimmedium med nedenstående sammensætning i ledningsvand: "Oxoid" maltekstrakt 1 vægt/volumenprocent "Oxoid" bakteriologisk pepton 1 vægt/volumenprocent

Glycerol 1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic L81" antiskum- middel i sojabønneolie 0,05 vægt/volumenprocent.

15 150489 ('Pluronic" markedsføres af Jacobs and Van den Berg UK Ltd., 231 The vale, London, W3, og indeholder en polypropylen-polyethylen blokpolymer, og sojabønneolie markedsføres af British Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, Storbritannien).

Mediet er i en 90 liters rustfri stålfermenteringsbeholder med prelpla-der og omrøres af en 12,5 cm vingeskiverotor ved 240 omdrejninger/ minut. Der ledes steril luft ind med en hastighed på 50 liter/minut, og tanken inkuberes ved 26°C.

Efter 72 timers forløb anvendes kimfermentet til at pode 150 liter af samme medium under anvendelse af en 5 volumen/volumenprocents tilsætning ved en steril overførsel. Dette produktionstrinsmedium er i en 30 liters rustfri stålfermenteringsbeholder, helt forsynet med prelplader, og omrørt af en 21,6 cm's vingeskiverotor med 210 om-drejninger/minut. Steril luft indblæses i en mængde på 150 liter/ minut. Fermenteringen bibeholdes ved 26°C. Der tilsættes, når det er nødvendigt, antiskummiddel i 10 ml's portioner (10% "Pluronic L81" i sojabønneolie). Med regelmæssige mellemrum udtages prøver, til bestemmelse af β-lactamase-inhibering. Det fermenterende stof høstes mellem 4. og 5. daq på det optimale niveau for B-lactamase-inh.l-berende virkning, og resultaterne er anført i tabel II.

Tabel II.

β-Lactamase-inhiberende virkning i prøver af kulturfiltrat udtaget fra en 300-liters fermenteringsbeholder med Streptomyces clavuligerus.

Fermenteringstid % inhibering ved β-lactamase-inhiberings- (dage) _forsøg i en endelig fortynding på 1/2500 1,0 12 1.5 20 2,0 31 2.5 36 3/0 50 3.5 54 4.0 51.

4.5 56 5.0 55.

150489 16

Beskrivelse 4.

Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.

100 ml sterilt vand sættes til en sporekultur, som er dyrket på Bennetts-agar i en Roux-flaske i 10 dage ved 26°C. Der fremstilles en mycelium/sporesuspension, og den anvendes til at pode 75 liter dampsteriliseret medium med nedenstående sammensætning i ledningsvand :

Dextrin 2 vægt/volumenprocent "Arkasay 50" 1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic L81" i sojabønneolie 0,03 volumen/volumenprocent.

pH-Værdien i mediet indstilles på 7,0.

Mediet er i en 100-liters rustfri stålfermentering.sbeholder med prelplader og omrøres af en 19,05 cm's vingeskiverotor ved 140 omdrej ninger/minut. Der tilføres steril luft i en mængde på 75 liter/ minut, og tanken inkuberes i 72 timer ved 26°C.

Indholdet af kimfermenteringsbeholderen anvendes til at pode 1500 liter dampsteriliseret medium med nedenstående sammensætning i ledningsvand: "Arkasoy 50" 1,5 vægt/volumenprocent

Glycerol 1,0 vægt/volumenprocent - KH2PC>4 0,1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic L81" i sojabønneolie 0,2 volumen/volumenprocent.

pH-Værdien i mediet indstilles på 7,0.

Dette medium indeholdes i en 2000 liters rustfri stålfermenteringsbeholder, som fuldstændig er forsynet med prelplader, og som omrøres af to 48,4 cm's vingeskiverotorer d 106 omdrejninger/minut.

17 150489

Steril luft ledes ind i en mængde på 1200 liter/minut. Når det er nødvendigt, tilsættes antiskummidler i 25 ml1s portioner. (10% "Pluronic L81" i sojabønneolie). Fermenteringen holdes ved 26°C, indtil der er nået et maksimalt udbytte af clavulansyre efter 3 -5 dages forløb, hvor der er produceret 200 - 300^ug/ml clavulansyre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i nedenstående eksempler 1-3, omdannelsen af et ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vundet salt belyses nærmere i eksempel 4 - 6, og det antibakterielle spektrum belyses nærmere i eksempel 7-9.

Eksempel 1.

Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.

Indhøstet kulturvæske, der er fremstillet som beskrevet i beskrivelse 3, klares ved kontinuerlig flydende centrifugering, og myceliet kasseres. Af 150 liter fermentationsvæske fås 120 liter klaret kulturvæske. Dette filtrat viser 58%'s inhibering i β-lactamase--inhiberingsforsøget i en fortynding på 1/25Q0. Filtratet afkøles til 5°C, og der tilsættes 40 liter n-butanol. Blandingen omrøres, og der tilsættes 25%'s H2SO^, indtil pH-værdien er 2,0. Den syrnede blanding omrøres i yderligere 10 minutter, før faserne adskilles ved centrifugering. Den vandige fase kasseres. Til n-butanoleks-trakten sættes 0,5% "Norit GSX", og blandingen omrøres i 15 minutter. Kullet kasseres efter fjernelse ved filtrering under anvendelse af diatoméjord som filterhjælpestof. Til n-butanolet sættes en fjerdedel rumfang deioniseret vand, og blandingen omrøres, medens der tilsættes 20%'s NaOH-opløsning, indtil pH-værdien har indstillet sig på 7,0. Faserne adskilles ved centrifugering, og n-butanolfasen kasseres. Den vandige fase inddampes under reduceret tryk til 800 ml, hvorefter den frysetørres. Derved fås 35 g af et råt fast clavulansyreprodukt med en Ig^-værdi på 1,3 ,ug/ml ved β-lactamase-inhiberingsforsøget. Dette faste præparat oplagres tørt ved -20 C, inden det renses yderligere.

Eksempel 2.

150489 18

Isolering af råt elavulansyre-natriumsalt.

Kulturfiltrat indeholdende 300^ug/ml clavulansyre syrnes under anvendelse af et "in-line"-mixersystem og ekstraheres med n-butanol, og clavulansyre tilbageekstraheres i vand ved neutral pH-værdi.

Afkølet kulturfiltrat (5 - 10°C) pumpes til en "in-line"-mixer, ved hvis tilledning der sættes en tilstrækkelig mængde 6 volumen/volumenprocent salpetersyre til at holde en udgangs pH-værdi på 2,0 - 0,1. Det syrnede filtrat ledes med en hastighed på 4 liter/minut gennem en glycolkølet pladevarmeveksler (A.P.V. Ltd.) for at holde en temperatur mellem 2 og 5°C. pH-Værdien måles i en gennemstrømningscelle, før væsken ledes ind i en tretrinsmodstrømsseparator (Westfalia Separator Ltd., model EG 1006).

Med afkølet vand mættet n-butanol (ved ca. 5°C) pumpes med en hastighed på 3 liter/minut ind i modstrømsseparatoren.

Det vandige udløb fra modstrømsseparatoren ledes bort. Indledt vand fjernes fra butanoludstrømningen fra modstrømsseparatoren under anvendelse af en væske/væske-centrifugalseparator (Alfa Laval Ltd., model 3024X - G). Butanolet opsamles i en rustfri ståltank forsynet med en kølekappe, i hvilken det oplagres ved ca.

5°C.

Fra tanken fjernes 40 liter prøver, ocr de blandes qrundigt med 2 liter afkølet vand (5°C) mættet med n-butanol. pH-Værdien i denne blanding indstilles på 6,8 - 0,1 under anvendelse af 20%'s natriumhydroxidopløsning.

Denne vandige ekstrakt/butanolblanding ledes ind i en væske/væskecen-trifugalseparator (Sharpies Centrifuge Ltd., model M35PY - 5 PH) med en tilpumpningshastighed på 2 liter/minut.

Af 1800 liter kulturfiltrat isoleres 90 liter vandig fase indeholdende 39¾ af den clavulansyre, som er i kulturfiltratet.

19 150489 15 liter af den vandige ekstrakt indstilles fra 2% til 8% totalfaststof .ved tilsætning af 60 g natriumchlorid/liter og forstøvningstørres (Anhydro, København, type Lab. S 1). Betingelserne er: fødehas-tighed 2 liter/time; forstøverspænding 170 volt; heaterstilling 6 -7; indgangstemperatur 150°C; udgangstemperatur 80°C.

Det' tørrede produkt med en totalvægt på 1 kg indeholder 62% af den clavulansyre, som er i den tilledte opløsning.

De resterende 75 liter vandig ekstrakt koncentreres ved ultrafiltrering (De Danske Sukkerfabrikker, laboratoriemodul, membrantype 900). Driftsteknikken er at recirkulere retentatet fra en rustfri ståltank forsynet med et kølesystem og med en udgangsventil sat på en sådan måde, at der fås et differentialtryk hen over 40 membraner på 25 atmosfærer. Temperaturen holdes ved 2 - 5°C, og pH-vær-dien holdes ved 6,8 - 0,1 ved tilsætning af 2N saltsyre efter behov. Rumfanget reduceres til 34 liter, som indeholder 72% af den clavulansyre, som er i den' tilledte opløsning.

Det vandige koncentrat oplagres ved ca. 5°C, indstilles på et faststofindhold på 8% og forstøvningstørres som ovenfor beskrevet. Det tørrede materiale indeholder 75% af clavulansyren i den til forstøvningstørringsapparaturet ledte opløsning.

Det totale forstøvningstørrede produkt fra 90 liter vandig ekstrakt indeholder 69,4 g clavulansyre, hvilket er 72% af clavulansyren i forstøvningstørringstilgangsvæsken og 21% af clavulansyren i de 1800 liter kulturfiltrat.

Eksempel 3.

Partiel rensning af clavulansyre-natriumsalt.

Kulturfiltrat fremstillet som beskrevet i beskrivelse 4 opløsnings-middelekstraheres som beskrevet i eksempel 1, hvorved der fås et fast præparat, som yderligere renses ved ionbytningschromatografi under anvendelse af "Whatman" diethylaminoethylcellulose DE 52.

Dette faste stof (10 g) opløses i 20 ml destilleret vand og hældes på en 3,81 cm x 50,80 cm søjle af DE 52-cellulose, som i forvejen 150489 20 er ækvilibreret med 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,5. Søjlen elueres med en NaCl-gradient. 0,1M NaCl i 0,01M natrium-phosphatpuffer med pH-værdi 7,5 ledes ind i et mixérkammer indeholdende 1 liter 0,01M phosphatpuffer med pH-værdi 7,5, som igen ledes på søjlen. 10 ml's fraktioner opsamles, og de undersøges for 3-lactamase-inhiberende virkning ved fortynding på 1/2500. Fraktionerne undersøges også for antibakteriel virkning ved hul-pladeforsøgsmetoden under anvendelse af næringsagarplader, på hvilke der er udpodet Klebsiella aerogenes. Fraktionerne med den høje'ste β-lactamase-inhiberende virkning og med inhiberingszoner i hulpladeforsøget sammenhældes, inddampes og afsaltes på en "Biorad Biogel P2"-søjle. Disse fraktioner vises ved hjælp af papirchro-matografi og tyndtlagschromatografi at indeholde clavulansyre.

Eksempel 4.

Fremstilling af en ester af clavulansyre (methylester).

^ ,CHo0H ^ CH2OH

rA=/ ^ r^w7 /-"V / v

VoONa COO'CH3 19,8 mg af natriumsaltet af clavulansyre opløses i 0,5 ml tørt di-methylformamid og behandles med 0,25 ml methyliodid. Efter henstand ved stuetemperatur i 1 1/2 time under vandfrie betingelser fjernes opløsningsmidlerne i vakuum. Remanensen renses ved P.L.C. på sili-cagel (Kieselgel 60F254, markedsført af E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) og eluering med ethylacetat, hvorved der fås clavulansyre--methylester i form af en farveløs olie (R^-væfdi 0,38; rød farve med triphenyltetrazoliumchloridspray), og olien har nedenstående egenskaber: 21 150489

Analyse;

Beregnet for C9hi;ln°5! C 50,70 H 5,20 N 6,57 Fundet: C50,49 H 5,43 N 6,29.

UV-spektrum (methanol: λ : ingen absorption >215 nm; IR-spektrum: v (film): 3300 - 3600 (bredt), 1800, 1750, 1695 cm

IUclX

Tilnærmet første ordens NMR-spektrum (CDCl^): 2,49 (bred S, 1, udskiftet med D2O), 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 3,84 (S,3) 4,24 (d, 2, J = 7 Hz), 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,07 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,72 (d, 1, J = 2,5 Hz).

Molekylvægt (massespektrum): 213,0635.

Beregnet for CgH^NO^: 213,0637.

Tyndtlagschromatografi på methylesteren viser en enkelt zone i hver af de nedenstående opløsningsmiddelsystemer: butanol/ethanol/ vand i volumen/volumen-forholdet 4:1:5, topfase R^-værdi 0,75; iso-propanol/vand i volumen/volumen-forholdet 7:3, R^-værdi 0,95; ethyl-acetat/ethylalkohol i volumen/volumen-forholdet 8:2, R^-værdi 0,87. Disse zoner bestemmes ved bioautografi under anvendelse af Klebsiella aerogenes med tilsat benzylpenicillin (synergismesystem) .

Eksempel 5.

Fremstilling af en ester af clavulansyre (benzylester).

CH^OH

I ch2oh

J—n-L * ___I

<f COONa / N X>C00CH9-Ph 0 ^ 150489 22

Urent 3-(β-hydroxyethyliden)—7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan--2-carboxylsyre-natriumsalt (antages at være ca. 55 mg rent stof) i 0,64 ml tørt dimethylformamid behandles med 0,18 ml benzylbromid. Opløsningen holdes ved stuetemperatur (ca. 17 - 18 C) i 3 timer under vandfrie betingelser. Reaktionsblandingen fraktioneres på silicagel og elueres med ethylacetat, hvorved der fås 63 mg af en i det væsentlige ren form af benzylesteren af 3-(3‘-hydroxyethyliden)--7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylsyre i form af en farveløs olie.

IR-spektrum (film): 1800, 1745 og 1695 cm NMR-spektrum (CDClj): 2,25 (s, 1, udskiftelig med D20), 3,05 (d, 1, J » 17 Hz), 3,51 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,92 (dt, 1, J * 7,5 Hz, J2 - 1,5 Hz), 5,15 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,24 (s, 2), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,456 (s, 5).

Eksempel 6.

Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre ud fra råekstrakter af kulturfiltratet af Streptomyces clavuligerus.

En alikvot af en vandig reekstrakt af butanolekstrakten fra kulturfiltratet, som er fremstillet som beskrevet i eksempel 1, frysetørres under anvendelse af et "Edwards" kammertørreapparat. En portion på 24 g af det vundne faste stof indeholder 0,96 g natrium-clavulansyre ifølge enzyminhiberingsforsøget. Dette faste stof suspenderes i 75 ml tørt dimethylformamid, og der tilsættes 75 ml benzylbromid. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Suspensionen fortyndes derefter med 500 ml ethylacetat, og blandingen filtreres. Filtratet inddampes på en roterende vakuuminddamper, hvorved der fås en olieagtig remanens. Denne remanens hældes på en 5,08 cm x 35,56 cm silicagelsøjle ("Biogel Biosil A" 100 mesh) i cyclohexan. Benzylbromid elueres fra søjlen, og derefter ændres opløsningsmidlet til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 10 ml. Fraktioner indeholdende benzylesteren af clavulansyre udvælges ved synergismemetoden. Yderligere rensning udføres ved hjælp af søjlechromatografi. Ved denne fremgangsmåde fås 220 mg ren benzylester.

23 150489

Eksempel 7.

Antibakterielt spektrum for clavulansyre.

Den antibakterielle virkning af clavulansyre-natriumsalt mod en række bakterier bestemmes under anvendelse af mikrotitermetoden. Seriefortyndinger af clavulansyre-natriumsaltet i "Oxoid"-sensitivi-tetsforsøgsvæske i en mikrotiter plastbakke podes med en dyrkningskultur, der har stået natten over, af hver organisme, således at -4 den endelige fortynding af inokulet er 0,5 x 10 . Kulturerne in kuberes natten over, og punkterne med bakterievækst bestemmes næste morgen ved at observere kulturens uklarhed. Resultaterne, udtrykt som tilnærmelsesvise MlC-værdier (minimum inhiberingskoncentration ^ug/ml) er anført i nedenstående tabel III, som viser, at forbindelsen har bredspektret antibakteriel virkning.

Tabel in,

Antibakterielt spektrum for clavulansyre-natriumsalt.

Bakteriestammer Minimum inhiberings koncentration yug/ml

Staphylococcus aureus (Oxford H) .7,5

Staphylococcus aureus (Russell) 7,5

Bacillus subtilis 62

Streptococcus faecalis >500

Streptococcus pyogenes CN 10 125

Escherichia coli NCTC 10418 31

Klebsiella aerogenes 31 - 62

Klebsiella oxytocum 62

Enterobacter aerogenes T 624 31

Enterobacter cloacae 62

Acinetobacter anltratus 125

Providentia stuartii 125

Serratia marcescens 125

Proteus mirabilis C977 62

Proteus vulgaris WO90 31

Salmonella typhimurium 31

Shigella sonnei 62

Pseudomonas aeruginosa A 500

Eksempel 8.

24 150489

Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og clavulansyre-natrium-salt.

Den minimale inhiberingskoncentration (MIC-værdi) for ampicillin, clavulansyre-natriumsalt og ampicillin i tilstedeværelse af 1^ug/ml clavulansyre-natriumsalt bestemmes for en række (3-lactamase-produ-cerende bakterier. Organismerne podes i "Oxoid" sentivitetstests-dyrkningsvæske anbragt i små skakter i en plastbakke og indeholdende forskellige koncentrationsgradienter af ampicillin, clavulansyre--natriumsalt eller ampicillin plus lyug/ml clavulansyre-natriumsalt (mikrotitermetode). Den endelige fortynding af inokulet i dyrknings- -2 væsken, dyrket natten over, er 0,5 x 10 . Bakken inkuberes ved 37°C natten over, og næste morgen bestemmes endepunkterne for bakterievæksten. MIC-værdierne i yug/ml er anført i tabel IV, hvoraf det fremgår, at synergisten ved den lave koncentration på l^ug/ml 'på afgørende måde forbedrer den antibakterielle virkning af ampicillin mod visse grampositive og gramnegative bakterier. Mekanismen i denne synergisme antages at bestå i inhibering af ampicillin--nedbrydende β-lactamase-enzymer, men eksistensen af andre mekanismer kan ikke udelukkes.

Der fås lignende resultater som dem, som vises i tabel IV, når ampicillin erstattes med amoxycillin eller med phthalidylesteren af ampicillin.

Tabel IV.

Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og clavulansyre-natriumsalt.

Bakteriestamme Minimal inhiberingskoncentration ^ug/ml

Clavulansyre- Ampicillin Ampicillin i -natriumsalt tilstedeværelse af 1 ,ug/ml cla-vulansyre-natri- _umsalt_

Escherichia coli NCTC 10481 31 1,8 <0,4

Escherichia coli B 11 62 >500 125

Klebsiella aerogenes A 31 125 <0,4

Klebsiella sp 62 31 125 <0,4 150489 25

Tabel IV fortsat

Enterobacter cloacae 62 250 62

Serratia marcescens 125 >500 62

Staphylococcus aureus (Russell) 15 500 <0,4

Staphylococcus aureus 62 250 7,5 len methicillinresistent stamme)

Eksempel 9.

Antibakteriel synergisme mellem clavulansyre-natriumsalt og forskellige penicilliner.

De i tabel V viste resultater er opnået med den i eksempel 8 beskrevne metode.

Tabel V.

Antibakteriel synergisme mellem clavulansyre-natriumsalt og forskellige penicilliner mod stammer af Klebsiella aerogenes.

Stamme Amoxycillin Carbenicillin* Benzylpenicillin alene +5 ,ug/ml alene +5 ,ug/ml alene +5 ,ug/ml _synergist_synergist_synergist_ A 500 0,97 500 7,8 250 7,8 E 70 . 500 3,9 500 15 500 15,6 62 250 15,6 125 7,8 250 15,6 X Der fås lignende resultater, når carbenicillin erstattes med car-benicillin-phenyl-a-ester eller ticarcillin.

i—· Påvisning af synergisme mellem natriumclavulanat og penicilliner mod Klebsiella.

26 150439

Tabel VI.

MIC (yUg/ml) "A 62 E 70 Ib a 95 |1LO 7500

Ampicillin alene 250 500 2000 >4000 >8000

Ampicillin + synergist 0,5^ug/ml 0,39 1,56 0,39 >4000

Ampicillin + synergist 5yUg/ml <0,09 0,19 0,39-0,78 62 >8000

Amoxycillin alene 500 500 2000 >4000 >8000

Amoxycillin + synergist 0,5yug/ml 0,39 6,0 1,56 >4000 -

Amoxycillin + synergist 5,ug/ml 0,19 0,39 0,39 250 >8000

Carbenicillin alene 31 250 500 >4000 >8000

Carbenicillin + synergist 0,5yug/ml 3,1 12 6,2 4000

Carbenicillin + synergist 5^ug/ml 0,78 1,56-3,1 6,2 1000 >8000

Ticarcillin alene 52-125 125 500 >4000 >8000

Ticarcillin + synergist 0,5yug/ml 1,56 6,2 3,1 >4000

Ticarcillin + synergist 5/Ug/ml 0,78 0,78 1,56 500 >8000

Benzylpenicillin alene 125 1000 1000 >4000 <8000

Benzylpenicillin + synergist 0,5^ug/ml 3,1 35 6,2 >4000

Benzylpenicillin + synergist 5yUg/ml 1,56 6,2 12,5 250 8000

Natriumclavulanat alene 31 15 15 31 31 20^,ug/ml natriumclavulanat anvendes også i kombination, men natriumclavulanat alene inhiberer væksten af organismen.

Påvisning af synergisme mellem natriumclavulanat og penicilliner mod Staphylococcus aureus.

150489 27

Tabel VII.

MIC (/Ug/ml) _ Russell__H__5275__Nobel_

Ampicillin alene 1000 1000 500 500

Ampicillin + synergist 0,6 1,25 2,5-1,25 0,6 lyug/ml

Ampicillin + synergist 0,019 0,3 0,15 0,03 5 yug/ml

Amoxycillin alene 1000 1000 500 500

Amoxycillin + synergist 1,25 1,25 2,5 0,6 1yug/ml

Amoxycillin + synergist 0,15-0,07 0,3 0,15 0,15 5yug/ml

Carbenicillin alene 62,5 62,5 62,5 31

Carbenicillin + synergist 5,0 5,0 5,0 2,5 1/ug/ml

Carbenicillin + synergist 0,6 2,5 0,6 1,25 5^ug/ml

Ticarcillin alene 31 62,5 62,5 31-15,6

Ticarcillin + synergist 5,0 2,5 5,0 2,5 1/ug/ml

Ticarcillin + synergist 0,6 1,25 1,25 2,5 5^ug/ml

Benzylpenicillin alene 1000 1000 1000 500

Benzylpenicillin + syner- 5,0 2,5 10 1,25 gist 1yug/ml

Benzylpenicillin + syner- 0,03 0,15 0,3 0,07 gist 5^.ug/ml

Natriumclavulanat alene 15,6 7,8 7,8 7,8

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et clavulansyresalt, kendetegnet ved, at et kulturfiltrat indeholdende clavulansyre efter tilsætning af syre til en pH-værdi på ca. 2. ca. 3 ekstraheres med et med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, faserne adskilles, og clavulansyren reekstraheres i en vandig fase, medens pH-værdien holdes på omtrentlig neutralt niveau, hvorhos den vandige fase eventuelt indeholder alkalimetalhydrogencarbonat- eller -phosphatpuffer eller en CaCO^-suspension, hvorefter saltet af clavulansyren isoleres derfra.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kulturfiltratet indeholdende clavulansyre er et ved dyrkning af en stamme af Streptomyces clavu-ligerus vundet kulturfiltrat.