DE2517316A1 - Clavulansaeure, deren salze und ester, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

DiPL.-CHEM. DR. ELISABETH JUNG DIPL.-PHYS. DR. JÜRGEN SCHIRDEWAHN PATENTANWÄLTE

MÖNCHEN 4-·,

TEL-FON 34 Λ 67

TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MONCHEN

TELEX 5-29 626

J 561 C (j/vdB/gs)

Case A.826

BEECHAM GROUP LIMI TED

Brentford, Middlesex, England

"Clavulansäure, deren Salze und Ester, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel"

Priorität: 20. April 1974

21. «7uni 1974

9. Okt. 1974

11. Dez. 1974

Großbri tannien
Großbritannien
Großbri tanni en
Großbritannien

- Nummer 17 410/74

- Nummer 27 715/74

- Nummer 4^ 651/74

- Nummer 53 525/74

Die Erfindung betrifft ein neues Mittel gegen Bakterien, das aus Streptomyces clavuligerus isoliert werden kann. Diese neue Verbindung wird als Clavulansäure bezeichnet, die die nachstehende Formel I besitzt:

CH₂OH

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Streptomyces clavuligerus ist ausführlich beschrieben worden von Higgens und Mitarbeitern in Int.J.Systematic Bacteriology 2J₁ (1971), S. 326. Dieser Mikroorganismus war insofern interessant, als er bestimmte ß-Lactam-Antibiotika erzeugt, wie Penicillin N, 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure und 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure. Dieser Mikroorganismus ist bei der Agricultural Research Service Collection unter der Nummer NRRL 3585 und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 27064 hinterlegt worden. Streptomyces cla-•uligerus ist auch in der US-PS 3 770 590 und von Nagarajan und Mitarbeitern in J.Amer.Chem.Soc. 95 (1971), S. 2308, Brannon und Mitarbeitern in Antimicrob.Agents Chemother. 1_ (1972), S. 237 und 247 und Higgens und Mitarbeitern in J.Antibiotics 27 (1974), S. 298, erwähnt worden. .

ß-Lactamasen sind Enzyme, die den ß-Lactamring von Penicillinen und Cephalosporinen öffnen und Produkte liefern, die keine antibakterielle Wirksamkeit mehr besitzen. Derartige Enzyme werden von verschiedenen Bakterien erzeugt, z.B. Spezies oder Stämmen von Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter und Staphylococcus; Diese Enzyme sind in vielen Fällen die Erklärung für eine Widerstandsfähigkeit bestimmter Stämme solcher Organismen gegenüber manchen Penicillinen und Cephalosporinen. Die Bedeutsamkeit einer ß-Lactamase-Erzeugung wird verständlich, wenn offensichtlich wird, daß ein hoher Anteil von klinisch isolierten Organismen ß-Lactamasen erzeugen (vgl. z.B. M. Wilson und I.A. Freeman in Bacteriological Proceedings 8b (I969), wo in dem Aufsatz "Penicillin Inactivation by Gram-negative Bacilli"

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- J5 -

die Autoren gezeigt haben, daß 84 Prozent der gramnegativen Organismen, die in einem amerikanischen Krankenhaus isoliert worden sind, ß-Lactamase erzeugen). In zahlreichen Fällen sind bestimmte Penicilline oder Cephalosporine unwirksam bei der Behandlung von Krankheiten, die keine ß-Lactamase erzeugenden Organismen wegen des allgemeinen Auftretens einer Nebeninfektion durch einen ß-Lactamase-Erzeuger zugeschrieben werden (vgl. z.B. R. May und Mitarbeiter in Brit.J.Dis.Chest. 66 (1972), S. 185). Von Gemischen von ß-Lactamase-Hemmsubstanzen mit einem Penicillin oder einem Cephalosporin könnte man erwarten, daß das letztere vom Abbau durch bakterielle ß-Lactamase geschützt sei, so daß sie dadurch ihre antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche infektiöse Organismen steigern. Eine derartige Steigerung einer antibakteriellen Wirksamkeit nennt man Synergismus, wenn die antibakterielle Wirksamkeit des Gemisches über eine einfache Addition der Wirksamkeiten der beiden Einzelsubstanzen hinausgeht. Die ß-Lactamase-Hemmsubstanz der Mischung wird als Synergist bezeichnet. Derartige Substanzen sind vorteilhaft zur Erhöhung der antibakteriellen Wirksamkeit von Penicillinen und Cephalosporinen gegen resistente Organismen. Es ist eine Aufgabe vorliegender Erfindung, derartige Synergisten bereitzustellen.

Anwendungsbeispiele von bestimmten ß-Lactamase-resistenten halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen,als ß-Lactamase-Hemmstoffe und Synergisten für Penicilline und Cephalosporine sind bereits in der Literatur beschrieben, z.B. von Sutherland und Mitarbeiter in Nature 201 (1964), 868; Sabath und Mitarbeiter in Nature 204 (1964), IO66; O'Callaghan und Mitarbeiter in Antimicrob. Agents and Chemotherapy I968 (1969), 67. Jedoch

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besitzt keine dieser bekannten Substanzen einen besonders eindrucksvollen Effekt auf das Spektrum des anderen, im Gemisch vorliegenden Antibiotikums.

Es ist auch von einigen Actinomycetes-Züchtungen beschrieben worden, daß sie ß-Lactamase-Hemmstoffe erzeugen, die mit Penicillinen, oder Cephalosporinen synergistisch wirken, z.B. die in der GB-PS 1 363 075 und von Hata und Mitarbeitern in J.Antibiotics 25 (1972), S. 473 und Umezawa und Mitarbeitern in J.Antibiotics 26> (1973), S. 51, beschriebenen Züchtungen. Von diesen ß-Lactamase-Hemmstoffen von Actinomycetes ist bisher noch keine klinische Verwendbarkeit festgestellt worden. Besonders bemerkenswerte Merkmale, die Clavulansäure von anderen ß-Lactamase-Hemmstoffen von Actinomyceten unterscheiden, sind ihre Extrahierbarkeit in organische Lösungsmittel aus dem Nährmedium bei pH 2, ihre hohe Stabilität in Menschenblut und ihr breites Antibiotika-Spektrum und ß-Lactamase-Hemmwirkung, ihr niedriges Molekulargewicht und ihr hoher R_f-Wert bei der Papierchromatographie bei Anwendung zahlreicher Lösungsmittelsysteme.

Es ist gefunden worden, daß die aerobe Züchtung von Streptomyces clavuligerus in üblichen Nährmedien bei etwa 25 bis 30⁰C unter annähernd neutralen Bedingungen eine ß-Lactamase-Hemmsubstanz erzeugt, die auch eine antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese neue Substanz wird als "Clavulansäure" bezeichnet.

Clavulansäure hat folgende Eigenschaften:

(a) Sie ist eine Carbonsäure;

(b) sie bildet ein Natriumsalz, das ein charakteristisches

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Infrarot-Spektrum besitzt, wie es im wesentlichen aus der Fig. 1 hervorgeht;

(c) sie vermag das Wachstum von Staphylococcus aureus-Stämmen zu hemmen;

(d) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen;

(e) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Cephaloridin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen; und

(f) sie bildet einen Methylester, der aufgrund der Massenspek-. troskopie ein Molekulargewicht von 213,0635 entsprechend der Formel CqH, .NO,- besitzt.

Die Clavulansäure kann als einwertige Carbonsäure der Formel CoHqNO₁- betrachtet werden, die in Form des Natriumsalzes ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum besitzt, das im wesentlichen dem in Fig. 1 gezeigten entspricht.

Die von Streptomyces clavuligerus erzeugte Verbindung mit den vorgenannten Eigenschaften besitzt die Formel II

CH₂OH

(H)

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Die Clavulansäure kann als 3-(ß-Hydroxyäthyliden)~7-oxo-4-oxal-azabicyclo/3j2,07heptan-2-carbonsäure bezeichnet werden.

In stereochemischer Hinsicht sind die Kohlenstoffatome in 2- und 5-Stellung der Clavulansäure gleich wie bei den natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen, so daß die Clavulansäure durch die nachstehende Strukturformel (I) dargestellt werden kann:

CH OH

(D

Deshalb ist der vollständigere chemische Name für Clavulansäure Z- (2R, 5R) -3- (ß-Hydroxyäthyliden) -Y-oxo-^-oxa-l-azabicyclo/jJ, 2,0jheptan-2-carbonsäure.

Die-hervorragende Brauchbarkeit der Clavulansäure wird erst richtig erkannt, wenn man sich vergegenwärtigt, daß- bestimmte Stämme von Klebsiella aerogenes A, deren Wachstum durch die Anwesenheit von 125 Wg/ml Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin oder Benzylpenicillin oder durch die Anwesenheit von 10 ^ig/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorhandensein von unter 12,5 Ug/ml der vorerwähnten Penicilline jedoch gehemmt werden, wenn gleichzeitig 5 Ug/ml Clavulansäure vorhanden sind. Ähnliche Ergebnisse sind bei Gemischen mit einem Gehalt verschiedener Ester der Clavulansäure beobachtet worden. Zum Beispiel

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werden Stämme von Klebsieila aerogenes A, deren Wachstum durch 125 yUg/ml Ampicillin oder durch 10 pg/ml Clavulansäure-methyl-

nicht
ester/gehemmt wird, jedoch von unter 12,5 J-ig/ml Ampicillin in Gegenwart von 5 pg/ml Clavulansäure-methylester gehemmt. Es ist ferner festgestellt'worden, daß Stämme von Staphylococcus aureus Russell, deren Wachstum durch die Gegenwart von 100 ug/ml Ampicillin oder durch 5 pg/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorliegen von unter 10 ug/ml Ampicillin in Gegenwart von 1 pg/ml Clavulansäure gehemmt werden. Bei Untersuchungen an weiblichen Mäusen ist festgestellt worden, daß beträchtlich über 5 Ug/ml liegende Mengen an Clavulansäure im Blut und Gewebe in einfacher Weise durch eine subcutane Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erreicht werden können und daß brauchbare Mengen an Clavulansäure nach einer oralen Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erhalten werden können.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist daher die Clavulansäure und deren Salze und Ester.

Die zweckmäßigsten Salze der Clavulansäure sind die pharmakologisch verträglichen Salze, wie das Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und das Ammoniumsalz, ferner substituierte Ammoniumsalze, wie das Trimethylammoniumsalz, sowie weiterhin Benzathin-, Procain- und ähnliche Salze, wie sie üblicherweise mit Penicillinen oder Cephalosporinen gebildet werden. Pharmakologisch nicht verträgliche Salze der Clavulansäure bilden ebenfalls einen Gegenstand vorliegender Erfindung, da sie wertvolle Zwischenprodukte bei der Herstellung der Ester der Clavulansäure

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sind. Zum Beispiel kann das Lithium- oder das Silbersalz der Clavulansäure mit Benzylbromid unter Bildung des wertvollen Benzylesters der Clavulansäure umgesetzt werden.

Die Salze der Clavulansäure sind gewöhnlich stabiler als die freie Säure per se und bilden daher einen bevorzugten Gegenstand vorliegender Erfindung. Besonders zweckmäßige Salze der Clavulansäure sind das Natrium- und das Kaliumsalz der nachstehenden Formeln III und IV:

CH OH

CO₂Na

(HI)

(IV)

Kristalline Formen derartiger Salze können Hydratwasser enthalten.

Zweckmäßige Ester der Clavulansäure sind diejenigen, die sich von den betreffenden Alkoholen ableiten, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, 2,2,2-Trichloräthanol, 2,2,2-Trifluoräthanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzy!alkohol, Phenol, Acetoxymethanol, Trimethylacetoxymethanol, 2-Dimethylaminoäthanol und anderen üblichen Alkoholen. Zählreiche Ester der Clavulansäure sind wertvolle Zwischenprodukte bei bestimmten Verfahren zur Reindarstellung der Clavulansäure. Viele Clavulansäureester sind wertvolle synergistische Verbindungen. Die Wirksamkeit derartiger Ester dürfte in einer Hydrolyse des Esters zur freien Säure liegen.

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Wenn vorstehend der Ausdruck "Ester" verwendet wird, so schließt er die Ester mit ein, die sich begrifflich von einem Alkohol oder einem Thiol der allgemeinen Formeln ROH oder RSH ableiten, in denen R ein organischer Rest ist. Geeignete Reste für R sind Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylalkyl- oder andere ähnliche Reste, die auch substituiert sein können. Um das Molekulargewicht nicht übermäßig zu erhöhen, sollten die Reste R normalerweise nicht über 16 Kohlenstoffatome, zweckmäßigerweise nicht über 12 Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt nicht über 8 Kohlenstoffatome enthalten.

Vorzugsweise leitet sich der Rest R von einem Alkohol ROH oder nicht ganz so bevorzugt von einem Thiol RSH ab, die pharmakologisch verträglich sind.

Beispiele von geeigneten Substituenten an den Resten R sind Halogenatome, Hydroxylgruppen, niedere Alkoxy-, niedere Acyloxy-, niedere Alkylamino- oder niedere Dialkylaminoreste. Der Ausdruck "nieder" gibt an , daß der Rest bis 6 Kohlenstoffatome und vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoffatome enthält. Demzufolge kann R die Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, geradkettige oder verzweigte Butyl-, Pentyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Vinyl-, Allyl-, Butenyl-, Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cyclohexenyl-, Cyclohexadienyl-, Methylcyclopentyl-, Methylcyclohexyl-, Benzyl-, Benzhydril-, Phenyläthyl-, Naphthylmethyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Propinyl-, Tolyl-, 2-Chloräthyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-, 2,2,2-Trifluoräthyl-, Acetylmethyl-, Benzoylmethyl-, 2-Methoxyäthyl-,

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- ίο -

2-Dimethylaminoäthyl-, 2-Diäthylaminoäthyl-, 2-Piperidinoäthyl-, 2-Morpholinoäthyl-, 3-Dimethylaminopropyl-, p-Chlorbenzyl-,. p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Brombenzyl-, m-Chlorbenzyl-, 6-Methoxynaphthyl-2-methyl-, p-Chlorphenyl- und die p-Methoxy-

bedeuten

phenylgruppe und ferner solche Gruppery, die aus der Penicillinoder Cephalosporin-Chemie zur Herstellung solcher Ester bekannt sind, die in vivo leicht zur antibiotischen Stammsubstanz hydrolysieren.

Leicht hydroIysierbare Ester umfassen auch die Ester der allgemeinen Formeln V und VI, doch sind sie nicht auf diese beschränkt:

^O CH₂OH

ο" \

ϊ^χ

QO I

^-0 — Cw X

A₂

CH₂OH

(V)

— CO

(VI)

= y

in denen A, ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist, A₂ ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeutet, A-, für einen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest steht, X und Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome sind und Z einen

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²⁵¹⁷³I⁶U.

zweiwertigen organischen Rest darstellt. Ester der allgemeinen Formeln V und VI, die nach einer Verabreichung zeimlich leicht die Clavulansäure im Blutkreislauf freisetzen, schließen auch solche ein, in denen A₁ ein Wasserstoffatom, A₂ ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe und A, die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Benzyl- oder die Phenylgruppe sind, sowie solche, in denen X ein Sauerstoffatom, Y ein Sauerstoffatom ist und Z eine der Gruppierungen -CH₂CH₂-, -CH:CH-,

oder lli

yK^\ OCH3

darstellt.

Wenn in Verbindung mit den vorstehenden Formeln der Ausdruck "Alkyl" verwendet wird, schließt er Alkylreste bis zu 6 Kohlenstoffatomen ein. Der Ausdruck "Aryl" bedeutet die Phenyl- oder die Naphthylgruppe oder ferner einen Phenylrest, der durch einen inerten Substituenten, wie ein Fluor- oder Chloratom oder die Methyl- oder Methoxylgruppe oder dergleichen, substituiert ist. Wenn hierin der Ausdruck "Aralkyl" verwendet wird, bedeutet er einen durch einen Arylrest substituierten Alkylrest.

Besonders zweckmäßige Ester der allgemeinen Formeln V und VI sind diejenigen,der allgemeinen Formeln VII und VIII:

CO - 0 - CH - 0 - CO - A

(VII)

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(VIII)

In diesen Formeln bedeutet A^, ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe, Aj- die Methyl-, tert.-Butyl- oder die Phenylgruppe und Ag ein Wasserstoffatom und/oder die Methoxygruppe.

Zahlreiche Ester der Clavulansäure unterscheiden sich von analogen Estern von Penicillinen oder Cephalosporinen darin, daß sie eine erhöhte Bereitschaft zur Hydrolyse zu Clavulansäure unter milden Bedingungen zeigen. So hydrolysieren z.B. einfache Alkylester, wie der Methylester, langsam in auf pH 7 gepuffertem V/asser zu Clavulansäure. Ester, die schon unter milden Bedingungen in gewissem Grad eine Hydrolyse erleiden, sind solche,der allgemeinen Formel IX:

H₂QH

(IX)

in der R¹ ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist, der durch Halogenatome, niedere Alkoxyreste, Hydroxyl-

P "5

gruppen oder durch gegebenenfalls in Salzform vorliegende NR R-Reste substituiert sein kann, wobei R und R^ gleich oder ver-

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schieden sind und Wasserstoffatome und/oder niedere Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6gliedrigen Ring bilden können.

Wenn unter Bezugnahme auf die allgemeine Formel IX der Ausdruck "nieder" verwendet wird, bedeutet er, daß der Rest 1 bis 4 Kohlenstoff atome enthält.

Geeignete Reste für R sind Alkyl- und Aralkylreste, die gegebenenfalls durch Halogenatome, Hydroxyl- oder Methoxy»gruppen oder

2 3
durch in Salzform vorliegende NR R^ - Reste substituiert sein

können, wobei R der Methyl- oder Ä'thylrest und Vr der Methyl-

oder Athylrest ist oder mit dem Rest R unter Einschluß des Stickstoffatoms zu einem Pyrrolidin-,' Piperidin- oder Morpholinrest verbunden ist.

Die zweckmäßigsten Alkylreste für R sind geradkettige Reste bis zu 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch eine Methoxy-

2 "5 oder eine Hydroxylgruppe, einen in Salzform vorliegenden NR R-Rest oder ein Chlor-, Brom- oder Jodatom oder durch die CCl-,- oder CP^-Gruppe substituiert sind.

Die Ester der Clavulansäure sind besonders brauchbar als Synergisten, wenn sie in Geweben von Säugern, insbesondere im menschlichen Blut unter Bildung von Clavulansäure oder dessen Salz hydrolysieren, da man annimmt, daß Clavulansäure oder deren Salze etwas stärker wirksame antibakterielle Mittel als die Ester per se sein dürften. Zahlreiche Ester der allgemeinen Formeln V bis IX sind für diese Zwecke brauchbar.

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Eine weitere Gruppe besonders geeigneter Ester nach vorliegender Erfindung sind jene wertvollen Zwischenprodukte, die leicht in Clavulansäure oder deren Salz durch chemische oder biochemische Methoden, die aus der Penicillin- oder Cephalosporin-Chemie bekannt und ausreichend milde sind, die reaktionsfähigen säurelabilen ß-Lactamringe aufzuspalten, überführt werden.

Am zweckmäßigsten ist natürlich ein Ester, der durch Hydrierung spaltbar ist. Übliche Ester für ein derartiges Verfahren sind die Benzyl-, substituierten Benzyl-, Benzhydril-, substituierten Benzhydril- oder die Tritylester. Der Benzylester hat sich als besonders zweckmäßig für dieses Verfahren erwiesen.

Im großen und ganzen ist die Art eines Substituenten im Esterrest ohne Bedeutung, so lange er nicht bei der Spaltung durch Hydrierung stört.

Da Clavulansäure und ihre Salze wertvolle Zwischenprodukte bei der Herstellung der erwünschten antibakteriell wirksamen Ester vorliegender Erfindung sind, bezieht sich vorliegende Erfindung auch auf Clavulansäure und seine Salze, wenn sie als chemische Zwischenprodukte Verwendung finden.

Es ist bereits vorstehend darauf hingewiesen worden, daß Clavulansäure und ihre Salze und Ester wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen. Demgemäß bilden einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung Arzneimittel mit einem Gehalt an Clavulansäure oder deren Salzen oder Estern, gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch unbedenklichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungs-

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mitteln.

Die Arzneimittel vorliegender Erfindung umfassen solche in einer Form, die für eine orale, lokale oder parenterale Anwendung geeignet sind und die zur Behandlung von Infektionen bei Säugern, einschließlich Menschen, verwendet werden können.

Zweckmäßige Formen der Arzneimittel vorliegender Erfindung sind Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, Suspensionen, Lösungen, Trokkensäfte und sterile, zu Injektions- oder Infusionszwecken geeignete Formen . Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallhilfsmittel und- dergleichen gemäß einer üblichen pharmakologischen Praxis zur Formulierung von Antibiotika enthalten, wie sie dem Fachmann bekannt ist. Injizierbare oder infundierbare Arzneimittel der Clavulansäure oder deren Salze sind besonders zweckmäßig, da große Mengen der Verbindung Clavulansäure im Gewebe nach einer Verabreichung durch Injizieren oder Infundieren auftreten können. Demzufolge ist ein besonderes bevorzugtes Arzneimittel nach vorliegender Erfindung die Clavulansäure oder deren Salz in steriler Form.

Einzeldosierungen mit einem Gehalt an Clavulansäure oder deren Salz oder Ester, die für eine orale Verabreichung angepaßt sind, bilden ein weiteres bevorzugtes Arzneimittel im Hinblick auf vorliegende Erfindung.

Unter bestimmten Voraussetzungen kann die Wirksamkeit der oralen

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Arzneimittel mit Clavulansäure und deren Salze oder Ester verbessert werden, wenn derartige Arzneimittel eine Puffersubstanz enthalten oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehen sind, so daß die Verbindungen vorliegender Erfindung keine lange Berührungszeit mit dem hochgradig sauren Magensaft haben. Derartige gepufferte oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehene Arzneimittel können nach den üblichen pharmazeutischen Techniken hergestellt werden.

Die Clavulansäure oder deren Salz°e oder Ester können in den Arzneimitteln als einziger therapeutischer Wirkstoff vorliegen oder sie können zusammen mit anderen therapeutischen Mitteln, wie einem ß-Lactam-Antibiotikum, vergesellschaftet sein. Geeignete ß-Lactam-Antibiotika zum Einarbeiten in derartige synergistische Arzneimittel schließen nicht nur solche ein, die in hohem Maße gegen ß-Lactamase empfindlich sind, sondern auch solche, die einen guten Grad an innewohnender Widerstandsfähigkeit gegen ß-Lactamasen haben. Demzufolge sind geeignete ß-Lactam-Antibiotika zum Einarbeiten in die Arzneimittel vorliegender Erfindung Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Carbenicillin, Methicillin, Propicillin, Ampicillin, Amoxycillin, Epicillin, Ticarcillin, Cyclacillin, 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure, Cephaloridin, Cephalothin, Cefazolin, Cephalexin, Cefoxitin, Cephacetril, Cephamandol, Cephapirin, Cephradin, Cephaloglycin und andere gut bekannte Penicilline und Cephalosporine oder deren Vorstufen, wie Hetacillin, Metampicillin, ferner die Ace'toxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder die Phthalidylester von Benzylpenicillin, Ampicillin, Amoxycillin oder Cephaloglycin oder der Phenyl-, Tolyl-

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oder Indalyl-o£-ester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder dergleichen.

Wenn natürlich das im Arzneimittel vorliegende Penicillin oder Cephalosporin nicht für eine orale Verabreichung geeignet ist, dann wird das Arzneimittel für eine parenterale Verabreichung angepaßt.

Wenn die Clavulansäure oder deren Salze oder Ester in den Arzneimitteln zusammen mit einem ß-Lactam-Antibiotikum vorliegen, kann das Verhältnis der vorhandenen Clavulansäure oder deren Salz oder Ester zum vorhandenen ß-Lactam-Antibiotikum von beispielsweise 10 : 1 bis 1 : 10 und vorteilhafterweise von 3 : 1 bis 1 : 3 sein.

Die Gesamtmenge der in einer Einzeldosierungsform vorhandenen antibakteriellen Mittel liegt gewöhnlich zwischen 50 und 1500 mg und üblicherweise zwischen 100 und 1000 mg.

Die Arzneimittel vorliegender Erfindung können zur Behandlung von Infektionen von u.a. der Atemwege, des Harnsystems und der Weichteile beim Menschen verwendet werden. Sie können auch zur Behandlung von Infektionen bei Haustieren, wie der Mastitis beim Vieh, eingesetzt werden.

Üblicherweise werden zwischen 50 und 6000 mg des erfindungsgemäßen Arzneimittels je Behandlungstag verabreicht, jedoch vorzugsweise zwischen 500 bis 3000 mg je Tag. Jedoch für eine Behandlung schwerer Körperinfektionen oder Infektionen eines besonders

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schwer beeinflußbaren Organismus können in Übereinstimmung mit der klinischen Praxis höhere Dosen verwendet werden.

Die genaue Form der Arzneimittel vorliegender Erfindung hängt in bestimmtem Haß von dem zu behandelnden Mikroorganismus ab. Für eine Behandlung von Infektionen werden die erfindungsgemäßen Arzneimittel üblicherweise so eingestellt, daß sie ein Maximum beim Blutspiegel von mindestens 0,1 pg/ml, noch.zweckmäßiger von mindestens 0,25 /Jg/ml und vorzugsweise von mindestens 1 ug/ml Clavulansäure hervorrufen.

Die Penicilline oder Cephalosporine in den synergistisch wirkenden Arzneimitteln vorliegender Erfindung sind üblicherweise bis zu oder bei annähernd einer üblicherweise verwendeten Menge vorhanden, wenn das betreffende Penicillin oder Cephalosporin .als einziges_/ bei der Behandlung der Infektion verwendetes therapeutisches Mittel vorliegt.

Besonders begünstigte Arzneimittel vorliegender Erfindung enthalten 150 bis 1000 mg Amoxycillin, Ampicillin oder eine deren Vorstufen und 50 bis 500 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbaren Ester, noch zweckmäßiger 200 bis 500 mg Amoxycillin, Ampicillin oder deren Vostufen und 50 bis 250 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbaren Ester.

Die Substanzen in derartigen Arzneimitteln können gegebenenfalls in hydratisierter Form vorliegen. Die Gewichte der Antibiotika in solchen Arzneimitteln wird auf der Grundlage des aus dem Arznei-

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mittel theoretisch verfügbaren Antibiotikums und nicht auf der Basis des Gewichts pro Arzneimittel ausgedrückt.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der Clavulansäure und deren Salze oder Ester, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm Streptomyces clavuligerus züchtet und aus dem Kulturmedium die Clavulansäure oder deren Salz gewinnt und gegebenenfalls, anschließend in an sich bekannter Weise die freie Säure, ein Salz oder einen Ester dieser Säure bildet.

Vorzugsweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren der Stamm Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 oder eine seiner, eine hohe Ausbeute liefernden Mutanten verwendet.

Der hier verwendete Ausdruck "züchten" bedeutet ein wohlerwogenes aerobes Wachstum eines Clavulansäure erzeugenden Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalzen. Dieses aerobe Wachstum kann auf einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Nährmedium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder mittels einer Submers-Kultur stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt oder chemisch definiert sein. Es wurde diesseits gefunden, daß Medien mit komplexen Nährstoffen, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, besonders geeignet sind.

Die Nährmedien, die zum Züchten von Streptomyces clavuligerus

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verwendet werden können, können 0,1 bis 10 Prozent einer komplexen organischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt., Maisquellwasser, pflanzliches Protein, Saatprotein, Hydrolysate derartiger Proteine, Milchprotein-Hydrolysate, Fisch- und Fleischextrakte und Hydrolysate derartiger Peptone/ Gegebenenfalls können chemisch definierte Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Amide, einzelne oder Gemische von gewöhnlichen Aminosäuren, z.B. Valin,, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Prolin und Phenylalanin, eingesetzt werden. Kohlenhydrate in einer Menge von 0,1 bis 5 Prozent . können in den Nährmedien vorliegen, doch ist Glukose in bestimmten Medien unerwünscht, da sie eine nachteilige Wirkung auf die Ausbeute der erwünschten Clavulansäure hat. Stärke oder Stärkehydrolysate, wie Dextrine, Saccharose, Lactose oder andere Zucker oder Glyzerin oder Glyzerinester können ebenfalls eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann sich auch von pflanzlichen Ölen oder tierischen Fetten ableiten. Carbonsäuren und ihre Salze können als Kohenstoffquelle für das Wachstum und die Erzeugung von ß-Lactamase-Hemmstoffen eingesetzt werden. Ein besonders geeignetes Medium, das preiswert ist, enthält Sojabohnenmehl, das unter dem Warenzeichen "Arkasoy" im Handel ist, zusammen mit Malzdestillat-Trockensaft, der unter dem Warenzeichen "Scotasol" im Handel ist, sowie Dextran.

Der Zusatz von Antischaummitteln, wie Polyoxyalkylenderivate von Propylenglykol, wie das unter dem Warenzeichen "Pluronic L8l" bekannte Produkt, können zur Steuerung des Schäumens von bestimmten Medien im Fermenter erforderlich sein.

Mineralsalze, wie NaCl, KCl, MgCl2, ZnCIg, FeCl-*,

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MgSOj, und Natrium- oder Kaliumsalze der Phosphorsäure können den vorgenannten Medien zugegeben werden, insbesondere wenn sie ehe misch definiert sind. CaCO-, kann als Quelle für Calciumionen oder zu Pufferungszwecken zugesetzt werden, Salze von Spurenelementen wie nickel, Kobalt öder Mangan, können ebenfalls mit eingesetzt werden. Vitamine kann man gegebenenfalls ebenfalls zusetzen.

Wenn hierin der Ausdruck "Mutante" verwendet wird, umfaßt er beliebige Mutanten, die sich spontan entwickeln oder durch Einwirkung eines äußerlichen Mittels entstehen, gleichgültig ob diedes Mittel absichtlich oder in anderer V/eise angewendet wird. Zweckmäßige Methoden zur Erzeugung von Mutantenstämmen sind von H.I. Adler in dem Kapitel "Techniques for the Development of Micro-Organisms" in dem Buch "Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro-Organisms", Proceedings of a Symposium, Wien 1973* S. 24l, International Atomic Energy Authority, beschrieben worden. Diese Techniken umfassen:

(1) Ionisierende Bestrahlung, wie ' Röntgen- oder V^-Strahlen, UV-Licht, UV-Licht plus ein fotoempfindliches Mittel (wie 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidin-Analoga (wie 5-Bromuracil), Acridine, alkylierende Mittel (wie Senfgas, Äthyl-methan-sulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Wärme, und

(2) genetische Techniken, wie Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisation, lysogenetische Konversion, und selektive Techniken für spontane Mutanten.

Das Züchten von Streptomyces clavuligerus findet normalerweise bei Temperaturen von 15 bis 4o°C, gewöhnlich 20 bis j55°C und

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vorzugsweise 25 bis J5O°C und bei einem pH-Wert von 5" bis 8,5, vorzugsweise von 6 bis 1,5, statt.

Der Stamm Streptomyces clavuligerus kann in den oben genannten Medien in belüfteten konischen Glasflaschen durch Schütteln auf einem Drehschüttler oder in mit Prallblechen ausgerüsteten und mit Scheibenkreiselmischern gerührten und mittels Zerstäubereinrichtungen belüfteten Züchtungsgefäßen aus rostfreiem Stahl gegezüchtet werden. Die Fermentation kann auch kontinuierlich durchgeführt werden.

Der Ausgangs-pH-Wert der Fermentation ist typischerweise 7,,Q₀ Die höchste Ausbeute" an Clavulansäure erhält man in 2 bis 10 Tagen bei einer Temperatur von 20 bis 35°C. In einem Rührzüchtungsgefäß aus rostfreiem Stahl unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Mediums mit Sojabohnenmehl, Malzdestillat-Trockensaft und Dextrin beträgt die bevorzugte Temperatur 26°C. Das Maximum an Clavulansäure wird innerhalb 5 Tagen erhalten.

Die Clavulansäure kann aus dem Filtrat der Nährbouillon auf die verschiedensten Weisen extrahiert werden. Die Lösungsmittel-Extraktion aus dem kalten, auf saure pH-Werte eingestellten Filtrat einerseits und die sich auf die anionische Natur des Stoffwechselprodukte beziehende Verfahren, wie die Verwendung von Anionenaustauscherharzen; andererseits haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Zellen des Streptomyces clavuligerus werden normalerweise zuerst aus dem Züchtungsmedium durch Abfiltrieren oder Zentrifugieren entfernt, bevor man mit der Extraktion beginnt.

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Beim Lösungsmittelextraktionsverfahren kühlt man das Filtrat der Nährbouillon und erniedrigt den pH-Wert auf einen Bereich von 2 bis 3 durch Zugabe von Säure, währenddessen das Filtrat gründlich mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel vermischt wird, wie n-Butylacetat, Methylisobutylketon, n-Butanol oder Äthylacetat. Die zur Herabsetzung des pH-Wertes des Mediums verwendete Säure ist gewöhnlich eine Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder dergleichen. n-Butanol ist ein besonders geeignetes Lösungsmittel zum Einsatz bei der Extraktion des angesäuerten Nährbouillon-Filtx'ats. Nach der Abtrennung der Phasen durch Zentrifugieren wird das die ß-Lactamase-inhibierende Stoffwechselprodukt aus dem Lösungsmittel in wässrigerBicarbonatlösung oder KaIiumhydrogenphosphat-Pufferlösung, Calciumcarbonat-Suspension oder Wasser rückextrahiert, währenddessen der pH-Wert annähernd neutral gehalten wird, z.B. bei pH 7,0. Dieser wässrige Extrakt nach der Trennung der Phasen kann unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet werden, um ein Rohprodukt eines Salzes der Clavulansäure zu erhalten. Dieses Rohprodukt ist stabil, wenn es im trockenen Zustand bei -20°C gelagert wird.

Bei dem Anionenaustauscherharz-Verfahren wird das geklärte Filtrat der Nährbouillon bei einem annähernd neutralen oder schwachsauren pH-Wert, z.B. bei pH 6 bis 7, an einer Säule mit einem schwach- oder stark basischen Anionenaustauscherharz, wie "Amber-Iite IR4B" oder "Zerolit FFIF", perkoliert, bis das Harz gesättigt ist und die ß-Lactamase-hemmende Substanz am Fuß der Säule austritt. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen und mit wässriger Natriumchloridlösung eluiert. Die ß-Lactamase-hemmenden Frakti-

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y 24 - -

onen werden gesammelt, vereinigt, entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält ein festes Rohsalz der Clavulansäure.

Eine Alternative des Extraktionsverfahrens besteht in einem in-Berührung-bringen d'es Filtrats der Nährbouillon - gewöhnlich bei annähernd neutralem pH-Wert - , das ein Salz der Clavulansäure enthält, mit einer organischen Phase, in der ein wasserunlösliches Amin gelöst ist. Beispiele geeigneter organischer Lösungsmittel sind die üblichen, mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Trichloräthylen und dergleichen. Beispiele geeigneter Amine sind sekundäre oder tertiäre Amine, in denen einer der Substituenten ein langkettiger aliphatischer Rest, z.B. mit 12 bis l6 Kohlenstoffatomen, und der andere Rest ein tertiärer Alkylrest ist, so daß das Molekül lipophil ist. Es ist festgestellt worden,, daß "Amberlite LA2" sich als erfolgreiches Amin erwiesen hat. Üblicherweise wird das Amin als Säureadditionssalz eingesetzt.

Nach diesem Extraktionsverfahren liegt die Clavulansäure in der organischen: Phase als Aminsalz vor. Die organische Phase wird dann von dem Piltrat der Nährbouillon abgetrennt. Die Clavulansäure kann in die wässrige Phase mittels einer Salzlösung, vorzugsweise einer konzentrierten Lösung von Natriumchlorid, Natriumnitrat oder dergleichen, zurückextrahiert werden. Das rohe Salz der Clavulansäure kann dann durch Gefriertrocknen oder dergleichen erhalten werden.

Weitere Grundverfahren zur Isolierung, die angewendet werden können, umfassen übliche Verfahren, wie die Adsorption an Aktiv-

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kohle, Ionenpaar-Extraktion, Ausfällen, Aussalzen und Molekularfiltration, doch sind diese Verfahren gewöhnlich nicht so erfolgreich wie die zuvor beschriebenen Verfahren , die deshalb bevorzugt sind.

Eine weitere Reinigung der festen, nach den vorgenannten Verfahren erhaltenen Salze kann mittels zahlreicher Methoden erreicht werden, doch ist die Ionenaustausch-Säulenchromatographie besonders geeignet, insbesondere unter Verwendung von "Isopor", "De-Acidite FFIP SRA64" oder "DEAE-Cellulose". Die "De-Acidite"-Säule wird nacheinander mit einer wässrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid, von O-bis 0,5-molar eluiert. Die Säule von "DEAE-Cellulose" in einer 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 wird mit einer Salzlösung, normalerweise einer Natriumchloridlösung von 0- bis 0,2-m Natriumchlorid in 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7> eluiert. Die aktiven Fraktionen können durch ihre ß-Lactamase-Hemmwirkung und ihre antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Klebsiella aerogenes beim Agardiffusionsvsrsuch festgestellt werden. Die die Masse dieser Aktivität enthaltenen Fraktionen werden dann vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt, von einem Clavulansäuresalz wird durch Perkolieren an einer Säule von "Biogel P2" entsalzt. Die aktive entsalzte Substanz wird dann eingeengt, mit Äthanol vermischt und nochmals an einer Cellulosesäule unter Verwendung eines Gemisches von Butanol, Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 1 : 5 in der oberen Phase als Lösungsmittel chromatographiert.

Die Fraktionen, die die Escherichia coli-ß-Lactamase inhibieren-

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de Substanz enthalten, werden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, in Wasser wieder aufgelöst und gefriergetrocknet. Man erhält das Salz der Clavulansäure als weißen Feststoff.

Die Verfahren, die erfindungsgemäße bei der Feststellung der Clavulansäure in den Filtraten der Nährbouillon am besten geeignet sind, sind die Papierchromatographie und das bioautographische Bestimmungssystem. Die Clavulansäure kann dadurch geprüft werden, daß von ihrer ß-Lactamase-Hemmwirkung Gebrauch gemacht wird. Die Dünnschicht-Chromatographie kann angewendet werden, um die Clavulansäure in festen Zubereitungen festzustellen. Diese Bestimmungs- und Versuchsverfahren werden nachstehend beschrieben.

Eine Abwandlung des Verfahrens zur Herstellung der reinen Clavulansäure oder ihrer Salze besteht in der Isolierung einer unreinen Clavulansäure oder ihres Salzes, Herstellen eines Esters der Clavulansäure in üblicher Weise, Reinigen des Esters und anschliessendes Wiedergewinnen der Clavulansäure oder deren Salz aus dem Ester.

Die bei diesem Verfahren verwendete verunreinigte Clavulansäure oder ihr Salz enthält üblicherweise mindestens 1 Gewichtsprozent des Antibiotikums.

Geeignete Ester zur Verwendung bei diesem Verfahren sind solche, die durch Hydrogenolyse, durch enzymatische Methoden oder durch eine Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen gespalten werden können.

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251731α ₂₇ _

Eine geeignete Gruppe von bei diesem Verfahren verwendeten Estern besitzt die nachstehende Formel X:

CH₂OH

^CO-O-CH-Av

in der A ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe ist und Ao eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe bedeutet.

Am zweckmäßigsten ist A₇ ein Wasserstoffatom oder die Phenyl-, ToIyI-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe und Ao die Phenyl-, Tolyl-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe.

Vorzugsweise ist A₇. ein Wasserstoff atom und Ag die Phenylgruppe.

Die Ester der allgemeine Formel X können durch Hydrogenolyse gespalten werden, wodurch man die Clavulansäure oder ihr Salz erhält.

Andere Gruppen von Estern, die bei diesem Verfahren verwendet werden können, besitzen die vorstehend beschriebenen allgemeinen Formeln V und VI. Derartige Ester können in Salze der Clavulansäure mittels milder alkalischer Hydrolyse, z.B. bei pH 7,5, umgewandelt werden.

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Die verunreinigte Form der Clavulansäure oder deren Salz, die nach diesem Verfahren gereinigt werden muß, kann in Form eines Feststoffes oder einer Lösung vorliegen, und zwar gewöhnlich auch mit einem Gehalt von beträchtlichen Mengen anorganischer oder organischer Verunreinigungen.

Die Clavulansäure oder deren Salz kann in einen Ester durch die nachstehend beschriebenen Veresterungsreaktionen umgewandelt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Bildung eines erwünschten Esters der Clavulansäure besteht in der Reaktion eines Salzes der Clavulansäure mit einem Veresterungsmittel, wie einem reaktionsfähigen Halogenid, einem Sulfonatester oder dergleichen, wie nachstehend beschrieben wird. Derartige Reaktionen werden häufig in einem organischen Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstanten durchgeführt, wie Dimethylformamid, einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton, in Dirnethylsulfoxid·, N-Methylacetamid, Hexamethylphosphoramid und dergleichen.

Gegebenenfalls kann das Salz der Clavulansäure in üblicher Weise in dem Lösungsmittel gelöst oder es kann an ein polymeres Trägermaterial gebunden werden. Geeignete Trägermaterialien zur Verwendung bei diesem Verfahren umfassen stark basische Anionenaustauscherharze, insbesondere solche von mal^roretikularer Natur, die die Anwendung von nicht-wässrigen Lösungsmittelsystemen gestatten. Es ist gefunden worden, daß für diesen Zweck "Amberblyst A26" geeignet ist. Das Clavulansäuresalz kann an das Harz aus dem FiI-trat der Nährlösung adsorbiert werden. Danach kann das Harz in Dimethylformamid mit einem Gehalt an Natriumjodid suspendiert oder gegebenenfalls in der Säule mit einer Lösung von Natriumjodid

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in Dimethylformamid oder in einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton eluiert werden.

Einmal gebildet, wird der verunreinigte Ester der Clavulansäure chromatographisch gereinigt. Bei derartigen Verfahrensschritten wird der Ester üblicherweise in einem organischen Lösungsmittel gelöst, wie Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Cyclohexan oder ähnlichen Lösungsmitteln. Die bei dem chromatographischen Verfahren verwendete feste Phase ist normalerweise eine inerte Substanz, wie Silikagel oder ähnliche, für chromatographische Zwecke geeignete Substanzen.

Die aus der Säule austretenden Fraktionen können hinsichtlich des Vorliegens von Clavulansäure untersucht werden, indem von synergistischen Eigenschaften Gebrauch gemacht wird. Normalerweise vereinigt man die aktiven Fraktionen und dampft das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab.'

Der bei diesem Verfahren erhaltene Ester weist gewöhnlich eine annehmbare Reinheit auf, doch kann die Substanz gegebenenfalls nochmals chromatographiert werden. - "

Der gereinigte Ester der Clavulansäure kann in Clavulansäure oder deren Salz nach dem vorherbeschriebenen Verfahren umgewandelt werden.

Ein besonders zweckmäßiges Verfahren, um Clavulansäure oder deren Salz zu erhalten, ist die Hydrierung einer Verbindung der allgemeinen Formel X, wie es zuvor beschrieben worden ist. Derartige

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Reaktionen finden üblicherweise in Gegenwart eines Katalysators eines Übergangsraetails unter Anwendung von niedrigen oder mittleren Wasserstoffdrücken statt. Die Reaktion kann bei erhöhten, normalen oder erniedrigten Temperaturen, z.B. bei 0 bis 100⁰C, ' durchgeführt werden; Besonders zweckmäßige Reaktionsbedingungen für derartige Hydrierungen verwenden einen geringen Überdruck an Wasserstoff bei annähernd Raumtemperatur von 12 bis 20⁰C. Die Reaktion kann in üblichen Lösungsmitteln, wie niederen Alkanolen, z.B. Äthanol, durchgeführt werden. Es ist gefunden worden, daß ein besonders zweckmäßiger Katalysator Palladium auf Holzkohle ist.

Falls die Hydrierung in Gegenwart einer Base durchgeführt wird, bildet sich ein Salz der Clavulansäure, z.B. das Natrium- oder Kaliumsalz, wenn die Reaktion in Gegenwart von Natrium- oder Kaliumbicarbonat durchgeführt-wird.

Die Clavulansäure oder deren Salze aus derartigen Reaktionen sind im allgemeinen von guter Reinheit.

Ester von Clavulansäure können durch Veresterung der Clavulansäure oder deren Salz durch übliche Verfahren hergestellt werden.

Zweckmäßige Verfahren einer Esterbildung sind

(a) die Umsetzung eines Salzes der Clavulansäure mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Q-R, in der Q eine leicht ersetzbare Gruppe und R ein organischer Rest istj

(b) die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan und

(c) die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Alkohol der

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251731Θ_₃₁_

allgemeinen Formel ROH in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels, wie einem Carbodiimid oder dergleichen.

Geeignete Salze der-Clavulansäure, die mit Verbindungen R-Q reagieren können, sind Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder andere übliche Salze, wie das Silbersalz.

Geeignete Reste Q schließen solche Atome oder Gruppen ein, die in bekannter Weise durch Carbonsäureanionen ersetzbar sind. Es handelt sich um Chlor-, Brom- und Jodatome, Sulfonsäureester, wie die -O-SCUCH·,- oder die -Q-SOpCgHhCEU-Gruppen, um aktive Estergruppen, wie die -0-CO-H-oder -O-CO-CF^-Gruppen und andere übliche, durch nukleophile Reste ersetzbare Gruppen.

Die vorstehende Reaktion wird normalerweise in einem organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismäßig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Dimethylformamid, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran oder dergleichen, und bei einer nicht außergewöhnlichen Temperatur, wie von -5 bis 100⁰C, im allgemeinen bei-t5 bis 50⁰C, z.B. bei Raumtemperatur, durchgeführt.

Die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan ist ein mildes Verfahren zur Herstellung von Alkyl-, Aralkyl- oder ähnlichen Estern.Die Diazotierung kann unter üblichen Reaktionsbedingungen erfolgen, z.B. bei einer nicht extremen Temperatur und in einem üblichen Lösungsmittel. Derartige Reaktionen werden üblicherweise bei Temperaturen von -5 bis 100⁰C, gewöhnlich bei 5 bis 30⁰C, z.B. bei Raumtemperatur/ durchgeführt. Geeignete Lösungs-

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. 2517318 .32-

mittel für diese Reaktion sind niedere Alkanole, wie Methanol und Äthanol, und Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen. Äthanol hat sich als besonders zweckmäßiges Lösungsmittel bei dieser Reaktion erwiesen.

Die Reaktion der Clavulansäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels findet normaler-*- weise in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismäßig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Acetonitril, statt. Die Reaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur oder bei erniedrigter Temperatur, z.B. bei -10 bis 22°C, gewöhnlich bei -5 bis l8°C, z.B. anfänglich bei 0⁰C und danach allmählich unter Erwärmen bis zu 15°C, durc" ührt. Die verwendeten, die Kondensation beschleunigenden Mittel sind üblicherweise solche, die Wasser aus dem Reaktionsgemisch entfernen. Beispiele geeigneter Mittel sind Carbodiimide, Carbodiimidazole oder äquivalente Reagentien. Dicyclohexylcarbodiimid hat sich als die Kondensation beschleunigendes Mittel zur Anwendung bei diesem Verfahren als besonders zweckmäßig erwiesen. Um eine Selbstkondensation der Clavulansäure weitgehend zu unterdrücken, wird die Reaktion gewöhnlich in Gegenwart eines beträchtlichen Überschusses an Alkohol durchgeführt.

Andere geeignete Verfahren zur Bildung eines Esters sind ein Abspalten von Kohlendioxid aus einer Verbindung der allgemeinen Formel XI

(XI)

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in der R ein inerter organischer Rest ist; und

(e) die Umsetzung einer Verbindung der allgemeinen Formel XI mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH (oder weniger begünstigt mit einem Thiol der allgemeinen Formel RSH).

Kohlendioxid kann aus einer Verbindung der allgemeinen Formel XI spontan während ihrer Herstellung oder gegebenenfalls durch Erhitzen einer Verbindung der allgemeinen Formel XI in einem inerten Lösungsmittel abgespalten werden. Geeignete inerte Lösungsmittel sind Äther, wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen. In zahlreichen Fällen zersetzt sich eine Verbindung der allgemeinen Formel XI spontan sogar bei niedrigen Temperaturen, z.B. bei -5°C, um einen Ester der allgemeinen Formel

αν-

CO₂R⁴

h
zu liefern, in der R ein inerter Rest innerhalb der Definition

von R ist.

Wenn eine Verbindung der allgemeinen Formel XI mit einem Alkohol (oder weniger begünstigt mit einem Thiol) umgesetzt werden muß, dann wird die Reaktion üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel, wie einem Äther, in Gegenwart überschüssigen Alkohols (oder Thiols) durchgeführt, um die Selbstkondensation des Clavulansäure". Derivats zu verhindern.

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2517318 _-

Die Veresterungsverfahren sind im allgemeinen nicht so bevorzugt wie jene, die die Reaktion eines Salzes der Clavulansäure mit einer zuvor beschriebenen Verbindung R=Cl betreffen.

Eine Verbindung der.allgemeinen Formel XI kann durch die Umsetzung

4 eines Salzes der Clavulansäure mit einer Verbindung Cl-CO-O-R oder einer chemisch äquivalenten Verbindung davon hergestellt wer= den „ Üblicherweise wird diese Reaktion bei erniedrigter Temperatur, z.B. bei einer Temperatur nicht über 5°C, in einem inerten Lösungsmittel, z.B. Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan oder dergleichen,, durchgeführt. Am zweckmäßigsten ist das bei dieser Reaktion verwendete Salz der Clavulansäure ein lipophiles SaIs₅ so daß es sich in dem Lösungsmittel löst_a obwohl gegebenenfalls das weniger begünstigte Natriumsalz eingesetzt werden kann, indem es in dem Reaktionsmedium suspendiert wird.

Beschreibung 1

Zur Bestimmung der Clavulansäure geeigneter Versuch Grundlagen des Versuchs

Lösungen mit einem Gehalt an Clavulansäure (Filtrat der Nährbouillon, Proben aus einem Isolierungsverfahren oder dergleichen) werden 15 Minuten mit einem ß-Laetamase-Präparat bei 37⁰C in einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 bebrütet. Währenddessen tritt eine Enzymhemmung oder eine Inaktivierung auf_β Dann wird ein Substrat (Benzylpenicillin) zugegeben und das Bebrüten bei 37°C 30 Minuten fortgesetzt. Die Menge des enzymatischen Ab= baus des Substrats zu Penicillansäure wird mittels des HydroxyI-

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amin-Versuchs für Penicillin bestimmt. Die Menge der verwendeten ß-Lactamase errechnet sich aus einer 75prozentigen Hydrolyse des Benzylpenicillins in 30 Minuten bei 37°C.

Das Ausmaß der Hydrolyse ist der Einfluß der Menge des ungehemmt verbleibenden Enzyms. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in Prozent Hemmung der Enzymaktivität durch eine gegebene Verdünnung der Clavulansäure enthaltenden Lösung (z.B. des Filtrats der Nährbouillon) oder durch die Konzentration der Clavulansäure in ug/ml bei gegebener 50prozentigen Hemmung des Enzyms unter den vorstehend genannten Bedingungen (Ic₀).

ß-Lactamase-Enzym

Es wird die mittels Escherichia coil JT4 erzeugte ß-Lactamase als Enzym verwendet. Diese Züchtung ist ein Ampicillin-resistenter Stamm und verdankt seine Resistenz einer Erzeugung der den R-Faktor steuernden ß-Lactamase. Gegebenenfalls können ähnliche den R-Faktor steuernde ß-Lactamasen verwendet werden.

Die auf einem Schrägagar gehaltene Züchtung wird in einem 400 ml sterilen Trypton-Medium bebrütet, das in einer konischen Flasche von 2 Liter Inhalt enthalten ist. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung: 32 g/Liter Trypton, 20 g/Liter Hefeextrakt,

5 g/Liter Natriumchlorid und 2,2 g/Liter Calciumchlorid mit

6 Mol Hydratwasser. Der pH-Endwert wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,4 eingestellt. Die Flasche wird 20 Stunden auf einem Drehschüttler mit 240 UpM bei 25°C geschüttelt.

Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt,

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mit 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewaschen (nochmals suspendiert und zentrifugiert) und dann in Wasser nochmals suspendiert, wodurch man eine 25fache Zellkonzentration in dem Kulturmedium erhält. Diese Zellsuspension wird dann bei 4°C in einem MSE-Ultraschall-Disintegrator zertrümmert. Die Zellbruchstücke werden durch Zentrifugieren entfernt, und aliquote Anteile der überstehenden Lösung werden im tiefgefrorenen Zustand gelagert. . Zur Verwendung bei dem Versuchsverfahren wird das Überstehende mit einer 0,005-m Phosphatpufferlösung verdünnt, bis man eine etwa 75prozentige Hydrolyse einer 1 mg/ml enthaltenden Lösung von Benzylpenicillin in JO Minuten bei 37°C erhält.

Versuchsverfahren

Geeignete Verdünnungen des Hemmpräparats und der ß-Lactamase-Lösung werden vermischt und 15 Minuten bei 37⁰C bebrütet (Test). Ein Kontrollversuch mit einer Pufferlösung anstelle des Inhibitorpräparats wird ebenfalls bebrütet. Dann wird eine Benzylpenicillin-Lösung (Substrat) zu dem Test- und dem Kontrollgemisch gegeben. Dann wird die Bebrütung weitere 30 Minuten bei 37⁰C fortgesetzt. Es wird dann das restliche Benzylpenicillin in jedem Gemisch unter Verwendung des Hydroxylaminversuchs bestimmt, wie er beschrieben ist von E ,cnelor und Mitarbeitern in Proc.Roy." Soc. B 154 (1961), S. 498, Zu allen Tests werden β ml Hydroxylamin-Reagens zugegeben. Die Kontrollversuche und die Versuche mit den reinen Substanzen läßt man 10 Minuten- bei Raumtemperatur reagieren, bevor man 2 ml eines Eisen(III)-aramoniumsulfat-Reagens zusetzt. Die Absorption der Endlösungen wird in einem E.E.L.-Colorimeter oder in einem Spekfcrophotometer bei 490 nsi gegenüber dem reinen Reagens gemessen. Die" Zusammensetsungeri der Reaktions--

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lösungen, der Testlösungen und der reinen Substanzen vor dem Hydroxylamin-Versuch sind wie folgt.

Bestandteile (alle gelöst in oder verdünnt mit 0,005-ni Phosphatpuffer vom pH 7)	reines Benzyl- Test peni cillin, ml	Kontroll versuch, ml	reines Reagens, ml
Escherichia coli- 3-Lactamase-Lösung	1,9 o,o	1,9	1,9
Inhibitor	0,1 0,0	0,0	0,0
Benzylpenicillin 5 mg/ml	0,5 0,5	0,5	0,0
0,005-m Phosphatpuffer vom pH 7	0,0 2,0	0,1	0,6

Berechnung der Ergebnisse

Die prozentuale Hemmung der 3-Lactamase wird wie folgt berechnet;

Absorption des reinen Benzylpenicillins minus Absorption der Kontrollösung (nicht gehemmte Reaktion) = χ

Absorption der Testlösung (gehemmte Reaktionslösung) minus Absorption der Kontrolllösung (nicht gehemmte Reaktion) = y

Hemmung in % = — χ 100

Um den Ι,-Λ-Wert zu erhalten, wird das Hemmpräparat verdünnt, bis eine 50prozentige Hemmung der ß-Lactamase-Inaktivierung des Benzy!penicillins bei dem vorgenannten Verfahren erhalten wird.

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Beschreibung 2

Papierchromatographische Bestimmung der Clavulansäure

Das Filtrat der Nährbouillon und eine Bezugslösung der Clavulansäure (250 ug/ml eines teilweise gereinigten Präparats) werden auf 1 cm breite Papierstreifen (Whatman No. l)(20 uLiter der Ausgangslösung) getüpfelt, Die Chromatogramme laufen bei absteigender Chromatographie 16 Stunden bei 5⁰C unter Verwendung eines Gemisches von n-3utanol/lsopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 als Lösungsmittel. Die Streifen werden bei 4o°C getrocknet und auf Agarplatten ausgelegt, die 6 ug/ml Benzylpenicillin enthalten und dann mit einem ß-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsieila aerogenes (synergistisches System) beimpft«. Die Platten werden über Nacht bei 30⁰C bebrütet, und die Clavulansäure zeigt sich als Zone eines gehemmten Wachstums» Der PU-Wert der Zone ist 0,46. Die Menge von 6 ug/ml Benzylpenicillin allein liegt unterhalb der erforderlichen Konzentration, um Klebsieila aerogenes abzutöten, Jedoch in Gegenwart eines ß-Lactamase-Hemmstoffes wird diese Konzentration toxisch, was hinsichtlich des Synergismus zu sagen ist.

Die Verwendung des vorgenannten synergistischen Systems ermöglicht die Feststellung der Clavulansäure bei Konzentrationen unterhalb denjenigen, bei denen sie eine antibakterielle Wirksamkeit zeigt.

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Beschreibung 3 Dünnschicht-Chromatograph!sehe Bestimmung des Natriumsalzes

der Clavulansäure

Lösungen von Präparaten des Natriumsalzes der Clavulansäure werden auf Glasplatten, die mit einer 0,25 mm dicken Schicht von Silikagel (F25^) beschichtet sind, in einer Menge von 5 pLiter von 1 mg/ml getüpfelt. Die Chromatogramme laufen bei 22°C unter Verwendung einer oberen Phase eines Gemisches von n-Butanol/Äthanol/-Wasser im Volumenverhältnis von 4:1:5. Die Chromatogrammplatten werden bei 4o°C getrocknet. Das Natriumsalz der Clavulansäure wird durch Bioautographie auf Agarplatten mit einem Gehalt von 6 ug/ml Benzylpenicillin angeordnet und mit Klebsiella aerogenes beimpft (synergistisches System wie bei der vorstehend besprochenen Papierchromatographie). Die Agaroberfläche wird mit einem feinen Filtertuch abgedeckt, bevor die Dünnschicht-Chromatographieplatte darübergelegt wird. Nach 15-bis 30minütigem Ruhenlassen zum Befeuchten und Diffundieren wird die Dünnschicht-Chromatographieplatte mit Hilfe des Filtertuches abgehoben und die Agarplatte über Nacht bei 50⁰C bebrütet, um die Zonen eines gehemmten Wachstums aufzuzeigen. Der R^-Wertetes Natriumsalzes der Clavulansäure in dem vorgenannten Lösungsmittel beträgt annähernd 0,5?. Zwei sprühbare Reagent!en, nämlich Ehrlich'sches Reagens und Triphenyltetrazolium-chlorid, werden ebenfalls verwendet, um die Zone des Natriumsalzes der Clavulansäure aufzuzeigen. Das erstgenannte Reagens besteht aus 300 mg p-Dimethylaminobenzaldehyd, das in 9 ml Äthanol, 54 ml n-Butanol und 9 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst ist. Beim 1- bis 2minütigen Erhitzen der besprühten Dünnschicht-ChrOmatographieplatte auf 120°C er-

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- 4ο -

scheint das Natriumsalz der Clavulansäure als rosaroter Flecken. Das Triphenyltetrazolium-chlorid-Reagens besteht aus einem Gemisch von 1 Volumenteil einer 4prozentigen Lösung dieser "Verbindung in Methanol und 1 Volumenteil methanolischer Natronlauge. Nach dem Aufsprühen werden die Dünnschicht-Chromatographieplatten auf 8o°C erhitzt. Das Natriumsalz der Clavulansäure erscheint als roter Punkt auf weißem Untergrund.

Beispiel 1 Züchten von Streptomyees clavuligerus

Streptomyces clavuligerus wird bei 26°C und einem pH-V/ert von 6,8 auf einem Schrägagar gezüchtet, der 1 Prozent Hefeextrakt, 1 Prozent Glukose und 2 Prozent "Oxoid"-Agar Nr. 3? enthält. Es wird eine sterile öse verwendet, um das Mycel und die Sporen vom Schrägagar in 100 ml einer Nährbouillon in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben zu überführen. Die Nährbouillon hat die folgende Zusammensetzung:

Malzextrakt 10 g/Liter

Bakteriologisches Pepton 10 g/Liter

Glyzerin 20 g/Liter

Leitungswasser ad 1 Liter

Die Nährbouillon wird mittels Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7*0 eingestellt. Dann werden jeweils 100 ml in Flaschen verteilt, die mit Schaumstöpseln verschlossen werden, bevor sie 20 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm im Autoklaven behandelt werden. Die beimpfte Flasche wird 5 Tage bei 26°C auf einem Drehschüttler mit 5 cm Ausschlag..und einer Geschwindigkeit

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- 4i -

von 200 UpM geschüttelt. Die Flaschen der Produktionsstufe, die die vorgenannte Nährbouillon enthalten, werden mit 5 Prozent eines vegetativen Impfstoffes geimpft und unter den gleichen Bedingungen wie bei der Anzuchtflasche wachsen gelassen. Die proben des Piltrats der Nährbouillon werden auf die Hemmwirkung gegenüber der ß-Lactamase von Escherichia coli JT4 geprüft. Die höchste Aktivität wird nach 3 Tagen erhalten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I angegeben. Man sieht eine Zone der Clavulansäure beim Rp-Wert von 0,46, wenn das Filtrat der Nährbouillon nach dem zuvor beschriebenen papierchrcmatographischen Verfahren geprüft wird. Eine Vergrößerung der Zone verläuft parallel mit einer Erhöhung beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Streptomyces clavuligerus wird auch in 2 Liter fassenden Schüttelflaschen mit einem Gehalt von 400 ml des Mediums (der Produktionsstufe) unter Verwendung des gleichen Mediums und der gleichen Züchtungsbedingungen, wie sie zuvor in diesem Beispiel beschrieben sind, gezüchtet. Bei diesen größeren Gefäßen verläuft das Wachstum des Organismus langsamer, und die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung wird 7 bis 9 Tage nach der Beimpfung mit dem vegetativen Impfstoff erreicht. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I angegeben.

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Tabelle I

ß-Lactamase-Hemmwirkung von in 500 ml- und 2000 ml· Flaschen gezüchtetem Streptomyces clavuligerus

Permentations- zeit, Tage	prozentuale Hemmung der Escherichla ' coli-ß-Lactamase bei einer Endver dünnung von 1/2500 des Kulturfiltrats	2000 ml-Schüttel- flasche
1 2 3 4 5 6 7 • 8 9	500 ml-Schüttel- flasche	10 21 36 · 51 53 50
15 30 55 50 51 • 57

Beispiel 2 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Eine Anzuchtflasche, wie sie in Beispiel 1 zubereitet worden ist, wird zur Beimpfung von konischen 500 ml-Flaschen verwendet, die 100 ml aliquote Anteile der nachstehenden Nährbouillon in entsalztem V/asser enthalten:

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Lösliche Stärke 2 Gewichtsprozent

Glyzerin 0,3 Gewichtsprozent

Malzdestillat-Trockensaft 0,1 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

FeSO^·7HpO 0,01 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird 20 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm in einem Autoklaven sterilisiert und durch Zugabe von 5 Prozent der vegetativen Anzuchtstufe beimpft. Die Flaschen werden wie in Beispiel 1 bei 26°C auf einem Drehschüttler geschüttelt. Der
höchste Gehalt an Clavulansäure wird zwischen 3 und 5 Tagen erreicht. Eine Verdünnung von 1/2500 der Nährbouillon ergibt eine 60prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch. Es wird eine Zone der Clavulansäure bei einem R~-Wert von 0,46 gesehen, wenn man das vorstehend beschriebene papierchromatographische (bioautographisehe) Verfahren anwendet. Diese Zone vergrößert sich
parallel mit einem Anstieg der Aktivität beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 3 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Es wird eine Anzuchtflasche, wie sie in Beispiel 1 zubereitet
worden ist, zur Beimpfung von konischen 500 ml-Flaschen verwendet, die 100 ml aliquote Anteile der nachstehenden Nährbouillon enthalten, die mit entsalztem Wasser hergestellt und wie zuvor
beschrieben sterilisiert worden ist. Die Impfstoffmenge beträgt 5 Prozent.

509843/0933

Dextrin 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

Malzdestillat-Trockensaft 0,1 Gewichtsprozent

PeSO^.7HpO 0,01 Gewichtsprozent

Die beimpften Flaschen werden bei 26⁰C geschüttelt. Die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung wird zwischen j5 und 5 Tagen erreicht. Die Aktivität war gleich der in Beispiel 2 erreichten.

Beispiel4 Bebrütung von Streptomyces clavuligerus

Die wie in Beispiel 1 beschriebene Anzucht wird zur Beimpfung von konischen 500 ml-Flaschen verwendet, die die nachstehende Nährbouillon in entsalztem Wasser enthalten:

Dextrose 1 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

Malzdestillat-Trockensaft 0,05 Gewichtsprozent

CaCO^ 1 Gewichtsprozent

Diese Flaschen werden genauso wie in den vorstehenden Beispielen behandelt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung wird zwischen j5 und 5 Tagen erreicht. Das Filtrat der Nährbouillon bei einer Endverdünnung von 1/2500 ergibt eine 55- bis 45prozentige Hemmung bei dem ß-Lactamase-Hemmversuch.

509843/093 3

Beispiel 5

Züchtung von Streptomyces clavullgerus

Die der Clavulansäure zuzuschreibende ß-Lactamase-Hemmwirkung wird unter Verwendung der nachstehenden Mährbouillon mit identischen Anzucht- und Züchtungsbedingungen wie in Beispiel 1 erzeugt,

Glyzerin 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent

MgSO^ 0,1 Gewichtsprozent

KpHPOj, 0,1 Gewichtsprozent

Die Kährbouillon wird in entsalztem Wasser hergestellt.

Die ß-Lactamase-Hemmwirkung erreicht den Höchstwert bei 3 bis Tagen und liegt in der gleichen Größenordnung wie die des Beispiels 4.

Beispiel 6 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Die folgende Nährbouillon erzeugt Clavulansäure, wenn die Bedingungen und die vegetative Anzucht wie in Beispiel 1 beschrieben angewendet werden,

Glukose 2 Prozent

Lab 1 Prozent

Hefeextrakt 0,3 Prozent

CaCO^ 0,3 Prozent

Die Nährbouillon wird in entsalztem Wasser hergestellt.

5 0984370933

Die höchsten Werte werden in 3 bis 5 Tagen erreicht. Eine l/2500-Verdünnung des Piltrats der Nährbouillon ergibt eine 35-bis 45prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 7 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Wie in den Beispielen 4, 5 und β ruft die nachstehende Nährbouillon eine 35- bis 45prozentige Hemmung (1/25ΟΟ-Verdünnung) beim ß-Lactamase-Hemmversuch bei einer Höchstmenge hervor, die 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung erreicht wird. Alle Bedingungen sind bereits vorher beschrieben.

Glukose ' 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

CaCCU 0,02 Gewichtsprozent

.CoCIp.6HpO 0,0001 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird mit entsalztem Wasser hergestellt.

Beispiel 8 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Die nachstehende Produktions-Nährbouillon liefert, wenn sie unter den wie in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen normalen Züchtungsbedingungen angewendet wird, eine 20- bis 30prozentige Hemmung bei einer 1 j2500-Verdünnung beim ß-Lactamase-Versuch, wobei die Höchstmenge an Clavulansäure 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung erreicht wird. Unter Anwendung des zuvor beschriebenen papierchromatographischen Verfahrens wird eine Clavulansäurezone bei einem R--Wert von 0,46 gesehen, wenn das Piltrat der Nähr-

509843/0 933

bouillon geprüft wird.

Malzdestillat-Trockensaft 2 Prozent

Hefeextrakt 1 Prozent

Die Nährbouillon wird mit
Leitungswasser zubereitet·

pH-Endwert 7,0

Beispiel 9
Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Unter Standard-Züchtungsbedingungen erzeugt die nachstehende Nährbouillon Clavulansäure innerhalb j5 bis 5 Tagen nach dem Beimpfen mit der vegetativen Anzucht. Eine Verdünnung von 1 j2500 der Züchtung liefert eine 20- bis ^Oprozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

	g/Liter
Glycerin	15
Saccharose	20
Prolin	2,5
Mononatrium-glutamat	1,5
NaCl	5,0
K2HPO4	2,0
CaCl2	0,4
MnCl2.4H2O	0,1
FeC1^.6Ho0	0,1
ZnCl2	0,05
MgSO4.7H2O	1,0
Die Nährbouillon wird mit	entsalztem Wasser hergestellt:
pH-Endwert 7,1

509843/093 3

Beispiel 10
Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Es wird ein Hefeextrakt-Glukose-Nähragar zur Beimpfung eines Hefeextrakt-Glukose-Schrägagars. in einer Röux-Flasche verwendet, indem man eine Suspension des Mycels und der Sporen in sterilem Wasser herstellt. Die schrägliegende Roux-Flasche wird 10 Tage bei 26⁰C bebrütet. Zu diesem Schrägagar werden 100 ml steriles Wasser zugefügt und eine Mycel-Suspension hergestellt. Diese wird zur Beimpfung von 50 Liter eines dampf'sterilisierten Anzuchtmediums der folgenden Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet:

Malzextrakt 1 Gewichtsprozent

bakteriologisches Pepton 1 Gewichtsprozent Glycerin 1 Gewichtsprozent

lOprozentiges Antischaummittel

("Pruronic L81") in Sojabohnen-

öl 0,05 Gewichtsprozent

Die Nährboulllon wird in einen 90' Liter fassenden, mit Prallblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben und mittels eines Schreibenkreiselmischers mit 12,7 cm Leitschaufeln bei 24o UpM gerührt. ..Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter/Min, zugeführt und ₍das Gefäß bei 26⁰C bebrütet.

Nach 72 Stunden wird der Anzuchtfermenter zur Beimpfung von 150 Litern der gleichen Nährbouillon unter Verwendung eines 5volumenprozentigen Zusatzmittels einer sterilen Überführung verwendet. Diese Produktions-Nährbouillon wird in einem 500 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der mittels eines Scheibenkreiselmischers mit 21,6 cm' Leitschaufeln bei 210 UpM gerührt wird. Es wird sterile Luft mit

5 0 9 8 4 3/0933

einer Geschwindigkeit von 150 Liter/Min, zugeführt. Die Fermentation wird bei g6°C gehalten. Gegebenenfalls wird ein Antischaummittel in 10 ml-Schüben zugegeben. In regelmäßigen Abständen werden zum ß-Lactamase-Hemmversuch Proben entnommen. Nach 4 bis 5
Tagen hat der Fermenter das Maximum an einer ß-Lactamase-Hernmwirkung erreicht, wie aus Tabelle II hervorgeht.

Tabelle II

ß-Lactamase-Hemmwirkung von Proben eines aus einem
300 Liter-Fermentationsgefäßes von Streptomyces clavuligerus entnommenen Kulturfiltrats

Fermentations- zeit, Tage	prozentuale Hemmung beim ß-Iactamase-Hemm- versuch bei einer Endverdünnung von 1/2500
1,0	12
1,5	20
2,0	31
2,5	36
3,0	50
3,5	54
4,0	51
4,5	56
5,0	55

Beispiel 11 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Es wird ein Anzucht-Fermenter unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 10 beschrieben sind, und unter Verwendung der gleichen Nährbouillon betrieben.

Nach 72 Stunden wird der Anzucht-Ferrnenter zur Lieferung eines

50984 37 0933

5volumenprozentigen vegetativen Impfstoffes in einen 300 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem' Stahl mit einem Gehalt an 150 Liter einer dampfsterilisierten Nährbouillon verwendet, die bei 210 UpM mittels eines mit 21,6 cm großen Leitschaufeln versehenen Scheibenkreiselmischers gerührt wird. Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter/Min, zugeführt. Die Fermentation wird bei 26⁰C gehalten. Gegebenenfalls wird in Schüben von 10 ml ein Antischaummittel zugegeben.

Die in der Herstellungsstufe verwendete Nährbouillon entspricht der in Beispiel 3 beschriebenen mit einem Zusatz von 0,05 Volumenprozent des in Beispiel 10 genannten Antischaummittels vor der Sterilisation.

Die ß-Lactamase-Hemmwirkung der Fermentationsproben entspricht der des Beispiels 10 (vgl. Tabelle II). Die papierchromatographische Untersuchung zeigt eine Clavulansäurezone beim R--Wert von 0,46 unter Anwendung der zuvor beschriebenen bioautographischen (synergistischen) Methode. Die Größe der Clavulansäurezone wächst mit einem Anstieg beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 12 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

100 ml steriles Wasser werden zu einem Sporenmedium gegeben, das auf einem Bennetts-Agar in einer Roux-Flasche 10 Tage bei 26⁰C gewachsen ist. Es wird eine Mycel-Sporen-Suspension erzeugt und zum Beimpfen von 75 Litern einer dampfsterilisierten Nährbouillon der folgenden Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet:

509843/09 33 /.

Dextrin 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenrnehl 1 Gewichtsprozent

das in Beispiel 10 genannte

Antischaummittel 0,05 Volumenprozent

Der pH-Wert der Nährbouillon wird auf 7>0 eingestellt

Die Nährbouillon wird in einem 100 Liter fassenden, mit Leitblechen versehenen Permenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der bei

mit
140 UpM mittels eines^Y19 cm großen Leitschaufeln versehenen Scheibenkreiselmischers gerührt wird. Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 75 Liter/Min, zugeführt. Das Gefäß wird 72 Stunden bei 26°C bebrütet.

Der Inhalt des Anzucht-Fermenters wird zur Beimpfung von 15OO Litern einer dampfsterilisierten Nährbouillon der nachstehenden Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet:

Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent

Glycerin 1,0 Gewichtsprozent

PO^ 0,1 Gewichtsprozent

das in Beispiel 10 genannte

Antischaummittel -0,2 Volumenprozent

Der pH-Wert der Nährbouillon wird auf 7,0 eingestellt.

Die Nährbouillon wird in einen 2000 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gege-

eines mit
ben, der mittels/zwei 48 cm langen Leitschaufeln versehenen Scheibenkreiselmischers mit 106 UpM gerührt wird.

Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 1200 Li.tern/Min.

eingeleitet. Erforderlichenfalls wird ein Antischaummittel - wie

509843/0933

es in Beispiel 10 beschrieben ist - in Mengen von je 25 ml zugesetzt. Die Fermentation wird bei 26°C eingeregelt, bis die höchste Ausbeute an Clavulansäure nach 3 bis 5 Tagen erhalten worden ist, wenn nämlich 20^ bis 300 ug/ml Clavulansäure erzeugt worden sind.

Beispiel 13 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

In einer Anzuchtflasche, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, jedoch unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Nährbouillon, deren pH-Wert auf 7>0 eingestellt worden ist, wird ein Impfstoff erzeugt, der zum Beimpfen von konischen 500 ml-Flaschen mit einem Gehalt an 100 ml aliquoten Teilen der nachstehend angegebenen, in entsalztem Wasser hergestellten und sterilisierten Nährbouillon verwendet wird. Die Impfstoffmenge beträgt 5 Prozent.

Triglyzerid ("Prichem P224") 1 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent

KHpPOh "0,1 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

Die beimpften Flaschen werden bei 26°C geschüttelt, und die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung wird nach 3 bis 5 Tagen erreicht. Man erhält 30& bis 500 Ug/ml Clavulansäure.

Beispiel l4

Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure .Die wie in Beispiel 10 erzeugte, angereicherte .Kulturflüssigkeit wird durch kontinuierliches Zentrifugieren geklärt. Das Mycel wird verworfen. Aus. 150 Litern Fermentationsflüssigkeit erhält man

5098 A3/0933

120 Liter geklärte Kulturflüssigkeit. Dieses Filtrat weist bei einer Verdünnung 1/2500 eine 58prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch auf. Das Filtrat wird auf 5°C gekühlt und mit 4o Liter n-Butanol versetzt. Das Gemisch wird gerührt und mit 25prozentiger Schwefelsäure versetzt, bis der pH-V/ert 2,0 beträgt. Das angesäuerte Gemisch wird weitere 10 Minuten gerührt, bis durch Zentrifugieren die Phasen getrennt werden. Die wässrige Phase viird verworfen. Zum n-Butanol-Extrakt gibt man 0,5 Prozent Aktivkohle ("Korit GSX") und rührt das Gemisch nochmals 15 Minuten. Nach dem Abfiltrieren der Kohle unter Zuhilfenahme von Diatorneenerde als Filtrierhilfe wird die Kohle verworfen. Zum n-Butanol wird ein Viertel seines Volumens entsalztes Wasser zugegeben und das Gemisch gerührt, währenddessen eine 20prozentige Natronlauge zugesetzt wird, bis sich der pH-Wert auf 7,0 eingestellt hat. Durch Zentrifugieren trennt man die Phasen auf und verwirft die n-Butanol-Phase. Die wässrige Phase wird unter vermindertem Druck auf 800 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet. Man erhält 35 g einer festen Rohsubstanz·von Clavulansäure mit einem I₁-Q-Wert von 1,3 ug/ml beim ß-Lactamase-Hemmversuch. Dieser Feststoff wird im trockenen Zustand bei -20⁰C gelagert, um dann einer weiteren Reinigung unterworfen zu werden.

Beispiel 15

Isolierung des rohen Hatriumsalzes der Clavulansäure 1 Liter des wie in Beispiel 12 beschrieben erhaltenen Kulturfiltrats mit einer 53prozentigen Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch bei einer Verdünnung von 1/2500 wird an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 15,2 cm Lange mit einer Füllung von Permutit ("Isopore Resin FF IP (SRA 62)") in der Chloridform perkoliert.

509843/0933-

Dem Kulturfiltrat folgen 300 ml destilliertes V/asser, um die Säule zu waschen. Eine Eluierung des aktiven ß-Lactamase-Hemmstoffes erzielt man mit einer 0,2-rn Natriumchloridlösung. Es werden 20 ml-Praktionen gesammelt und bei einer Endverdünnung von 1/2500 beim ß-Lactamase-Hemmversuch geprüft. Aktive Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 20 ml eingeengt. Diese Lösung wird mittels Gelausschluß-Chromatographie an einer "Bio Rad Biogel P2"-Säule von 3,8 cm Durchmesser mit einer Gelfüllung von etwa 4o cm"Höhe entsalzt und mit 1 Prozent n-Butanol enthaltendem Wasser eluiert. Die aufgrund des ß-Lactamase-Hemmversuches festgestellten aktiven Fraktionen werden vereinigt. Nach dem Eluieren der Clavulansäure wird Natriumchlorid eluiert, wie mittels einer Silbernitratlösung festgestellt werden kann. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet'.

Nach der vorgenannten Behandlung ergibt 1 Liter Kulturfiltrat 0,^5 g eines festen Rohprodukts der Clavulansäure mit einem Icq-Wert von 0,92 ^g/ml.

Dieser Feststoff wird bei -20°C gelagert und dann einer weiteren Reinigung unterworfen.

Beispiel 16

Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure Ein 300 ug/ml Clavulansäure enthaltendes Kulturfiltrat wird . .... unter Anwendung eines Mischsystems in Rohrleitungen angesäuert und mit n-Butanol extrahiert. Die Clavulansäure wird, bei neutralem pH-Wert in das Wasser zurückextrahiert. .. . . -

509 8437 0 933

^17316

Auf 5 .bis 10⁰C gekühltes Kulturfiltrat wird zu einem Mischer in
Rohrleitungen gepumpt, an dessen Einlaßende ausreichend 6volumenprozentige Salpetersäure zugegeben wird, um beim Austritt einen
pH-Wert von 2,0 +0,1 zu haben. Das angesäuerte Filtrat wird mit
einer Geschwindigkeit von 4 Liter/Min, durch einen mit Glykol gekühlten Plattenwärmeraustauscher geschickt, der auf einer Temperatur von 2 bis 5°C gehalten wird. Der pH-Wert wird in der FließzeHe überwacht, bevor die Flüssigkeit durch einen jjstufigen Gegenstromabscheider geschickt wird.

\uf etwa 5°C gekühltes, mit n-Butanol gesättigtes Wasser wird mit einer Geschwindigkeit von 3 Liter/Min, in den Gegenstromabscheider gepumpt.

Die aus dem Gegenstromabscheider austretende wässrige Phase wird
verworfen. Mitgeschlepptes Wasser wird aus dem Butanol-Ablauf des Gegenstromabscheiders unter Verwendung eines Flüssig-Flüssig-Zentrifugalabscheiders entfernt. Das Butanol wird in einem mit
einem Kühlmantel versehenen Gefäß aus rostfreiem Stahl gesammelt, wo es bei etwa 5°C gelagert wird.

Aus dem Gefäß werden 4o Liter aliquote Anteile entnommen und
gründlich mit 2 Liter auf 5°C gekühltem Wasser, das mit n-Butanol gesättigt ist, vermischt . Der pH-Wert dieses Gemisches wird auf
6,8 + 0,1 unter Verwendung einer 20prozentigen Natronlauge eingestellt. ·

Das Gemisch aus wässrigem Extrakt und Butanol wird einem Flüssig-Flüssig-Zentrifugalabscheider mit einer Geschwindigkeit von 2

509843/0933

ORIGINAL INSPECTED

- 56 Liter/Min, zugeführt.

Aus l800 Liter Kulturflüssigkeit warden 20 Liter einer wässrigen Phase gewonnen, die 39 Prozent der im Kulturfiltrat vorliegenden Clavulansäure enthält.

15 Liter des wässrigen Extrakts v/erden durch Zugabe von 60 g Natriumchlorid je Liter auf einen Gesamtfeststoffgehalt von 2 bis 8 Proznet eingestellt und sprühgetrocknet. Die Bedingungen hierfür sind: Einspeisgeschwindigkeit 2 Liter/Stunde; Spannung des Zerstäubers 170 Volt; Heizeinstellung 6 bis 7; Einlaßternperatur 150⁰C; Auslaßtemperatur 8o°C.

Das Trockenprodukt im Gesamtgewicht von 1 kg enthält 62 Prozent der im Ausgangsmaterial vorliegenden Clavulansäure.

Die restlichen 75 Liter des wässrigen Extrakts werden durch Ultrafiltrieren eingeengt. Die Arbeitsweise besteht in einem Zirkulieren dieses Restes aus einem Gefäß"aus rostfreiem Stahl, das mit einem Kühlsystem ausgerüstet ist, mittels eines Auslaßventilsatzes derart, daß man über 4o Membranen einen Druckunterschied von 25 Atmosphären erhält. Die Temperatur wird bei 2 bis · 5°C und erforderlichenfalls der pH-Wert bei 6,8 + 0,1 durch Zugabe von 2-n Salzsäure gehalten. Das Volumen wird auf J54 Liter eingeengt, die 72 Prozent der im Ausgangsmaterial vorhandenen Clavulansäure enthalten.

Das wässrige Konzentrat wird bei 5⁰C gelagert, auf 8 Prozent Feststoffgehalt eingestellt und wie vorgenannt sprühgetrocknet.

5098^3/0933

Die getrocknete Substanz enthält 75 Prozent der in dem Ausgangsmaterial zum Sprühtrockner vorliegenden Clavulansäure.

Das Gesarntsprühtroekenprodukt aus 90 Liter wässrigen Extrakts enthält 69>^ g Clavulansäure, was 72 Prozent Clavulansäure im Ausgangsmaterial für die Sprühtrocknung und 21 Prozent Clavulansäure, die in l800 Liter Kulturfiltrat vorhanden gewesen ist, entspricht.

Beispiel 17

i'eilweise Reinigung der rohen Clavulansäure Die gemäß· Beispiel 15 erhaltenen rohen Clavulansäure-Zubereitungen werden durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. l8 g des gemäß Beispiel 15 hergestellten Materials mit einem I ,-₀-Wert

von 1,3 Mg/ml (Endkonzentration) werden in 25 ml destilliertem Wasser gelöst und auf ein ~$, 8 χ 4θ cm großes Bett von "Permutit FF IP (SRA 62)-Harz" in der Chloridform aufgebracht. Die Säule wird mit einem Natriumchlorid-Gradienten eluiert, der durch Zuführung von 0,5-m Natriumchlorid in ein 1 Liter destilliertes Wasser enthaltendes Mischgefäß, wobei dies nach und nach der Chromatographiesäule zugeführt wird, aufgrund der Schwerkraft gebildet wird. Es werden 10 ml-Fraktionen gesammelt. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung wird unter Verwendung einer 1/2500-Verdünnung der Fraktionen untersucht. Die aktiven Fraktionen werden aufgrund des Auftretens einer Hauptfarbbande bei den Fraktionen 2²I- bis eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 30 ml eingeengt.

Diese Lösung wird unter Verwendung eines 5 x ^6 cm-Bettes von

509843/093 3

"Biorad' Biogel P2" entsalzt und mit 1 Prozent n-Butanol enthaltendem V/asser eluiert. Die 20 ml-Fraktionen werden unter Anwendung des ß-Lactamase-Hernmversuches auf einen Clavulansäure-Gehalt untersucht. Die B'raktionen werden auf Papierstreifen getüpfelt und entweder mit dem in der "Beschreibung 3" beschriebenen Ehrlich'sehen oder dem Triphenyltetrazolium-Spray-Reagens besprüht. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung stimmt mit den rosaroten oder roten Flecken überein, die mittels dieser Reagentien erzeugt werden. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, mit Ausnahme derjenigen, die Natriumchlorid enthalten, und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 520 mg eines teilweise gereinigten Natriumsalzes der Clavulansäure mit einem I^-Wert von 0,2 ug/ml beim Standärd-ß-Lactamase-Hemmversuch.

Die"Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel dieses Clavulansäure-Präparats liefert die folgenden R_f-Werte:-Beim n-Butanol/A'thanol/-Wasser-Gemisch als obere Phase im Volumenverhältnis von 4 : 1 :5 einen R_f-Wert von 0,37;

beim n-Butanol/Essigsäure/Wasser-Gemiseh vom Volumenverhältnis 12 : 3 : 5 einen R_f-Wert von 0,44; und

beim Isopropanol/Wasser-Gemisch im Volumenverhältnis· von 7 : 3 einen R_f-Wert von 0,78.

Die Zonen werden durch Besprühen mit Ehrlich'schem Reagens festgestellt.

Als Markierungsmittel läuft 6-Aminopenicillansäure mit; sie wird mit dem gleichen Spray bestimmt und weist R^-Werte von 0,38, 0,39 bzw. 0,77 auf.

50984 3/093 3

- 59 Beispiel l8

Teilweise Reinigung des Natriumsalzes der Clavulansäure Das gemäß Beispiel 12 erzeugte Kulturfiltrat wird wie in Beispiel l4 beschrieben lösungsmittelextrahiert und liefert einen Feststoff, der mittels Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Diäthylaminoäthyl-Cellulose "DE 52" weiter gereinigt wird. 10 g dieses Peststoffes werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine j5,8 χ 51 cm-Säule von "DE 52"-Cellulose, die zuvor mit 0,01-m Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7*5 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht. Die Säule wird mit einem Natriurachlorid-Gradienten eluiert. Es werden 0,1-m Natriumchlorid in 0,01-m Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7*5 einer Mischkammer zugeführt, die 1 Liter einer 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7,5 enthält, die nach und nach mit der Säule in Berührung gebracht wird. Es werden 10 ml-Fraktionen gesammelt, die bei einer Verdünnung von 1/25ΟΟ auf eine ß-Lactamase-Hemmwirkung untersucht werden. Die Fraktionen werden auch auf ihre anttbakterielle Wirksamkeit mittels der Lochplatten-Versuchsmethode unter Verwendung von mit Klebsiella aerogenes beimpften Nähragarplatten geprüft. Die Fraktionen, die die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung besitzen und die Hemmzonen beim Lochplattenversuch liefern, werden vereinigt, eingeengt und dann an einer "Biorad Biogel P2"-Säule entsalzt. Mittels Papierchromatographie und Dünnschi cht-Chromatographie erkennt man, daß diese Fraktionen Clavulansäure enthalten.

509843/0 9-3

- 6ο Beispiel 19

Isolierung des festen Natriumsalzes der Clavulansäure 500 mg des gemäß Beispiel 17 teilweise gereinigten festen Präparats von Clavulansäure werden auf eine Säule mit 2,5 x 51 cm-Bettgröße gebracht, die mit mikrogranulierter "CC 31"-Cellulose beschickt ist. Als chromatographisches Lösungsmittel wird als obere Phase ein n-Butanol/Ä'thanol/Wasser-Gernisch im Volumenverhältnis von 4:1:5 verwendet. Die Säule läuft bei 4°C. Es werden 4 ml-Fraktionen' gesammelt. Die Fraktionen werden auf das Vorhandensein von Clavulansäure untersucht, indem man Filterpapier mit den Fraktionen betüpfelt und dann Ehrlich'sches oder Triphenyltetrazolium-Sprüh-Reagens aufsprüht, die rosarote bzw. rote Flecken liefern. Diese TüpfeTtests werden durch die ß-Lactamase-Hemmversuche bei Verdünnungen von l/l250 bestätigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf einem Drehverdampfer unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in einer geringen Menge destillierten Wassers gelöst und gefriergetrocknet. Man erhält als weißen Feststoff 4o mg des Natriumsalzes der Clavulansäure mit einem If-Q-Wert von 0,08 ug/ml beim ß-Lactanrase-Hemmversuch.

Beispiel 20 Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

6 Liter des aus der Ultrafiltration gemäß Beispiel 16 erhaltenen konzentrierten Rückkonzentrats mit einem Gehalt von 10 g Clavulansäure, wie es gemäß dem ß-Lactamase-Hemmversuch nach der "Beschreibung 1" bestimmt worden ist, werden mit einer Geschwindigkeit von 11 Liter/Stunde an einer 5*1 x öl cm-Säule eines Permutit-Anionaustauscherharzes in der Chloridform ("Zeolit FF IP SRA62¹)

509843/0933

perkoliert. Danach wird die Säule rait 2 Liter entsalztem Wasser vor einem Eluieren mit einem Natriumchiorid-Gradienten gewaschen. Dieser Natriumchlorid-Gradient wird aus einem Vorratsbehälter mit einem Gehalt an 4 Liter einer 1,4-m Natriumchloridlösung gebildet, wobei unter Rühren in einem-Vorratsbehälter mit einem Gehalt von 4 Liter einer 0,7-m Natriumchloridlösung nach und nach 4 Liter entsalztes Wasser eingespeist werden, wobei das Vorratsgefäß über eine Pumpe mit der Säule in Verbindung steht. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/Min, eluiert. Man sammelt 25 ml-Fraktionen, die dem ß-Lactamase-Hemmversuch unterworfen werden. Die aktiven Fraktionen Nr. l40 bis 230 werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis nahe zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 500 ml Äthanol versetzt und nach kräftigem Schütteln der verbliebene Feststoff abfiltriert. Der Kthanolextrakt wird dann unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 40 ml entsalztem Wasser wieder aufgelöst. Mit dieser Lösung wird eine 5,1 χ 6l cm-Säule mit einer Füllung von "Biorad Biogel P2" beschickt. Dann wird die Säule mit 1 Prozent n-Butanol enthaltendem Wasser eluiert. Es werden 25 ml-Fraktionen gesammelt, die auf die ß-Lactamase-Hemmwirkung bei einer L/2500 Endverdünnung untersucht werden. Unter Verwendung einer Silbernitratlösung wird der Natriumchloridgehalt bei einer l/2500-Verdünnung der Fraktionen untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einem Gehalt an natriumchloridfreier Clavulansäure werden vereinigt, unter vermindertem Druck durch Abdampfen des Lösungsmittels auf 20 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet. Man erhält 4,8 g Natriumsalz der Clavulansäure mit einem IV₀-Wert von etwa 0,06 ug/ml.

509843/0933

Beispiel 21

Herstellung des Methylesters der Clavulansäure

CH₂OH

CO₂

Na

CO₂CH₃

19,8 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure werden in 0,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit 0,25 ml Methyljodid behandelt. Nach 90minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird mittels Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel (Kieselgel 60F254) gereinigt, wobei das Eluieren mit Äthylacetat den Clavulansäure-Methylester als farbloses öl mit einem R_f-Wert von O,j58 und einer roten Farbe mit Triphenyltetrazolium-chlorid-Spray-Reagens liefert. Die Verbindung hat die folgenden Eigenschaften:

Analyse für

ber.: 50,70 5,20 6,57 gef.: 50,49 5,43 6,29

A.max (Methanol): keine Absorption über 215 nm. Umax (Film): 3300-3600 (breit), l800, 1750, 1695 cm" Etwa 1. Ordnung-NMR.Spektrum (CDCl,): 2,49(breites s, 1, ausgetauscht mit D₂O)J 3,05 (d, 1, J=17,5 Hz); 3,54 (dd, 1, J=17,5 Hz, J₂=2,5 Hz); 3,84 (s, 3); 4,24 (d, 2, J=7 Hz);

509843/0933

4,93 (dt, 1, J=7 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,07 (d, I₁ J=I,5 Hz); 5,72 (d, 1, J=2,5 Hz).

Molekulargewicht (Massenspektrum): 213,0635; berechnet für C₉II_nNO₅: 213,0637-

Die Dünnschicht-Chromatographie des Methylesters zeigt eine einzige Zone bei den folgenden Lösungsmittelsystemen: Butanol/Äthanol/Wasser-Gemisch als obere Phase im Volumenverhältnis von 4:1:5 einen R~-Wert von 0,75; Isopropanol/Wasser-Gemisch im Volumenverhältnis von 7 : 3 einen R--Wert von Ο,95ϊ und

Äthylacetat/Äthanol-Gemisch im Volumenverhältnis von 8 : 2 einen Rj,-Wert von 0,87.·

Diese Zonen werden mittels Bioautographie unter Verwendung von Klebsiella aerogenes mit einem Zusatz von Benzylpenicillin (also unter Verwendung eines synergistischen Systems) bestimmt.

Beispiel 22 Herstellung des p-Nitrobenzylesters der Clavulansäure

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Die Behandlung des Natriumsalzes der Clavulansäure mit p-Nitrobenzylbromid in wasserfreiem Dimethylformamid liefert nach der Dünnschicht-Chromatographie ein farbloses öl, das aus einem Gemisch von Chloroform und Äther kristallisiert und den p-Nitrobenzylester der Clavulansäure als weiße federartige Nädelchen vom Fp. 111 bis 112⁰C liefert, die beim Umkristallisieren einen Schmelzpunkt von 117,5 bis ll8°C haben.

Beispiel 23 Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure

" CH₂OH

CH₂OH

\ CO₂CH₂Ph

Unreines Natriumsalz der 3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa-lazabicyclo/3i2,07heptan-2-carbonsäure, von der man annimmt, daß sie roh gerechnet 55 mg reine Substanz enthält, wird in 6,4 ml wasserfreiem Dimethylformamid mit 0,l8 ml Benzylbromid behandelt. Die Lösung wird 3 Stunden unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur (etwa 17 bis l8°C) gehalten. Das Reaktionsgemisch wird an Silikagel fraktioniert, mit Äthylacetat eluiert und liefert im wesentlichen in reiner Form den Benzylester der 3-(ß-Hydroxyäthyliden) -^-oxo^-oxa-l-azabicyclo/^,2,O/heptan-2-carbonsäure als' farbloses öl in einer Ausbeute von 63 mg.

5 09843/0933

IR (Film): l800, 1745, 1695 cm"¹;

NMR (CDCl,): 2,25 (s, 1, austauschbar mit DgO); 3,05 (d,l, J=17 Hz); 3,51 (dd, 1, J=17 Hz, J₂=2,5 Hz); 4,24 (d, 2, J=7,5 Hz); 4,92 (dt, 1, J=7,5 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,15 (d, 1, J=I,5 Hz.); 5,24 (s, 2); 5,71 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,45 S (s, 5).

Beispiel 24

Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure aus rohen Extrakten des Kulturfiltrats von Streptomyees clavuligerus

20 Liter des gemäß Beispiel 10 erhaltenen Kulturfiltrats werden unter Einsatz eines Kletterverdampfers auf 5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird unter Verwendung eines "Edwards E.F.6"-Gefriertrockenschranks gefriergetrocknet. Die derart erhaltenen 3OO g Feststoff enthalten 3 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie mittels des ß-Lactamase-Hemmversuches festgestellt worden ist. Der Feststoff wird in 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 150 ml Benzylbromid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 1 Liter Äthylacetat verdünnt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wird auf ein möglichst geringes Volumen eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit einem weiteren Liter Äthylacetat extrahiert. Nach dem Filtrieren des Extrakts wird das Filtrat wiederum eingedampft und man erhält einen öligen Rückstand, der auf eine 7,6 χ 35,6 cm große Silikagel-Säule Cßiogel Biosei A" mit einer Teilchengröße von 0,15 mm) in Cyclohexan gegeben. Die Säule wird mit Cyclohexan eluiert, um Benzylbromid zu entfernen. Das Lösungsmittel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fängt 20 ml-

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Fraktionen auf. Die Fraktionen werden auf das Vorliegen des Benzylesters der Clavulansäure durch Tüpfeln auf mit Sililcagel beschichteten Dünnschicht-Chromatographie-Glasplatten (Silikagel 60F254) und Besprühen mit 2,3i5-1^lriphenyl-tetrazolium-chlorid-Sprüh-Reagens (TTC) untersucht.

Die Fraktionen, die mit diesem Reagens intensive rote Flecken liefern, werden weiterhin mittels Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel-Platten unter Verwendung eines Chloroform-Äthylacetat-Gemisches im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel und durch Sprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray geprüft. Der Benzylester der Clavulansäure läuft bei 22° mit einem R_-Wert von 0,31, Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf 15 ml eingeengt. Diese Lösung wird nochmals chromatographiert an einer 3,8 χ 4θ cm Sillkagel-Säule ("Silikagel H, Typ 6θ") mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis. 8 : 2 als Lösungsmittel. Es werden 15 ml-Fraktionen gesammelt und wie in der vorbeschriebenen V/eise auf den Benzylester geprüft. Die diesen Ester enthaltenden Fraktionen werden auf 8 ml eingeengt und nochmals durch Säulenchromatographie an einer 2,5 x 4θ cm Silikagel-Säule (Silikagel H, Typ 6θ") mit einem Äthylacetat/Cyclohexan-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel gereinigt. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält l60 ml reinen Benzylester als öl.

Beispiel 25 Herstellung des Clavulansäure-berazylesters

3,3 ^g eines sprühgetrockneten Feststoffes mit einem Gehalt von 69,^ g Clavulansäure, wie es durch den ß-Lactamase-Hemmversuch

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festgestellt worden ist, werden wie in Beispiel 16 angegeben erhalten. Der Peststoff wird in 5,5 Liter Dimethylformamid aufgeschlämmt und mit 500 ml Benzylbromid versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 12 Liter Äthylacetat zugesetzt. Die Feststoffe werden abfiltriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Die erhaltenen 212 g öliger Rückstand werden auf eine Säule mit einer Silikagel-Beschickung von 10 χ 33 cm in Cyclohexan gegeben. Di-e Säule wird mit 12 Liter Cyclohexan eluiert, um überschüssiges Benzylbromid zu entfernen. Das Eluierungsmittel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fängt 500 ml-Fraktionen auf, die auf den Clavvlansäure-Benzj'lester-Gehalt durch Tüpfeln auf Silikagel-Dünnsehicht-Chromatographieplatten ("Siiikagel 60F254") und Besprühen mit TTC-Sprüh-Reagens geprüft werden. Die intensive rote Flecken liefernden Fraktionen werden weiterhin mittels Dünnschicht-Chromatographie an Siiikagel mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel^ und Besprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray untersucht. Die Fraktionen Nr. 5 bis IJ enthalten den Hauptteil des Esters. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu 79*3 g öl eingedampft. Dieses öl wird dann an einer 10 χ 46 cm-Säule von Siiikagel ("Siiikagel H, Typ 60") mit einem Chloroform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel chromatographiert. Die Fraktionen werden wie zuvor beschrieben gesammelt und ergeben beim Konzentrieren 45*9 g eines Öls, das einen Reinheitsgrad von 62 Prozent aufweist, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

Dieses Produkt wird nochmals an einer 7 χ 46 cm-Säule von vernetztem Dextran ("Sephadex LH 20") in einem Cyclohexan/Chloroform-

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Gemisch im Verhältnis 1 : 1 chromato^raphiert. Nach der Auswahl der Fraktionen und nach Einengen erhält man 27,6 g eines farblosen Öls, das den Clavulansäure-benzylester mit einem Reinheitsgrad von 95 Prozent darstellt, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

Beispiel 26

Herstellung des Clavulansäure-benzylesters 150 Liter eines KuIturfiltrats vom pH 7*0 mit einem Gehalt von l6,2 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie bei dem ß-Lacta-· mase-Hemmversuch festgestellt worden ist, werden hut 5 kg eines Anionenaustauscherharzes in der Chloridform ("Amberlyst A.26") 1 Stunde bei Raumtemperatur verrührt. Das Harz wird dann abfiltriert. Das Piltrat wird nochmals geprüft und zeigt, daß 6,4 g Clavulansäure entfernt worden sind. Das Harz wird mit 20 Liter entsalztem Wasser, dann mit 20 Liter Aceton und schließlich mit 10 Liter Dimethylformamid gewaschen. Nach nochmaligem Filtrieren wird das Harz in 2,5 Liter Dimethylformamid mit einem Gehalt von 0,2-m Natriumiodid suspendiert. Ferner werden 200 ml Benzylbromid zugesetzt. Die Suspension wird gut gerührt. Nach l6stündigem Stehen bei Raumtemperatur fügt man 2 Liter Ä'thylacetat hinzu, filtriert dann das Harz ab, wäscht es wiederum mit Ä'thylacetat und vereinigt die Waschwässer mit dem Filtrat. Der Extrakt wird dann auf ein geringes Volumen eingeengt und an einer 7,6 x 46 em-Silikagel-Säule ("Silikagel H, Typ 60") mit einem Ä'thylacetat/Cyclohexan-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel chromatographiert. Die den Clavulansäure-benzylester enthaltenden Fraktionen werden ausgewählt, indem man auf Silikagel-Dünnschicht-Chromatographieplatten tüpfelt und mit TTC-Reagens wie im vorstehenden

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Beispiel 2-4 beschrieben besprüht. Die ausgewählten Fraktionen v/erden dann auf 20 rel eingeengt und dann an einer *>, 8 χ 46 crn-Silikagel-Säule ("Silikagel H, Typ 60") mit einem Chloroform/-Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8 : 2 als Lösungsmittel chromatographiert. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und zu einem farblosen Öl eingedampft. Man erhält 440 mg Clavulansäurebenzylester mit einem Reinheitsgrad von 90 Prozent, wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

Beispiel 27

Herstellung des Clavulansäure-banzylesters aus roiien Extrakten eines Kulturfiltrats von Streptomyces clavuligerus

Ein aliquoter Teil eines wässrigen Rückextraktes aus einem Butanol-Extrakt eines Kulturfiltrats, das wie in Beispiel l4 beschrie. ben erhalten worden ist, wird unter Anwendung eines Gefriertrokkenschranks gefriergetrocknet. Ein Anteil von 24 g des erhaltenen Feststoffes weist einen Gehalt von 0,96 g des Natriumsalzes der Clavulansäure auf, wie durch den ß-Lactamase-Hemmversuch bestimmt worden ist. Dieser Feststoff wird in 75 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert. Dann werden 75 ml Benzylbromid zugegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Suspension mit 500 ml Äthylacetat verdünnt. Nach dem Filtrieren des Gemisches wird das Filtrat unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer zu einem öligen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird auf eine 5 χ J55,5 cm-Silikagel-Säule ("Biogel Biosil A" von einer Teilchengröße unter 0,15 mm) in Cyclohexan gegeben. Aus der Säule wird Benzylbromid eluiert. Dann wird das Lösungsmittel gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man sammelt 10 ml-Fraktionen, wobei man den mit einem Gehalt an Clavulansaure-ben-

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zylester wie in Beispiel 24 angegebenen auswählt. Eine weitere Reinigung wird auch durch Säulenchromatographie, wie in Beispiel 24 angegeben, erreicht. Bei diesem Verfahren erhält man 220 mg des reinen Benzylesters.

Beispiel 28
Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

CH₂OH ^H₂OH

°' V

COpCH₂C^H,- COoNa

281 mg im wesentlichen reiner Clavulansäure-benzylester in 25 ml Äthanol mit einem Gehalt an 82 mg Natriumbicarbonat werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 90 mg 10 Prozent Palladium auf Kohle hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und Waschen mit Wasser und Äthanol werden die vereinigten Filtrate unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingedampft. Der halbfeste Rückstand wird mit Aceton verrieben, filtriert und mit Äther gewaschen. Man erhält 135 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure.

Beispiel 29

Hydrolyse des Clavulansäure-methylesters zu Clavulansäure 2,17 mg Clavulansäure-methylester werden in 0,1 ml Methanol gelöst und mit 0,208 ml einer O,O482-n Natriumhydroxidlösung behan-

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delt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur enthält das Reaktionsgemisch verschiedene Produkte. Die Dünnschicht-Chromatographie zeigt an, daß einer der Hauptbestandteile einen R„-Wert besitzt, der mit dem des Natriumsalzes der Clavulansäure identisch ist. Farbreaktionen und der biologische Versuch bestätigen, daß es sich um das Natriumsalz der Clavulansäure handelt.

Eine langsame Umwandlung des Esters in Clavulansäure wird dann festgestellt, wenn 1 mg/ml der Verbindung bei 37°C in einer 0,05~m Phosphatpufferlösung bei pH 7 bebrütet werden. Der Reaktion schließt sich eine Papierchromatographie (bioautographisches System) an. Unter Verwendung eines Butanol/Äthanol/Wasser-Systems, um der Reaktion über einen Zeitraum von 2 Stunden zu folgen, verkleinert sich die Zone des Methylesters bei einem R_f-Wert von 0,79 und vergrößert sich die Zone der Clavulansäure beim R,.-Wert von 0,12.

Beispiel 30 Antibakterielles Spektrum der Clavulansäure

Die antibakterielle Wirksamkeit des Natriumsalzes der Clavulansäure gegenüber einer Reihe von Bakterien wird unter Anwendung der Mikrotiter-Methode bestimmt. Reihenverdünnungen des Natriumsalzes der Clavulansäure in der "Oxoid"-Empfindlichkeits-Testbouillon, die in einer Mikrotiter-Kunststoffcuvette enthalten ist, werden mit einer über Nacht bebrüteten Kulturlösung jedes Organismus beimpft, so daß die Endverdünnung des Impfstoffes" 0,5 χ 10 beträgt. Die Kulturen werden über Nacht bebrütet. Am nächsten Morgen werden die Punkte des bakteriellen Wachstums durch Beobachtung der Eintrübung der Kulturlösung beobachtet. Die Ergeb-

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nisse, ausgedrückt als angenäherte Mindest-Hernmkonzentratlonswerte in jig/ml, sind in der Tabelle III aufgeführt, die auch zeigt, daß die Verbindung- ein breites Spektrum hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit besitzt.

Tabelle III

Antibakterielles Spektrum des Natriumsalzes der Clavulansäure

	Mindes t-Hcmnikonzen-
Bakterienstamm	tration, )ig/ml
Staphylococcus aureus (Oxford H)	7,5
Staphylococcus aureus (Russell)	7,5
Bacillus subtilis	62
Streptococcus faecalis	>500
Streptococcus pyogenes CN 10	125
Escherichia coil NCTC 104l8	31
Klebsiella aerogenes	31-62
Klebsiella oxytocum	62
Enterobacter aerogenes T 624	31
Enterobacter cloacae	62
Acinetobacter anitratus	125
Providentia stuartii	125
Serratia marcescens	125
Proteus mirabilis C977	62
Proteus vulgaris V/090	31
Salmonella typhimurium	31
Shigella sonnei	62
Pseudomonas aeruginosa A	500

Beispiel 31

ß-Lactamase-Hemmung durch das Natriumsalz der Clavulansäure Clavulansäure hemmt fortschreitend und irreversibel die ß-Laetamase von Escherichia coil. Die Methode der "Beschreibung l" zeigt, daß andere, in Tabelle IV aufgeführte ß-Lactamasen ebenfalls

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durch Clavulansäure gehemmt werden.

Tabelle

Hemmung der ß-Lactamaoen durch Clavulansäure

Quelle der ß-Lactamase	ungefährer I -Wert Im Verhältnis zu Escherichia coli JT 4 = 1
Staphylococcus aureus (Russell) Escherichia coil JT4 Escherichia coli BIl Klebsiella aerogenes A Pseudomonas aeruglnosa 1822 (R-Faktor) Pseudomonas dalgleish	1,0 1,0 2,0 0,6 5,0 0,1

Mit Penicillin G als Substrat beträgt der Ij-Q-Wert des Natriumsalzes der Clavulansäure gegenüber der ß-Lactamase von Staphylococcus aureus Russell annähernd 0,06 ug/ml.

Beispiel 32

Aktivität des Clavulansäure-methylesters Untersuchungen hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit in Brühen zeigen, daß der Clavulansäure-rr.ethylester ein breites Wirkungsspektrum, jedoch von etwas geringerer Stärke als die Clavulansäure selbst hat. Es ist nicht klar, ob es sich bei dieser Aktivität um die Aktivität der Verbindung selbst oder um die der durch langsame wässrige Hydrolyse des Esters freigesetzten Clavulansäure handelt. Clavulansäure-methylester zeigt einen bemerkenswerten antibakteriellen Synergismus in Verbindung mit Ampicillin oder Cephaloridin gegenüber solchen Bakterien, die

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gegen diese Antibiotika resistent sind. Dementsprechend wird die Mindest-Hemmkonzentration für Ampicillin gegenüber Staphylococcus aureus (Russell) von 500 pg/ml auf unter 0,4 in Gegenwart von 1,0 pg/ml ClavulansUure-methylester herabgesetzt. Die iMindest-Hemmkonzentration für Cephaloridin wird von 1,5 pß/ml auf unter 0,03 pg/ml in Gegenwart von 1 pg/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt. Die Mindest-Hemmkonzentration für Ampicillin gegenüber Proteus mirabilis C889 wird von 500 pg/ml auf 31 pg/ml in Gegenwart von 5 Ug/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt.

B e i s ρ i e 1 33

Herstellung von Clavulansäure-Trimethylmethoxymethylester Zu einer gerührten Lösung von 0,37 g Trimethylessigsäure-brommethylester in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,49 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 20 ml Wasser behandelt. Das Gemisch trennt sich in zwei Schichten auf. Die nicht-wässrige Schicht wird abgetrennt, mit 20 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird eingedampft. Man erhält 500 mg eines schwachgelben Öls.

NMR (CDCl,): 1,26 (s, 9'); 3,13 (d, 1, J=17 Hz); 3,62 (dd, 1, J=17 Hz, J₁₌2,5 Hz); 4,3 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, j=7,5 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,16 (d, 1, J=I,5 Hz); 5,79 (d, 1, J=2,5 Hz); 5,92<£(s, 2).

IR (flüssiger Film): ß-Lactarn-C.0 I8OO cm"¹,

Ester-C=0 I76O cm"¹.

509843/0333

Beispiel 34 Herstellung des Clavulansäure-phthalidasters

Zu einer gerührten Lösung von 0,43 g 3-Broraphthalid in 5 rcl wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,5 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen' und dann mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 30 ml V/asser gut durchgeschüttelt. Die nicht-wässrige Schicht wird mit 20 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält eine blaßgelbe, gummiartige Substanz. Die beiden diastereomeren Ester werden unter Anwendung einer Hochiruck-Plüssigkeits-Chromatographie an einer 40 cm χ 10 mm-Saule von Silikagel ("Merckosorb SI 60" mit einem Teilchendurchmesser von 5 u) aufgetrennt, wobei mit Kthylacetat bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min, eluiert wird.

Der erste Phthalidester mit einer Rezensionszeit von 7,15 Minuten kristallisiert aus Sthylacetat als Nadeln vom Schmelzpunkt 102⁰C und hat die nachstehenden Eigenschaften.

IR (Nujöl,vjarm )· y ß-Lactam-C=O I79O cm"^ Ester-C=0 1755 cm"¹ NMR (CD₅COCD₃): 3,14 (d, 1, J=17,5 Hz); 3,76 (dd, 1,^=17,5 Hz,

J₂=2,5 Hz); 4,25 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, J₁₌7,5 Hz, J₂=I,5 Hz); 5,4 (s, 1, J=I,5 Hz); 5,82 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,7 (s, 1); 8,06<f(m, 4); Molekulargewicht (Massenspektrum): 331,0696 entspricht C^H^NO^ (berechnet 331,0692).

Das zweite Diastereoisomere mit einer Retensionszeit von 8,85 Minuten hat die folgenden Eigenschaften:

50 98 43/0933

IR (CHgClg-Lösung); U ß-Lactam-C=O l800 cm"¹,

Ester-C=O 1780 cm"¹; NMR (CDCl^): 2,42 (breites s, 1 austauschbar mit DpO);

3,12 (d, 1, J=I8 Hz); 3,60 (dd, 1, J₁=IS Hz, J₂=2,5 Hz); 4,30 (d, 2, J=7,5 Hz); ' 5,0 (dt, 1, J₁=7,5 Hz, J₂=I,5 Hz);

5,76 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,52 (s, 1); 7,85£(m, 4)

Beispiel 35 Herstellung des Clavulansäure-nonylesters

44 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden mit 76 mg Nonyljodid behandelt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel fraktioniert, wobei mit einem Gemisch aus Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 2 : 1 eluiert wird. Man erhält ein öliges Produkt.

IR (Film): 18OO, 1745, I690 cm"¹;

Molekulargewicht (Massenspektrometrie): 325,1890 entspricht O₁₇H₂₇NO₅ (berechnet 325,1889).

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- 77 Beispiel 36

Herstellung von Clavulansäure

100 mg Clavulansäure-benzylester in 5 ml Ethanol werden 45 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 30 mg eines 10 Prozent Palladium~auf-Kohle-Katalysators hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 58 mg Clavulansäure als instabiles viskoses Öl.

NMR (C₅D₅N): 3,05 (d, 1, J=l8 Hz); 3,60 (dd, 1, J₁=IS Hz,

J₂= 2,5 Hz); 4,75 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,58 (t, 1, J=7,5 Hz); 5,66 (s, 1); 6,0 £(d, 1, J=l8 Hz).

Beispiel' 37

Herstellung des Clavulansäure-methylesters 130 mg Clavulansäure in 10 ml Äthanol werden mit überschüssigem Diazomethan in Äther behandelt. Nach 2 Minuten bei Raumtemperatur zeigt die Dünnschicht-Chromatographie, daß die Umsetzung vollständig ist. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Silikagel unter Eluierung mit Äthylacetat gereinigt. Die den Clavulansäure- methylester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 104 mg eines klaren Öls.

Beispiel 38 Herstellung des Clavulansäure-methylesters

200 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei

O⁰C gerührt. Dann werden 0,5 ml Methanol und 206 mg Dicyclohexyl-

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dicarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den rohen Clavulansäure-methylester der durch Chromatographie an Silikagel unter Eluieren mit Äthylacetat gereinigt wird. Man erhält l4o mg'eines klaren Öls.

Beispiel 39

Herstellung des Clavulansäure-phenylesters 100 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei 0⁰C gerührt. Zur Lösung werden 0,94 g Phenol und 100 mg Dicyclohexyldicarbodiimid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Piltrat wird eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch von Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 1 : 1 fraktioniert. Man erhält 70 mg Clavulansäure-Phenylester.

IR (Film)f\ l800, 1770, 1690 cm"¹;

NMR (CDCl,): 2, l8 (breites s, l); 3,06 (dd, 1,^=17 Hz, J₂=O,9 Hz); 3,54 (dd, 1, J₁= 17 Hz, J₂=2,6 Hz); 4,29 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,1 (dt, 1, J_x=7,5 Hz, J₂= 1,5 Hz); 5,29 (d, 1, J=I,5 Hz); 5,76 (dd, 1, J₁₌2,6 Hz, J₂=0,9 Hz); 7,35$ (ra, 5). ■ '

Molekulargewicht (Massenspektrometrie) = 275,0777 entspricht ^Cl4^H13^N05 (^berecnnet 275,0794).

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- 79 Beispiel 40

Herstellung von Clavulansäure-^, 2,2-tri chi oräthylcy.ror 221 mg Natriumsalz der Clavulansäure werden in 5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert und bei 0 C gerührt. Dann werden 211 mg Trichlorathylchlorformiat in 1 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zu der vorgenannten Suspension innerhalb 20 Minuten zugegeben. Man läßt die Temperatur dieses Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen und rührt über Nacht. Die Suspension wird filtriert, das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wird an Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch mit Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 2 : 1 chromatographiert. Man erhält das gewünschte Produkt als Öl.

IR (Film): l800, 176O, 1690 cm"¹;

NMR (CDCl^): 1,56 (breites s, l); 3,07 (dd, 1, ^=17,5 Hz,

J₂=O,7 Hz); 3,56 (dd, 1, ^=17,5 Hz, J₂=2,5 Hz);

4,24 (d, 2, J=7,5 Hz); 4,69 (d, 1, J=12 Hz); · ■4,92 (d, 1, J=12 Hz); 5,02 (dt, 1, J_x=7,5 Hz,

J₂=I,3 Hz); 5,19 (d, 1, J=I,3 Hz);

5,73<S(dd, 1, J₁₌2,5 Hz, J₂=O,7 Hz).

Molekulargewicht (Massenspektrometrie) = 328, 9621 entspricht Cl, (berechnet 328, 9625).

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2517318

- 8ο -

3\ 9H₂OH

\ / QC0.0R

CO₉Na

H₂OH

CO-O-CO-O-R

CO₂R

Beispiel 4l

Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

84O mg Clavulansäure-benzylester in 30 ml Äthanol und 5 ml V/asser werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 267 mg lOprozentigem Palladium auf Kohle und 244 mg Natriumbicarbonat hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit V/asser und Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt wird aus einem Gemisch von Wasser und Aceton umkristallisiert. Man erhält 565 mg Mikronadeln. Umkristallisieren aus einem Gemisch von Wasser und Aceton liefert Nadeln, die nach 24stündigem Trocknen über P₀Op- unter vermindertem Druck die nachstehende Analyse liefern:

C 41,01

* 4o,86

H 3,77
3,64

N 5,68 5,51

5098 43/0933

- δι -

IR (KBr-Platte): 1785, 1700, 1020 cm"¹;

NMR (D₂O): 3,06 (d, 1, J=I8,5 Hz); 3,57 (dd, 1, J₁₌l8,5 Hz, J₂=2,5 Hz); 4,15 (d, 2, J=8 Hz); 5,3 (HOD); 4,9 (χα); 5,71 (d, 1, J=2,5 Kz).

Beispiel 42

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Die Mindest-Hemmkonzentrationen von Ampicillin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Ampicillin in Gegenwart von 1 ug/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure werden bei einer Reihe von ß-Lactamase-erzeugenden Bakterien bestimmt. Die Organismen werden in eine "Oxoid"-Empfindlichkeits-Testflüssigkeit überimpft, die sich in kleinen Löchern in einer Plastikcuvette befinden und die unterschiedliche Konzentrationsgradienten von ,einmal Ampicillin, zum anderen von dem Natriumsalz der Clavulansäure und zum dritten von Ampicillin plus 1 ug/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure (Mikrotiter-Methode) enthalten. Die Endverdünnung des Impfstoffes beträgt 0,5 x 10"². Die Cuvette wird bei 37⁰C über Nacht bebrütet. Eine Aufzeichnung der Endpunkte des bakteriellen Wachstums wird am nächsten Morgen vorgenommen. Die Mindest-Hemmkonzentrationswerte in ug/ml sind in der Tabelle V verzeichnet, die auch aufzeigt, daß der Synergismus bei der niedrigen Konzentration von 1 ug/ml in bemerkenswerter Weise die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber bestimmten grampositiven und gramnegativen Bakterien steigert. Der Mechanismus dieses Synergismus besteht wahrscheinlich darin, die Hemmung der Ampicillin-zerstörenden ß-Lactamase-Enzyme nach sich zu ziehen, doch kann die

5098^3/0933

25173

Existenz anderer Mechanismen nicht ausgeschlossen werden.

Ähnliche Ergebnisse wie die in Tabelle V angegebenen werden er halten, wenn man Ampicillin durch Amoxycillin oder durch den. Phthalidylester ees Ampicillins ersetzt.

Tabelle V

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

	Mindest-Hemmkonzentrationen - ug/ml	Ampi cillin	Ampicillin in Gegenwart von 1 ^g/ml Natriumsalz der Clavulansäure
Bakterien- s tamrn	Natriumsalz der Clavulan säure	1,8	<0,4
Escherichia coli· NCTC 10418	31	>500	125
Escherichia coli B 11	62	125	< 0,4
Klebsieila aerogenes A	31	125	< 0,4
Klebsieila sp 62	31	250	62
Enterobacter cloacae	62	> 500	62
Serratia rnarcescens	125	500	<0,4
Staphylococcus aureus (Russell)	15	250	7,5
Staphylococcus aureus	62

Beispiel 4^

Antibakterieller Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure Die Mindest-Hernmkonzentrationen von Cephaloridin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Cephaloridin in Gegenwart von

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5 Wg/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure werden nach dem in Beispiel 42 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle VI zeigen, daß ein Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und Cephaloridin erhalten werden kann, insbesondere beim ß-Lactamase-erzeugenden Stamm vnn Staphylococcus aureus (Russell).

TabelleV

Antibakterieller Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Bakterien- stamm	Mindest-Hemmkonzentrationen jug/ml	Cephalo ridin	Cephaloridin in Gegenwart von 5 jig/ml Natrium salz der Clavu lansäure
Proteus mirabilis 899 Staphylococcus aureus (Russell) Staphylococcus aureus	Natriumsalz der Clavulan säure '	62 3,1 15	7,5 < 0,03+ 3,7
> 500* 15 62

χ Endpunkt

+ der gleiche Wert wird erhalten, wenn 1 ug/ml anstatt 5 Wg/ml Synergist zugegeben wird.

Beispiel 44

Antibakterieller Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse werden nach dem in Beispiel 42 beschriebenen Verfahren erhalten.

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- 84 -Tabelle VII

Antibakterieller Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen gegenüber Stämmen von Klebsiella aerogenes

f	Amoxycillin	+5 ug/ml Synergist	Carbenicillin*	+5 /ig/ml Synergist	Benzylpenicillin	+5 /ig/ml Synergist
Stamm	allein	0,97	allein	7,8	allein	7,8
A	500	3,9	500	15	250	15,6
E 70	500	15,6	500	7,8	500	15,6
62	250	125	250

Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn Carbenicillin durch den Phenyl-c^-ester des Carbenicillins oder durch Ticarcillin ersetzt wird.

Beispiel 45 Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und Estern der Clavulansäure

Die in der Tabelle VIII angegebenen Ergebnisse werden nach dem

in Beispiel 42 beschriebenen Verfahren erhalten.

Tabelle VIII

AntibakterJsLler Synergismus zwischen Ampicillin und Estern der Clavulansäure gegenüber Stämmen von

Stamm	Ampicillin allein	Ampicillin + 5 ps/ml des Methyl- esters der Clavulan säure	Ampicillin + 5 jag/ml des Benzyl- esters der Clavulan säure
A E 70 62	500 500 500	1,9 3,9 3,9	1,9 3,9 3,9

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Weder Clavulansäure-rnethylester noch Clavulansäurebenzylester hemmen das Wachstum der Testorganismen bei Konzentrationen von 100 ug/ml.

Beispiel 46

Ant j bakterielle y-irksainko.it von Clavulanaäura-Sstern Beim Verfahren des Beispiels 30, jedoch unter Verwendung einer Verdünnung von l/lOO bei der über Nacht angesetzten Bebrütung werden die in Tabelle IX angegebenen Mindest-Hemmkonzentrationswerte bei bestimmten Estern der Clavulansäure gegenüber einer Anzahl von Organismen erhalten.

Tabelle IX
Antibakterielle Wirksamkeit von Clavulansäureestern

Organismus	Mindest-Hemmkonzentrationen von Clavu- lansäureestern	Nonyl- ester	Tr!methyl- acetoxymethy1- ester	Phthali- dyl- ester	j Mindest- IIemmkon- ! zentra- tion des Natrium salzes der Clavulan säure*
Bacillus subtilis A	3enzyl- sster	31	62	125	62
Staph.aüreus Oxford	250	31	31	31	15
Staph.aureus Russell	62	31	62	15	15
Escherichia coli 104l8	125	250	125	125	125
125

3E Die Mindest-Hemmkonzentration des Natriumsalzes der Clavulansäure ist zu Vergleichszwecken mit aufgeführt worden. Die hohen Mindest-Hemmkonzentrntionswerte - wenn sie mit denen des Beispiels 30 verglichen werden beruhen auf dem verwendeten Grundimpfstoff.

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- 86 Beispiel 4γ

Extraktion von Clavulansäure unter Verwendung von flüssigen IonenaustauGeherharzen

200 mg eines Kulturfiltrats, das in ähnlicher Weise wie in Bei spiel 3, jedoch unter Verwendung eines Mediums mit einem Gehalt an 0,1 Volumenprozent KHgPO^ anstelle von 0,01 Prozent FeSO^ erhalten worden ist, wird 30 Minuten bei 5°C mit 66 ml "Amberlite LA2" in der Chloridform mit 15 Volumenprozent Methylisobu tylketon extrahiert.

Die Phasen werden durch 20minütiges Zentrifugieran mit l66O g getrennt. Die Lösungsmittelphase (60 ml) wird mittels einer Pipette entnommen und in vier gleiche Anteile aufgeteilt. Jeder Anteil wird durch 20minütiges Rühren bei 5⁰C mit einem Viertel des Volumens (3*75 ml) eines wässrigen Extraktionsmittels, wie es nachstehend in der Tabelle angegeben ist, extrahiert. Das erhaltene Gemisch wird 15 Minuten zentrifugiert (l660"g). Aus jeder Extraktion werden 3,6 ml einer wässrigen Phase gewonnen.

■ Probe	Volumen (ml)	Clavulansäure- Konzentration (Mg/ml)	Clavulan säure (mg)
geklärte Bouillon extrahierte Bouillon •n-NaCl -Extrakt 2m-NaCl-Extrakt -Ji-NaNO-,--Extrakt j 2ir-NaN07-Kxtrakt	200 200 3,6 3,6 3,6 3,6	128 15 305 598 638 758	25,4 3,0 1,1 2,5 2,3 2,73

Das mit 2-m η a tr: Gewinnung von K-\

umriitrat erhaltene Ergebnis zeigt die

rozeat aus einer geklärten Nährbcuillon an.

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- 87 Beispiel 48

Extraktion der Clavulansäure unter Verv/endur.r; eines flüssigen Ionenaustauscherharzes

47 Liter der nach Beispiel 12 erhaltenen geklärten Bouillon werden mit 12,? Liter "Amberlite LA2" in der Acetatform in 15 Volumenprozent Methylisobutylketon durch 1 stündiges Rühren bei 17⁰C extrahiert. Nach Zusatz von 500 ml Octan-1-öl werden die Phasen in einer kontinuierlichen Zentrifuge separiert, wobei man 9,2 Liter der Lösungsmittelphase erhält, die dann bei 5⁰C 90 Minuten mit 2,3 Liter einer 1-m Natriumnitratlösung verrührt wird. Das Gemisch wird mittels einer kontinuierlichen Z°ntrifuge aufgetrennt und ergibt 2,4 Liter einer wässrigen Phase (einschließlich des für Verdrängungszwecke verwendeten Wassers). Die wässrige Phase, deren ursprünglicher pH-Wert 8,0 war, wird auf einen pH-Wert von 7,0 mittels konzentrierter Salzsäure eingestellt.

Probe

Volumen (Liter)

Clavulansäure-Konzentration (pg/ml)

Clavulansäure (mg)

geklärte Bouillon 47

extrahierte
Bouillon

m-NaNO^-Extrakt

47 2,4

146

19 1638

6862

893

Die Extraktionswirksamkeit aus der geklärten Bouillon beim Natriumnitrat-Extrakt beträgt 57 Prozent.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   2. Pharmakologisch verträgliche Salze der Clavulansäure nach Anspruch 1.

   3. Salze nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formeln III und IV

   CH₂OH

   CH₂OH

   (IV)

   4. Ester nach Anspruch 1, die im Gewebe von Säugern zu Verbindungen nach Anspruch 2 hydrolysieren.

   5. Ester nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeinen Formeln V und VI

   CH₂OH

   (V)

   - CO - A:

   5098^3/09 3

   CH₂°^H

   (VI)

   wobei A, ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist, Ap ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeutet, A-, für einen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest steht, X und Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome sind und Z einen zweiwertigen organischen Rest darstellt.

   6. Ester nach Anspruch 5* gekennzeichnet durch die allgemeinen Formeln VII und VIII

   CH₂OH

   CO-O-CH-O-CO-A₅

   (VII)

   (VIII)

   wobei Aw ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe ist, A,- die Methyl-, tert.-Butyl- oder die Phenylgruppe bedeutet und Ag ein

   und

   UiIU /

   Wasserstoffatom/oder die Methoxygruppe darstellt.

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   7. Ester nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel IX

   (IX)

   in der R einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoff-" atomen ist, der durch Halogenatome, niedere Alkoxyreste, Hydroxylgruppen oder durch gegebenenfalls in Salzform vorliegende NR R-^-

   2 3

   Reste substituiert sein kann, wobei R und Br gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome und/oder niedere Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden können.

   8. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 7* dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces clavuligerus züchtet und aus dem Kulturmedium die Clavulansäure oder deren Salz gewinnt, gegebenenfalls anschliessend in an sich bekannter Weise die freie Säure, ein Salz oder einen Ester dieser Säure bildet.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 oder eine eine hohe Ausbeute liefernde Mutante davon verwendet.

   10. Verfahren nach den Ansprüchen 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Clavulansäure aus dem angesäuerten Kulturmedium mit einan mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungs-

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   - 91 mittel extrahiert.

   11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß -man als Lösungsmittel n-Butanol verwendet.

   12. Verfahren nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Clavulansäure in eine wässrige Phase unter annähernd neutralen Bedingungen rückextrahiert und daß man ein Salz der Clavulansäure aus der wässrigen Lösung durch Entfernen des Lösungsmittels bildet und isoliert.

   13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Clavulansäure aus dem Kulturmedium ah ein stark basisches oder ein schwach basisches Anionenaustauscherharz adsorbiert und es davon durch Eluieren mit einem anorganischen Salz gewinnt.

   14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ein unreines Salz der Clavulansäure, chromatographisch reinigt.

   15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel X

   (X)

   \ CO-O-CH-A₇

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   -.92 -

   in der A₇ ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe ist und Ag eine gegebebenenfalls substituierte Phenylgruppe bedeutet, hydrierend zu Clavulansäure oder deren Salz spaltet.

   16. Verfahren nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 8 bis l4, dadurch gekennzeichnet,.daß man

   (a) ein Salz der Clavulansäure mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Q-R, in der Q eine leicht ersetzbare Gruppe ist und R einen organischen Rest bedeutet, umsetzt;

   (b) Clavulansäure mit einem Diazoalkan umsetzt oder

   (c) Clavulansäure mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels umsetzt.

   17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis l6, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer Verbindung der allgemeinen Formel XII

   ,CH₂OH

   (XII) *CO-O-CO-OR

   Jl

   in der R ein inerter organischer Rest ist, Kohlendioxid abspaltet und eine Verbindung der allgemeinen Formel XI

   ,CH₂OH

   (XI)

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   bildet.

   18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XI mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH oder einem Thiol der allgemeinen Formel RSH, in denen R ein organischer Rest ist, umsetzt.

   19. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Clavulansäure, deren Salze oder Ester nach den Ansprüchen 1 bis 7.

   20. Ausfuhrungsform nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel zusätzlich ein ß-Lactam-Antibiotikum enthält.

   21. Ausführungsform nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel als ß-Lactam-Antibiotikum Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Carbenicillin, Methicillin, Propicillin, Ampicillin, Amoxycillin, Epicillin, Ticarcillin, Cyclacillin, 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure, Cephaloridin, Cephalothin, Cefazolin, Cephalexin, Cefoxitin, Cephacetril, Cephamandol, Cephapirin, Cephradin, Cephaloglycin und andere Penicilline und Cephalosporine oder deren Vorstufen, wie Hetacillin, Metampicillin, die Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder die Phthalylester von Benzylpenicillin, Ampicillin, Amoxycillin oder Cephaloglycin oder die Phenyl-, Tolyl- oder Indanyl-<^-ester von Carbenicillin oder Ticarcillin enthält.

   22. Ausfuhrungsform nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel pharmakolo-

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   gisch verträgliche Verdünnungsmittel und/oder Trägerstoffe und/ oder übliche Zusatzstoffe enthält.

   2j5. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Clavulansäure oder deren Salze oder Ester gegenüber dem ß-Lactam-Antibiotikum 10 : 1 bis 1 : 10 beträgt.

   24. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 23, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 150 bis 1000 mg Amoxycillin oder Ampicillin oder einer Vorstufe davon und von 50 bis 500 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbarer Ester. ·

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