CH629252A5 - Verfahren zur herstellung von clavulansaeure und deren salzen. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 50 Die ß-Lactamase-Hemmsubstanz der Mischung wird als Syner-Clavulansäure sowie deren Salze, die die nachstehende Formel gist bezeichnet. Derartige Substanzen sind vorteilhaft zur I besitzt: Erhöhung der antibakteriellen Wirksamkeit von Penicillinen und Cephalosporinen gegen resistente Organismen. Es ist eine , cho0h Aufgabe vorliegender Erfindung, derartige Synergisten bereit-

55 zustellen.

Anwendungsbeispiele von bestimmten ß-Lactamase-resi-stenten halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen als ß-Lactamase-Hemmstoffe und Synergisten für Penicilline , T. und Cephalosporine sind bereits in der Literatur beschrieben, * ' so z. B. von Sutherland und Mitarbeiter in Nature 201 (1964), 868; Sabath und Mitarbeiter in Nature 204 (1964), 1066; O'Callaghan und Mitarbeiter in Antimicrob. Agents and Chemotherapy 1968 (1969), 67. Jedoch besitzt keine dieser bekannten Substanzen einen besonders eindrucksvollen Effekt auf das Spektrum 65 des anderen, im Gemisch vorliegenden Antibiotikums.

durch aerobes Züchten eines Stammes von Streptomyces cla- Es ist auch von einigen Actinomycetes-Züchtungen vuligerus ATCC 27 064 und Gewinnen der Verbindung der For- beschrieben worden, dass die ß-Lactamase-Hemmstoffe erzeu-mel I oder von deren Salzen aus dem Kulturmedium. gen, die mit Penicillinen oder Cephalosporinen synergistisch co2h

wirken, z. B. die in der GB-PS 1 363 075 und von Hata und Mitarbeitern in J. Antibiotics 25 (1972), S. 473 und Umezawa und Mitarbeitern in J. Antibiotics 25 (1973), S. 51, beschriebenen Züchtungen. Von diesen 3-Lactamase-Hemmstoffen von Acti-nomycetes ist bisher noch keine klinische Verwendbarkeit festgestellt worden. Besonders bemerkenswerte Merkmale, die Clavulansäure von anderen ß-Lactamase-Hemmstoffen von Acti-nomyceten unterscheiden, sind ihre Extrahierbarkeit in organische Lösungsmittel aus dem Nährmedium bei pH 2, ihre hohe Stabilität in Menschenblut und ihr breites Antibiotika-Spektrum und ß-Lactamase-Hemmwirkung, ihr niedriges Molekulargewicht und ihr hoher RrWert bei der Papierchromatographie bei Anwendung zahlreicher Lösungsmittelsysteme.

Es ist gefunden worden, dass die aerobe Züchtung von Streptomyces clavuligerus in üblichen Nährmedien bei etwa 25 bis 30 °C unter annähernd neutralen Bedingungen eine ß-Lacta-mase-Hemmsubstanz erzeugt, die auch eine antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese neue Substanz wird als «Clavulansäure» bezeichnet.

Clavulansäure hat folgende Eigenschaften:

(a) Sie ist eine Carbonsäure;

(b) sie bildet ein Natriumsalz, das ein charakteristisches Infrarot-Spektrum besitzt, wie es im wesentlichen aus der Zeichnung hervorgeht;

(c) sie vermag das Wachstum von Staphylococcus aureus-Stämmen zu hemmen;

(d) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen;

(e) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Cephalori-din gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen; und

(f) sie bildet einen Methylester, der aufgrund der Massenspektroskopie ein Molekulargewicht von 213,0635 entsprechend der Formel CsHnNOs besitzt.

Die Clavulansäure kann als einwertige Carbonsäure der Formel C8H9NO5 betrachtet werden, die in Form des Natriumsalzes ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum besitzt, das im wesentlichen dem in der Zeichnung gezeigten entspricht.

Die von Streptomyces clavuligerus erzeugte Verbindung mit den vorgenannten Eigenschaften besitzt die Formel II

c0„h

Die Clavulansäure kann als 3-<ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa-1 -azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carbonsäure bezeichnet werden.

In stereochemischer Hinsicht sind die Kohlenstoffatome in 2- und 5-Stellung der Clavulansäure gleich wie bei den natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen, so dass die Clavulansäure durch die nachstehende Strukturformel (I) dargestellt werden kann:

629252

co h

Deshalb ist der vollständigere chemische Name für Clavulansäure Z-(2R,5R)-3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo4-oxa-l -azabi-cyclo[3,2,0]heptan-2-carbonsäure.

Die hervorragende Brauchbarkeit der Clavulansäure wird erst richtig erkannt, wenn man sich vergegenwärtigt, dass bestimmte Stämme von Klebsiella aerogenes A, deren Wachstum durch die Anwesenheit von 125 |ig/ml Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin oder Benzylpenicillin oder durch die Anwesenheit von 10 jig/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorhandensein von unter 12,5 (ig/ml der vorerwähnten Penicilline jedoch gehemmt werden, wenn gleichzeitig 5 (ig/ml Clavulansäure vorhanden sind. Ähnliche Ergebnisse sind bei Gemischen mit einem Gehalt verschiedener Ester der Clavulansäure beobachtet worden. Zum Beispiel werden Stämme von Klebsiella aerogenes A, deren Wachstum durch 125 |xg/ml Ampicillin oder durch 10 jig/ml Clavulansäure-methylester nicht gehemmt wird, jedoch von unter 12,5 (ig/ml Ampicillin in Gegenwart von 5 (ig/ml Clavulansäure-methylester gehemmt. Es ist ferner festgestellt worden, dass Stämme von Staphylococcus aureus Russell, deren Wachstum durch die Gegenwart von 100 ng/ml Ampicillin oder durch 5 ng/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorliegen von unter 10 (ig/ml Ampicillin in Gegenwart von 1 ng/ml Clavulansäure gehemmt werden. Bei Untersuchungen an weiblichen Mäusen ist festgestellt worden, dass beträchtlich über 5 ng/ml liegende Mengen an Clavulansäure im Blut und Gewebe in einfacher Weise durch eine subcutane Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erreicht werden können und dass brauchbare Mengen an Clavulansäure nach einer oralen Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erhalten werden können.

Die zweckmässigsten Salze der Clavulansäure sind die pharmakologisch verträglichen Salze, wie das Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und das Ammoniumsalz, ferner substituierte Ammoniumsalze, wie das Tri-methylammoniumsalz, sowie weiterhin Benzathin-, Procain-und ähnliche Salze, wie sie üblicherweise mit Penicillinen oder Cephalosporinen gebildet werden. Die Herstellung pharmakologisch nicht verträglicher Salze der Clavulansäure bildet ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung, da die Salze wertvolle Produkte bei der Herstellung der Ester der Clavulansäure sind. Zum Beispiel kann das Lithium- oder das Silbersalz der Clavulansäure mit Benzylbromid unter Bildung des wertvollen Benzylesters der Clavulansäure umgesetzt werden.

Die Salze der Clavulansäure sind gewöhnlich stabiler als die freie Säure per se und ihre Herstellung bildet daher einen bevorzugten Gegenstand vorliegender Erfindung. Besonders zweckmässige Salze der Clavulansäure sind das Natrium- und das Kaliumsalz der nachstehenden Formeln III und IV:

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

629252

Leicht hydrolysierbare Ester umfassen auch die Ester der allgemeinen Formeln V und VI, doch sind sie nicht auf diese beschränkt:

(iii)

c02Na cho0h 0 / 2

(iv)

ch2oh i

c — x !

a2

•— co ~a

3 (V)

ch2oh

Kristalline Formen derartiger Salze können Hydratwasser ' enthalten.

Zweckmässige Ester der Clavulansäure sind diejenigen, die sich von den betreffenden Alkoholen ableiten, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, 2,2,2-Trichloräthanol, 2,2,2-Trifluor-äthanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, Phenol, Acetoxy-methanol, Trimethylacetoxymethanol, 2-Dimethylaminoätha-nol und anderen üblichen Alkoholen. Zahlreiche Ester der Clavulansäure sind wertvolle Zwischenprodukte bei bestimmten Verfahren zur Reindarstellung der Clavulansäure. Viele Clavu-insäureester sind wertvolle synergistische Verbindungen. Die Wirksamkeit derartiger Ester dürfte in einer Hydrolyse des Esters zur freien Säure liegen.

Wenn vorstehend der Ausdruck «Ester» verwendet wird, so schliesst er die Ester mit ein, die sich begrifflich von einem Alkohol oder einem Thiol der allgemeinen Formeln ROH oder RSH ableiten, in denen R ein organischer Rest ist. Geeignete Reste für R sind Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylalkyl- oder andere ähnliche Reste, die auch substituiert sein können. Um das Molekulargewicht nicht übermässig zu erhöhen, sollten die Reste R normalerweise nicht über 16 Kohlenstoffatome, zweckmässigerweise nicht über 12 Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt nicht über 8 Kohlenstoffatome enthalten.

Vorzugsweise leitet sich der Rest R von einem Alkohol ROH oder nicht ganz so bevorzugt von einem Thiol RSH ab, die pharmakologisch verträglich sind.

Beispiele von geeigneten Substituenten an den Resten R sind Halogenatome, Hydroxylgruppen, niedere Alkoxy-, niedere Acyloxy-, niedere Alkylamino- oder niedere Dialkylamino-reste. Der Ausdruck «nieder» gibt an, dass der Rest bis 6 Kohlenstoffatome und vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoffatome enthält Demzufolge kann R die Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopro-pyl-, geradkettige oder verzweigte Butyl-, Pentyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Vinyl-, Allyl-, Bute-nyl-, Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cyclohexenyl-, Cyclohexadienyl-, Methylcyclo-pentyl-, Methylcyclohexyl-, Benzyl-, Benzhydril-, Phenyläthyl-, Naphthylmethyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Propinyl-, Tolyl-, 2-Chlor-äthyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-, 2,2,2-Trifluoräthyl-, Acetylmethyl-, Benzoylmethyl-, 2-Methoxyäthyl-, 2-Dimethylaminoäthyl-,

2-DiäthyIaminoäthyl-, 2-Piperidinoäthyl-, 2-MorphoIinoäthyl-,

3-Dimethylaminopropyl-, p-Chlorbenzyl-, p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Brombenzyl-, m-Chlorbenzyl-, 6-Methoxy-naphthyl-2-methyl-, p-Chlorphenyl- und die p-Methoxyphenyl-gruppe und ferner solche Gruppen bedeuten, die aus der Penicillin- oder Cephalosporin-Chemie zur Herstellung solcher Ester bekannt sind, die in vivo leicht zur antibiotischen Stammsubstanz hydrolysieren.

(VI)

= y in denen Ai ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist, A2 ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeutet, A3 für einen Alkyl-, Aryl- oer Aralkylrest steht, X und 35 Y Sauerstoff- und/oder Schwefelatome sind und Z einen zweiwertigen organischen Rest darstellt. Ester der allgemeinen Formeln V und VI, die nach einer Verabreichung ziemlich leicht die Clavulansäure im Blutkreislauf freisetzen, schliessen auch solche ein, in denen Ai ein Wasserstoffatom, a2 ein Was-40 serstoffatom oder die Methylgruppe und A3 die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Benzyl- oder die Phenylgruppe sind, sowie solche, in denen X ein Sauerstoffatom, Y ein Sauerstoffatom ist und Z eine der Gruppierungen -ch2ch2-, -CH:CH-,

OC

oder yx

0ch-

0ch-

50 darstellt.

Wenn in Verbindung mit den vorstehenden Formeln der Ausdruck «Alkyl» verwendet wird, schliesst er Alkylreste bis zu 6 Kohlenstoffatomen ein. Der Ausdruck «Aryl» bedeutet die Phenyl- oder die Naphthylgruppe oder ferner einen Phenylrest, 55 der durch einen inerten Substituenten, wie ein Fluor- oder Chloratom oder die Methyl- oder Methoxylgruppe oder dergleichen, substituiert ist. Wenn hierin der Ausdruck «Aralkyl» verwendet wird, bedeutet er einen durch einen Arylrest substituierten Alkylrest.

60 Besonders zweckmässige Ester der allgemeinen Formeln V und VI sind diejenigen, der allgemeinen formein VII und VIII:

:h20h

(VII)

co - 0 - ch - 0 - co - ac

629 252

0

(Vili)

In diesen Formeln bedeutet A4 ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe, As die Methyl-, tert.-Butyl- oder die Phenyl-gruppe und As ein Wasserstoffatom und/oder die Methoxy-gruppe.

Zahlreiche Ester der Clavulansäure unterscheiden sich von analogen Estern von Penicillinen oder Cephalosporinen darin, dass sie eine erhöhte Bereitschaft zur Hydrolyse zu Clavulansäure unter milden Bedingungen zeigen. So hydrolysieren z. B. einfache Alkylester, wie der Methylester, langsam in auf pH 7 gepuffertem Wasser zu Clavulansäure. Ester, die schon unter milden Bedingungen in gewissem Grad eine Hydrolyse erleiden, sind solche der allgemeinen Formel IX:

30

(IX)

in der R1 ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist, der durch Halogenatome, niedere Aikoxyreste, Hydro- 40 xylgruppen oder durch gegebenenfalls in Salzform vorliegende NR2R3-Reste substituiert sein kann, wobei R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome und/oder niedere Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6gliedrigen Ring bilden können. 45

Wenn unter Bezugnahme auf die allgemeine Formel IX der Ausdruck «nieder» verwendet wird, bedeutet er, dass der Rest 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.

Geeignete Reste für R1 sind Alkyl- und Aralkylreste, die gegebenenfalls durch Halogenatome, Hydroxyl- oder Methoxy-50 gruppen oder durch in Salzform vorliegende NR2R3-Reste substituiert sein können, wobei R2 der Methyl- oder Äthylrest und R3 der Methyl- oder Äthylrest ist oder mit dem Rest R2 unter Einschluss des Stickstoffatoms zu einem Pyrrolidin-, Piperidin-oder Morpholinrest verbunden ist.

Die zweckmässigsten Alkylreste für R1 sind geradkettige Reste bis zu 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch eine Methoxy- oder eine Hydroxylgruppe, einen in Salzform vorliegenden NR2R3-Rest oder ein Chlor-, Brom- oder Jodatom oder durch die CCI3- oder CFî-Gruppe substituiert sind.

Die Ester der Clavulansäure sind besonders brauchbar als Synergisten, wenn sie in Geweben von Säugern, insbesondere im menschlichen Blut unter Bildung von Clavulansäure oder dessen Salz hydrolysieren, da man annimmt, dass Clavulansäure oder deren Salze etwas stärker wirksame antibakterielle Mittel 65 als die Ester per se sein dürfen. Zahlreiche Ester der allgemeinen Formeln V bis IX sind für diese Zwecke brauchbar.

Eine weitere Gruppe besonders geeigneter Ester sind jene

55

60

wertvollen Zwischenprodukte, die leicht in Clavulansäure oder deren Salz durch chemische oder biochemische Methoden, die aus der Penicillin- oder Cephalosporin-Chemie bekannt und ausreichend milde sind, die reaktionsfähigen säurelabilen ß-Lactamringe aufzuspalten, überführt werden.

Am zweckmässigsten ist natürlich ein Ester, der durch Hydrierung spaltbar ist. Übliche Ester für ein derartiges Verfahren sind die Benzyl-, substituierten Benzyl-, Benzhydril-, substituierten Benzhydril- oder die Tritylester. Der Benzylester hat sich als besonders zweckmässig für dieses Verfahren erwiesen.

Im grossen und ganzen ist die Art eines Substituenten im Esterrest ohne Bedeutung, so lange er nicht bei der Spaltung durch Hydrierung stört.

Es ist bereits vorstehend darauf hingewiesen worden, dass Clavulansäure und ihre Salze und Ester wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen. Sie können für ihre Anwendung als Arzneimittel zusammen mit pharmakologisch unbedenklichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln verarbeitet werden.

Die Arzneimittel umfassen solche in einer Form, die für eine orale, lokale oder parenterale Anwendung geeignet sind und die zur Behandlung von Infektionen bei Säugern, einschliesslich Menschen, verwendet werden können.

Zweckmässige Formen der Arzneimittel sind Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, Suspensionen, Lösungen, Trocken-säfe und sterile, zu Injektions- oder Infusionszwecken geeignete Formen. Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallhilfsmittel und dergleichen gemäss einer üblichen pharmakologischen Praxis zur Formulierung von Antibiotika enthalten, wie sie dem Fachmann bekannt ist. Injizierbare oder infundierbare Arzneimittel der Clavulansäure oder deren Salze sind besonders zweckmässig, da grosse Mengen der Verbindung Clavulansäure im Gewebe nach einer Verabreichung durch Injizieren oder Infundieren auftreten können. Demzufolge ist ein besonderes bevorzugtes Arzneimittel die Clavulansäure oder deren Salze in steriler Form.

Einzeldosierungen mit einem Gehalt an Clavulansäure oder deren Salz oder Ester, die für eine orale Verabreichung ange-passt sind, bilden ein weiteres bevorzugtes Arzneimittel.

Unter bestimmten Voraussetzungen kann die Wirksamkeit der oralen Arzneimittel mit Clavulansäure und deren Salze oder Ester verbessert werden, wenn derartige Arzneimittel eine Puffersubstanz enthalten oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehen sind, so dass die Wirkstoffe keine lange Berührungszeit mit dem hochgradig sauren Magensaft haben. Derartige gepufferte oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehene Arzneimittel können nach den üblichen pharmazeutischen Techniken hergestellt werden.

Die Clavulansäure oder deren Salze oder Ester können in den Arzneimitteln als einziger therapeutischer Wirkstoff vorliegen oder sie können zusammen mit anderen therapeutischen Mitteln, wie einem ß-Lactam-Antibiotikum, vergesellschaftet sein. Geeignete ß-Lactam-Antibiotika zum Einarbeiten in derartige synergistische Arzneimittel schliessen nicht nur solche ein, die in hohem Masse gegen ß-Lactamase empfindlich sind, sondern auch solche, die einen guten Grad an innewohnender Widerstandsfähigkeit gegen ß-Lactamasen haben. Demzufolge sind geeignete ß-Lactam-Antibiotika zum Einarbeiten in die Arzneimittel Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Carbe-nicillin, Methicillin, Propicillin, Ampicillin, Amoxycillin, Epicil-lin, Ticarcillin, Cyclacillin, 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminoce-phalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure, Cephaloridin, Cephalothin, Cefazolin, Cephlexin, Cefoxitin, Cephacetril, Cephamandol, Cephapirin, Cephradin, Cephalo-glycin und andere gut bekannte Penicilline und Cephalosporine oder deren Vorstufen, wie Hetacillin, Metampicillin, ferner die

629252

Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder die Phthalidyl-ester von Benzylpenicillin, Ampicillin, Amoxycillin oder Cepha-loglycin oder der Phenyl-, Tolyl- oder Indalyl-a-ester von Carbe-nicillin oder Ticarcillin oder dergleichen.

Wenn natürlich das im Arzneimittel vorliegende Penicillin oder Cephalosporin nicht für eine orale Verabreichung geeignet ist, dann wird das Arzneimittel für eine parenterale Verabreichung angepasst.

Wenn die Clavulansäure oder deren Salze oder Ester in den Arzneimitteln zusammen mit einem ß-Lactam-Antibiotikum vorliegen, kann das Verhältnis der vorhandenen Clavulansäure oder deren Salz oder Ester zum vorhandenen ß-Lactam-Antibiotikum von beispielsweise 10:1 bis 1:10 und vorteilhafterweise von 3:1 bis 1:3 sein.

Die Gesamtmenge der in einer Einzeldosierungsform vorhandenen antibakteriellen Mittel liegt gewöhnlich zwischen 50 und 1500 mg und üblicherweise zwischen 100 und 1000 mg.

Die Arzneimittel können zur Behandlung von Infektionen von u. a. der Atemwege, des Harnsystems und der Weich teile beim Menschen verwendet werden. Sie können auch zur Behandlung von Infektionen bei Haustieren, wie der Mastitis beim Vieh, eingesetzt werden.

Üblicherweise werden zwischen 50 und 6000 mg der erfin-dungsg^mäss hergestellten Verbindung je Behandlungstag verabreicht, jedoch vorzugsweise zwischen 500 bis 3000 mg je Tag. Jedoch für eine Behandlung schwerer Körperinfektionen oder Infektionen eines besonders schwer beeinflussbaren Organismus können in Übereinstimmung mit der klinischen Praxis höhere Dosen verwendet werden.

Die genaue Form der Arzneimittel hängt in bestimmtem Mass von dem zu behandelnden Mikroorganismus ab. Für eine Behandlung von Infektionen werden die Arzneimittel üblicherweise so eingestellt, dass sie ein Maximum beim Blutspiegel von mindestens 0,1 pg/ml, noch zweckmässiger von mindestens 0,25 ug/ml und vorzugsweise von mindestens 1 jxg/ml Clavulansäure hervorrufen.

Die Penicilline oder Cephalosporine in den synergistisch wirkenden Arzneimitteln sind üblicherweise bis zu oder bei annähernd einer üblicherweise verwendeten Menge vorhanden, wenn das betreffende Penicillin oder Cephalosporin als einziges, bei der Behandlung der Infektion verwendetes therapeutisches Mittel vorliegt.

Besonders begünstigte Arzneimittel enthalten 150 bis 1000 mg Amoxycillin, Ampicillin oder eine deren Vorstufen und 50 bis 500 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbaren Ester, noch zweckmässiger 200 bis 500 mg Amoxycillin, Ampicillin oder deren Vorstufen und 50 bis 250 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbaren Ester.

Die Substanzen in derartigen Arzneimitteln können gegebenenfalls in hydratisierter Form vorliegen. Die Gewichte der Antibiotika in solchen Arzneimitteln wird auf der Grundlage des aus dem Arzneimittel theoretisch verfügbaren Antibiotikums und nicht auf der Basis des Gewichts pro Arzneimittel ausgedrückt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und von deren Salzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erhaltenen Clavulansäure oder deren Salze zur Herstellung der entsprechenden Ester.

Der hier verwendete Ausdruck «züchten» bedeutet ein wohlerwogenes aerobes Wachstum des Clavulansäure erzeugenden Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Kohlen-Stoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalzen. Diese aerobe Wachstum kann auf einem festen oder .halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Nährmedium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder mittels einer Submers-Kultur stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt oder chemisch definiert sein. Es wurde diesseits gefunden, dass Medien mit komplexen Nährstoffen, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, besonders geeignet sind.

Die Nährmedien, die zum Züchten von Streptomyces clavuligerus verwendet werden können, können 0,1 bis 10 Prozent einer komplexen organischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Maisquellwasser, pflanzliches Protein, Saatprotein, Hydrolysate derartiger Proteine, Milchprotein-Hydrolysate, Fisch- und Fleischextrakte und Hydrolysate derartiger Peptone enthalten. Gegebenenfalls können chemisch definierte Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Amide, einzelne oder Gemische von gewöhnlichen Aminosäuren, z. B. Valin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Prolin und Phenylalanin, eingesetzt werden. Kohlenhydrate in einer Menge von 0,1 bis 5 Prozent können in den Nährmedien vorliegen, doch ist Glukose in bestimmten Medien unerwünscht, da sie eine nachteilige Wirkung auf die Ausbeute der erwünschten Clavulansäure hat. Stärke oder Stärkehydrolysate, wie Dextrine, Saccharose, Lactose oder andere Zucker oder Glyzerin oer Glyzerinester können ebenfalls eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann sich auch von pflanzlichen Ölen oder tierischen Fetten ableiten. Carbonsäuren und ihre Salze können als Kohlenstoffquelle für das Wachstum und die Erzeugung von ß-Lactamase-Hemmstoffen eingesetzt werden. Ein besonders geeignetes Medium, das preiswert ist, enthält Sojabohnenmehl, das unter dem Warenzeichen «Arkasoy» im Handel ist, zusammen mit Malzdestillat-Trockensaft, der unter dem Warenzeichen «Scotasol» im Handel ist, sowie Dextrin.

Der Zusatz von Antischaummitteln, wie Polyoxyalkylende-rivate von Propylenglykol, wie das unter dem Warenzeichen «Pluronic L81» bekannte Produkt, können zur Steuerung des Schäumens von bestimmten Medien im Fermenter erforderlich sein.

Mineralsalze, wie NaCl, KCl, MgCk, ZnCk, FeCh, Na2S04, FeS04, MgSÜ4 und Natrium- oder Kaliumsalze der Phosphorsäure können den vorgenannten Medien zugegeben werden, insbesondere wenn sie chemisch definiert sind. CaCOî kann als Quelle für Calciumionen oder zu Pufferungszwecken zugesetzt werden. Salze von Spurenelementen, wie Nickel, Kobalt oder Mangan, können ebenfalls mit eingesetzt werden. Vitamine kann man gegebenenfalls ebenfalls zusetzen.

Wenn hierin der Ausdruck «Mutante» verwendet wird, umfasst er beliebige Mutanten, die sich spontan entwickeln oder durch Einwirkung eines äusserlichen Mittels entstehen, gleichgültig ob dieses Mittel absichtlich oder in anderer Weise angewendet wird. Zweckmässige Methoden zur Erzeugung von Mutantenstämmen sind von H.I. Adler in dem Kapitel «Techniques for the Development of Micro-Organisms» in dem Buch «Radiation and Radioisotopes for Industriai Micro-Organisms», Proceedings of a Symposium, Wien 1973, S. 241, International Atomic Energy Authority, beschriebenworden. Diese Techniken umfassen:

(1) Ionisierende Bestrahlung, wie Röntgen- oder y-Strahlen, UV-Licht, UV-Licht plus ein fotoempfindliches Mittel (wie 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimi-din-Analoga(wie 5-Bromuracil), Acridine, alkylierende Mittel (wie Senfgas, Äthyl-methan-sulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Wärme und

(2) genetische Techniken, wie Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisation, lysogenetische Konversion und selektive Techniken für spontane Mutanten.

Das Züchten von Streptomyces clavuligerus findet normalerweise bei Temperaturen von 15 bis 40 °C, gewöhnlich 20 bis 35 °C und vorzugsweise 25 bis 30 °C und bei einem pH-Wert von 5 bis 8,5, vorzugsweise von 6 bis 7,5, statt.

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

629252

Der Stamm Streptomyces clavuligerus kann in den oben genannten Medien in belüfteten konischen Glasflaschen durch Schütteln auf einem Drehschüttler oder in mit Prallblechen ausgerüsteten und mit Scheibenkreiselmischern gerührten und mittels Zerstäubereinrichtungen belüfteten Züchtungsgefässen 5 aus rostfreiem Stahl gezüchtet werden. Die Fermentation kann auch kontinuierlich durchgeführt werden.

Der Ausgangs-pH-Wert der Fermentation ist typischerweise 7,0. Die höchste Ausbeute an Clavulansäure erhält man in 2 bis 10 Tagen bei einer Temperatur von 20 bis 35 °C. In einem io Rührzüchtungsgefäss aus rostfreiem Stahl unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Mediums mit Sojabohnenmehl, Malzdestillat-Trockensaft und Dextrin beträgt die bevorzugte Temperatur 26 °C. Das Maximum an Clavulansäure wird innerhalb 5 T agen erhalten. 15

Die Clavulansäure kann aus dem Filtrat der Nährbouillon auf die verschiedensten Weisen extrahiert werden. Die Lösungsmittel-Extraktion aus dem kalten, auf saure pH-Werte eingestellten Filtrat einerseits und die sich auf die anionische Natur des Stoffwechselprodukte beziehende Verfahren, wie 20 die Verwendung von Anionenaustauscherharzen, andererseits haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Zellen des Streptomyces clavuligerus werden normalerweise zuerst aus dem Züchtungsmedium durch Abfiltrieren oder Zentrifugieren entfernt, bevor man mit der Extraktion beginnt. 25

Beim Lösungsmittelextraktionsverfahren kühlt man das Filtrat der Nährbouillon und erniedrigt den pH-Wert auf einen Bereich von 2 bis 3 durch Zugabe von Säure, währenddessen das Filtrat gründlich mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel vermischt wird, wie n-Butylacetat, 30 Methylisobutylketon, n-Butanol oder Äthylacetat. Die zur Herabsetzung des pH-Wertes des Mediums verwendete Säure ist gewöhnlich eine Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder dergleichen. n-Butanol ist ein besonders geeignetes Lösungsmittel 35 zum Einsatz bei der Extraktion des angesäuerten Nährbouillon-Filtrats. Nach der Abtrennung der Phasen durch Zentrifugieren wird das die ß-Lactamase-inhibierende Stoffwechselprodukt aus dem Lösungsmittel in wässriger Bicarbonatlösung oder Kaliumhydrogenphosphat-Pufferlösung, Calciumcarbo- 40 nat-Suspension oder Wasser rückextrahiert, währenddessen der pH-Wert annähernd neutral gehalten wird, z. B. bei pH 7,0. Dieser wässrige Extrakt nach der Trennung der Phasen kann unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet werden, um ein Rohprodukt eines Salzes der Clavulansäure zu 45 erhalten. Dieses Rohprodukt ist stabil, wenn es im trockenen Zustand bei -20 °C gelagert wird.

Bei dem Anionenaustauscherharz-Verfahren wird das geklärte Filtrat der Nährbouillon bei einem annähernd neutralen oder schwachsauren pH-Wert, z. B. bei pH 6 bis 7, an einer 50 Säule mit einem schwach- oder stark basischen Anionenaustau-scherharz, wie «Amberlite IR4B» oder «Zerolit FFIF», perko-liert, bis das Harz gesättigt ist und die ß-Lactamase-hemmende Substanz am Fuss der Säule austritt. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen und mit wässriger Natriumchloridlösung 55 eluiert. Die ß-Lactamase-hemmenden Fraktionen werden gesammelt, vereinigt, entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält ein festes Rohsalz der Clavulansäure.

Eine Alternative des Extraktionsverfahrens besteht in einem In-Berührung-Bringen des Filtrats der Nährbouillon - 60 gewöhnlich bei annähernd neutralem pH-Wert -, das ein Salz der Clavulansäure enthält, mit einer organischen Phase, in der ein wasserunlösliches Amin gelöst ist. Beispiele geeigneter organischer Lösungsmittel sind die üblichen, mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, 65 Trichloräthylen und dergleichen. Beispiele geeigneter Amine sind sekundäre oder tertiäre Amine, in denen einer der Substituenten ein langkettiger aliphatischer Rest, z. B. mit 12 bis 16

Kohlenstoffatomen, und der andere Rest ein tertiärer Alkylrest ist, so dass das Molekül lipophil ist. Es ist festgestellt worden, dass «Amberlite LA2» sich als erfolgreiches Amin erwiesen hat. Üblicherweise wird das Amin als Säureadditionssalz eingesetzt.

Nach diesem Extraktionsverfahren liegt die Clavulansäure in der organischen Phase als Aminsalz vor. Die organische Phase wird dann von dem Filtrat der Nährbouillon abgetrennt. Die Clavulansäure kann in die wässrige Phase mittels einer Salzlösung, vorzugsweise einer konzentrierten Lösung von Natriumchlorid, Natriumnitrat oder dergleichen, zurückextrahiert werden. Das rohe Salz der Clavulansäure kann dann durch Gefriertrocknen oder dergleichen erhalten werden.

Weitere Grundverfahren zur Isolierung, die angewendet werden können, umfassen übliche Verfahren, wie die Adsorption an Aktivkohle, Ionenpaar-Extraktion, Ausfällen, Aussalzen und Molekularfiltration, doch sind diese Verfahren gewöhnlich nicht so erfolgreich wie die zuvor beschriebenen Verfahren, die deshalb bevorzugt sind.

Eine weitere Reinigung der festen, nach den vorgenannten Verfahren erhaltenen Salze kann mittels zahlreicher Methoden erreicht werden, doch ist die Ionenaustausch-Säulenchromato-graphie besonders geeignet, insbesondere unter Verwendung von «Isopor», «De-Acidite FFIP SRA64» oder «DEAE-Cellu-lose». Die «De-Acidite»-Säule wird nacheinander mit einer wässrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid, von 0- bis 0,5molar eluiert. Die Säule von «DEAE-Cellulose» in einer 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 wird mit einer Salzlösung, normalerweise einer Natriumchloridlösung von 0- bis 0,2-m Natriumchlorid in 0,01-m Phosphatpufferlösung vom pH 7, eluiert. Die aktiven Fraktionen können durch ihre ß-Lacta-mase-Hemmwirkung und ihre antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Klebsiella aerogenes beim Agardiffuionsversuch festgestellt werden. Die die Masse dieser Aktivität enthaltenen Fraktionen werden dann vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt von einem Clavulansäuresalz wird durch Perkolieren an einer Säule von «Biogel P2» entsalzt. Die aktive entsalzte Substanz wird dann eingeengt, mit Äthanol vermischt und nochmals an einer Cellulosesäule unter Verwendung eines Gemisches von Butanol, Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 4:1:5 in der oberen Phase als Lösungsmittel chromato-graphiert.

Die Fraktionen, die die Escherichia coli-ß-Lactamase inhibierende Substanz enthalten, werden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, in Wasser wieder aufgelöst und gefriergetrocknet. Man erhält das Salz der Clavulansäure als weissen Feststoff.

Die Verfahren, die bei der Feststellung der Clavulansäure in den Fil traten der Nährbouillon am besten geeignet sind, sind die Papierchromatographie und das bioautographische Bestimmungssystem. Die Clavulansäure kann dadurch geprüft werden, dass von ihrer ß-Lactamase-Hemmwirkung Gebrauch gemacht wird. Die Dünnschicht-Chromatographie kann angewendet werden, um die Clavulansäure in festen Zubereitungen festzustellen. Diese Bestimmungs-und Versuchsverfahren werden nachstehend beschrieben.

Eine Abwandlung des Verfahrens zur Herstellung der reinen Clavulansäure oder ihrer Salze besteht in der Isolierung einer unreinen Clavulansäure oder ihres Salzes, Herstellen eines Esters der Clavulansäure in üblicher Weise, Reinigen des Esters und anschliessendes Wiedergewinnen der Clavulansäure oder deren Salz aus dem Ester.

Die bei diesem Verfahren verwendete verunreinigte Clavulansäure oder ihr Salz enthält üblicherweise mindestens 1 Gewichtsprozent des Antibiotikums.

Geeignete Ester zur Verwendung bei diesem Verfahren sind solche, die durch Hydrogenolyse, durch enzymatische

629 252

8

Methoden oder durch eine Hydrolyse unter sehr milden Bedingungen gespalten werden können.

Eine geeignete Gruppe von bei diesem Verfahren verwendeten Estern besitzt die nachstehende Formel X:

co-o-ch-A7

*

a8

in der A? ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe ist und As eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe bedeutet.

Am zweckmässigsten ist Ai ein Wasserstoffatom oder die Phenyl-, Tolyl-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe und As die Phenyl-, Tolyl-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe.

Vorzugsweise ist An ein Wasserstoffatom und As die Phenylgruppe.

Die Ester der allgemeinen Formel X können durch Hydro-genolyse gespalten werden, wodurch man die Clavulansäure oder ihr Salz erhält.

Andere Gruppen von Estern, die bei diesem Verfahren verwendet werden können, besitzen die vorstehend beschriebenen allgemeinen Formeln V und VI. Derartige Ester können in Salze der Clavulansäure mittels milder alkalischer Hydrolyse, z. B. bei pH 7,5, umgewandelt werden.

Die verunreinigte Form der Clavulansäure oder deren Salz, die nach diesem Verfahren gereinigt werden muss, kann in Form eines Feststoffes oder einer Lösung vorliegen, und zwar gewöhnlich auch mit einem Gehalt von beträchtlichen Mengen anorganischer oder organischer Verunreinigungen.

Die Clavulansäure oder deren Salz kann in einen Ester durch die nachstehend beschriebenen Veresterungsreaktionen umgewandelt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Bildung eines erwünschten Esters der Clavulansäure besteht in der Reaktion eines Salzes der Clavulansäure mit einem Veresterungsmittel, wie einem reaktionsfähigen Halogenid, einem Sul-fonatester oder dergleichen, wie nachstehend beschrieben wird. Derartige Reaktionen werden häufig in einem organischen Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstanten durchgeführt, wie Dimethylformamid, einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton, in Dimethylsulfoxid, N-Me-thylacetamid, Hexamethylphosphoramid und dergleichen.

Gegebenenfalls kann das Salz der Clavulansäure in üblicher Weise in dem Lösungsmittel gelöst oder es kann an ein polymères Trägermaterial gebunden werden. Geeignete Trägermaterialien zur Verwendung bei diesem Verfahren umfassen stark basische Anionenaustauscherharze, insbesondere solche von makroretikularer Natur, die die Anwendung von nicht-wässri-gen Lösungsmittelsystemen gestatten. Es ist gefunden worden, dass für diesen Zweck «Amberblyst A26» geeignet ist. Das Cla-vulansäuresalz kann an das Harz aus dem Filtrat der Nährlösung adsorbiert werden. Danach kann das Harz in Dimethylformamid mit einem Gehalt an Natriumjodid suspendiert oder gegebenenfalls in der Säule mit einer Lösung von Natriumjodid in Dimethylformamid oder in einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton eluiert werden.

Einmal gebildet, wird der verunreinigte Ester der Clavulansäure chromatographisch gereinigt. Bei derartigen Verfahrensschritten wird der Ester üblicherweise in einem organischen

Lösungsmittel gelöst, wie Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Cyclohexan oder ähnlichen Lösungsmitteln. Die bei dem chromatographischen Verfahren verwendete feste Phase ist normalerweise eine inerte Substanz, wie Silikagel oder ähnliche, für chromatographische Zwecke geeignete Substanzen.

Die aus der Säule austretenden Fraktionen können hinsichtlich des Vorliegens von Clavulansäure untersucht werden, indem von synergistischen Eigenschaften Gebrauch gemacht wird. Normalerweise vereinigt man die aktiven Fraktionen und dampft das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab.

Der bei diesem Verfahren erhaltene Ester weist gewöhnlich eine annehmbare Reinheit auf, doch kann die Substanz gegebenenfalls nochmals chromatographiert werden.

Der gereinigte Ester der Clavulansäure kann in Clavulansäure oder deren Salz nach dem vorherbeschriebenen Verfahren umgewandelt werden.

Die Clavulansäure oder deren Salze aus derartigen Reaktionen sind im allgemeinen von guter Reinheit.

Ester von Clavulansäure können durch Veresterung der Clavulansäure oder deren Salz durch übliche Verfahren hergestellt werden.

Zweckmässige Verfahren einer Esterbildung sind

(a) die Umsetzung eines Salzes der Clavulansäure mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Q-R, in der Q eine leicht ersetzbare Gruppe und R ein organischer Rest ist;

(b) die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan und

(c) die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels, wie einem Carbodiimid oder dergleichen.

Geeignete Salze der Clavulansäure, die mit Verbindungen R-Q reagieren können, sind Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder andere übliche Salze, wie das Silbersalz.

Geeignete Reste Q schliessen solche Atome oder Gruppen ein, die in bekannter Weise durch Carbonsäureanionen ersetzbar sind. Es handelt sich um Chlor-, Brom- und Jodatome, Sul-fonsäureester, wie die -O-SO2CH3- oder die -O-SO2C6H4CH3-Gruppen, um aktive Estergruppen, wie die -O-CO-H- oder -0-C0-CF3-Gruppen und andere übliche, durch nukleophile Reste ersetzbare Gruppen.

Die vorstehende Reaktion wird normalerweise in einem organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismässig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Dimethylformamid, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran oder dergleichen, und bei einer nicht aussergewöhnlichen Temperatur, wie von -5 bis 100 °C, im allgemeinen bei +5 bis 30 °C, z. B. bei Raumtemperatur, durchgeführt.

Die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan ist ein mildes Verfahren zur Herstellung von Alkyl-, Aralkyl- oder ähnlichen Estern. Die Diazotierung kann unter üblichen Reaktionsbedingungen erfolgen, z. B. bei einer nicht extremen Temperatur und in einem üblichen Lösungsmittel. Derartige Reaktionen werden üblicherweise bei Temperaturen von -5 bis 100 °C, gewöhnlich bei 5 bis 30 °C, z. B. bei Raumtemperatur, durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für diese Reaktion sind niedere Alkanole, wie Methanol und Äthanol, und Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen. Äthanol hat sich als besonders zweckmässiges Lösungsmittel bei dieser Reaktion erwiesen.

Die Reaktion der Clavulansäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels findet normalerweise in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismässig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Acetonitril, statt. Die Reaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur oder bei erniedrigter Temperatur, z. B. bei

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

629 252

-10 bis 22 °C, gewöhnlich bei -5 bis 18 °C, z. B. anfänglich bei 0 °C und danach allmählich unter Erwärmen bis zu 15 °C, durchgeführt. Die verwendeten, die Kondensation beschleunigenden Mittel sind üblicherweise solche, die Wasser aus dem Reaktionsgemisch entfernen. Beispiele geeigneter Mittel sind 5 Carbodiimide, Carbodiimidazole oder äquivalente Reagentien. Dicyclohexylcarbodiimid hat sich als die Kondensation beschleunigendes Mittel zur Anwendung bei diesem Verfahren als besonders zweckmässig erwiesen. Um eine Selbstkondensation der Clavulansäure weitgehend zu unterdrücken, wird die io Reaktion gewöhnlich in Gegenwart eines beträchtlichen Überschusses an Alkohol durchgeführt.

Zur Bestimmung der Clavulansäure geeigneter Versuch Grundlagen des Versuchs 15

Lösungen mit einem Gehalt an Clavulansäure (Filtrat der Nährbouillon, Proben aus einem Isolierungsverfahren oder dergleichen) werden 15 Minuten mit einem ß-Lactamase-Präparat bei 37 °C in einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 bebrütet. Währenddessen tritt eine Enzymhemmung oder eine 20 Inaktivierung auf. Dann wird ein Substrat (Benzylpenicillin) zugegeben und das Bebrüten bei 37 °C 30 Minuten fortgesetzt. Die Menge des enzymatischen Abbaus des Sustrats zu Penicil-lansäure wird mittels des Hydroxylamin-Versuchs für Penicillin bestimmt. Die Menge der verwendeten ß-Lactamase errechnet 25 sich aus einer 75prozentigen Hydrolyse des Benzylpenicillins in 30 Minuten bei 37 °C.

Das Ausmass der Hydrolyse ist der Einfluss der Menge des ungehemmt verbleibenden Enzyms. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in Prozent Hemmung der Enzymaktivität durch 30 eine gegebene Verdünnung der Clavulansäure enthaltenden Lösung (z. B. des Filtrats der Nährbouillon) oder durch die Konzentration der Clavulansäure in ng/ml bei gegebener 50prozen-tiger Hemmung des Enzyms unter den vorstehend genannten Bedingungen (Iso). 35

ß-Lactamase-Enzym

Es wird die mittels Escherichia coli JT4 erzeugte ß-Lactamase als Enzym verwendet. Diese Züchtung ist ein Ampicillinresistenter Stamm und verdankt seine Resistenz einer Erzeu- 40 gung der den R-Faktor steuernden ß-Lactamase. Gegebenenfalls können ähnliche den R-Faktor steuernde ß-Lactamasen verwendet werden.

Die auf einem Schrägagar gehaltene Züchtung wird in einem 400 ml sterilen Trypton-Medium bebrütet, das in einer 45 konischen Flasche von 2 Liter Inhalt enthalten ist. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung: 32 g/Liter Tryp-ton, 20 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter Natriumchlorid und 2,2 g/Liter Calciumchlorid mit 6 Mol Hydratwasser. Der pH-Endwert wird mit verdünnter N atronlauge auf 7,4 eingestellt. Die 50 Flasche wird 20 Stunden auf einem Drehschüttler mit 240 UpM bei 25 °C geschüttelt.

Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt, mit 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewaschen (nochmals suspendiert und zentrifugiert) und dann in 55 Wasser nochmals suspendiert, wodurch man eine 25fache Zellkonzentration in dem Kulturmedium erhält. Diese Zellsuspension wird dann bei 4 °C in einem MSE-Ultraschall-Disintegrator, zertrümmert. Die Zellbruchstücke werden durch Zentrifugieren entfernt, und aliquote Anteile der überstehenden Lösung 60 werden im tiefgefrorenen Zustand gelagert. Zur Verwendung bei dem Versuchs verfahren wird das Überstehende mit einer 0,005-m Phosphatpufferlösung verdünnt, bis man eine etwa 75prozentige Hydrolyse einer 1 mg/ml enthaltenden Lösung von Benzylpenicillin in 30 Minuten bei 37 °C erhält. 65

Versuchsverfahren

Geeignete Verdünnungen des Hemmpräparats und der

ß-Lactamase-Lösung werden vermischt und 15 Minuten bei 37 °C bebrütet (Test). Ein Kontrollversuch mit einer Pufferlösung anstelle des Inhibitorpräparats wird ebenfalls bebrütet. Dann wird eine Benzylpenicillin-Lösung (Substrat) zu dem Test- und dem Kontrollgemisch gegeben. Dann wird die Bebrütung weitere 30 Minuten bei 37 °C fortgesetzt. Es wird dann das restliche Benzylpenicillin in jedem Gemisch unter Verwendung des Hydroxylaminversuchs bestimmt, wie er beschrieben ist von Batchelor und Mitarbeitern in Proc. Roy. Soc. B 154 (1961), S. 498. Zu allen Tests werden 6 ml Hydroxylamin-Reagens zugegeben. Die Kontrollversuche und die Versuche mit den reinen Substanzen lässt man 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren, bevor man 2 ml eines Eisen(III)-ammoniumsulfat-Reagens zusetzt. Die Absorption der Endlösungen wird in einem E.E.L.-Colorimeter oder in einem Spektrophotometer bei 490 nm gegenüber dem reinen Reagens gemessen. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen, der Testlösungen und der reinen Substanzen vor dem Hydroxylamin-Versuch sind wie folgt.

Bestandteile

Test reines

Kontroll-

reines

(alle gelöst in oder verdünnt

Benzylpe- versuche, Reagens,

mit 0,005-m Phosphatpuffer

nicillin,

ml ml vom pH 7)

ml

Escherichia

coli-ß-Lactamase-Lösung

1,9

0,0

1,9

1,9

Inhibitor

0,1

0,0

0,0

0,0

Benzylpenicillin 5 mg/ml

0,5

0,5

0,5

0,0

0,005-m Phosphatpuffer

vom pH 7

0,0

2,0

0,1

0,6

Berechnung der Ergebnisse

Die prozentuale Hemmung der ß-Lactamase wird wie folgt berechnet:

Absorption des reinen Benzylpenicillins minus Absorption der Kontrollösung (nicht gehemmte Reaktion) = x,

Absorption der Testlösung (gehemmte Reaktionslösung) minus Absorption der Kontrollösung (nicht gehemmte Reaktion) = y, Hemmungen in % = y/x-100.

Um den Iso-Wert zu erhalten, wird das Hemmpräparat verdünnt, bis eine 50prozentige Hemmung der ß-Lactamase-Inakti-vierung des Benzylpenicillins bei dem vorgenannten Verfahren erhalten wird.

Papierchromatographische Bestimmung der Clavulansäure Das Filtrat der Nährbouillon und eine Bezugslösung der Clavulansäure (250 ng/ml eines teilweise gereinigten Präparats) werden auf 1 cm breite Papierstreifen (Whatman Nr. 1) (20 jxLiter der Ausgangslösung) getüpfelt. Die Chromatogramme laufen bei absteigender Chromatographie 16 Stunden bei 5 °C unter Verwendung eines Gemisches von n-Butanol/Isopropa-nol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 als Lösungsmittel. Die Streifen werden bei 40 °C getrocknet und auf Agarplatten ausgelegt, die 6 (ig/ml Benzylpenicillin enthalten und dann mit einem ß-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes (synergistisches System) beimpft. Die Platten werden über Nacht bei 30 °C bebrütet, und die Clavulansäure zeigt sich als Zone eines gehemmten Wachstums. Der RpWert der Zone ist 0,46. Die Menge von 6 pg/ml Benzylpenicillin allein liegt unterhalb der erforderlichen Konzentration, um Klebsiella aerogenes abzutöten. Jedoch in Gegenwart eines ß-Lactamase-Hemmstoffes wird diese Konzentration toxisch, was hinsichtlich des Synergismus zu sagen ist.

Die Verwendung des vorgenannten synergistischen Systems ermöglicht die Feststellung der Clavulansäure bei Konzentrationen unterhalb denjenigen, bei denen sie ein antibakterielle Wirksamkeit zeigt.

629252

10

Dünnschicht-chromatographische Bestimmung des Natriumsalzes der Clavulansäure

Lösungen von Präparaten des Natriumsalzes der Clavulansäure werden auf Glasplatten, die mit einer 0,25 mm dicken Schicht von Silikagel (F254) beschichtet sind, in einer Menge von 5 jiLiter von 1 mg/ml getüpfelt. Die Chromatogramme laufen bei 22 °C unter Verwendung einer oberen Phase eines Gemisches von n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis von 4:1:5. Die Chromatogrammplatten werden bei 40 °C getrocknet. Das Natriumsaiz der Clavulansäure wird durch Bioautographie auf Agarplatten mit einem Gehalt von 6 jig/ml Benzylpenicillin angeordnet und mit Klebsiella aerogenes beimpft (synergistisches System wie bei der vorstehend besprochenen Papierchromatographie). Die Agaroberfläche wird mit einem feinen Filtertuch abgedeckt, bevor die Dünnschicht-Chromatographieplatte darübergelegt wird. Nach 15- bis 30minütigem Ruhenlassen zum Befeuchten und Diffundieren wird die Dünnschicht-Chromatographieplatte mit Hilfe des Filtertuches abgehoben und die Agarplatte über Nacht bei 30 °C bebrütet, um die Zonen eines gehemmten Wachstums aufzuzeigen. Der Rf-Wert des Natriumsalzes der Clavulansäure in dem vorgenannten Lösungsmittel beträgt annähernd 0,37. Zwei sprühbare Reagentien, nämlich Ehrlichsches Reagens und Tri-phenyltetrazolium-chlorid, werden ebenfalls verwendet, um die Zone des Natriumsalzes der Clavulansäure aufzuzeigen. Das erstgenannte Reagens besteht aus 300 mg p-Dimethylamino-benzaldehyd, das in 9 ml Äthanol, 54 ml n-Butanol und 9 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst ist. Beim 1- bis 2minü-tigen Erhitzen der besprühten Dünnschicht-Chromatographieplatte auf 120 °C erscheint das Natriumsalz der Clavulansäure als rosaroter Flecken. DasTriphenyltetrazolium-chlorid-Re-agens besteht aus einem Gemisch von 1 Volumenteil einer 4prozentigen Lösung dieser Verbindung in Methanol und 1 Volumenteil methanolischer Natronlauge. Nach dem Aufsprühen werden die Dünnschicht-Chromatographieplatten auf 80 °C erhitzt. Das Natriumsalz der Clavulansäure erscheint als roter Punkt auf weissem Untergrund.

Beispiel 1

Züchten von Streptomyces clavuligerus

Streptomyces clavuligerus wird bei 26 °C und einem pH-Wert von 6,8 auf einem Schrägagar gezüchtet, der 1 Prozent Hefeextrakt, 1 Prozent Glukose und 2 Prozent «Oxoid»-Agar Nr. 3 enthält. Es wird eine sterile Öse verwendet, um das Mycel und die Sporen vom Schrägagar in 100 ml einer Nährbouillon in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben zu überführen. Die Nährbouillon hat die folgende Zusammensetzung:

Malzextrakt 10g/Liter

Bakteriologisches Pepton 10 g/Liter

Glyzerin 20 g/Liter

Leitungswasser ad 1 Liter

Die Nährbouillon wird mittels Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Dann werden jeweils 100 ml in Flaschen verteilt, die mit Schaumstöpseln verschlossen werden, bevor sie 20 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 im Autoklaven behandelt werden. Die beimpfte Flasche wird 3 Tage bei 26 °C auf einem Drehschüttler mit 5 cm Ausschlag und einer Geschwindigkeit von 200 UpM geschüttelt. Die Flaschen der Produktionsstufe, die die vorgenannte Nährbouillon enthalten, werden mit 5 Prozent eines vegetativen Impfstoffes geimpft und unter den gleichen Bedingungen wie bei der Anzuchtflasche wachsen gelassen. Die Proben des Filtrats der Nährbouillon werden auf die Hemmwirkung gegenüber der ß-Lactamase von Escherichia coli JT4 geprüft. Die höchste Aktivität wird nach 3 Tagen erhalten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I angegeben. Man sieht eine Zone der Clavulansäure beim RpWert von 0,46, wenn das Filtrat der Nährbouillon nach dem zuvor beschriebenen papierchromatographischen

Verfahren geprüft wird. Eine Vergrösserung der Zone verläuft parallel mit einer Erhöhung beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Streptomyces clavuligerus wird auch in 2 Liter fassenden Schüttelflaschen mit einem Gehalt von 400 ml des Mediums s (der Produktionsstufe) unter Verwendung des gleichen Mediums und der gleichen Züchtungsbedingungen, wie sie zuvor in diesem Beispiel beschrieben sind, gezüchtet. Bei diesen grösseren Gefässen verläuft das Wachstum des Organismus langsamer, und die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung wird 7 bis 9 io Tage nach der Beimpfung mit dem vegetativen Impfstoff erreicht. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

15 ß-Lactamase-Hemmwirkung von in 500-ml- und 2000-ml-Flaschen gezüchtetem Streptomyces clavuligerus

Fermenta- prozentuale Hemmung der Escherichia tionszeit, coli-ß-Lactamase bei einer Endverdünnung von V2500 des

Tage Kulturfiltrats

20 5 00-ml-Schüttelflasche 2000-ml-Schüttelflasche

1

15

-

2

30

-

25 3

55

-

4

50

10

5

51

21

6

57

36

7

-

51

30«

-

53

9

-

50

Beispiel 2

Züchtung von Streptomyces clavuligerus 35 Eine Anzuchtflasche, wie sie in Beispiel 1 zubereitet worden ist, wird zur Beimpfung von konischen 500-ml-Flaschen verwendet, die 100 ml aliquote Anteile der nachstehenden Nährbouillon in entsalztem Wasser enthalten:

Lösliche Stärke 2 Gewichtsprozent

40 Glyzerin 0,3 Gewichtsprozent

Malzdestillat-Trockensaft 0,1 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

FeS04 • 7H2O 0,01 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird 20 Minuten bei einem Druck von 45 1,05 kg/cm2 in einem Autoklaven sterilisiert und durch Zugabe von 5 Prozent der vegetativen Anzuchtstufe beimpft. Die Flaschen werden wie in Beispiel 1 bei 26 °C auf einem Drehschüttler geschüttelt. Der höchste Gehalt an Clavulansäure wird zwischen 3 und 5 Tagen erreicht. Eine Verdünnung von 'hsm der 50 Nährbouillon ergibt eine 60prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch. Es wird eine Zone der Clavulansäure bei einem RrWert von 0,46 gesehen, wenn man das vorstehend beschriebene papierchromatographische (bioautographische) Verfahren anwendet. Diese Zone vergrössert sich parallel mit 55 einem Anstieg der Aktivität beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 3

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Es wird eine Anzuchtflasche, wie sie in Beispiel 1 zubereitet 60 worden ist, zur Beimpfung von konischen 500-ml-Flaschen verwendet, die 100 ml aliquote Anteile der nachstehenden Nährbouillon enthalten, die mit entsalztem Wasser hergestellt und wie zuvor beschrieben sterilisiert worden ist. Die Impfstoffmenge beträgt 5 Prozent.

65 Dextrin 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

Malzdestillat-Trockensaft 0,1 Gewichtsprozent

FeS04*7H20 0,01 Gewichtsprozent

11

629252

Die beimpften Flaschen werden bei 26 °C geschüttelt. Die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung wird zwischen 3 und 5 Tagen erreicht. Die Aktivität war gleich der in Beispiel 2 erreichten.

Beispiel 4

Bebrütung von Streptomyces clavuligerus

Die wie in Beispiel 1 beschriebene Anzucht wird zur Beimpfung von konischen 500-ml-Flaschen verwendet, die die nachstehende Nährbouillon in entsalztem Wasser enthalten: Dextrose 1 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

Malzdestillat-Trockensaft 0,05 Gewichtsprozent

CaC03 1 Gewichtsprozent

Diese Flaschen werden genauso wie in den vorstehenden Beispielen behandelt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung wird zwischen 3 und 5 Tagen erreicht. Das Filtrat der Nährbouillon bei einer Endver-dünnung von V2500 ergibt eine 35- bis 45prozentige Hemmung bei dem ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 5

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Die der Clavulansäure zuzuschreibende ß-Lactamase-Hemmwirkung wird unter Verwendung der nachstehenden Nährbouillon mit identischen Anzucht- und Züchtungsbedingungen wie in Beispiel 1 erzeugt Glyzerin 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent

MgSC>4 0,1 Gewichtsprozent

K2HPO4 0,1 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird in entsalztem Wasser hergestellt. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung erreicht den Höchstwert bei 3 bis 5 Tagen und liegt in der gleichen Grössenordnung wie die des Beispiels 4.

Beispiel 6

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Die folgende Nährbouillon erzeugt Clavulansäure, wenn die Bedingungen und die vegetative Anzucht wie in Beispiel 1 beschrieben angewendet werden.

Glukose 2 Prozent

Lab 1 Prozent

Hefeextrakt 0,3 Prozent

CaCC>3 0,3 Prozent

Die Nährbouillon wird in entsalztem Wasser hergestellt Die höchsten Werte werden in 3 bis 5 Tagen erreicht. Eine 'Asoo-Verdünnung des Filtrats der Nährbouillon ergibt eine 35-bis 45prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 7

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Wie in den Beispielen 4,5 und 6 ruft die nachstehende Nährbouillon eine 35- bis 45prozentige Hemmung ('Asoo-Verdünnung) beim ß-Lactamase-Hemmversuch bei einer Höchstmenge hervor, die 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung erreicht wird. Alle Bedingungen sind bereits vorher beschrieben. Glukose 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent

CaCCb 0,02 Gewichtsprozent

CoCl2*6H20 0,0001 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird mit entsalztem Wasser hergestellt.

Beispiel 8

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Die nachstehende Produktions-Nährbouillon liefert, wenn sie unter den wie in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen normalen Züchtungsbedingungen angewendet wird,

eine 20- bis 30prozentige Hemmung bei einer Vkoo-Verdünnung beim ß-Lactamase-Versuch, wobei die Höchstmenge an Clavulansäure 3 bis 5 Tage nach der Beimpfung erreicht wird. Unter Anwendung des zuvor beschriebenen papierchromatographi-5 sehen Verfahrens wird eine Clavulansäurezone bei einem Rr Wert von 0,46 gesehen, wenn das Filtrat der Nährbouillon geprüft wird.

Malzedestillat-Trockensaft 2 Prozent

Hefeextrakt 1 Prozent

10 Die Nährbouillon wird mit Leitungswasser zubereitet pH-Endwert 7,0.

Beispiel 9

Züchtung von Streptomyces clavuligerus 15 Unter Standard-Züchtungsbedingungen erzeugt die nachstehende Nährbouillon Clavulansäure innerhalb 3 bis 5 Tagen nach dem Beimpfen mit der vegetativen Anzucht. Eine Verdünnung von V2500 der Züchtung liefert eine 20- bis 30prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch. 20 g/Liter

Glycerin 15

Saccharose 20

Prolin 2,5

Mononatrium-glutamat 1,5

25 NaCl 5,0

K2HPO4 2,0

CaCk 0,4

MnCb-4H20 0,1

FeCb.6H20 0,1

30 ZnCh 0,05

MgS04-7H20 1,0

Die Nährbouillon wird mit entsalztem Wasser hergestellt. pH-Endwert 7,1.

35 Beispiel 10 Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Es wird ein Hefeextrakt-Glukose-Nähragar zur Beimpfung eines Hefeextrakt-Glukose-Schrägagars in einer Roux-Flasche verwendet, indem man eine Suspension des Mycels und der 40 Sporen in sterilem Wasser herstellt. Die schrägliegende Roux-Flasche wird 10 Tage bei 26 °C bebrütet. Zu diesem Schrägagar werden 100 ml steriles Wasser zugefügt und eine Mycel-Suspension hergestellt Diese wird zur Beimpfung von 50 Liter eines dampfsterilisierten Anzuchtmediums der folgenden 45 Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet:

Malzextrakt 1 Gewichtsprozent bakteriologisches Pepton 1 Gewichtsprozent

Glycerin 1 Gewichtsprozent lOprozentiges Antischaummittel 50 («Pruronic L81 ») in Sojabohnenöl 0,05 Gewichtsprozent Die Nährbouillon wird in einen 90 Liter fassenden, mit Prallblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben und mittels eines Scheibenkreiselmischers mit 12,7 cm Leitschaufeln bei 240 UpM gerührt. Sterile Luft wird mit einer 55 Geschwindigkeit von 50 Liter/Min. zugeführt und das Gefäss bei 26 °C bebrütet.

Nach 72 Stunden wird der Anzuchtfermenter zur Beimpfung von 150 Litern der gleichen Nährbouillon unter Verwendung eines 5volumenprozentigen Zusatzmittels einer sterilen 60 Überführung verwendet. Diese Produktions-Nährbouillon wird in einem 300 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der mittels eines Scheibenkreiselmischers mit 21,6 cm Leitschaufeln bei 210 UpM gerührt wird. Es wird sterile Luft mit einer Geschwindig-65 keit von 150 Liter/Min. zugeführt Die Fermentation wird bei 26 °C gehalten. Gegebenenfalls wird ein Antischaummittel in 10-ml-Schüben zugegeben. In regelmässigen Abständen werden zum ß-Lactamase-Hemmversuch Proben entnommen.

629252

12

Nach 4 bis 5 Tagen hat der Fermenter das Maximum an einer ß-Lactamase-Hemmwirkung erreicht, wie aus Tabelle II hervorgeht.

Tabelle II

ß-Lactamase-Hemmwirkung von Proben eines aus einem 300-Liter-Fermentationsgefässes von Streptomyces clavuligerus entnommenen Kulturfiltrats

Fermentationszeit, prozentuale Hemmung beim Tage ß-Lactamase-Hemmversuch bei einer

Endverdünnung von V2500

1,0

12

1,5

20

2,0

31

2,5

36

3,0

50

3,5

54

4,0

51

4,5

56

5,0

55

Beispiel 11

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

Es wird ein Anzucht-Fermenter unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 10 beschrieben sind, und unter Verwendung der gleichen Nährbouillon betrieben.

Nach 72 Stunden wird der Anzucht-Fermenter zur Lieferung eines 5volumenprozentigen vegetativen Impfstoffes in einen 300 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl mit einem Gehalt an 150 Liter einer dampfsterilisierten Nährbouillon verwendet, die bei 210 UpM mittels eines mit 21,6 cm grossen Leitschaufeln versehenen Scheibenkreiselmischers gerührt wird. Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 150 Liter/Min. zugeführt. Die Fermentation wird bei 26 CC gehalten. Gegebenenfalls wird in Schüben von 10 ml ein Antischaummittel zugegeben.

Die in der Herstellungsstufe verwendete Nährbouillon entspricht der in Beispiel 3 beschriebenen mit einem Zusatz von 0,05 Volumenprozent des in Beispiel 10 genannten Antischaum-mittels vor der Sterilisation.

Die ß-Lactamase-Hemmwirkung der Fermentationsproben entspricht der des Beispiels 10 (vgl. Tabelle II). Die papierchro-matographische Untersuchung zeigt eine Clavulansäurezone beim Rf-Wert von 0,46 unter Anwendung der zuvor beschriebenen bioautographischen (synergistischen) Methode. Die Grösse der Clavulansäurezone wächst mit einem Anstieg beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Beispiel 12

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

100 ml steriles Wasser werden zu einem Sporenmedium gegeben, das auf einem Bennetts-Agar in einer Roux-Flasche 10 Tage bei 26 °C gewachsen ist. Es wird eine Mycel-Sporen-Suspension erzeugt und zum Beimpfen von 75 Litern einer dampfsterilisierten Nährbouillon der folgenden Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet:

Dextrin 2 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1 Gewichtsprozent das in Beispiel 10 genannte

Antischaummittel 0,03 Volumenprozent

Der pH-Wert der Nährbouillon wird auf 7,0 eingestellt. Die Nährbouillon wird in einem 100 Liter fassenden, mit Leitblechen versehenen Fermenter aus rostfreiem Stahl gehalten, der bei 140 UpM mittels eines mit 19 cm grossen Leitschaufeln versehenen Scheibenkreiselmischers gerührt wird. Sterile

Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 75 Liter/Min. zugeführt. Das Gefäss wird 72 Stunden bei 26 °C bebrütet.

Der Inhalt des Anzucht-Fermenters wird zur Beimpfung von 1500 Litern einer dampfsterilisierten Nährbouillon der nachstehenden Zusammensetzung in Leitungswasser verwendet:

Soj abohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent

Glycerin 1,0 Gewichtsprozent

KH2PO4 0,1 Gewichtsprozent das in Beispiel 10 genannte

Antischaummittel 0,2 Volumenprozent

Der pH-Wert der Nährbouillon wird auf 7,0 eingestellt.

Die Nährbouillon wird in einen 2000 Liter fassenden, voll mit Leitblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben, der mittels eines mit zwei 48 cm langen Leitschaufeln versehenen Scheibenkreiselmischers mit 106 UpM gerührt wird.

Sterile Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 1200 Litern/Min. eingeleitet. Erforderlichenfalls wird ein Antischaummittel - wie es in Beispiel 10 beschrieben ist - in Mengen von je 25 ml zugesetzt. Die Fermentation wird bei 26 °C eingeregelt, bis die höchste Ausbeute an Clavulansäure nach 3 bis 5 Tagen erhalten worden ist, wenn nämlich 200 bis 300 (O-g/ml Clavulansäure erzeugt worden sind.

Beispiel 13

Züchtung von Streptomyces clavuligerus

In einer Anzuchtflasche, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, jedoch unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Nährbouillon, deren pH-Wert auf 7,0 eingestellt worden ist, wird ein Impfstoff erzeugt, der zum Beimpfen von konischen 500-ml-Flaschen mit einem Gehalt an 100 ml aliquoten Teilen der nachstehend angegebenen, in entsalztem Wasser hergestellten und sterilisierten Nährbouillon verwendet wird. Die Impfstoffmenge beträgt 5 Prozent.

Triglyzerid («Prichem P224») 1 Gewichtsprozent

Sojabohnenmehl 1,5 Gewichtsprozent

KH2PO4 0,1 Gewichtsprozent

Die Nährbouillon wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

Die beimpften Flaschen werden bei 26 °C geschüttelt, und die höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung wird nach 3 bis 5 Tagen erreicht. Man erhält 300 bis 500 (ig/ml Clavulansäure.

Beispiel 14

Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure

Die wie in Beispiel 10 erzeugte, angereicherte Kulturflüssigkeit wird durch kontinuierliches Zentrifugieren geklärt. Das Mycel wird verworfen. Aus 150 Litern Fermentationsflüssigkeit erhält man 120 Liter geklärte Kulturflüssigkeit. Dieses Filtrat weist bei einer Verdünnung 'Asm eine 58prozentige Hemmung beim ß-Lactamase-Hemmversuch auf. Das Filtrat wird auf 5 °C gekühlt und mit 40 Liter n-Butanol versetzt. Das Gemisch wird gerührt und mit 25prozentiger Schwefelsäure versetzt, bis der pH-Wert 2,0 beträgt. Das angesäuerte Gemisch wird weitere 10 Minuten gerührt, bis durch Zentrifugieren die Phasen getrennt werden. Die wässrige Phase wird verworfen. Zum n-Butanol-Extrakt gibt man 0,5 Prozent Aktivkohle («Norit GSX») und rührt das Gemisch nochmals 15 Minuten. Nach dem Abfiltrieren der Kohle unter Zuhilfenahme von Diatomeenerde als Filtrierhilfe wird die Kohle verworfen. Zum n-Butanol wird ein Viertel seines Volumens entsalztes Wasser zugegeben und das Gemisch gerührt, währenddessen eine 20prozentige Natronlauge zugesetzt wird, bis sich der pH-Wert auf 7,0 eingestellt hat. Durch Zentrifugieren trennt man die Phasen auf und verwirft die n-Butanol-Phase. Die wässrige Phase wird unter vermindertem Druck auf 800 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet. Man erhält 35 g einer

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

629 252

festen Rohsubstanz von Clavulansäure mit einem bo-Wert von 1,3 ng/ml beim ß-Lactamase-Hemmversuch. Dieser Feststoff wird im trockenen Zustand bei -20 °C gelagert, um dann einer weiteren Reinigung unterworfen zu werden.

Beispiel 15

Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure

1 Liter des wie in Beispiel 12 beschriebenen erhaltenen Kul-turfiltrats mit einer 53prozentigen Hemmung beim ß-Lacta-mase-Hemmversuch bei einer Verdünnung von '/isoo wird an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 15,2 cm Länge mit einer Füllung von Permutit («Isopore Resin FF 1P (SRA 62)») in der Chloridform perkoliert. Dem Kulturfiltrat folgen 300 ml destilliertes Wasser, um die Säule zu waschen. Eine Eluierung des aktiven ß-Lactamase-Hemmstoffes erzielt man mit einer 0,2-m Natriumchloridlösung. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt und bei einer Endverdünnung von V2500 beim ß-Lactamase-Hemmversuch geprüft. Aktive Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 20 ml eingeengt. Diese Lösung wird mittels Gelausschluss-Chromatographie an einer «Bio Rad Biogel P2»-Säule von 3,8 cm Durchmesser mit einer Gelfüllung von etwa 40 cm Höhe entsalzt und mit 1 Prozent n-Butanol enthaltendem Wasser eluiert. Die aufgrund des ß-Lactamase-Hemmversuches festgestellten aktiven Fraktionen werden vereinigt. Nach dem Eluieren der Clavulansäure wird Natriumchlorid eluiert, wie mittels einer Silbernitratlösung festgestellt werden kann. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet.

Nach der vorgenannten Behandlung ergibt 1 Liter Kulturfiltrat 0,45 g eines festen Rohprodukts der Clavulansäure mit einem Iso-Wert von 0,92 |ig/ml.

Dieser Feststoff wird bei -20 °C gelagert und dann einer weiteren Reinigung unterworfen.

Beispiel 16

Isolierung des rohen Natriumsalzes der Clavulansäure

Ein 300 (ig/ml Clavulansäure enthaltendes Kulturfiltrat wird unter Anwendung eines Mischsystems in Rohrleitungen angesäuert und mit n-Butanol extrahiert. Die Clavulansäure wird bei neutralem pH-Wert in das Wasser zurückextrahiert.

Auf 5 bis 10 °C gekühltes Kulturfiltrat wird zu einem Mischer in Rohrleitungen gepumpt, an dessen Einlassende ausreichend 6volumenprozentige Salpetersäure zugegeben wird, um beim Austritt einen pH-Wert von 2,0 ± 0,1 zu haben. Das angesäuerte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 4 Liter/ Min. durch einen mit Glykol gekühlten Plattenwärmeraustau-scher geschickt, der auf einer Temperatur von 2 bis 5 °C gehalten wird. Der pH-Wert wird inder Fliesszelle überwacht, bevor die Flüssigkeit durch einen 3stufigen Gegenstromabscheider geschickt wird.

Auf etwa 5 °C gekühltes, mit n-Butanol gesättigtes Wasser wird mit einer Geschwindigkeit von 3 Liter/Min. in den Gegenstromabscheider gepumpt.

Die aus dem Gegenstromabscheider austretende wässrige Phase wird verworfen. Mitgeschlepptes Wasser wird aus dem Butanol-Ablauf des Gegenstromabscheiders unter Verwendung eines Flüssig-Flüssig-Zentrifugalabscheiders entfernt. Das Butanol wird in einem mit einem Kühlmantel versehenen Gefäss aus rostfreiem Strahl gesammelt, wo es bei etwa 5 °C gelagert wird.

Aus dem Gefäss werden 40 Liter aliquote Anteile entnommen und gründlich mit 2 Liter auf 5 °C gekühltem Wasser, das mit n-Butanol gesättigt ist, vermischt. Der pH-Wert dieses Gemisches wird auf 6,8 ± 0,1 unter Verwendung einer 20pro-zentigen Natronlauge eingestellt.

Das Gemisch aus wässrigem Extrakt und Butanol wird einem Flüssig-Flüssig-Zentrifugalabscheider mit einer Geschwindigkeit von 2 Liter/Min. zugeführt.

Aus 1800 Liter Kulturflüssigkeit werden 20 Liter einer wässrigen Phase gewonnen, die 39 Prozent der im Kulturfiltrat vorliegenden Clavulansäure enthält.

15 Liter des wässrigen Extrakts werden durch Zugabe von 5 60 g Natriumchlorid je Liter auf einen Gesamtfeststoffgehalt von 2 bis 8 Prozent eingestellt und sprühgetrocknet. Die Bedingungen hierfür sind: Einspeisgeschwindigkeit 2 Liter/Stunde; Spannung des Zerstäubers 170 Volt; Heizeinstellung 6 bis 7; Einlasstemperatur 150 °C; Auslasstemperatur 80 °C. 10 Das Trockenprodukt im Gesamtgewicht von 1 kg enthält 62 Prozent der im Ausgangsmaterial vorliegenden Clavulansäure.

Die restlichen 75 Liter des wässrigen Extrakts werden durch Ultrafiltrieren eingeengt. Die Arbeitsweise besteht in 15 einem Zirkulieren dieses Restes aus einem Gefäss aus rostfreiem Stahl, das mit einem Kühlsystem ausgerüstet ist, mittels eines Auslassventilsatzes derart, dass man über 40 Membranen einen Druckunterschied von 25 Atmosphären erhält. Die Temperatur wird bei 2 bis 5 °C und erforderlichenfalls der pH-Wert 20 bei 6,8 ± 0,1 durch Zugabe von 2-n Salzsäure gehalten. Das Volumen wird auf 34 Liter eingeengt, die 72 Prozent der im Ausgangsmaterial vorhandenen Clavulansäure enthalten.

Das wässrige Konzentrat wird bei 5 °C gelagert, auf 8 Prozent Feststoffgehalt eingestellt und wie vorgenannt sprühge-25 trocknet. Die getrocknete Substanz enthält 75 Prozent der in dem Ausgangsmaterial zum Sprühtrockner vorliegenden Clavulansäure.

Das Gesamtsprühtrockenprodukt aus 90 Liter wässrigen Extrakts enthält 69,4 g Clavulansäure, was 72 Porzent Clavulan-30 säure im Ausgangsmaterial für die Sprühtrocknung und 21 Prozent Clavulansäure, die in 1800 Liter Kulturfiltrat vorhanden gewesen ist, entspricht.

Beispiel 17

35 Teilweise Reinigung der rohen Clavulansäure

Die gemäss Beispiel 15 erhaltenen rohen Clavulansäure-Zubereitungen werden durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. 18 g des gemäss Beispiel 15 hergestellten Materials mit einem Iso-Wert von 1,3 (ig/ml (Endkonzentration) wer-40 den in 25 ml destilliertem Wasser gelöst und auf ein 3,8x40 cm grosses Bett von «Permutit FF 1P (SRA 62>Harz» in der Chloridform aufgebracht. Die Säule wird mit einem Natriumchlorid-Gradienten eluiert, der durch Zuführung von 0,5-m Natriumchlorid in ein 1 Liter destilliertes Wasser enthaltendes Mischge-45 fäss, wobei dies nach und nach der Chromatographiesäule zugeführt wird, aufgrund der Schwerkraft gebildet wird. Es werden 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die ß-Lactamase-Hemm-wirkung wird unter Verwendung einer Visoo-Verdünnung der Fraktionen untersucht. Die aktiven Fraktionen werden auf-50 grund des Auftretens einer Hauptfarbbande bei den Fraktionen 24 bis 30 eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereingt und auf 30 ml eingeengt.

Diese Lösung wird unter Verwendung eines 5 x 46-cm-Bet-tes von «Biorad Biogel P2» entsalzt und mit 1 Prozent n-Buta-55 noi enthaltendem Wasser eluiert. Die 20-ml-Fraktionen werden unter Anwendung des ß-Lactamase-Hemmversuches auf einen Clavulansäure-Gehalt untersucht. Die Fraktionen werden auf Papierstreifen getüpfelt und entweder mit dem in der «Beschreibung 3» beschriebenen Ehrlichschen oder dem Tri-60 phenyltetrazolium-Spray-Reagens besprüht. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung stimmt mit den rosaroten oder roten Flecken überein, die mittels dieser Reagentien erzeugt werden. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, mit Ausnahme derjenigen, die Natriumchlorid enthalten, und unter vermindertem Druck 65 zur Trockne eingedampft. Man erhält 520 mg eines teilweise gereinigten Natriumsalzes der Clavulansäure mit einem Iso-Wert von 0,2 ng/ml beim Standard-ß-Lactamase-Hemmver-such.

629 252

14

Die Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel dieses Cla- gens aufsprüht, die rosarote bzw. rote Flecken liefern. Diese vulansäure-Präparats liefert die folgenden RrWerte : Beim Tüpfeltests werden durch die ß-Lactamase-Hemmversuche bei n-Butanol/Äthanol/Wasser-Gemisch als obere Phase im Volu- Verdünnungen von V2500 bestätigt. Die aktiven Fraktionen wer-menverhältnis von 4:1:5 einen RpWert von 0,37 ; beim n-Buta- den vereinigt und auf einem Drehverdampfer unter verminder-nol/Essigsäure/Wasser-Gemisch vom Volumenverhältnis 12:3:5 5 tem Druck zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird einen RrWert von 0,44; und beim Isopropanol/Wasser- in einer geringen Menge destillierten Wassers gelöst und

Gemisch im Volumenverhältnis von 7:3 einen Rf-Wert von 0,78. gefriergetrocknet. Man erhält als weissen Feststoff 40 mg des Die Zonen werden durch Besprühen mit Ehrlichschem Re- Natriumsalzes der Clavulansäure mit einem Lo-Wert von 0,08 agens festgestellt. Hg/ml beim ß-Lactamase-Hemmversuch.

Als Markierungsmittel läuft 6-Aminopenicillansäure mit; sie 10 wird mit dem gleichen Spray bestimmt und weist RrWerte von

0,38,0,39bzw.0,77auf. Be.spie 20 . . ..

Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

BeisD' 118 6 Liter des aus der Ultrafiltration gemäss Beispiel 16 erhal-

Teilweise Reinigung des Natriumsalzes der Clavulansäure .5 tenen konzentrierten Rückkonzentrats mit einem Gehalt von

Das gemäss Beispiel 12 erzeugte Kulturfiltrat wird wie in 10 g Clavulansäure, wie es gemäss dem ß-Lactamase-Hemmver-Beispiel 14 beschrieben lösungsmittelextrahiert und liefert such nachder «Beschreibung 1» bestimmt worden ist, werden einen Feststoff, der mittels Ionenaustausch-Chromatographie e'"er Geschwindigkeit von 11 Uter/Stunde an einer unter Verwendung von Diäthylaminoäthyl-Cellulose «DE 52» J1 x61-cm-SauIe eines auscherharzes m weiter gereinigt wird. 10 g dieses Feststoffes werden in 20 ml 20 der Chlondform («Zeolit FF 1P SRA 62») perkoliert. Danach destilliertem Wasser gelöst und auf eine 3,8x51-cm-Säule von wird die 2 Liter entsalztem Wasser vor einem Eluie-«DE 52»-Cellulose, die zuvor mit 0,01-m Natriumphosphatpuf- rKf mit einem Natrmmchlond-Gradienten gewaschen Dieser ferlösung vom pH 7,5 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, Natnumchlorid-Gradient wird aus einem Vorratsbehalter mit aufgebracht. Die Säule wird mit einem Natriumchlorid-Gra- eir!e™ Geha'1 an 4 Liter einer 1,4-m Natriumchlorid osung dienten eluiert. Es werden 0,1-m Natriumchlorid in 0,01-m 25 SeblldeÌ' ^1 unter Ruhren in einem Vorratsbehalter mit Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 einer Mischkammer eineKm °f haltkV°M Liter einer 0,7-m Natnumchlondlosung zugeführt, die 1 Liter einer 0,01-m Phosphatpufferlösung vom nacKh u"d nach 4 Liter entsalztes Wasser eingespeist werden pH 7,5 enthält, die nach und nach mit der Säule in Berührung Z f dastV°rrats|efa,ss ubef ei.f PumPe mi} d^ Saule in Ver-gebracht wird. Es weren 10-ml-Fraktionen gesammelt, die bei kmdungsteht. Pie Wird ?e?cthwmdlfke" von einer Verdünnung von '/i™ auf eine ß-Lactamase-Hemmwir- 30 J5 elu'ert Man san?me't 25-ml-Fraktionen, die dem kung untersucht werden. Die Fraktionen werden auch auf ihre ß-Lactamase-Hemmversuch unterworfen werden. Die aktiven antibakterielle Wirksamkeit mittels der Lochplatten-Versuchs- J^tionen N/k140 b's 230 !lerdf veremif1 undfu"ter ^T"' methode unter Verwendung von mit Klebsiella aerogenes dert*m P .ra<* b'snnal?ex^r Tr,ockne eingedampft Der Ruckbeimpften Nähragarplatten geprüft. Die Fraktionen, die die f,ndJ!rd,mlt SÖOmlAthanoIversetztuncl nach kraftigem höchste ß-Lactamase-Hemmwirkung besitzen und die Hemm- 35 fch"ttelnder vergebene Feststoff abfiltnert Der Athanolex-zonen beim Lochplattenversuch liefern, werden vereinigt, ein- fkt ™rd da"n U1?ter vermindertem Druck au einem Drehver-geengt und dann an einer «Biorad Biogel P2»-Säule entsalzt. dampfer zur Trockne eingedampft Der Ruckstand wird mit 40 Mittels Papierchromatographie und Dünnschicht-Chromato- ml Wass,er W1feder auJsf ost"Mlt d'eser Losungw.rd graphie erkennt man, dass diese Fraktionen Clavulansäure ent- ?me J1 ^cm-Saulemitemer Fullung von «Biorad Biogel P2» ^ajtgn 40 beschickt. Dann wird die Saule mit 1 Prozent n-Butanol enthaltendem Wasser eluiert. Es werden 25-ml-Fraktionen gesam-Beisniel 19 me"t' d'e au^ d'e ß-Lactamase-Hemmwirkung bei einer V2500 End-Isolierung des festen Natriumsalzes der Clavulansäure Verdünnung untersucht werden. Unter Verwendung einer Sil-500 mg des gemäss Beispiel 17 teilweise gereinigten festen bernitratlosung wird der Natriumchlondgehalt bei einer >/«co-Präparats von Clavulansäure werden auf eine Säule mit 45 Verdünnung der Fraktionen untersucht. Diejenigen Fraktionen 2,5x51 cm-Bettgrösse gebracht, die mit mikrogranulierter «CC einem Gehalt an natriumchlondfreier Clavulansäure wer-31 »-Cellulose beschickt ist. Als chromatographisches Lösungs- den vereinigt, unter vermindertem Druck durch Abdampfen mittel wird als obere Phase ein n-Butanol/Äthanol/Wasser- des Losungsmittels auf 20 ml eingeengt und dann gefnerge-Gemisch im Volumenverhältnis von 4:1:5 verwendet. Die Säule trocknet. Man erhalt 4,8 g Natriumsalz der Clavulansäure mit läuft bei 4 °C. Es werden 4-ml-Fraktionen gesammelt. Die Frak- 50 einem Lo-Wert von etwa 0,06 ng/ml.

tionen werden auf das Vorhandensein von Clavulansäure untersucht, indem man Filterpapier mit den Fraktionen betüpfelt Beispiel 21

und dann Ehrlichsçhes oder Triphenyltetrazolium-Sprüh-Rea- Herstellung des Methylesters der Clavulansäure ch20h ch-

\ V

ch2oh co2Na

/7

•N

y

0

\

\

.CO2CH5

15

629 252

19,8 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure werden in 0,5 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz); 3,84 (s, 3); 4,24 (d, 2, J = 7 Hz); 4,93 (dt, 1, J

ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit 0,25 ml =7Hz,j2= 1,5 Hz);5,07 (d, 1, J = 1,5 Hz); 5,72 (d, 1,] = 2,5 Hz).

Methyljodid behandelt. Nach 90minütigem Stehenlassen bei Molekulargewicht (Massenspektrum): 213,0635; berechnet für

Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen werden die C9H11NO4:213,0637.

Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der 5 Die Dünnschicht-Chromatographie des Methylesters zeigt

Rückstand wird mittels Dünnschicht-Chromatographie an Sili- eine einzige Zone bei den folgenden Lösungsmittelsystemen:

kagel (Kieselgel 60F254) gereinigt, wobei das Eluieren mit Butanol/Äthanol/Wasser-Gemisch als obere Phase im Volu-

Äthylacetat den Clavulansäure-Methylester als farbloses öl mit menverhältnis von 4:1:5 einen RrWert von 0,75; Isopropanol/

einem RrWert von 0,38 und einer roten Farbe mit Triphenylte- Wasser-Gemisch im Volumenverhältnis von 7:3 einen RrWert trazolium-chlorid-Spray-Reagens liefert. 10 von 0,95; und Äthylacetat/Äthanol-Gemisch im Volumenver-

Die Verbindung hat die folgenden Eigenschaften: hältnis von 8:2 einen RpWert von 0,87.

Analyse für C9H11NO5: C H N Diese Zonen werden mittels Bioautographie unter Verwen-

% % % dung von Klebsiella aerogenes mit einem Zusatz von Benzylpe-

ber.: 50,70 5,20 6,57 nicillin (also unter Verwendung eines synergistischen Systems)

gef.: 50,49 5,43 6,29 15 bestimmt.

Ä-max (Methanol): keine Absorption über 215 nm.

umax (Film): 3300-3600 (breit), 1800,1750,1695 cm"1.

Etwa 1. Ordnung-NMR-Spektrum (CDCh): 2,49 (breites s, 1, Beispiel 22

ausgetauscht mit D2O); 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz); 3,54 (dd, 1, J = Herstellung des p-Nitrobenzylesters der Clavulansäure

^ chooh

I /=!■

ch20h y

0

->

'COgNa

/

\-

J

\

C°2CH2—^ ^—

NO.

Die Behandlung des Natriumsalzes der Clavulansäure mit Umkristallisieren einen Schmelzpunkt von 117,5 bis 118 °C p-Nitrobenzylbromid in wasserfreiem Dimethylformamid lie- 35 haben.

fert nach der Dünnschicht-Chromatographie ein farbloses öl,

das aus einem Gemisch von Chloroform und Äther kristallisiert und den p-Nitrobenzylester der Clavulansäure als weisse feder- Beispiel 23

artige Nädelchen vom Fp. 111 bis 112 °C liefert, die beim Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure ch2oh ch2oh

Unreines Natriumsalz der 3-(ß-Hydroxyäthyliden>7-oxo4- Beispiel 24 oixa-l-azabicycio[3,2,0]heptan-2-carbonsäure, von der man Herstellung des Benzylesters der Clavulansäure aus rohen annimmt, dass sie roh gerechnet 55 mg reine Substanz enthält, 55 Extrakten des Kulturfiltrats von Streptomyces clavuligerus wird in 6,4 ml wasserfreiem Dimethylformamid mit 0,18 ml Ben- 20 Liter des gemäss Beispiel 10 erhaltenen Kulturfiltrats zylbromid behandelt. Die Lösung wird 3 Stunden unter wasser- werden unter Einsatz eines Kletterverdampfers auf 5 Liter einfreien Bedingungen bei Raumtemperatur (etwa 17 bis 18 °C) geengt. Das Konzentrat wird unter Verwendung eines gehalten. Das Reaktionsgemisch wird an Silikagel fraktioniert, «Edwards E.F.6»-Gefriertrockenschranks gefriergetrocknet, mit Äthylacetat eluiert und liefert im wesentlichen in reiner 60 Die derart erhaltenen 300 g Feststoff enthalten 3 g des Natri-Form den Benzylester der 3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa- umsalzes der Clavulansäure, wie mittels des ß-Lactamase-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carbonsäure als farbloses öl in Hemmversuches festgestellt worden ist. Der Feststoff wird in einer Ausbeute von 63 mg. 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit IR (Film): 1800,1745,1695 cm-1; 150 ml Benzylbromid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei NMR (CDCh): 2,25 (s, 1, austauschbar mit D2O); 3,05 (d, 1, J = 65 Raumtemperatur gerührt und dann mit 1 Liter Äthylacetat ver-17 Hz); 3,51 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 2,5 Hz); 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz); dünnt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat 4,92 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz); 5,15 (d, 1, J = 1,5 Hz); 5,24 (s, wird auf ein möglichst geringes Volumen eingedampft. Der 2); 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz); 7,45 8 (s, 5). ölige Rückstand wird mit einem weiteren Liter Äthylacetat

629252 16

extrahiert. Nach dem Filtrieren des Extrakts wird das Filtrat phiert. Nach der Auswahl der Fraktionen und nach Einengen wiederum eingedampft und man erhält einen öligen Rückstand, erhält man 27,6 g eines farblosen Öls, das den Clavulansäure-der auf eine 7,6x35,6 cm grosse Silikagel-Säule («Biogel Biosei benzylester mit einem Reinheitsgrad von 95 Prozent darstellt, A» mit einer Teilchengrösse von 0,15 mm) in Cyclohexan gege- wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

ben. Die Säule wird mit Cyclohexan eluiert, um Benzylbromid 5 zu entfernen. Das Lösungsmittel wird dann gegen Äthylacetat Beispiel 26

ausgetauscht. Man fängt 20-ml-Fraktionen auf. Die Fraktionen Herstellung des Clavulansäure-benzylesters werden auf das Vorliegen des Benzylesters der Clavulansäure 150 Liter eines Kulturfiltrats vom pH 7,0 mit einem Gehalt durch Tüpfeln auf mit Silikagel beschichteten Dünnschicht- von 16,2 g des Natriumsalzes der Clavulansäure, wie bei dem Chromatographie-Glasplatten (Silikagel 60F254) und Besprü- io ß-Lactamase-Hemmversuch festgestellt worden ist, werden mit hen mit 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium-chlorid-Sprüh-Reagens 5 kg eines Anionenaustauscherharzes in der Chloridform (TTC) untersucht. («Amberlyst A.26») 1 Stunde bei Raumtemperatur verrührt.

Die Fraktionen, die mit diesem Reagens intensive rote Flek- Das Harz wird dann abfiltriert. Das Filtrat wird nochmals ken liefern, werden weiterhin mittels Dünnschicht-Chromato- geprüft und zeigt, dass 6,4 g Clavulansäure entfernt worden graphie an Silikagel-Platten unter Verwendung eines Chloro- is sind. Das Harz wird mit 20 Liter entsalztem Wasser, dann mit form-Äthylacetat-Gemisches im Verhältnis 8:2 als Lösungsmit- 20 Liter Aceton und schliesslich mit 10 Liter Dimethylform-tel und durch Sprühen der entwickelten Platten mit TTC-Spray amid gewaschen. Nach nochmaligem Filtrieren wird das Harz geprüft. Der Benzylester dei' Clavulansäure läuft bei 22° mit in 2,3 Liter Dimethylformamid mit einem Gehalt von 0,2-m einem RrWert von 0,31. Die diesen Ester enthaltenden Fraktio- Natriumjodid suspendiert. Ferner werden 200 ml Benzylbro-nen werden vereinigt und auf 15 ml eingeengt. Diese Lösung 20 mid zugesetzt. Die Suspension wird gut gerührt. Nach 16stündi-wird nochmals chromatographiert an einer 3,8 x 40 cm Silika- gern Stehen bei Raumtemperatur fügt man 2 Liter Äthylacetat gel-Säule («Silikagel H, Typ 60») mit einem Chloroform/Äthyl- hinzu, filtriert dann das Harz ab, wäscht es wiederum mit Äthyl-acetat-Gemisch im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel. Es werden acetat und vereinigt die Waschwässer mit dem Filtrat. Der 15-ml-Fraktionen gesammelt und wie in der vorbeschriebenen Extrakt wird dann auf ein geringes Volumen eingeengt und an Weise auf den Benzylester geprüft. Die diesen Ester enthalten- 25 einer 7,6x46-cm-Silikagel-Säule («Silikagel H, Typ 60») mit den Fraktionen werden auf 8 ml eingeengt und nochmals durch einem Äthylacetat/Cyclohexan-Gemisch im Verhältnis 8:2 als Säulenchromatographie an einer 2,5 x 40 cm Silikagel-Säule Lösungsmittel chromatographiert. Die den Clavulansäure-ben-(«Silikagel H, Typ 60») mit einem Äthylacetat/Cyclohexan- zylester enthaltenden Fraktionen werden ausgewählt, indem Gemisch im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel gereinigt. Die aus- man auf Silikagel-Dünnschicht-Chromatographieplatten tüp-gewählten Fraktionen werden vereinigt und unter verminder- 30 felt und mit TTC-Reagens wie im vorstehenden Beispiel 24 tem Druck eingedampft. Man erhält 160 ml reinen Benzylester beschrieben besprüht. Die ausgewählten Fraktionen werden als Öl. dann auf 20 ml eingeengt und dann an einer 3,8 x 46-cm-Silika-

gel-Säule («Silikagel H, Typ 60») mit einem Chloroform/Äthyl-Beispiel 25 acetat-Gemisch im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel chromato-

Herstellung des Clavulansäure-benzylesters 35 graphiert. Die ausgewählten Fraktionen werden vereinigt und

3,3 kg eines sprühgetrockneten Feststoffes mit einem zu einem farblosen Öl eingedampft. Man erhält 440 mg Clavu-

Gehalt von 69,4 g Clavulansäure, wie es durch den ß-Lacta- lansäurebenzylester mit einem Reinheitsgrad von 90 Prozent, mase-Hemmversuch festgestellt worden ist, werden wie in Bei- wie durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist.

spiel 16 angegeben erhalten. Der Feststoff wird in 5,5 Liter Dimethylformamid aufgeschlämmt und mit 500 ml Benzylbromid 40 Beispiel 27

versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wer- Herstellung des Clavuransäure-benzylesters aus rohen Extrak-den 12 Liter Äthylacetat zugesetzt. Die Feststoffe werden abfil- ten eines Kulturfiltrats von Streptomyces clavuligerus triert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Ein aliquoter Teil eines wässrigen Rückextraktes aus einem Die erhaltenen 212g öliger Rückstand werden auf eine Säule Butanol-Extrakt eines Kulturfiltrats, das wie in Beispiel 14 mit einer Silikagel-Beschickung von 10x33 cm in Cyclohexan 45 beschrieben erhalten worden ist, wird unter Anwendung eines gegeben. Die Säule wird mit 12 Liter Cyclohexan eluiert, um Gefriertrockenschrankes gefriergetrocknet. Ein Anteil von überschüssiges Benzylbromid zu entfernen. Das Eluierungsmit- 24 g des erhaltenen Feststoffes weist einen Gehalt von 0,96 g tel wird dann gegen Äthylacetat ausgetauscht. Man fängt des Natriumsalzes der Clavulansäure auf, wie durch den ß-Lac-

500-ml-Fraktionen auf, die auf den Clavulansäure-Benzylester- tamase-Hemmversuch bestimmt worden ist. Dieser Feststoff Gehalt durch Tüpfeln auf Silikagel-Dünnschicht-Chromatogra- 50 wjrcj jn 75 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert, phieplatten («Silikagel 60F254») und Besprühen mit TTC- Dann werden 75 ml Benzylbromid zugegeben. Das Gemisch

Sprüh-Reagens geprüft werden. Die intensive rote Flecken wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die liefernden Fraktionen werden weiterhin mittels Dünnschicht- Suspension mit 500 ml Äthylacetat verdünnt. Nach dem Filtrie-Chromatographie an Silikagel mit einem Chloroform/Äthylace- ren des Gemisches wird das Filtrat unter vermindertem Druck tat-Gemisch im Verhältnis 8:2 als Lösungsmittel und Besprühen 55 auf einem Drehverdampfer zu einem öligen Rückstand einge-der entwickelten Platten mit TTC-Spray untersucht. Die Frak- dampft. Dieser Rückstand wird auf eine 5x35,5-cm-Silikagel-tionen Nr. 5 bis 13 enthalten den Hauptteil des Esters. Diese Säule («Biogel Biosil A» von einer Teilchengrösse unter Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck 0,15 mm) in Cyclohexan gegeben. Aus der Säule wird Benzyl-zu 79,3 g Öl eingedampft. Dieses Öl wird dann an einer 10x46- bromid eluiert. Dann wird das Lösungsmittel gegen Äthylace-cm-Säule von Silikagel («Silikagel H, Typ 60») mit einem Chlo- 60 tat ausgetauscht. Man sammelt 10-ml-Fraktionen, wobei man roform/Äthylacetat-Gemisch im Verhältnis 8:2 als Lösungsmit- den mit einem Gehalt an Clavulansäure-benzylester wie in Beitel chromatographiert. Die Fraktionen werden wie zuvor spiel 24 angegebenen auswählt. Eine weitere Reinigung wird beschrieben gesammelt und ergeben beim Konzentrieren 45,9 g auch durch Säulenchromatographie, wie in Beispiel 24 angege-eines Öls, das einen Reinheitsgrad von 62 Prozent aufweist, wie ben, erreicht. Bei diesem Verfahren erhält man 220 mg des rei-durch NMR-Spektroskopie festgestellt worden ist. 65 nen Benzylesters.

Dieses Produkt wird nochmals an einer 7 x 46-cm-Säule von vernetztem Dextran («Sephadex LH 20») in einem Cyclohe- Beispiel 28

xan/Chloroform-Gemisch im Verhältnis 1:1 chromatogra- Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

17

629252

ch20h

4

c02ch2c6h5

ch2oh

281 mg im wesentlichen reiner Clavulansäure-benzylester in 25 ml Äthanol mit einem Gehalt an 82 mg Natriumbicarbo-nat werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 90 mg 10 Prozent Palladium auf Kohle hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und Waschen mit Wasser und Äthanol werden die vereinigten Filtrate unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingedampfte. Der halbfeste Rückstand wird mit Aceton verrieben, filtriert und mit Äther gewaschen. Man erhält 135 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure.

Tabelle III

Antibakterielles Spektrum des Natriumsalzes der Clavulansäure

15 •

Bakterienstamm

Mindest-Hemmkonzen-tration, (ig/ml

Beispiel 29

Hydrolyse des Clavulansäure-methylesters zu Clavulansäure

2,17 mg Clavulansäure-methylester werden in 0,1 mlMetha- 25 noi gelöst und mit 0,208 ml einer 0,0482-n Natriumhydroxidlösung behandelt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur enthält das Reaktionsgemisch verschiedene Produkte. Die Dünn-schicht-Chromatographie zeigt an, dass einer der Hauptbestandteile einen RrWert besitzt, der mit dem des Natriumsalzes 30 der Clavulansäure identisch ist. Farbreaktionen und der biologische Versuch bestätigen, dass es sich um das Natriumsalz der Clavulansäure handelt.

Eine langsame Umwandlung des Esters in Clavulansäure wird dann festgestellt, wenn 1 mg/ml der Verbindung bei 37 °C in einer 0,05-m Phosphatpufferlösung bei pH 7 bebrütet werden. Der Reaktion schliesst sich eine Papierchromatographie (bioautographisches System) an. Unter Verwendung eines Butanol/Äthanol/Wasser-Systems, um der Reaktion über einen Zeitraum von 2 Stunden zu folgen, verkleinert sich die Zone 40 des Methylesters bei einem RrWert von 0,79 und vergrössert sich die Zone der Clavulansäure beim RrWert von 0,12.

Antibakterielles Spektrum der Clavulansäure

Die antibakterielle Wirksamkeit des Natriumsalzes der Cla- 45 vulansäure gegenüber einer Reihe von Bakterien wird unter Anwendung der Mikrotiter-Methode bestimmt. Reihenverdünnungen des Natriumsalzes der Clavulansäure in der «Oxoid»-Empfindlichkeits-Testbouillon, die in einer Mikrotiter-Kunst-stoffcuvette enthalten ist, werden mit einer über Nacht bebrü- 50 teten Kulturlösung jedes Organismus beimpft, so dass die Endverdünnung des Impfstoffes 0,5 x 10-4 beträgt. Die Kulturen werden über Nacht bebrütet. Am nächsten Morgen werden die Punkte des bakteriellen Wachstums durch Beobachtung der Eintrübung der Kulturlösung beobachtet. Die Ergebnisse, aus- 55 gedrückt als angenäherte Mindest-Hemmkonzentrationswerte in ng/ml, sind in der Tabelle III aufgeführt, die auch zeigt, dass die Verbindung ein breites Spektrum hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit besitzt.

Staphylococcus aureus (Oxford H) 7,5

Staphylococcus aureus (Russell) 7,5

Bacillus subtilis 62

Streptococcus faecalis >500

Streptococcus pyogenesCN 10 125

Escherichia coli NCTC10418 31

Klebsiella aerogenes 31-62

Klebsiella oxytocum 62

Enterobacter aerogenes T 624 31

Enterobacter cloacae 62

Acinetobacter anitratus 125

Providentia stuardi 125

Serratia marcescens 125

Proteus mirabilis C977 62

Proteus vulgaris W090 . 31

Salmonella typhimurium 31

35 Shigella sonnei 62

Pseudomonas aeruginosa A 500

ß-Lactamase-Hemmung durch das Natriumsalz der Clavulansäure

Clavulansäure hemmt fortschreitend und irreversibel die ß-Lactamase von Escherichia coli. Die Methode der «Beschreibung 1» zeigt, dass andere, in Tabelle IV aufgeführte ß-Lacta-masen ebenfalls durch Clavulansäure gehemmt werden.

Tabelle IV

Hemmung der ß-Lactamasen durch Clavulansäure

Quelle der ß-Lactamase ungefährer Iso-Wert im Verhältnis zu Escherichia coli JT 4 = 1

Staphylococcus aureus (Russell)

1,0

Escherichia coli JT4

1,0

Escherichia coli Bll

2,0

Klebsiella aerogenes A

0,6

Pseudomonas aeruginosa 1822

(R-Faktor)

5,0

Pseudomonas dalgleish

0,1

60 Mit Penicillin G als Substrat beträgt der Iso-Wert des Natriumsalzes der Clavulansäure gegenüber der ß-Lactamase von Staphylococcus aureus Russell annähernd 0,06 (ig/ml.

Aktivität des Clavulansäure-methylesters 65 Untersuchungen hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit in Brühen zeigen, dass der Clavulansäure-methylester ein breites Wirkungsspektrum, jedoch von etwas geringerer Stärke als die Clavulansäure selbst hat. Es ist nicht klar, ob es

629252

sich bei dieser Aktivität um die Aktivität der Verbindung selbst oder um die der durch langsame wässrige Hydrolyse des Esters freigesetzten Clavulansäure handelt. Clavulansäure-methylester zeigt einen bemerkenswerten antibakteriellen Synergismus in Verbindung mit Ampicillin oder Cephaloridin gegenüber solchen Bakterien, die gegen diese Antibiotika resistent sind. Dementsprechend wird die Mindest-Hemmkonzen-tration für Ampicillin gegenüber Staphylococcus aureus (Russell) von 500 (ig/ml auf unter 0,4 in Gegenwart von 1,0 p.g/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt. Die Mindest-Hemm-konzentration für Cephaloridin wird von 1,5 n.g/ml auf unter 0,03 p.g/ml in Gegenwart von 1 (ig/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt. Die Mindest-Hemmkonzentration für Ampicillin gegenüber Proteus mirabilis C889 wird von 500 [ig/ml auf 31 LLg/ml in Gegenwart von 5 [ig/ml Clavulansäure-methylester herabgesetzt.

Beispiel 30

Herstellung von Clavulansäure-Trimethylmethoxymethylester Zu einer gerührten Lösung von 0,37 g Trimethylessigsäure-brommethylester in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,49 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 20 ml Wasser behandelt. Das Gemisch trennt sich in zwei Schichten auf. Die nicht-wässrige Schicht wird abgetrennt, mit 20 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird eingedampft. Man erhält 500 mg eines schwachgelben Öls.

NMR (CDCh): 1,26 (s, 9); 3,13 (d,l,J = 17 Hz);3,62(dd, 1, J = 17 Hz, J. = 2,5 Hz); 4,3 (d, 2, J = 7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, J = 7,5 Hz, ]i =

1.5 Hz); 5,16 (d, 1, J = 1,5 Hz); 5,79 (d, 1, J = 2,5 Hz); 5,92 ô (s, 2). IR (flüssiger Film): ß-Lactam-C.O 1800 cm-1, Ester-C=Ó

1760 cm-1.

Beispiel 31

Herstellung des Clavulansäure-phthalidesters

Zu einer gerührten Lösung von 0,43 g 3-Bromphthalid in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,5 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 30 ml Wasser gut durchgeschüttelt. Die nicht-wässrige Schicht wird mit 20 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält eine blassgelbe, gummiartige Substanz. Die beiden diastereo-meren Ester werden unter Anwendung einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie an einer 40 x 10-mm-Säule von Silikagel («Merckosorb SI 60» mit einem Teilchendurchmesser von 5 (j.) aufgetrennt, wobei mit Äthylacetat bei einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/Min. eluiert wird.

Der erste Phthalidester mit einer Rezensionszeit von 7,15 Minuten kristallisiert aus Äthylacetat als Nadeln vom Schmelzpunkt 102 °Cund hat die nachstehenden Eigenschaften.

IR(Nujol, warm): ß-Lactam-C=0 1790 cm-1, Ester-C=0 1755 cm"1.

NMR (CD3COCD3): 3,14 (d, 1, J = 17,5 Hz); 3,76 (dd, 1, J. = 17,5 Hz, h = 2,5 Hz); 4,25 (d, 2, ] = 7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, ]i = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz); 5,4 (s, 1, J = 1,5 Hz); 5,82 (d, 1, J = 2,5 Hz); 7,7 (s, 1);

8.06 5 (m, 4); Molekulargewicht (Massenspektrum): 331,0696 entspricht C16H13NO7 (berechnet 331,0692).

Das zweite Diastereoisomere mit einer Retensionszeit von 8,85 Minuten hat die folgenden Eigenschaften.:

IR(CH2Cl2-Lösung):ß-Lactam-C=0 1800 cm-1 Ester-C=0 1780 cm-1;

NMR (CDCh): 2,42 (breites s, 1 austauschbar mit D2O); 3,12 (d, 1, J = 18 Hz); 3,60 (dd, 1, Ji = 18 Hz, J2 = 2,5 Hz); 4,30 (d, 2, J = 7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, J. = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz); 5,76 (d, 1, J = 2,5 Hz); 7,52 (s, l);7,85 5(m,4).

Beispiel 32

Herstellung des Clavulansäure-nonylesters

44 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden mit 76 mg Nonyljodid behandelt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel fraktioniert, wobei mit einem Gemisch aus Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 2:1 eluiert wird. Man erhält ein öliges Produkt.

IR (Film): 1800,1745,1690 cm"1;

Molekulargewicht (Massenspektrometrie): 325,1890 entspricht C17H27NO5 (berechnet 325,1889).

Beispiel 33

Herstellung von Calvulansäure

100 mg Clavulansäure-benzylester in 5 ml Äthanol werden 45 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 30 mg eines 10 Prozent Palladium-auf-Kohle-Kataly-sators hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 58 mg Clavulansäure als instabiles viskoses Öl.

NMR (CsDsN): 3,05 (d, 1, J = 18 Hz); 3,60 (dd, 1, Ji = 18 Hz, ]z = 2,5 Hz); 4,75 (d, 2, J = 7,5 Hz); 5,58 (t, 1, J = 7,5 Hz); 5,66 (s, 1); 6,0 8 (d, 1, J = 18 Hz).

Beispiel 34

Herstellung des Clavulansäure-methylesters

130 mg Clavulansäure in 10 ml Äthanol werden mit überschüssigem Diazomethan in Äther behandelt. Nach 2 Minuten bei Raumtemperatur zeigt die Dünnschicht-Chromatographie, dass die Umsetzung vollständig ist. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Silikagel unter Eluierung mit Äthylacetat gereinigt. Die den Clavulansäure-methylester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 104 mg eines klaren Öls.

Beispiel 35

Herstellung des Clavulansäure-methylesters

200 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei 0 °C gerührt. Dann werden 0,5 ml Methanol und 206 mg Dicyclohexyldicarbödiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den rohen Clavulansäure-methylester der durch Chromatographie an Silikagel unter Eluieren mit Äthylacetat gereinigt wird. Man erhält 140 mg eines klaren Öls.

Beispiel 36

Herstellung des Clavulansäure-phenylesters

100 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei 0 °C gerührt. Zur Lösung werden 0,94 g Phenol und 100 mg Dicyclohexyldicarbodiimid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Filtrat wird eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch von Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 1:1 fraktioniert. Man erhält 70 mg Clavulansäure-Phenylester.

IR (Film): 1800,1770,1690 cm-'; NMR(CDCb): 2,18 (breites s, 1 ); 3,06 (dd, 1, Ji = 17 Hz, J2 = 0,9 Hz); 3,54 (dd, 1, Ji = 17 Hz, J2 = 2,6 Hz); 4,29 (d, 2, J = 7,5 Hz); 5,1 (dt, 1, Ji = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz); 5,29 (d, 1, ) = 1,5 Hz); 5,76 (dd, 1, Ji = 2,6 Hz, J2 = 0,9 Hz); 7,35 8 (m, 5).

Molekulargewicht (Massenspektrometrie) = 275,0777 entspricht C14H13NO5 (berechnet 275,0794).

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

19

629 252

Beispiel 37

Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

840 mg Clavulansäure-benzylester in 30 ml Äthanol und 5 ml Wasser werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 267 mg lOprozentigem Palladium auf Kohle und 244 mg Natriumbicarbonat hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Wasser und Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt wird aus einem Gemisch von Wasser und Aceton umkristallisiert. Man erhält 565 mg Mikrona-deln. Umkristallisieren aus einem Gemisch von Wasser und Aceton liefert Nadeln, die nach 24stündigem Trocknen über P2O5 unter vermindertem Druck die nachstehende Analyse liefern:

C 41,01 H 3,77 N 5,68 C 40,86 H 3,64 N5,51 IR(KBr-Platte): 1785,1700,1620 cm"1;

NMR (d2o): 3,06 (d, 1, J = 18,5 Hz); 3,57 (dd, 1, Ji = 18,5 Hz, j2 = 2,5 Hz); 4,15 (d, 2, J = 8 Hz); 5,3 (HOD); 4,9 (m); 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz).

Versuch

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Die Mindest-Hemmkonzentration von Ampicillin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Ampicillin in Gegenwart von 1 p,g/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure werden bei einer Reihe von ß-lactamase-erzeugenden Bakterien bestimmt. Die Organismen werden in eine «Oxoid»-Empfind-lichkeits-Testflüssigkeit überimpft, die sich in kleinn Löchern in einer Plastikcuvette befinden und die unterschiedliche Konzentrationsgradienten von einem Ampicillin, zum anderen von dem Natriumsalz der Clavulansäure und zum dritten von Ampicillin plus 1 p.g/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure (Mikro-titer-Methode) enthalten. Die Endverdünnung des Impfstoffes beträgt 0,5 x 10~2. Die Cuvette wird bei 37 °C über Nacht bebrütet. Ein Aufzeichnung der Endpunkte des bakteriellen Wachstums wird am nächsten Morgen vorgenommen. Die Mindest-Hemmkonzentrationswerte in (xg/ml sind in der Tabelle V verzeichnet, die auch aufzeigt, dass der Synergismus bei der niedrigen Konzentration von 1 |ig/ml in bemerkenswerter Weise die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber bestimmten grampositiven und gramnegativen Bakterien steigert. Der Mechanismus dieses Synergismus besteht wahrscheinlich darin, die Hemmung der ampicillin-zerstörenden ß-Lactamase-Enzyme nach sich zu ziehen, doch kann die Existenz anderer Mechanismen nicht ausgeschlossen werden.

Ähnliche Ergebnisse wie die in Tabelle V angegebenen werden erhalten, wenn man Ampicillin durch Amoxycillin oder durch den Phthalidylester des Ampicillins ersetzt.

Tabelle V

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Staphylococcus aureus (Russell) Staphylococcus aureus

15 62

500 250

<0,4 7,5

Antibakterieller Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Die Mindest-Hemmkonzentrationen von Cephaloridin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Cephaloridin in 1 Gegenwart von 5 [ig/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure werden nach dem vorne beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle VI zeigen, dass ein Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und Cephaloridin erhalten werden kann, insbesondere beim ß-lactamase-erzeugenden Stamm von Staphylococcus aureus (Russell).

20 Tabelle V

Antibakterieller Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Bakterienstamm Mindest-Hemmkonzentrationen, |ig/ml

25 Natriumsalz Cephalo- Cephaloridin in der ridin Gegenwart von 5 Clavulan- [ig/ml Natriumsalz säure der Clavulansäure

30

Proteus mirabilis 899 >500*

62

7,5

Staphylococcus

aureus (Russell)

15

3,1

<0,03**

Staphylococcus

aureus

62

15

3,7

* Endpunkt

** der gleiche Wert wird erhalten, wenn 1 (ig/ml anstatt 5 ng/ml Synergist zugegeben wird.

40 Antibakterieller Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen

Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse werden nach dem im Versuch beschriebenen Verfahren erhalten.

45

Tabelle VII

Antibakterieller Synergismus zwischen dem Natriumsalz der 50 Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen gegenüber Stämmen von Klebsiella aerogenes

Bakterienstamm

Mindest-Hemmkonzentrationen, ng/ml

Natriumsalz

Ampi

Ampicillin in

der cillin

Gegenwart von 1

Clavulan

(ig/ml Natriumsalz

säure

der Clavulansäure

Escherichia coli

NCTC10418

31

1,8

<0,4

Escherichia coli B 11

62

>500

125

Klebsiella aerogenes

A

31

125

<0,4

Klebsiella sp 62

31

125

<0,4

Enterobacter cloacae

62

250

62

Serratia marcescens

125

>500

62

Amoxycillin

Carbenicillin*

Benzylpenicillin

allein +5|xg/ml allein +5 ng/ml allein +5ng/ml

Stamm

Synergist

Synergist

Synergist

A

500 0,97

500 7,8

250 7,8

E 70

500 3,9

500 15

500 15,6

62

250 15,6

125 7,8

250 15,6

60

* Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn Carbenicillin durch den Phenyl-a-ester des Carbenicillins oder durch Ticar-cillin ersetzt wird.

65 Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und Estern der Clavulansäure

Die in der Tabelle VIII angegebenen Ergebnisse werden nach dem im Versuch beschriebenen Verfahren erhalten.

629252

20

Tabelle Vili

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und Estern der Clavulansäure gegenüber Stämmen von Klebsiella aerogenes

Stamm Ampicillin Ampicillin + 5 |xg/ml Ampicillin + 5 (ig/ml des allein des Methylesters der Benzylesters der Clavulansäure Clavulansäure

A 500 1,9 1,9

E 70 500 3,9 3,9

62 500 3,9 3,9

Weder Clavulansäure-methylester noch Clavulansäure-ben-zylester hemmen das Wachstum der Testorganismen bei Konzentrationen von 100 (xg/ml.

5 Antibakterielle Wirksamkeit von Clavulansäure-Estern

Beim Verfahren wie bei der Bestimmung des antibakteriellen Spektrums der Clavulansäure, jedoch unter Verwendung einer Verdünnung von Vioo bei der über Nacht angesetzten Bebrütung werden die in Tabelle IX angegebenen Mindest-io Hemmkonzentrationswerte bei bestimmten Estern der Clavulansäure gegenüber einer Anzahl von Organismen erhalten.

Tabelle IX

Antibakterielle Wirksamkeit von Clavulansäureestern

Mindest-Hemmkonzentrationen von Mindest-Hemmkon-

Clavulansäureestern zentration des

Natriumsalzes der Benzyl- Nonyl- Trimethyl- Phthali- Clavulansäure*

Organismus ester ester acetoxymethyl- dyl-

ester ester

Bacillus subtilis A Staph. aureus Oxford Staph. aureus Russell Escherichia coli 10418

250

31

62

125

62

62

31

31

31

15

125

31

62

15

15

125

250

125

125

125

* Die Mindest-Hemmkonzentration des Natriumsalzes der Clavulansäure ist zu Vergleichszwecken mit aufgeführt worden. Die hohen Mindest-Hemmkonzentrationswerte - wenn sie mit denen der Clavulansäure aus der vorstehenden Tabelle III verglichen werden - beruhen auf dem verwendeten Grundimpfstoff.

Beispiel 38

Extraktion von Clavulansäure unter Verwendung von flüssigen Ionenaustauscherharzen

200 mg eines Kulturfiltrats, das in ähnlicher Weise wie in Beispiel 3, jedoch unter Verwendung eines Mediums mit einem Gehalt an 0,1 Volumenprozent KH2PO4 anstelle von 0,01 Prozent FeS04* 7H2O erhalten worden ist, wird 30 Minuten bei 5 °C mit 66 ml «Amberlite LA2» in der Chloridform mit 15 Volumenprozent Methylisobutylketon extrahiert.

Die Phasen werden durch 20minütiges Zentrifugieren mit 1660 g getrennt. Die Lösungsmittelphase (60 ml) wird mittels einer Pipette entnommen und in vier gleiche Anteile aufgeteilt. Jeder Anteil wird durch 20minütiges Rühren bei 5 °C mit einem Viertel des Volumens (3,75 ml) eines wässrigen Extraktionsmittels, wie es nachstehend in der Tabelle angegeben ist, extrahiert. Das erhaltene Gemisch wird 15 Minuten zentrifugiert (1660 g). Aus jeder Extraktion werden 3,6 ml einer wässrigen Phase gewonnen.

Probe

Volumen

Clavulansäure-

Clavulan

(ml)

Konzentration säure

(|xg/ml)

(mg)

geklärte Bouillon

200

128

25,4

extrahierte Bouillon

200

15

3,0

m-NaCl-Extrakt

3,6

305

1,1

2m-NaCl-Extrakt

3,6

598

2,5

m-NaN03-Extrakt

3,6

638

2,3

2m-N aN03-Extrakt

3,6

758

2,73

1 Das mit 2-m Natriumnitrat erhaltene Ergebnis zeigt die Gewinnung von 43 Prozent aus einer geklärten Nährbouillon an.

35 Beispiel 39

Extraktion der Clavulansäure unter Verwendung eines flüssigen Ionenaustauscherharzes

47 Liter der nach Beispiel 12 erhaltenen geklärten Bouillon werden mit 12,5 Liter «Amberlite LA2» in der Acetatform in 15 40 Volumenprozent Methylisobutylketon durch 1 stündiges Rühren bei 17 °C extrahiert. Nach Zusatz von 500 ml Octan-l-ol werden die Phasen in einer kontinuierlichen Zentrifuge separiert, wobei man 9,2 Liter der Lösungsmittelphase erhält, die dann bei 5 °C90 Minuten mit 2,3 Liter einer 1-m Natriumnitrat-45 lösung verrührt wird. Das Gemisch wird mittels einer kontinuierlichen Zentrifuge aufgetrennt und ergibt 2,4 Liter einer wässrigen Phase (einschliesslich des für Verdrängungszwecke verwendeten Wassers). Die wässrige Phase, deren ursprünglicher pH-Wert 8,0 war, wird auf einn pH-Wert von 7,0 mittels kon-50 zentrierter Salzsäure eingestellt.

55

Probe

Volumen Clavulansäure-

Clavulan

(Liter)

Konzentration säure

(M-g/ml)

(mg)

geklärte Bouillon

47

146

6862

extrahierte Bouillon

47

19

893

m-NaN03-Extrakt

2,4

1638

3931

Die Extraktionswirksamkeit aus der geklärten Bouillon beim Natriumnitrat-Extrakt beträgt 57 Prozent.

1 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

1. 629252

   2

   PATENTANSPRÜCHE Streptomyces clavuligerus ist ausführlich beschrieben wor-

   1. Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure der Formel den von Higgens und Mitarbeitern in Int. J. Systematic Bacte-

   riology 21 (1971), S. 326. Dieser Mikroorganismus war insofern interessant, als er bestimmte ß-Lactam-Antibiotika erzeugt, wie

   5 Penicillin N, 7-{5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoy-, j, loxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure und 7-(5-Amino-5-carboxy-' valeramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-car-bonsäure. Dieser Mikroorganismus ist bei der Agricultural Research Service Collection unter der Nummer NRRL 3585 io und bei der American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852, USA unter der Nummer ATCC 27064 hinterlegt worden und ist dort seit 18.5.1971 und von deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen öffentlich zugänglich. Streptomyces clavuligerus ist auch in der Stamm von Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 aerob US-PS 3 770 590 und von Nagarajan und Mitarbeitern in J.

   züchtet und aus dem Kulturmedium die Clavulansäure oder is Amer. Chem. Soc. 93 (1971), S. 2308, Brannon und Mitarbeitern deren Salz gewinnt. in Antimicrob. Agents Chemother. 1 (1972), S. 237 und 247 und
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Higgens und Mitarbeitern in J. Antibiotics 27 (1974), S. 298,

   dass man die gewonnene Säure mit einer Base behandelt, um erwähnt worden.

   vorzugsweise das N atrium-, Kalium- oder Lithiumsalz zu gewin- ß-Lactamasen sind Enzyme, die den ß-Lactamring von Peninen. 20 cillinen und Cephalosporinen öffnen und Produkte liefern, die
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich- keine antibakterielle Wirksamkeit mehr besitzen. Derartige net, dass man ein erhaltenes Salz zur freien Säure hydrolysiert. Enzyme werden von verschiedenen Bakterien erzeugt, z. B.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Spezies oder Stämmen von Escherichia, Klebsiella, Proteus, dass man die Clavulansäure aus dem angesäuerten Kulturme- Pseudomonas, Enterobacter und Staphylococcus. Diese dium mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen 25 Enzyme sind in vielen Fällen die Erklärung für eine WiderLösungsmittel extrahiert. standsfähigkeit bestimmter Stämme solcher Organismen
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, gegenüber manchen Penicillinen und Cephalosporinen. Die dass man als Lösungsmittel n-Butanol verwendet. Bedeutsamkeit einer ß-Lactamase-Erzeugung wird verständlich
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich- wenn offensichtlich wird, dass ein hoher Anteil von klinisch iso-net, dass man die Clavulansäure in eine wässrige Phase unter 30 Herten Organismen ß-Lactamasen erzeugen (vgl. z.B. M. Wilson annähernd neutralen Bedingungen rückextrahiert, und dass und I.A. Freman in Bacteriological Proceedings 80 (1969), wo in man ein Salz der Clavulansäure aus der wässrigen Lösung dem Aufsatz «Penicillin Inactivation by Gram-negative Bacilli» durch Entfernen des Lösungsmittels bildet und isoliert die Autoren gezeigt haben, dass 84 Prozent der gramnegativen
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Organismen, die in einem amerikanischen Krankenhaus isoliert dass man die Clavulansäure aus dem Kulturmedium an ein stark 35 worden sind, ß-Lactamase erzeugen). In zahlreichen Fällen sind basisches oder ein schwach basisches Anionenaustauscherharz bestimmte Penicilline oder Cephalosporine unwirksam bei der adsorbiert und es davon durch Eluieren mit einem anorgani- Behandlung von Krankheiten, die keine ß-Lactamase erzeugen-schen Salz gewinnt. den Organismen wegen des allgemeinen Auftretens einer
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich- Nebeninfektion durch einen ß-Lactamase-Erzeuger zugeschrie-net, dass man ein unreines Salz der Clavulansäure chromato- 40 ben werden (vgl. z. B. R. May und Mitarbeiter in Brit. J. Dis. graphisch reinigt. Chest. 66 (1972), S. 185). Von Gemischen von ß-Lactamase-
9. 9. Verwendung der nach dem Verfahren nach Anspruch 1 Hemmsubstanzen mit einem Penicillin oder einem Cephalospo-erhaltenen Clavulansäure oder deren Salze zur Herstellung der rin könnte man erwarten, dass das letztere vom Abbau durch entsprechenden Ester, durch Veresterung. bakterielle ß-Lactamase geschützt sei, so dass sie dadurch ihre

   45 antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche infektiöse Organismen steigern. Eine derartige Steigerung einer antibakteriel- len Wirksamkeit nennt man Synergismus, wenn die antibakterielle Wirksamkeit des Gemisches über eine einfache Addition der Wirksamkeiten der beiden Einzelsubstanzen hinausgeht.