SE453600B - Forfarande for framstellning av ett salt av klavulansyra - Google Patents

Description

UI 453 600 2 gism när kombinationens antibakteriella aktivitet väl över- stiger den enkla adderade aktiviteten för de två separata ämnena.

Blandningens 8-laktamasinhibierande komponent kallas synergíst och sådana ämnen är värdefulla när det gäller att förhöja den antíbakteriella aktiviteten hos penicilliner och cefalosporiner gentemot resistenta organismer. Ett av ändamålen med föreliggande uppfinning är åstadkommande av sådana synergister.

Ex. pà användningen av vissa B-laktamasresistenta halv- syntetiska penicilliner och cefalosporiner som 5-laktamasinhibitorer och synergister för penicilliner och cefalosporíner har redan be- skrivits i litteraturen, se ex.vis Sutherland et al, Nature, 201, 868 (1964), Sabath et al, Nature, 20ü, 1066 (1964), O'Callaghan et al, Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 1968, 67 (1969).

Inget av dessa kända ämnen har emellertid haft en dramatisk effekt på spektret för det andra i blandningen närvarande antibiotikumet.

Vissa aktinomyceteodlingar har beskrivits såsom bildande ß- laktamasinhiberande ämnen, vilka verkar synergistiskt med peni- cilliner eller cefalosporiner, ex.vis de odlingar som avslöjas i brittiska patentet nr l 363 075 och de som beskrives av Hata et al, J.Antibiotics, 25, 473 (1972) och Umezawa et al, J.Antibiotics, » 5l'(l97j). Ingen av dessa B-laktamasinhibitorer av aktino- mycetiskt ursprung har hittills visat sig vara användbart kliniskt.

Speciellt anmärkningsvärda kännetecken som skiljer klavulansyra från andra B-laktamasinhibitorer av aktinomycetiskt ursprung är dess extraherbarhet över i organiska-lösningsmedel från Odlinšs' filtrat vid pH 2, dess höga stabilitet i humanblod och dess breda :S::t:::aa:oí::;ï:ï::P:::ld:0h Bïlaktamasinhiberande aktivitet, SS h°3a Rf'VäPdefl På PaPPerskromato- gram under användning av en mångfald lösningsmedelssystem Det har nu upptäckts, att den aeroba odlingen av Strepto- myces clavuligerus i konventionella näríngsmedia vid ca 25-30°C under i stort neutrala betingelser ger ett 5-lakgamasinhibepanfie ämne som även besitter antibakteriell aktivitet. Detta nya_mate- rial har getts benämningen "klavulansyra".

Klavulansyra har följande egenskaper: fa) Den är en karbcxylsyra. (Ö) Den bildar ett natriumsalt med ett karakteristiskt infraröd- spektrum i huvudsak såsom visas i fig. 1.

(C) Den kan inhibera tillväxten av stammar av Staphylococcus' fl-Y' BO HO 3 453 son' aureus.

Den kan åstadkomma synergism med avseende pà den antibakte- riella effekten av ampicillin gentemot B-laktamasalstrande stammar av Escherichia coli, Klebsiella erogenes och Staphylococcus aureus.

Den kan åstadkomma synergism betr. den antibakteriella effekten av cefalosporidin gentemot B-laktamasalstrande stammar av Proteus mirabilis och Staphylococcus aureus.

Den bildar en metylester som har en molekylvikt (bestämd medelst mass-spektroskopí) av 2l3,0635, vilket motsvarar formeln C9H1lNO5.

Klavulansyra kan sålunda betraktas som en monobasisk karboxyl- syra med formeln C8H9NO5, vilken i form av dess natriumsalt har ' ett karakteristiskt infrarödabsorptionsspektrum i huvudsak såsom visas i fig. 1.

Föreningen alstrad av Streptomyces clavuligerus med ovan- stående egenskaper har formeln (II): _? «á'""N \\\ (d) (e) (f)' CH OH 2 (II) O 0211 Klavulansyra kan sålunda benämnas 3-(ß-hydroxietyliden)- 7-oxo-4-oxa-l-azabicyklo/B.2.0/heptan-2-karboxylsyra.

"Stereokemin vid klavulansyrans C5 och C2 är densamma som den som äterfinnes i naturligt uppträdande penicilliner och ce- falospnríner, varför klavulansyra kan återges med strukturformeln (I): ___gJ4Oj>F==// '__ \\/' O \ CHEOE (I) “00211 _ Ett fullständigare kemiskt namn för klavulansyra är sålunda z-(an,sn)-3-(s-nydroxiecyiiaan)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyklo/3.2.0/1 heptan-2-karboxylsyra.

Den stora användbarheten av klavulansyra inses lätt mot bakgrunden av att vissa stammar av Klebsiella aercgenes A, vars 453 600 u tillväxt ej inhiberas av närvaron av 125/ug/hl ampicillin, amoxi- cillin, karbenieillin eller bensylpenicillin eller av närvaron av r a g/ml klavulansyra, inhiberas genom närvaron av mindre än 12,5/ug/ml av tidigare omnämnda penicilliner när samtidigt 5/ug/ml klavulansyra är närvarande. Samma resultat har observerats för kombinationer innehållande olika estrar av klavulansyra. Ex.vis stammar av Klebsiellaaerogenes A, vars tillväxt icke inhiberas av 125/ugfinl av ampicillin eller av 10 g/ml av klavulansyrametylester inhiberas genom mindre än 12,5/ug/ml ampicillin i närvaro av /ug/ml av klavulansyrans metylester. Det har även visat sig, att stammar av Staphylococcus aureus Russell, vars tillväxt ej inni- beras av närvaron av 100/ug/ml ampicillin eller av 5/ug/ml klavulan- syra, inhiberas genom närvaron av mindre än lu/ug/ml ampicillin i närvaro av l/ug/ml klavulansyra. Vid försök på nonmöss har de: visat sig att blod- obh vävnadsnivàer av klavulansyra väsentligt överstigande 5 lg/ml lätt kan uppnås genom subkutan administration av 100 mg/kg av natriumsaltet av klavulansyra, och att användbara nivåer av klavulansyra kan erhållas efter oral administration av 100 mg/kg av natriumsaltet av klavulansyra.

Genom föreliggande uppfinning åstadkommes följaktligen ett förfarande för framställning av ett salt av klavulansyra.

Salterna av klavulansyra är lämpligast i form av farmaeeutiskt acceptabla salter, såsom natrium-, kalium-, klacíum-, magnesium-, aluminium-, ammonium- och substituerade ammoniumsalter, såsom trímetylammonium,bensatin, prokaín och liknande salter, konven- tionellt bildade med penicilliner eller cefalosporiner.

,Salter av klavulansyra har tendens att vara stabilare än modersyran som sådan och bildar sålunda en föredragen sida av föreliggande uppfinning. Speciellt lämpliga salter av klavulansyra innefattar natrium- och kaliumsalterna, vilka har formeln (III) resp. (IV): ' _ C H OH O§==/CIH2OH , I “co / toa (III) (IV) Kristallína former av sådana salter kan innehålla hydratvatten.

Såsom tidigare angivits har klavulansyra och dess salter 2 2Na K J: HO 453 600 värdefulla terapeutiska egenskaper. De kan sålunda användas för framställning av en farmaeeutisk komposition, vilken innefattar klavulansyra eller ett salt eller en ester därav jämte en farma- ceutiskt acceptabel bärare.

Kompositionerna innefattar sådana i en form avsedd för oral, lokal eller parenteral användning och kan användas för behandling av infektion på däggdjur innefattande nänniskor.

Lämpliga former av kompositionerna innefattar tabletter, kaps- lar, krämer, sirup, suspensioner, lösningar, rekonstituerbara pul- ver och steríla former lämpliga för injicering eller infusion.

Sådana kompositioner kan innehålla konventionella farmaceutiskt acceptabla material, såsom utspädningsmedel, bindemedel, färgämnen, smakämnen, konserveringsmedel, desintegrationsmedel och liknande i enlighet med konventionell farmaceutisk teknik på ett sätt som är välkänt för fackmannen pâ omrâdet för framställning av anti- biotika.

Injicerbara eller infunderbara kompositioner av klavulansyran eller dess salter är speciellt lämpliga eftersom höga vävnadsnivåer av föreningen av klavulansyra kan erhållas efter administration genom injicering eller infusion. En föredragen komposition inne- fattar därför klavulansyra eller ett salt därav i steril form.

Enhetsdoskompositioner innefattande klavulansyra eller ett salt därav avsedda för oral administration bildar en ytterligare föredragen komposition.

Under vissa betingelser kan effektiviteten av de orala kom- positionerna av klavulansyra och dess salter och estrar förbätt- ras om sådana kompositioner innehåller buffertmedel eller ett enteriskt beläggningsämne, så att föreningarna ej blir föremål för utsträckt kontakt med den mycket sura magsaften. Sådana buff- rade eller enteriskt överdragna kompositioner kan framställas i enlighet med konventionell farmaceutisk teknik.

Klavulansyran eller dess salt kan vara närvarande i kom- positionen som enda terapeutiskt ämne eller kan vara närvarande tillsammans med andra terapeutiska ämnen, såsom B-laktamantibioti- kum. Lämpliga'B-laktamantibíotika för införlivning i sådana synergis- tiska kompositioner innefattar ej endast de som är kända för att vara högst påverkbara av B-laktamaser utan även sådana som har hög- gradig inneboende resistens mot ß-laktamaser. Lämpliga B-laktam- 453 600 antibiotika för inröriivning i kompositionerna innefattar sålunda bensylpenicillin, fenoximetylpenicillin, kar- benicillin, meticillin, propicillin. ampioillin, amoxicillin, epicillin, tikarcillin, cyklacillin,'6-aminopenicillansyra, 7- aminocefalosporansyra, 7-aminodesacetoxicefalosporansyra, cefalo- ridin, cefalotin, cefazolin, cefalexin, cefoxitin, cefacetril, cefamandol, cefapirin, cefradin, cefaloglycin, Och andra välkända penicilliner och cefalosporiner eller proläkemedel därför, såsom hetacillin, metampicillin, acetoximetyl-, pivaloyl- oximetyl- eller ftalidylestrar av bensfipenicillin, ampicillin, amoxicillin eller cefaloglycin eller fenyl-, tolyl- eller indanyl- a-estrar av karbenicillin eller tikarcillin eller liknande.

.Om penicillinet eller cefalosporinet i kompositionen ej är lämpligt för oral administration är kompositionen naturligtvis lämpad för parenteral administration.

Vid närvaro i en farmaceutisk komposition jämte ett ß- laktamantibiotikum är förhållandet klavulansyra eller dess salt eller ester till ß-laktamantibiotikum från ex.vis 20:l till 1:12, speciellt lO:l till 1:10 och helst 3:1 till l:}.

Den totala mängden antibakteriella ämnen närvarande i god- tycklig enhetsdosform är normalt mellan 50 och 1500 mg och vanligen mellan 100 och 1000 mg.

Kompositionerna kan användas för behandling av infektioner av inter alia andningsvägen, urinvägen och mjukvävnad i människor.

Kompositionerna kan även användas för behandling av infek- tioner i husdjur, såsom mastitis hos kreatur.

Normalt administreras mellan 50 och 6000 mg av kompositionen varje behandlingsdag, speciellt mellan 500 och 3000 mg av kompo- sitionen per dygn. För behandling av allvarliga systeminfektioner eller infektioner av speciellt intransigenta organismer kan emel- lertid högre doser användas i enlighet med klinisk praxis.

Den exakta formen av kompositionerna beror i viss utsträck- ning på den mikroorganism som behandlas. För behandling av°de flesta infektioner är kompositionerna normalt avsedda att ge en toppblodnívâ av minst 0,1 /ug/ml, speciellt minst 0,25 /ug/ml och företrädesvis minst 1 /ng/ml av synergist, ex.vis 2,5-S /ug/ml av synergísten.

Penicillinet eller cefalosporinet i de synergistiska komposi- _15” 40 453 600 tionerna är normalt närvarande upp till eller ungefär till den mängd som konventionellt användes när nämnda penicillin eller cefalospo-_ rin är det enda terapeutiska ämne som användes vid behandlingen av infektion.

Speciellt föredragna kompositioner innehåller från 150-1000 mg amoxicillin, ampicillin eller proläkemedel därtill och från 50 till S00 mg klavulansyra eller ett salt därav och speciellt från 200 till 500 mg amoxycillin, ampicillin eller ett förläkemedel därtill och från 50 till 250 mg klavulansyra eller ett salt därav.

I sådana kompositioner närvarande material kan vara hydra- Vikterna av antibiotika i sådan kompo- sition uttryckes på basis av det antibiotikum som teoretiskt är tillgängligt i kompositionen och ej på basis av vikten av proläke- medel.

Enligt föreliggande uppfinning åstadkommes ett förfarande för framställning av ett salt av klavulansyra, vid vilket ett avklarnat odlingsmedium, som erhållits genom odling av en stam av Strepto- tiserade om det erfordras. myces clavuligerus, innehållande klavulansyra eller ett salt därav bringas i kontakt med ett starkt basiskt eller svagt basiskt anjonbytarharts tills klavulansyran eller dess salt absorberats därpå och ett salt av klavulansyra elueras från hartset under an- vändning av en vattenlösning av ett motsvarande salt och därefter avsaltas den resulterande lösningen och det önskade saltet av klavulansyran erhålles därur.

Företrädesvís användes Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 eller en mutant därav med väsentligen samma egenskaper vid för- farandet enligt föreliggande uppfinning.

Med det häri använda uttrycket "odling" avses avsiktlig aerob tillväxt av en klavulansyraproducerande organism i närvaro av assimilerbara källor av kol, kväve och mineralsalter. Dylika aerob tillväxt kan äga rum i ett fast eller halvfast näringsmedium eller i ett flytande medium, i vilket näringsämnena är upplösta Odlingen kan äga rum på en aerob yta eller genom submers odling. Näringsmediet kan vara sammansatt av komplexa näringsmedia eller kan vara kemiskt definierat. Det har visat sig att media innehållande komplexa näringsmedel, såsom Jästextrakt, sojabönmjöl och liknande är speciellt lämpliga. eller suspenderade. 50 453 600 8 De näringsmedia som kan användas för odling av Streptomyces clavuligerus kan innehålla inom intervallet 0,1-10% av en komplex organisk kvävekälla, såsom jästextrakt, majsstöpvätska, vegeta- biliskt protein, fröprotein, hydrolysat av sådana proteiner, mjölk- proteinhydrolysat, fisk- och köttextrakt och hydrolysat, såsom ) peptoner. Alt. kan kemiskt definierade källor av kväve användas, såsom urea, amider, enkla eller blandningar av vanliga aminosyror, såsom valin, asparagin, glutaminsyra, prolin och fenylalanin.

Kolhydrat (0,1-5%) kan innefattas i näringsmedia men glukos är icke önskvärt i vissa media eftersom det har en nedsättande effekt på utbytet av den önskade klavulansyran. Stärkelse eller stärkelse- hydrolysat, såsom dextrin, sukros, laktos eller andra sockerarter, eller glycerol eller glycerolestrar kan även användas. Kolkällan kan även vara härledd från vegetabiliska oljor eller animaliska fetter. Karbcxylsyror och deras salter kan innefattas som kolkälla för tillväxt och bildning av 3-laktamasinhibitorer. Ett speciellt lämpligt billigt medium är ett innehållande sojabönmjöl (Årkasoy) jämte torkade solubilat från maltdestillation (Scotasol) plus dextrin. ÄTillsatsen av antiskumämnen, såsom Pluronic L8l, kan vara nödvändigt för att reglera skumningen av vissa media i jäsnings- kärl.

Mineralsalter, såsom NaCl, KCl, MgC12, ZnCl2, FeCl3, Na2SO4, Fesobl, Mgson och .vaï eller kïsalter av fcsforsyra kan sättas till ovan beskrivna media. speciellt om de är kemiskt definierade; CaCO3 kan tillsättas som kalciumjonkällaeller för dess buffrande Salter av spårelement, såsom nickel, kobolt eller mangan, Vitaminer kan om det är önskvärt tillsättas. verkan. kan även innefattas.

Det häri använda uttrycket "mutant" innefattar vilken som helst mutant stam som bildas spontant eller genom effekten av ett yttre medel, vare sig detta tillsättes avsiktligt eller på annat sätt. Lämpliga förfaranden för bildning av mutantstammar innefattar sådana beskrivna i H.I.Ad1er betr. teknik för utveckling av mikro- organismer i "Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro- Organisms", Proceedings of a Symposium, Vienna, 1973, sid Zül, International Atomic Energy Authority och dessa innefattar: 1. Joniserande strålning (såsom röntgenstrålning och gamma- strålning), uv-ljus, uv-ljus jämte ett ljussensibiliserande BO 40 9 453 600 ämne (såsom 8-metoxipsoralen), salpetersyrlighet, hydroxyl- amin, pyrimidinbasanaloger (såsom 5-bromuracil), akridiner, alkyleringsmedel (såsom senapsgas, etylen-metansulfonat), väteperoxid, fenoler, formaldehyd, värme, och ii. Genetisk teknik, såsom rekombination, transformation, trans- duktion, lysogenisering, lysogenisk omvandling och selektiv teknik för spontana mutanter. i Odling av Streptomyces clavuligerus äger normalt rum inom temperaturintervallet 15-40°C, speciellt 20-3500 och 1 synnerhet -50°C och vid ett pH av mellan 5 och 8,5, företrädesvis mellan 6 och 7,5.

Streptomyces clavuligerus kan odlas i ovanstående media 1 koniska glaskolvar luftade genom skakning på enzotationsskakanord- ning eller i baffelförsedda Jäsningskärl av rostfritt stål omrörda med skovelförsedda skivomrörare och luftade med en luftfördelare.

Jäsningen kan även utföras på kontinuerligt sätt.

Utgängs-pH vid Jäsningen är typiskt 7,0 och maximalt utbyte av klavulansyra erhålles efter 2-10 dygn vid 20-5500. I ett omrört jäsningskärl av rostfritt stål under användning av Arkasoy/Écotasol/ dextrinmedium angivet ovan är den föredragna temperaturen 26°C och topputbyten klavulansyra erhålles inom 5 dygn.

.Klavulansyra kan extraheras från odlingsfiltratet genom en mångfald förfaranden. Extraktion med lösningsmedel från kallt odllngsfiltrat Justerat till sura pH-värden och förfaranden base- rade på metabolitens anjoniska karaktär, såsom användning av jon- bytarhartser, har visat sig vara speciellt användbara. Cellerna av Streptomyces clavuligerus avlägsnas normalt först från Jäsnings- mediet genom filtrering eller centrifugering innan sådana ex- traktionsprocedurer igångsättes.

Vid extraktion med lösningsmedel kyles odlingsfiltratet och pH sänkes till intervallet pH 2-3 genom tillsats av syra under noggrann blandning med ett med vatten oblandbart organiskt_lös- ningsmedel, såsom n-butylacetat, metylisobutylketon, n-butanol eller etylacetat. Den syra som användes för att sänka pH i mediet är normalt en mineralsyra, såsom saltsyra, svavelsyra, salpetersyra, fosfcrsyra eller liknande syra. n-butanol är speciellt lämpligt H0 453 600 lösningsmedel för användning vid extraktionen av det surgjorda odlingsfiltratet. Efter separation av faserna genom centrifugering extraheras den 6-laktamasinhiberande metaboliten åter från lösnings- medelsfasen till en vattenlösning av natriumvätekarbonat eller kaliumvätefosfat som buffert, CaCO3-suspension eller vatten, under det att pH nálles vid ungefär neutralt värde, ex.vis 7,0. Detta vattenextrakt efter separation av faserna kan koncentreras under reducerat tryck och frystorkas till bildning av en rå beredning av ett salt av klavulansyra. Denna beredning är stabil vid lagring som ett torrt fast ämne vid -20°C. vid anjonbytarprocessen perkoleras det avklarnade odlings-I filtratet vid ungefär ett neutralt eller något surt pH, ex.vis 6-7, ned genom en kolonn av en svag eller stark bas anjonbytarharts såsom AmberliteQIRUfB eller ZeroIiLQFFIF resp., till dess att hartset är mättat och det B-laktamasinhiberande materialet utträder från botten. Kolonnen tvättas därefter med vatten och elueras med en vattenlösning av natriumklorid. De B-laktamasinhiberande frak- tionerna uppsamlas, sammanföres, avsaltas och frystorkas till bildning av ett fast råsalt av klavulansyra.

Amberlite IRÄB är ett ex. på ett svagt basiskt anjonbytar- harts med aktiva polyamingrupper och ett förnätat polystyren- divinyl-bensenmatrix. zerontePFFIP är ett starkt basiskt anjon- bytarharts med kvaternära reaktiva ammoniumgrupper och ett för- nätat polyvinyl-divinylbensenmatrix. Hartser liknande Zerolite® FFIP innefattar Isopor FFIP och DeAcidite FFIP SRA.64. Dessa hartser tillhandahållas av BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, U.K.

¿En alternativ form av extraktionsproceduren är att bringa odlingsmediet (vanligen vid ca neutralt pH) innehållande ett salt av klavulansyra i kontakt med en organisk fas, 1 vilken en vatten- olöslig amin är upplöst. Dylika organiska lösningsmedel inne- fattar sådana konventionella med vatten oblandbara polära lösnings- medel som metylisobutylketon, trikloretvlen och liknande. 'Lämpliga aminer innefattar sekundära eller tertiära aminer, i vilka en av substituentgrupperna är en långkedjig alifatisk grupp, ex.vis med 12-16 kolatnmer, och den andra är en tertiär alkylgrupp, varigenom molekylen är lipofil. Amberlite®LA2 har visat sig vara en framgångsrik amin. Normalt användes aminen i form av dess H0 11 453 600 syraadditionssalt.

Efter denna extraktionsprocedur föreligger klavulansyra i den organiska fasen som aminsaltet. Den organiska fasen avskiljes därefter från odlingsfiltratet. Klavulansyran kan återextraheras till vattenfasen genom återextraktion med en saltlösning, före- trädesvis en koncentrerad lösning av natriumklorid, natriumnitrat eller liknande. Råsaltet av klavulansyra kan sedanerhàllas genom frystorkning eller liknande.

Andra primärmetoder för isolering som kan användas inne- fattar konventionella förfaranden, såsom adsorption på kol, ut- fällning, utsaltning och molekylarfiltrering, men dessa förfaranden är normalt ej så framgångsrika som ovan beskrivna förfaranden, vilka är föredragna.

Ytterligare-rening av det fasta råmaterialet erhållet genom ovan beskrivna förfaranden kan uppnås genom en mångfald metoderj men jonbytarkolonnkromatografi är speciellt lämplig, i synnerhet vid användning av Isopor, Deacidite FFIP SRA64 eller DEAE-cellulosa- DeAcidite-kolonnen kan gradientelueras med vattenlösning av ett salt, såsom natriumklorid (O-O,5M). Kolonnen av DEAE-cellulosa 1 0,0lM fosfatbuffert vid pH 7 kan elueras med en saltlösning, normalt en NaCl-lösning (O-O,2M NaCl i 0,0lM fosfatbuffert pH 7).

Aktiva fraktioner kan detekteras genom sin B-laktamasinhiberande aktivitet och sin antibakteriella aktivitet gentemot Klebsiella aerogenes i ett agardiffusionsprov. Fraktionerna innehållande huvuddelen av denna aktivitet kombineras sedan och koncentreras till liten volym under vakuum. Denna ráberedning av klavulansyra- saltet avsaltas genom perkolering ned genom en kolonn av Bio Gel P2. (Bio Gel P2 är ett ex. på ett höglipofilt harts, pà vilket organiska material kan adsorteras, men vilket ej kvarhåller oor- ganiska salter. Bi* Gel P2 än en polyakrylamidgel saluïörd av Bio Rad, }2nd and Griffen Avenue, Richmond, Ca 94304, USA).

Det aktiva, avsaltade materialet koncentreras sedan, blandas med etanol och kromatograferas ytterligare på en cellulosakolonn under användning av butanol/etanol/vatten 4/l/B volym/volym topfas, som lösningsmedel. _ Fraktioner innehållande material som inhiberar Escherichia coli B-laktamns sammanslås, indunstas till torrhet under vakuum, upplöses ånyo i vatten och frystorkas till bildning av ett salt LO L5 453 600 H av klavulansyra som ett vitt, fast ämne.

De förfaranden som befunnits mest användbara för att detek- tera klavulansyra i odlingsfiltrat är papperskromatografl och ett bioautografiskt detekteringssystem. Klavulansyra kan analyseras genom utnyttjning av dess B-laktamasinhiberande aktivitet. Tunn- skiktskromatografi kan användas för att detektera klavulansyra L fasta beredningar. Dessa detekterings- och analysprocedurer beskrivas nedan. ' Beskrivninš l-H Analys lämplig för detektering av klavulansyra Analysprincio Lösningar innehållande klavulansyra (odlingsfiltrat, prov från isoleringsprocedur och liknande) inkuberas i 15 min. med en a-laxtamasbereaning 1 o,o5m rosfazbufrerr vid pa 7 sen 37°c.

Under denna tidrymd sker enzyminhibering eller inaktivering._ Substrat (bensylpenicillin) tillsättes sedan och inkubering utföres under 50 min. vid 5700. Graden av enzymatisk nedbrytning av substratet till penicilloinsyra bestämmes genom hydroxylaminprov med avseende på penicillin. Den använda mängden ß-laktamas är sådan att 75% hydrolys-av bensylpenicilline: erhålles på 30 min. vid ;7°c. _Graden av hydrolys återspeglar mängden enzym som förblir oinhiberat. Resultaten uttryckas som procentuell inhibering av enzymaktiviteten med en given utspädning av den klavulansyra innehållande lösningen (ex.vis odlingsfiltrat) eller koncentra- tionen av klavulansyra ( g/ml) som ger 50% inhibering av enzymet under ovan angivna betingelser (I Q-laktamasenzwn Det av Escherichia coli JT4 bildade B-laktamaset användes som enzym. 50)' Denna odling är en ampicillinresistent stam och dess resistens är betingad av bildningen av B-laktamaskontrollerande R-faktorn. Andra liknande R-faktorkontrollerande ß-laktamaser kan användas om det är önskvärt. - Odlingen hàlles på näringsagarslopes, inympas i 400 ml sterilt Tryptone-medium i en 2 liters konisk kolv. Detta medium har följ- ande sammansättning: Tryptone (Oxoid) 32 g/1, jästextrakt (0xoid) g/1, Nasi 5 g/1 och cac126H2o 2,2 g/1. slut-pH justerades till 7,4 med ucspaad naon. kolven skakas vid 25°c 1 20 timmar på en H0 453 600 13 rotationsskakanordning vid 240 varv/min.

Bakteriecellerna uppsamlas genom centrifugering, tvättas med 0,05M fosfatbuffert pH 7 (suspenderas och centrifugeras) och resuspenderas l vatten till bildning av en cellkoncentration 25 ggr den i Denna cellsuspensisn nedbrytes sedan i en MSE-ultraljuddesintegrator vid #06. Cellresterna avlägsnades cdlingsmediet. genom centrifugering och alikvota delar av den cvanförliggande vätskan lagraies 1 djupfryst tillstànd. För användning vid analys- proceduren utspäddes vätskan i 0,005M fosfatbuffert till dess att den ger ca 75% hydrolys av en l mg/ml lösning av bensylpenicillin under EG min. vid BYQC.

Lämpliga utspädningar av inhibitorberedningen och fi-1aktamas- lösningen blandas och inxuberas vid 37°c 1 15 min. (rest). Ern kontrollprov med buffert istället för inhibitorberedning inkuberas även. Bensylpenicillinlösning (substrat) sättes därefter till test- och ktntrallblandningarna, inkuberingen fortsättes under ytterligare 30 min. vid 3700. Det kvarvarande bensypenicillinet i varje blandning bestämmas sedan under användning av hydroxylamin- provet såsom beskríves av Batchelor et al, Proc.Roy.Soc., B l5ü, 498 (1961). 6 ml hydroxylaminreagens sättes till samtliga prover och tillâtes reagera i 10 min. vid rumstemperatur före tillsatsen av 2 ml ferriammoniumsulfatreagens. Absorptionen av de slutliga lösningarna uppmätes i en E.E.L. Colorimeter eller en spektrofoto- meter vid N90 nm gentemot reagensnollprovet. Sammansättningen för samtliga prov före hydroxylaminprovet är följande: Komponenter (samtl. upplösta i Bensyl- Reagens- eller utspädda med penicillin Kontroll- noll- 0,005M pH 7 fosfat- Test nollprov prov priv buffert) ml ml ml Escherichia coli - B-laktamaslösning 1,9 0,0 1,9 1,9 Inhibitorlösning 0,1 0,0 0,0 0,0 Bensyl enicillin mg ml 0,5 0,5 0,5 0,0 0,005M pH 7 fosfatbuffert 0,0 2,0 0,1 0,6 453 600 11» ultat UI Beräkning av re Procentuell innibering av 6-laktamaset beräknas på följande sätt: Absorption av bensfipenicillinnollprov minus absorption av kontroll (oinhiberad reaktion) = x Absorption av test (inhiberad reaktion) minus absorption av kontroll (oinhiberad reaktion) = y Y % inhibering = -š- x 120 penicillin erhålles vid ovanstående procedur.

Beskrivning 2 Panberskromatografibestämning av klavulansyra' Cdlingsfiltrat och en referenslösning av klavulansyra (250 /ug/ml partiellt renad beredning) sättes som droppar (20/ul/ ursprungligt) på l cm breda pappersremsor Whatman nr 1. Kroma- togrammen köres med sjunkande kromatografi i 16 timmar vid 5°C under användning av n-butanol/isopropanol/vatten, 7/7/B volym/ volym som lösningsmedel. Remsorna torkas i 4000 och läggas på agarplattor innehållande 6/ug/ml bensylpenicillin och ympade med en B-laktamasalstrande stam av Klebsiella aerogenes (synergism- system). Plattorna inkuberas över natten vid 3000 och klavulan- syra visar sig som en zon av inhiberad tillväxt. Zonenz R,-värde var 0,46. 6/u*/ml bensylpenicíllin enbart ligger under den kon- centration som erfordras för avdödning av Klebsiella aerogenes, men i närvaro av en 8-laktamasinhibitor blir denna koncentration toxisk, dvs det föreligger synergism.

Under användning av ovanstående synergismsystem kan kla- vulansyra detekteras vid koncentrationen under sådana vid vilka den visar antibakteriell aktivitet. _ Beskrivninr 3 Tunnskiktskromatsarafisk detektering av klavulansyra. natriumsalt Lösningar av klavulansyranatríumsaltberedningar sättas droppvis (5 1 av l ma/ml) på glasplattor överdragna med 0,25 mm skikt av ailikagel (FQSÄ), salufört av E.Merck, Darmstadt, Väst- tyskland. Kromacogrammen köres vid 2200 under användning av 50 H0 452» 600 ' toppfasen av blandningen n-butanol/etanol/vatten, 4/l/B volym/ volym. Kromatogramplattorna torkas vid 4000 och klavulansyrans natriumsalt lokaliseras genom bioautografi på agarplattor inne- hållande 6/ug/ml bensylpenicillin och ympade med Klebsiella aero- genes (synergismsyszem - se avsnittet om papperskromatografi ovan).

Agarytan täckes med en fin filterduk före TLC-plattans placering därpå. Efter 15-30 min. för vätning och diffusion avlyftes TIC- plattan med tillhjälp av filterduken, och agarplattan inkuberas över natten vid 5000 för'iïamka11ande av zonerna av inhiberad tillväxt. R,-värdet för klavulansyrans natriumsalt ibvanstàende lösningsmedel är ca 0,37. Två sprayreagens, Ehrlich och trifenyl- tetrazoliumklorid, användes även för framkallande av klavulansyrans natriumsaltzon. Det förra reagenset består av 300 mg p-dimetyl- aminobensaldehyd upplöst i 9 ml etylalkohol,54 ml n-butanol och 9 ml konc. H01. vid 12030 i 1-2 min. uppträder klavulansyrans natriumsalt som en Vid upphettning av den besprutade Tlß-plattan skär fläck. Trifenyltetrazoliumkloridreagenset består av en bland- ning av 1 volym av en 4% lösning av denna förening i metanol med l volym metanulisk natriumhydroxid. E ter sprayning upphettas 'rm-plattorna via L-3o°c. en röd fläck mot en vit bakgrund.

Klavulansyrans natriumsalt uppträder som Exempel l Odling av Streptomyces clavuligerus Streptomyces clavuligerus odlades vid 26°C på agarslopes innehållande 1% Yeatex (jästextrakt), 1% glukos och 2% Oxoid-agar nr 3, pH 6,8. En steril ögla användes för överföring av mycelium och sporer från slopen till 100 ml av ett flytande medium i en 500 ml Ehrlemreyer-kolv. Det flytande mediet hade följande sammansättning: , Uxoid-maltextrakt _ 10 g/1 Oxoid-bakteriologiskt pepton 10 g/1 Glycerol 20 g/1 _ Vattenledningsvatten I liter _ Medlet Justerades till pH 7,0 med natriumhydroxidlösning och 100 ml volymer överfördes i kolvar som tillslöts med skum- pluggar före autoklavering vid 1,05 kp/bmg i 20 min. En in- okulerad ympflaska skakades i 3 dygn vid 2600 i en rotationsskak- anordning med 5 cm slaglängd och en hastighet av 240 varv/min.

\Jl 453 600 W Produktionskolvar innehållande ovan beskrivet flytande medium ympades med 5% vegetativt inokulat och tilläts tillväxa under samma betingelser som ympkolven. Prov av odlingsfiltratet under- söktes med avseende på inhibitorverkan gentemot B-laktamaset av Esenerlenle cell JT4. optimal aktivitet erhölls efter 3 dygd.

Resultaten visas i tabell l. En zon av klavulansyra vid Rr = 0,46 kunde iakttagas när odlingsfiltratet undersöktes genom pappers- kromatografi enligt tidigare beskrivning. Ökningen 1 storlek av zonen motsvarade ökningen i B-laktamasinhibítorprovet.

Streptomyces clavuligerus odlades även i 2 liters skakkolvar innehållande 400 ml medium (produktionssteg) under användning av samma medium och odlingsbetingelser såsom beskrivits tidigare i föreliggande ex. I dessa större kärl var organismens tillväxt långsammare och optimal 5-laktamasinhiberande aktivitet uppnâddes 7-9 dygn efter inokulering med det vegetativa ympmediet.

Resultaten visas även i tabell l.

TABELL 1 B-laktamasinhiberande aktivitet av Streptomyces clavuligerus, tillväxt i 500 ml och 2000 ml kolvar % inhibering av Escherichia coli B-laktamas vid en slutlig utspädning av l/2500 av Jäïgšgâštid odlingsfiltrat 500 ml skakkolv 2000 ml skakkolv 1 15 - 2 30 ~ 3 55 - - 4 50 lO 51 21 6 57 36 7' - 51 3 - 53 9 - 50 ÉO 40 453 600 Exempel 2 Odling av Streptomyces clavuligerus En ympkolv preparerad såsom i ex. l användes för inokulering av 500 ml koniska kolvar innehållande 100 ml alikvota delar av följande medium 1 avjoniserat vatten: Löslig stärkelse 2% vikt/volym Glycerol O,3% " Scotasol 0,l% " Arkasoy 1% " FGS0u.7H20 0,01% " Mediet steriliserades genom autoklavering vid 1,05 kp/bma 1 20 min. och inokulerades genom tillsats av det 5% vegetativa ympmediet. Kolvarna skakades vid 26°C på en rotationsskakanordning såsom i ex. 1. Optimal titer av klavulansyran erhölls mellan 5 och 5 dygn. En utspädning av l/2500 av odlingsfiltratet gav 60% inhibering vid B-laktamasinhiberingsprovet. En zon av klavulan- syran kunde iakttagas vid Br = 0,46 vid användning av pappers- kromatogram (bioautografiskt) såsom tidigare beskrivits. zon ökade i storlek parallellt med ökningen av aktiviteten i B- laktamasinhibitorprovet.

(Löslig stärkelse saluföres av British Drug Houses Ltd., Pcole, U.K.

Denna - Scotasol är "dried distillers solubles" tillhandahállet av Thomas Borthwich Ltd., 60 Wellington Street, Glasgow, U.K.

Arkasoy är sojabönmjöl tillhandahàllet av British Arkady co., old Trarford, Manchester, U.K.). ' Exempel 2 Odling av Streptomyces clavuligerus En ympkolv preparerad såsom i ex. l användes för inokulering av 500 ml koniska kolvar innehållande 100 ml alikvota delar av följande medium framställt i avjoniserat vatten och steriliserat såsom tidigare beskrivits. Inokulatnivån var 50%.

Dextrin 2% vikt/volym Arkasdy 1% " _ Scotasol 0,l% " FeSO4.7H2O 0,01% " De inokulerade kolvarna skakades vid 26°C. Optimal B- laktamasinhiberande aktivitet erhölls mellan 3 och 5 dygn. Akti- viteten var liknande den som erhölls i ex. 2. 453 son W (Dextrin tíllhandahålles av C P C (UK) Ltd., Trafford, Park, Manchester, U.K.).

Exempel Å Odling av Streptomyces clavuligerus Ympmediet såsom beskrives i ex. l användes för inokulering av 500 ml koniska kolvar innehållande följande medium framställt i avjoniserat vatten: ' Dextros 1% vikt/volym Sojabönmjöl 1% " Scotasol 0,05% " CaC03 1% " Dessa kolvar behandlades på exakt samma sätt som i tidigare ex. och odlades under identiska betingelser. Den ß-1aktamas- inhïberande aktiviteten erhölls mellan 3 och 5 dygn. Odlings- filtratet vid en slutlig utspädning av 1/2500 gav 55-45% inhibering vid Balaktamasinhiberingsprovet.

Exempel § Odling av Streotomyces clavuligerus Den till klavulansyra hänförbara B-laktamasinhiberande aktiviteten erhölls under användning av följande medium med identiskt ympmedium och identiska odlingsbetingelser som i ex. 1.

Glycerol 2% vikt/volym Sojabönmjöl 1,55 " Mg O; n KêHPO4 I O,l% " Medium berett i avjoniserat vatten.

B-laktamasinhiberande aktivitet uppnådde maximal nivå mellan 3 och 5 dygn'och var av samma storleksordning som den i ex. 4 erhållna.

Exempel 6 Odling av Streptomyces clavuligerus Följande medium gav klavulansyra vid användning av de betingelser och det vegetativa ympinokulat sam beskrives i ex. 1.

Glukos 2% Lab Lemcoß' (Oxoid) 1% Oxoid jästextrakt 0,3% CaCO3 ' 0,3% Medium berett 1 avjoniserat vatten. 50 HO 19 453 600 Optimala títer erhölls efter 3-5 dygn, och en 1/2500 utspädning av odlingsfiltratet gav 35-H51 inhibering i B-lakta- masenzymínhiberingsprovet.

Exemgel 7 Odling av Strentomyces clavuligerus Såsom i ex. Ä, 5 och 6 gav följande medium 35-45% inhibering (l/2500 utspädning) vid 5-laktamasprovet vid optimal titer, som uppnås 3-5 dygn efter inokulering. Samtliga betingelser var såsom tidigare beskrivits.

Glukos 2% vikt/volym Arkasoy 1% " CaCO5 0,02fi " C0Cl2.6H2O 0,000l% " Medium berett i avjoniserat vatten.

Exemgel 8 Odling av Stregtomyces clavuligerus Följande produktionsstadiemedium vid användning under standardodlingsbetingelser såsom beskrives i tidigare ex. gav -30% inhibering vid 1/2500 utspädning i B-laktamasprovet mellan 3-5 dygn efter inokulering. Under användning av tidigare beskriven papperskromatografisk metod iakttogs en zon av klavulansyra vid Rf = 0,46 när odlingsfiltratet undersöktes.

Scotasol 2% Oxoid jästextrakt 1% Medium berett i vattenledningsvatten.

Slutligt pH 7,0.

Exemoel Q Odling av Streotomyces clavulizerus Under standardodlingsbetingelser gav följande medium kla-' vulansyra 3-5 dygn efter inokulering med det vegetativa ymp- materialet. En l/2500 utspädning av odlingen gav 20-30% inni- bering vid_6-laktamasinhiberingsprovet. _ z/1 Glycerol 15 Sukros 20 Prolin ' 2,5 Mononatriumglutamat 1,5 NaCl ' 5,0 Kgnpon 2,0 453 600 CaCl2 9,4 . Mncialugo 0,1 FeC136H2O 0,1 ZIICIQ (LQS 3g3O¿7H9Û 1,3 Medium berett i avjoniserat vatten.

Slutligt pH 7.1.

Exemoel 10 Odling av Streotcmyces clavuligerus En bas-Yeatex/glukosagarslope användes för inokuléring av en Yeatex/glukosagarslope i en Roux-flaska genom framställning av en mycelium/sporsuspension i sterilt vatten. Roux-flask- slopen inkuherndes vid 26°C i 10 dygn. Till denna slope sattes 100 ml sterilt vatten och en myceliesuspenslon bereddes. Denna användes för inokulering av 50 liter ångsteriliserat ympmedium av följande sammansättning i vattenledningsvatten.

Oxoidmaltextrakt 1% vikt/volym Bakteriologisk oxoidpepton 1% " Glycerol 1% " % Pluronic®lBl Antiskum i sojabönolja 0,05% " /Pluronidgsalufört av Jacobs and Van den Berg UK Ltd., 231 The Vale, London H3 och innehåller en polypropen-po1yeten- blockpolymer, och sojabönolja tillhandahållas av Britsh Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, U.K./. _ Mediet placerades i ett 90 liter baffelförsett Jäsningskärl av rostfritt stål under omröring med en 13 cm skovelförsedd skivomrörare vid 240 varv/min. Steril luft tillfördes med 50 liter per min. och kärlet inkuberades vid 260 .

Efter 72 timmar användes ympjäsmediet för inokulering av 150 liter av samma medium under användning av en 5% volym/volym' tillsats genom steril överföring. Detta produktionsstadiemedium placerades i en 300 liter fullt bafflad jäsningstank av rostfritt - stål omrörd med en 22 cm skovelförsedd skivomrörare vid 210 varv/ min. Steril luft tillfördes vid 150 liter per min. Jäsningen ägde rum vid 26ÖC. Antiskum tillsattes därefter alltefter behov i 10 ml portioner (lO% P1uroniÉ”L8l i sojabönolja). Prov av- lägsnades för B-laktamasinhiberingsprov med regelbundna intervall.

Jäsningsmediet skördades efter 4-5 dygn vid optimalhivâ av 5- laktamasinhíberande aktivitet (tabell 2).

H0 21 453 600 TABELL 2 E-laktamasinhiberande aktivitet av prov av odlingsfiltrat taget från en 300 liter jäsning av Streptomyces clavuligerus % inhibering i ß-laktamas- Jäsningstid inhiberande prov vid en (dygn) slutlig utspädning av 1/2500 1.0 12 1,5 20 2,0 _ ' 31 2,5 36 3.0 50 3.5 54 4,0 51 ms* se .0 _ 55 Exemgel ll Odling av Streptomyces clavuligerus.

Ympjäsningen utfördes exakt såsom beskrivas i ex. 10 under användning av samma medium. _ Efter 72 timmar användes ympjäsmediet för bildning av ett % vølym/volym vegetativt inokulat i en 300 liter fullt bafflad jäsningstank av rostfritt stål innehållande 150 liter ångsteri- liserad medium omrört med en 22 cm skovelförsedd skivomrörare vid 210 varv per min. Steril luft tillfördes vid 26°C. Jäsning ut- fördes vid 26°C. Antiskum tillsattes efter behov i 10 ml por- ' tioner (105 Pluronic@L8l i sojabönolja).

Det i produktionssteget använda mediet överensstämde med det i ex. 3 beskrivna med tillsats av=0,05% volym/volym 10% Pluroni@> 181/šojabönoljeantiskum före sterilíseringen.

Jäsningsprovens B-laktamasinhiberande aktivitet var liknande den i ex. 10 (se tabell 2). Pappeukromatografisk undersökning gav en zon av klavulansyra vid Ef = 0,46 under användning av tidigare beskriven bioautografiska metod (synergism). Storleken av klavulansyrazonen ökade parallellt med förhöjning i B-laktamas- inhiberingsprovet.

Exemnel 12 Odling av Streotomyces clavuligerus I 100 ml sterilt vatten sattes till en sporodling, som till- UI UI 2 453 600 22 växt på Bennetts agar í en Roux-flaska i 10 dygn vid 2600. En mycelíum/sporsuspensíon bildades och användes för ínokulering av 75 liter ångsteriliserat medium med följande sammansättning 1 vattenledningsvatten. Q Dextrin Arkasoy "SO" % Pluronicølßl i sojabönolja Mediets pH Justerades till 7,0.

Mediet överfördes i en 100 liter bafflad Jäsningstank av rostfritt stål omrörd med en 19 cm skovelförsedd skivomrörare vid 140 varvfinin. Steril luft tillfördes med 75 liter per min. och tanken inkuberades 1 72 timmar vid 2600.

Innehållet i ympjäsmediet användes för inokulering av 1500 liter ángsteriliserat medium med följande sammansättning i vatten- vihívolym 1% " 0,03% volym/volym ledningsvatten.

Arkasoy "50" l,5% vikt/volym Glycerol 1,05 " magpou 0,15 " % Pluronid@L8l 1 sojabönolja Mediets pH justerades till 7,0.

Mediet överfördes i en 2000 liter fullt bafflad Jäsnings- tank av rostfritt stål omrörd med tvâ 48 cm skovelförsedda skiv- omrörare vid 106 varv/min.

Steril luft tillfördes med 1200 liter per min. Anüskum tillsattes i 25 ml porfioner alltefter behov. (105 Pluronic L8l 1 sojabönolja).. Jäsningen reglerades vid 2600 till dess att maximalt utbyte av klavulansyra erhölls mellan 3 och 5 dygn, då 200-500/ug/ml klavulansyra bildades. ' Exemoel 1: Odling av Streptomyces clavulizerus Inokulat bereddes 1 en ympkólv såsom tidigare beskrivits men under användning av mediet enligt ex._} (med mediets pH juste- rat till 7,0). kolvar innehållande 100 ml alikvota delar av följande medium berett i avjoniserat vatten och steríliserat. Inokulatnivàn var 5%.

Primer? 9224 1% viks/volym Arkasoy "50" l,5% " KHQPOR 0,l% “ 0,2% volym/volym Detta användes för inokulering av 500 ml koniska BO H0 453 600 Mediets pH justerades till 7,0.

De ínokulerade kolvarna skakades vid 2600 och optimal B- laktamasinniberande aktivitet uppnáddes från 3-5 dygn. Nivâer om 300-500/ug/ml klavulansyra uppnåddes.

Prichen? P22!! är en triglycerid som saluföres av Prices Limited, Bromborough, Bebington, Wirral, Cheshires, U.K.- Prichem®P22fl är baserad på oleinsyra (65%), palmitinsyra (11%) och andra liknande syror.

Exempel 14 Isolering av ránatriumsaltet av klavulansyra Skördad odlingsvätska framställd såsom beskrives i ex. l0 klarnades genom kontinuerlig flödescentrifugering och myceliet Av 150 liter Jäsningsvätska erhölls 120 liter klarnat odlingsmedium. Detta filtrat gav 58% inhibering i ß-laktamas- inhiberingsprovet vid 1/2500. Filtratet kyldes till 5°C och 40 liter n-butanol tillsattes. Blandningen omrördes och 25% H2S0¿ tillsattes till dess att pH var 2,0. Den surgjorda blandningen omrördes under ytterligare 10 min. före fasseparation genom cent- rifugering. Vattenfasen kastades. Till n-butanolextraktet sattes 0,5% Norit GSX kol och blandningen omrördes i 15 min. Kolet kastades efter avlägsnande genom filtrering under användning av kiselgur som filtertillsats. Till n-butanolen sattes l/W av volymen av avjoniserat vatten, och blandningen omrördes under tillsats av 20% NaOH-lösning till dess att pH uppnått jämvikt vid 7,0.

Faserna separerades genom centrifugering och n-butanolfasen kas- tades. Vattenfasen koncentrerades under reducerat vakuum till 800 ml och frystorkades därefter. Härvid erhölls 55 g fast råämne av klavulansyra med ett I50 av 1,3/ug/ml vid B-laktamasinhiberings- provet. Denna fasta beredning lagrades torr vid -20°C i avvaktan kastades. på ytterligare rening.

Exernæl 15 Isolering av ránatriumsaltet av klavulansyra En liter odlingsfiltrat med förmåga till 53% inhibering vid 1/2500 i B-laktamasinhiberingsprovet ocherhàllet enligt ex. 12 perkolerades ned genom en kolonn 2,5 x 15 cm av Permutit Isopore harts FF lP (SBA 62) i Cl°formen (salufört av Permutit Co.Itd., 632-652 London Road, Isleworth, Middlesex, U.K.). Odlings- riitracet acföijaes av :oo nn destillera; vatten för koionnens LO L5 453: 1600 211 ' tvättning. Eluering av den aktiva B~laktamasinhibitorn uppnâddes med 0,2M NaCl-lösning. Fraktioner (20 ml) uppsamlades och undersöktes vid en 1/2500 slutlig utspädning i ß~laktamasinhí- beringsprovet. Aktiva fraktioner sammanslogs och koncentrerades under vakuum till 20 ml. Denna lösning avsaltades genom gel- exklusionskromatografi på en 38 mm i diameter kolonn av Biorad Biogel P2 med en gelbädd av H0 cm och eluerad med 1% n-butanol i vatten. /Biogel P2 saluföres av Bio Rad Laboratories, 32nd and Griffin Ave., Richmond, California. usa/L na aktiva frak- tionerna bestämda genom 8-laktamasinhiberingsprov kombínerades.

Natriumklorid eluerades efter klavulansyra och detekterades under användning av silvernitratlösning. De sammanslagna aktiva fraktionerna koncentrerades och frystorkades.

En liter odlingsfiltrat gav efter ovanstående behandling 0,H5 g av en rå fast beredning av klavulansyra med ett I50 av 0,92/ug/ml. I Detta fasta ämne lagrades vid -20°C i avvaktan på ytterligare rening.

Exempel 16 Isolering av rånatriumsaltet av klavulansyra Odlingsfiltrat innehållande 300/ug/ml klavulansyra surgjordes under användning av ett in-line-blandarsystem, extraherades med n-butanol och klavulansyra âterextraheras i vatten vid neutralt pH.

Kylt odlingsfiltrat (5-1000) pumpades till en in-líne-b1an- dare vid vars inlopp tillräckligt 6% (volym/volym) salpetersyra tillsattes för upprätthållande av ett pH vid utloppet av 2,03 0,1.

Det surgjorda filtratet leddes med 4,1 l/min. genom en glykol- kyld plattvärmeväxlare (A.P.V. Ltd.) för upprätthållande av en temperatur av mellan 2 Och 530- pi: msniaai-ades i en flödasaall före passagen in i en motstrëmsseparator i tre steg (wesaïalia Separator Ltd., Hodel EG lOC6}. kan vatnanmaf-Jaa n-bucaaai (vid ca 5%) pumpas-as .nen 3 litar per min. in i motströmsseparatorn. ' Vattenutloppet från motströmsseparatorn leddes till utloppet.

Medbringat vatten avlägsnades från butanolutflödet från separaïorn under användning av en vätske/våtskecentrifugalseparatsr_ (Alfa Laval Lcd. :andel 30241443). rostfritt stål försett med en kylmantel, 1 vilken den lagrades Butanolen uppsamlades i ett kärl av 40 453 eoó vid ca 50.

Från kärlet avlägsnades M0 liter alikvota delar och blan- dades noggrant med 2 liter kylt vatten (5°C) mättat med n-buta- nol. Denna blandnings pH justerades till 6,8: 0,1 under använd- ning av en 20% natriumhydroxidlösning.

Denna vattenextrakt/butanolblandning överfördes till en vätske/vätskecentrifugalseparator (Sharples Centrifuge Ltd.

Model MBSPY-5 PH) med en pumphastighet av 2 liter/min.

Av 1800 liter odlingsfiltrat erhölls 90 liter vattenfas innehållande 39% av den i odlingsfiltratet närvarande klavulansyran. liter vattenextrakt justerades från 2- å totala fasta beståndsdelar genom tillsats av 50 g natriumklorld per liter och spraytorkades (Anhydro, Copenhagen, Type Lab S 1). Använda Matningsnastighet 2 liter/timme. Atomizer- Inloppstemperatur 15000. betingelser var: spänning: 170 v.

Utloppstemperatur 80°C.

Den torkade produkten, total-fik: 1 kg, innehöll 62% av i utgångsmaterialet närvarande klavulansyra. Återstâende 75 liter vattenextrakt koncentrerades genom ultrafiltrering (De Danske sukkerfabrikker, Laboratory Module, Membrane Type 900). Proceduren bestod i recirkulering av reten- tatet från en tank av rostfritt stål försedd med ett kylsystem med utloppsventilen inställd så att ett differentialtryck över de 40 membranen av 25 atmosfärer erhölls. Temperaturen hölls vid 2-500 och pH vid 6,8 f 0,1 genom tillsats av 2N saltsyra alltefter behov. volymen reducerades till 34 liter, som innehöll 72% av i utgângsmaterialet närvarande klavulansyra.

Vattenkoncentratet torkades vid ca 533, Justerades till 8% fasta beståndsdelar och spraytorkedes enligt ovan. Det torkades materialet innehöll 75% av i inmatningen på spraytorken när- varande klavulansyra.

Den totala spraytorkade produkten från 90 liter av vatten- extrakt innehöll 69,ü g klavulansyra, som utgjorde 75% av i spraytorkmaterialet närvarande klavulansyra och 21% av den i IÉOO liter odlingsfiltrat närvarande klavulansyran.

Värmeinställning 6-7.

Exempel 17 Partiell rening av rå klavulansyra Ràklavulansyraberedningar erhållna såsom beskrives i ex. lš L5 n l2:3:5 volym/volym Br 26 453 600 renades genom jonbytarkromatografi. 18 g material framställt såsom beskrivas i ex. 15 med ett Iso-värde av 1,3/ug/ml (slutlig koncentration) upplöstes i 25 ml destillerat vatten och appli- cerades på en 3,8 x 40 cm bädd av Permutit FF IP (SBA 62) harts i kloridform. Kolonnen elueradesmed en natriumkloridgradient bildad genom gravitationsmatning av 0,5M natriumklorld till en blandningsbehàllare innehållande l liter destillerat vatten, som i sin tur påfördes den kromatografiska kolonnen. 10 ml fraktioner uppsamlades och den B-laktamasinhiberande aktiviteten uppmättes under användning av l/?5OO utspädning av fraktionerna. Efter ett huvudfärgband eluerades aktiviteten mellan fraktionerna 2U och . De aktiva fraktionerna kombinerades och koncentrerades till 30 ml.

Denna läsning avsaltades under användning av en 5 x #5 cm bädd av Biorad Biogel P2 och eluering med 1% n-butanol 1'vatten. ml fraktioner undersöktes med avseende på kiavulansyrainnehåll Fraktionerna avsattes även på pappersremsor och besprutades med endera Ehrlich- eller trifenyltetraaoliumsprayreagensen beskrivna under under användning av B-laktamasinhiberingsprav. beskrivning 5. Den 6-laktamasinhiberande aktiviteten korreleë rades med de rosa resp. röda fläckarna som bildades av dessa reagens. Aktiva fraktioner kombinerndes under uteslutning av sådana innehållande natriumklorid och koncentrerades under vakuum till torrhet. Härigenom erhölls 520 mg partkílt renat klavulan- syrasalt med ett ISO av 0,2/ug/ml 1 standard-B-laktamasinhiberings- provet.

Tunnskiktskromatografi (silikagel) av denna klavulansyra- beredning gav följande Ef-värden: n-butanol/etanol/vatten 4:l:5 volym/volym toppfas Rf = 0,37. n-butanol/ättiksyra/vatten = 0,4ü. isopropanol/vatten ?:3 volym/volym Hr = 0,78. Zonerna detekterades genom besprutning med Ehrlichs reagens. 6-aminopenicillansyrakörning som kontroll och detek- terad med samma besprutning hade Rf-värden av 0,38, 0,39 resp. 0,77- Exemoel 18 Partiell rening av klavulansyrans natriumsalt Odlingsfiltrat framställt såsom beskrives i ex. 12 extra- 40 27 453 600 herades med lösningsmedel såsom i ex. 14 till bildning av en fast beredning, som :enades ytterligare genom jonbytarkromatografi l under användning av Whatmans dietylaminoetylcellulasa DE 52.

Detta fasta ämne (10 g) upplöstes 1 20 ml destilleraä vatten och överfördes på en 3,8 x 50 cm kolonn av DE E2 cellulosa 1 förväg ekvilibrerad med 0,01M natriumfosfatbuffert pH 7,5. Kolonnen eiueraaes med en Naci-gradient. o,1M Naci i o,o1m natrium- fosfatbuffert pH 7,5 överfördes 1 en blandningskammare inne- hållande l liter 0,0lM fosfatbuffert pH 7,5 som i sin tur anslöts till kolonnen. Fraktioner (10 ml) uppsamlades och undersöktes med avseende på B-laktamasinhiberande aktivítetvid en utspädning av 1/2500. Fraktionerna undersöktes även med avseende på anti- bakteriell aktivitet genom hål-1-plattametcden under användning av näringsagarplattor ympade med Klebsiella aerogenes. Frak- tionerna med högsta B-laktamasinhiberande aktivitet och med zoner av inhibering i hål-i-plattaprovet kombinerades, koncentrerades och avsaltades sedan på en kolonn med Biorai Biogel P2. Dessa fraktioner befanns innehålla klavulansyra såsom bestämmes med pappers- och tunnskíktskromatografi.

Exempel 12 Isolerinz av fast klavulansvranatriumsalt En partiellt renad fast beredning av klavulansyra (500 mg) beredd såsom 1 ex. 17 överfördes på en kolonn med 3,8 x 50 cm bäddstorlek innehållande Whatmans microcrystalline CC Bl cellulosa.

Det kromatografiska lösningsmedlet var n-butanol/etanol/vatten 4:l:5 volym/volym, toppfas. Kolonnen kördes vid NOC och 4 ml fraktioner uppsamlades. Fraktioner testades med avseende på närvaron av klavulansyra genom avsättning på filterpapper och besprutning med Ehrlich reagens (rosa fläck) eller trifenyltetra- zoliumreagens (röd fläck). Dessa tester bekräftades genom B- laktamasinhiberingsprover vid l/l25O utspädning. Aktiva fraktioner sammanslogs och torkades under vakuum i en rotationsindunstare.

Det fasta ämnet upplöstes i en liten volym destillerat vatten och frystorkades. En vit fast beredning av natriumsaltet av klavulan- syra erhölls (ÄO mg) med ett 150 av 0,08/ng/ml 1 B-laktamas- inhiberingsprovet.

LO 453 600 w Exemgel 20 Isolering av fast klavulansyranatriumsalt koncentrerat àterextrakt (6 liter) (från ultrafiltrering 1 ex. 16) innehållande lO 5 klavulansyra såsom bestämt med B- laktamasinhiberingsprov 1 beskrivning l. Detta perkolerades vid 1 iicer/timme 1 en 5 x 60 cm koionn av Parenti: zeroiiíwrr 1 P SEA 62 anjonbytarharts 1 kloridform. med 2 liter avjoniserat vatten före eluering med en natriumklorid- gradient. Gradienten bildades med en lösning innehållande 4 liter l,Ä m HaCl tillförd en omrörd behållare innehållande Ä liter 0,7 NaCl som i sin tur var ansluten till en omrörd behållare innehållande 4 liter avjoniserat vatten via en pump ansluten till Kolonnen tvättades därefter kolonnen. Kolonnen eluerades vid 2,5 ml/min. och 25 ml fraktioner uppsamlades. Fraktionerna undersöktes med ß-laktamasinhiberings- provet.

Aktiva fraktioner (nr 140-250) kombinerades och vakuum- indunstades till nära torrhet. Etanol (500 ml) tillsattes sedan och det fasta ämnet avfiltrerades efter kraftig skakning.

Etanolextraktet vakuumindunstades därefter till torrhet i en rotationsindunstare och upplöstes ånyo i avjoniserat vatten (#0 ml).

Det erhållna överfördes på en 10 x 60 cm kolonn av Biorad Biogel P2 och eluerades med en l% n-butanollösning. Fraktioner upp- samlades (25 ml) och undersöktes mei avseende på fi-laktamas- inhiberande aktivitet vid en slutlig utspädning av 1/2590.

Analysen med avseende på natriumklorldinnehåll på l/25 utspäd- ningar av fraktionerna gjordes under användning av silvernitrat- Sådana fraktioner innehållande klavulansyra fri fràn natriumklorid kombinerades, koncentrerades genom indunstning lösning. av lösningsmedlet under reducerat tryck till 20 ml och frystorkade Härigenom erhölls 4,8 g av natriumsaltet av klavulan- syra. (l5O ca 0,06/ug/hl). därefter.

Exemoel Éi 4 - Antibakteriellt soektrum av klavulansyra Den antibakteriella aktiviteten för klavulansyranatriumsalt gentemot en rad bakterier bestämdes under användning av mikrotiter metoden. Serieutspädningar av klavulansyranatriumsalt i Oxoid- sensitivitetstestbuljong innehâllen i ett plasttråg för mikrotiter inokulerades med en över natten odling av vardera organismen, så NO 29 453 eoo -LL att den slutliga :ltspädninsefl av W-'flfulatet V” 'V5 x w I' Odlingarna inkuberades över natten och punkterna av bakteriell tillvägt registrerades nästa morgon genom att odlingens grumlighet observerades. Resultaten uttryckta som ungefärliga NIC-värden (minsta inhibítoriska koncentration /ug/ml) anges i tabell 3 som visar att föreningen hade ett brett spektrum av antíbakteriell aktivitet.

TABELL 3 Antíbakteriellt soektrum av klavulansyranatriumsalt Minsta inhibitoriska Bakterïestam kzncentration/ug/ml Staphylococcus aureus (Oxford H) 7,5 Staphylococcus aureus (Russell) 7,5 Bacillus subtilis 52 Streptococcus faecalis > 500 Streptococcus pyogenes CN 10 125 Escherichi coli NCTC 10318 31 Klebsíella aerogenes 31-62 Klebsiella oxitocum 62 Enterobacter aerogenes T 624 31 Enterobacter cloacae 52 Acinetobacter anítratus 125 Providentia stuartii 125 Serratia marcescens Proteus mirabilis C 977 Proteus vulgaris W 090 El Salmonella typnimurium 31 Shigella sonnei 52 Pseudomonas aeruginosa A EGO Exemoel 22 Exemoèl av B-laktamasinhíbering med klavulansvranatriumsalt Klavulansyra inhiberar ökande och irreversibelt 6-laktamas av Escheríchia coli. 1 tabell 4 visade ß-laktamaser även inhïberas av klavulansyra.

Metoden enligt beskrivning l visar att övriga LO 455 600 30 TABELL 4 Inhibering av B-laktamaser med klavulansyra Un¿efärl1gt ISO-värde relativt Escherichia coli JT 4=l Källa till B-laktamas Staphylococcus aureus (Russelll 1,0 Escherichia coli JT4 1,0 Escherichia coli Bll 2,0 Klebsiella aerogenes A 0,6 Pseudomonas aeruglncsa 1522 (R-faktor) 5,0 Pseudomonas daïgleish 0,1 Med penicillin G som substrat är 150 för klavulansyranatriumsalt gentemot 6-laktamaset av Staph. aureus (Russell) ca 0,06/um/ml.

Exembel 25 Antibakteriell synergism mellan ampicillin och klavulan- syranatriumsalt Den minsta inhibitoriska koncentrationen (NIC-värden) av ampicillin, klavulansyranatriumsalt och ampizillin i närvaro av 1/ug/ml klavulansyranatriumsalt bestämdes för ett antal B-laktamas- alstrande bakterier. Organismerna inokuleraies i Oxoid-sensiti~ vitetstestbuljong placerade i små gropar i ett plasttràg och innehållande separatakoncentrationsgradienter av ampicillin, klavulansyranatriumsalt eller ampicillin jämte 1/ugfml klavulan- syranatriumsalt (mikrotítermetoden). Den slutliga utspädningen' av övernatzenbuljonginokulatet var 0,5 x 10-2- Tråget inkuberades vid 3700 över natten och notering gjordes nästa morgon av änd- punkterna av bakteriell tillväxt. MIC-värdena i/ug/ml anges i tabell 5, som visar att synergísten vid den låga koncentrationen l/ug/ml markerat förhöjer den antibakteriella aktiviteten av ampicillin gentemot vissa gram + ve och gram - ve bakterier.

Mekanismen för denna synergism innebär troligen inhibering av_ ampicillinförstörande B-laktamasenzymer, men förekomsten-av andra mekanismer kan ej uteslutas.

Liknande resultat med de i tabell 5 visade erhölls när am- picillin ersattes med amoxicillin eller med ftalidylestern av ampioíllin. ' BO RO “ 453 son TABELL 5 " Antibakteríell synergism mellan ampicillin och klavulansyranatriumsalt Minsta inhibitoriska koncentrationer/ng/hl Bakteriestam Klavulansyra- Ampicillin :Ampícillin 1 - natriumsalt - närvaro av l/ug/hi i klavulansyra- ¶ natriumsalt Escherichia coli - a -er-rcfrr: _1049: i i _ 31l 1,8 40,1; Escherichia ooli 5 ll 62 Å>50O 125 Klebsiella aerogenes A 31 125 <.O;4 Klebsiella sp 62 'jl 125 ” 40,3! Enterobacter cloacae l 62 ' 250 _62 i Serratia marcescens_ ' _ 125 >50O 62 Staphylococcus aureus _ (Russell?} 15 500 <3,4 -Staphylococcus~aureus (en meticlllinresistent stam) 62 250 7,5 Exemnel 2U Antibakteriell synergism mellan cefaloridin qch klavulansyra- natriumsalt' E ' ' ' Minsta inhibitoriska koncentrationer av cefaloridín, ¶ /ugfinl klavulansyranatriumsalt bestämdes genom den metod som beskrives 1 ex. #2. Resultaten i tabell 6 mellan klavulansyranatriumsalt klavulansyranatriumsalt och cefaloridin i närvaro av 5 visar, att synergism kan erhållas och cefaloridin speciellt för den B-laktamasalstrande stammen av Staphylococcus aureus (Russell). 453 600 aa TABELL 6 Antibakteriell synergism mellan ceïaloiídin och - e klavulansyranatriumsalt Minsta innibièopisxa-goneencfationer lg/hl Bakteriestam Klavnlansyra- _~Cefaloridin 1 f natriumsalt; Cet“aloi°ídin_ närvaro av 5 ug/ní e l gklavulansyraz - f . anatrlumsalt ' kranen; mirabiiis 889 t ¿ > 500* f e62 f -1_. 7.5.¶ Staphyloeoccus aureus_ - ~ + (Russell) _ , A_ 15mm 3,1 _¿_o;o3 Staphylococcus.aurens ' ' l l I (en metiçillinresístent ' - stam ¶ 62 15 3,7 lxS1utpunkt *Visst värde erhållet när synefgisten tillsattes vid l/ug/ml istället för 5/ng/ml e Exemoeï 25 Antibakteriell synergism mellan klavulansyraçatriumsalt och olika oenicillíneñ - - = t _ I tabell 7 angivna resultat erhölls gencm den metcd som beskrivas i ex. #2.

TABELL T Antibakteriell synergism mellan klavulansyranatriumsalt och olika oenicilliner gentemot stammar av Klebsíella aerozenes Amoxicillin Karbenicillinx Eensylpenicillin Stam Enbart +56ug/ml Enbart +5¿ug/ml Enbart +5Äu5finl sy ergist synerglst syflergzst A _ 500 0,97 soc 7.8 250 7,8 E Yo soo 3,9 500 15 500 15,6 62 250 15,6 125 7,8 25o 5,6 xLiknande resultat kunde observeras när karbenicillin ersattes med karbenicillinfenyl-Q-ester eller tikarcillin. (i L5 55 50 453 600 Exemoel 26 Extraktion av klavulansyra under användninz av flytande Jonbytarharts Odlingsiiltrat (200 ml) (erhållet på samma sätt som i ex.-3 men under användning av ett medium innehållande 0,15 volym/volym -xngrou istället för p,o1% reso4.7a2o)_extraneraaes med Amber11ce° X LA2* (c1'0farm,'15ø vqiym/volym 1 mecyiisobuuyiketon, 66 mi) 1 min. vid 5°c. ' _ Faserna separerades genom centrifugering (1660 3,020 min.).

Lösningšmedelsfasen (60 ml) tillvaratogs med nipett och uppdelades i fyra lika stora delar. Varje del extraherades under omröring, avid 5°C i 20 min. med l/Ä velym (},75 ml) vattenextraktant såsom' anges 1 tabellen nedan. Erhållen blandning centrifugerades (1660 g.- min.). 3,6 ml vattenfas tillvaratogs från varje extraktion.

Prov Vol Klavulansyrae - (ml koncentration Klavulansyra (/US/fil'1),' (ms)_ avklarad bryga zoo 128 ' 25,4 Extraherad brygd 200 15 . 3,0 M Naci-extrakt 3,6_ - 305: _ 1,1 2M naci-extrakt 3,6 I 598 0 ' 2,5 M NaN03-extrakt 3,6 638 2,5 2M NaN03-extrakt 3,6 758, 2,73 Öet resultat som erhölls med 2M NaN0 representerar en återvinning av 43% från den avklaradä brygden.

*Amber11:e°LA2 erhålles från nanm and Haas (vx) Ltd. croyaon.

Exempel 27 Extraktion av klavulansyra under användning av flytande Jonbytarharts Avklarad brygd (47 liter, erhàllen såsom i ex. 12) extraherades med Amherlite@lA2 (acetatform, 15% volym/volym 1 metylisobutylketon, 12,5 liter) genom omröring 1 1 timme vid l7°C. Efter tillsats av oktan-1-ol (500 ml) separerades faserna i en centrifug med konti- nuerligt flöde till bildning av 9,2 liter lösningsmedelsfas, som därefter omrördes vid 5°C i 1,5 timmar med en molar natriumnitrat (2,3 liter). tinuerligt flöde till bildning av 2,4 liter vattenfas (innefattande vatten använt för förträngningsändamál). Vattenfas-pH (ursprungligen 8,0) Justerades till 7,0 med konc. saltsyra. U ßlandningen separerade: genom centrifugering med kon-

Claims (3)

..-.. _. .___ ....w.__..... __..- 455 600 3% Klavulansyra- Prov Volym koncentration Klavulansyra (l) (ße/rn-l) (ms) Avklarad brygd 47 läó 6862 Ektraherad brygd 47 19 893 M NaNQ3-extrakt 2,4 1658 3931 Extraktionseffektiviteten från avklarad brygd till natrium- nitratextrakt är 57%. PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett salt av klavulan- syra CH OH *l/O 2 (I) 4"" \>/ ° - " coafl k_ä n n e t e c k n a t av att ett avklarnat odlingsmedium, som erhållits genom odling av en stam av Streptomyces clavuligerus, innehållande klavulansyra eller ett salt därav bringas i kontakt med ett starkt basiskt eller svagt basiskt anjonbytarharts tills klavulansyran eller dess salt absorberats därpå och ett salt av klavulansyra elueras från hartset under användning av en vatten- lösning av ett motsvarande salt och därefter avsaltas den resulte- rande lösningen och det önskade saltet av klavulansyran erhålles därur.

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t av att anjonbytarmaterialet är ett starkt basiskt anjonbytarharts.

3. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t av att anjonbytarmaterialet är ett svagt basiskt anjonbytarharts. H. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e 5 t e c k n a t av att saltet i vattenlösningen är natriumklorid.