DE2035812A1 - Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

FARBWERKE HOECHST AG., vormals Meister Lucius & Brüning Aktenzeichen: HOE 70/F 124

Datum: 16, Juli 1970 Dr. Tg/EH

Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung

Gegenstand der Erfindung ist ein im Folgenden mit "Proticin^tt bezeichnetes neues Antibiotikum sowie Verfahren zu seiner Herstellung, Isolierung und Reinigung.Das neue Antibiotikum entsteht bei der mikrobiologischen Züchtung von Bacillus licheniformis '(ATCC 21552),der aus einer in Norwegen isolierten Bodenprobe stammt. Der Organismus kann nach konventionell-en mikrobiologischen Methoden sowohl emers auf Schrägagarröhrchen als auch submers im Erlenmeyer-Kolben unter Verwendung der Züchtung von Mikroorganismen allgemein gebräuchlichen Nährstoffe gerichtet werden. Die Nährböden enthalten neben organischen und anorganischen Salzen als Kohlenstoffquellen Stärke, Rohrzucker oder Glucose, als Stickstoffquelle Sojamehl, Cornsteep liquor, Hefeextrakte, Peptone, Nitrate oder Ammoniumsalze.

Neben den oben angeführten komplexen Nährbodensübstraten kann der Keim auch auf synthetischen Nährböden gehalten werden, mit denen die minimalen Nährstoffansprüche ermittelt werden. Diese Minimalnährböden erlauben weitere Untersuchungen übet» Wachstumsfaktoren, (Vitamine, Mikro- und Makroelemente) Induktoren, Inhibitoren und rautägene Agenzien zur Erzielung eines optimalen Metabolismus des Bakteriums und stabiler, im Geno- und Phänotypus einheitlicher Stammvarianten.

*)' var* meeentericus FH-G-439 ,

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Neben der batch-Methode kann der Keim kontinuierlich

kultiviert werden. Bei Bereitstellung aller dafür benötigten technischen Systeme kann der Keim längere Zeit im Fließgleichgewicht gehalten werden, ohne daß spontane Mutationen oder andere Degenerationserscheinungen auftreten. Das Antibiotikum kann nach bekannten_f weiter unten beschriebenen Methoden aus dem kontinuierlich ■ gekühlten Abfluß isoliert werden.

Zur Identifikation des Bakteriums wurden morphologische Merkmale und stoffwechselphysiologische Eigenschaften herangezogen. Taxonomisch gehört der Stamm zur Familie der Bacillaceae, morphologische Gruppe I des Genus Bacillus und kann als Variante von B. licheniformis var. mesentericus charakterisiert werden.

Die folgende Tabelle gibt die. morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes B. licheniformis ATCG 21552 wieder.

Merkmal

Merkmal

Ve rwe rtung von:

Fructose

Arabinose

Mannose

Raffinose

Mannit

Stärke

Glycerin

Maltose

Laktose

Xylose

Glucose

Sorbit

Galaktose

Salicin

Insulin

Saccharose

Rhamnose

Dulcit

Glucose

Saccharose

Glycerin

Arabinose

Xylose

Mannit

Lactose

Rhamnose

Sorbit

•rt

'Bt CtD

<H O •P

•ri -P IQ

φ H H Φ

Sporengröße 0,3	ix 1,0	■■-'■■	-
Stäbchengröße 2,C	) χ 6,0	+	+
Gramfärbung	+	-
Beweglichkeit
Schleimbildung	-	-t·
Gelatinase	+	-
Protease	+	+
Amylase	+
Lipase	+	+
Katalase	·.+	-
Urease	- ;	-
Cytochromoxydase	-	Voges-Proskauer-Reaktion +
Phenylalanindearainse -	Methylrot-Reaktion
Lys inde carboxyla s e	H_S-Bildung
Lecithinase
Glucose-Oxidase
Phosphatase
Cellulase
Häraolyse
Wachs turn in NaCl^- Lösung 856
Wachstum in NaCl- Lösung 9$>
Wachstum bei 40°C
Wachstum bei 50°C
Indol-Reaktion

N0_-Reduktion +

Citrat als C-Quelle +_ Pigment -

anaerobes Wachstum +^

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Fortsetzung der Tabelle:

2OS5612-

Merfciöäl

+ = ja bzw. positiv bzw» vorhanden

- -= nein bzw. negativ bzw. nicht vorhanden

£ = unter besonderen Bedingungen positiv bzw. vorhanden

Vi taminbedärf

Wachstum in Glucose

Ü,9 - 7,2

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Zur technischen Gewinnung des Antibiotikums züchtet man eine Vorkultur von B* * lichenif ormi-s bei ca .28° - 3G°C submers in einem Nährmedium, welches eine Kohlenstoff- und eine Stickstoff quelle* enthält. Die Kultivierung ist nach ca· 48 - 60 Stunden abgeschlossen» Der pH-Wert verändert sich dabei ^ron neutral nach schwach sauer (pH 6.1 - 6,7)} eine Pufferung des Nährmediums ist nicht erforderlich.

Das rohe Fermentations-Medium kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Äthylacetat oder einem Alkohol mit 4 - 5 C-Atomen extrahiert werden. In diesem Fall geht die antibiötisehe Aktivität indie orga<r nische Phase, die von der wäßrigen Phase durch Abscheiden oder Zentrifugieren abgetrennt werden kann. Das Kulturmedium kann aber auch filtriert oder zentrifugiert werden, doch-bleibt in diesem Falle ein beträchtlicher Teil der Aktivität in der Zellmasse, die man zur Gewinnung des Wirkstoffs ebenfalls extrahieren kann. Durch Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, wie Aceton oder niedere aliphatisch^ Alkohole ist die Aktivität von der Zellmasse abtrennbar. Parallel kann Proticin aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe, z. B. mit den oben angegebenen Lösungsmitteln, extrahiert werden. Es ist auch möglich, das Rohantibiotikum aus dem KuIturfiltrat mittels Zugabe von Lösungen auszufällen, die geeignete Ionen enthalten. Als solche kommen viele Kationen, vorzugsweise aber Ionen des Calciums und Bariums, in Frage, mit denen Proticin in Wasser schwer lösliche Niederschläge bildet» Das Fällungsprodukt kann mit den üblichen Methoden abgetrennt werden. Das Antibiotikum kann durch Abfangen des zur Fällung benutzten Ions wieder in Lösung gebracht werden. Dies kann geschehen durch Bindung des Kations mit Komplexbildnern wie Xthylendiamintetraacetat, oder durch Umfällung mit Anionen wie z. B. Sulfat, zu denen das betreffende Kation eine größere Bindungsneigung hat als zum Antibiotikum. Aus einer so bereiteten wäßrigen Lösung kann das angereicherte Antibiotikum wieder durch Extraktion wie oben isoliert werden.
'*) sowie Nährsalze

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Aus den genannten organischen Phasen kann das Rohprodukt durch Einengen Isoliert werden. Es ist Jedoch aucft zweckmäßig, das Einengen weniger weit zu treiben und die Ausfällung d©s rohen Antibiotikums dann durch Zugabe eines Lösungsmittels, welches das Antibiotikum schlecht löst, wie beispielsweise Patroläther oder Cyclohexan, zu bewirken»

Zur Gewinnung des reinen Antibiotikums maß das Rohprodukt, noch welter aufgetrennt werden· Das kann efaroraat©graphisch unter Verwendung eines geeigneten Trägers,, wie ssum Beispiel Kieselsäure, geschehen· Das am Träger adsorbierte Antibiotikum., kann in relativ reiner Form gewonnen werden, indem saarn mit geeigneten Lösungsmitteln wie ss· B. Chlorofona-Methanol-Miscixuhgexi eluiert. Will man bei der saulenchromatoi^raphischen-Reinigung mit organischen Lösungsmitteln arbeiten^ so kami eine teilweise Desaktivierung des Trägers. etwa durch Waseerbenetzting odor Phosphatpufferbeschichtung zur Vermeietaag von. Substanssverlusten vorteilhaft sein (Beispiel 4)® Weiterlais aaSglieh ist auch eine Trennung an Kioselgel,, z» B· mit XsopXOpasaoX^asseX^Aimnoniak-Mischungen, wobei das Antibiotikum au T^&g®T v©rbl©ibt land Begleitstoffe eluiert werden© Dieser AuttTewcmng jLiegt. di© B©ob>=> achtung zugrunde, daßidas Proticin dmtch. S«Ssungsniit,t©l-mit aus» reichender NH„-»Konzantration nicht ©ä©^ affla? wenig ©Itiierbar ■ ist₉ während Lösungen von gleicher oder s®ga^ ges'lsagos'sr Polarität? jedoch ohne einen Gehalt an
können·

Ein weiteres wahlweise anzuwendendes Yarfata¹©» sos= Reiaigung Antibiotikums ist die ßelfiltratiosio Mss& I&smn das Antibiotikum auch mit Hilfe der Geg©nstroiaverteiltssag -assad diarcSi. "W®2n?mm.dxmg von Ionenaustauschern reinigen· Die auf@®gSlilt©5a ¥©2'f^>ata'©Bi können zur Reinigung der erfindungsgemä&en Srabstasas maeSa B®li©ben wiederholt oder kombiniert werden«

Zum Nachweis der Reinheit des Antibiotikmas ©ignet eieSu dia Dünnschichtchromatograpliie relativ polar©:?

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: ; ^; ; - 7 - - ■■,■■.''■■

Brauchbar sind ζ· B. die Misclitmgen Chloroform-Metlianol-Wasser 65 s 25 t h (a) oder lsopropanol-Wasser-2n-Ainmoniumnydroxid im Volumenverhältnis 85 : i4 j 1 (b) bei Verwendung von Kieselgel-G-Platten.

Das reine Antibiotikum ist eine farblose, in Chloroform, Tetrahydrofuran» Aceton, Äthylacetat, niederen Alkoholen^ Pyridin und Wasser lösliche Substanz. Sie ist in unpolaren Lösungsmitteln wie Petrolätber, Cyclohexan oder Tetrachlorkohlenstoff schwer löslich, aber auch aus wäßrigen Lösungen fällt bei Ansäuern teilweise Proticin aus·

Das Antibiotikum Proticin ist z. B. mit Chlorsulfonsäure-Eisessig» Liebermann-Burchard-Lösung, Antimon-III-chiorid, Kaliumpermanganat und Ammoniummolybdat-Perchlofsäure anfärbbar, während die Farbreaktionen mit Eisen-lll-chlorid, Dinitrosalieylsäure, Tetraphenyltetrazoliumchlorid, Ninhydrin, sowie mit Morgan-Elson, Sakaguchi-, Ehrlich-, Dragendorff- und Pauly-Reagenz negativ ausfallen·

Proticin setzt sich zusammen aus C, H, 0 und P, die prozentuale Zusammensetzung des chromatographisch gewonnenen Natriumsalzes ist C = 63,8 ^, H = -7,8 i»t Pi 4,3 ^, Na : 3.2 9δ, Rest: Sauerstoff · Die Analysendaten können von diesen Daten abweichen, besonders häufig findet man zu niedrige lierte für Kohlenstoff. Bemerkenswert ist das Fehlen von Stickstoff, Schwefel sowie der Halogene. Phosphorhaltige und stickstofffreie Antibiotika sind außer Phosphonomycin bisher nicht bekannt. Von letzterem unterscheidet sich Proticin unter anderem im Ultraviolett-Spektrum.

Das IR-Spektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben. Es zeigt Absorptionsbanden bei 3380, 3Ο8Ο, 2920, 2850, 1725, 164O, 1445, 1370, 116O, 985t 920 (flach), 890, 830 (flach) und 750 cm"¹.

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Proticin absorbiert ultraviolettes Licht intensiv (Figo 2)« Charakteristisch für das Antibiotikum sind die Maxima bei 284, 272,5, 264 (wenig ausgeprägt) und 235 nm« Die spezifische Drehung Z^7n wurde zu -78° (c = 0,35 A^. Äthanol) ermittelt. Nach längerem Stehenlassen in konzentrierten Lösungen- über mehrere Tage ist die optische Aktivität jedoch geringer.

Charakteristisch für Proticin ist di© leichtere Spaltbarkeit. Schon under schwachsauren Bedingungen kann vom Antibiotikum Phosphat abgespalten werden* Der Rest des Moleküls ist instabil und kann schon während der Gewinnung Umwandlungen erleiden· Die organischen Spaltprodukte können zur Charakterisierung des Antibiotikums herangezogen werden« Alle Spaltprodukte zeigen einige gemeinsame physikalische Eigenschaften; Die UV~Spektren haben Absorptionsmaxima bei 235, 264, 272,5 und 284 nra, während im Massenspektrum folgende Zonenmassen intensiv erscheinen: 4.1, 43, 55, 67, 79, 81, 91, 93, 105, 107, 125, 23t, 365, 444 und 462.

Proticin wirkt hemmend gegen verschiedene Gram-positive und Gram-negative Bakterien sowie gegen Mykobakterien. Eine Auswahl der minimalen Hemmkonzentration, die mit dem Reihenverdünnungstest ermittelt worden sind, zeigt folgende Tabelleι

Proteus mirabilis Escherichia coil Salmon· typhimurium Shigella flexneri Streptoc. haem. 308 Staphyloc. aureus P 209 Mycobact. tuberc. H 37 RV 5

Proticin ist wenig toxisch. Mäuse vertragen 100 mg/kg i« v»' und 1000 mg/kg se.

0,4	mcg/ml
12	mcg/ml
3	mcg/ml
3	mcg/ml
0,4	mcg/ml
50-	iac g/ml
5	mce/ml

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-9 - '■ V ■ '. ■ ■■ ■ '■■ ■ ' ^: 'Ζ \

I. Züchtung

Beispiel T FH-G-439

Der Stamm Bacillus licheniformis var. mesentericus /(ATCC 21552) wird auf Schrägagarröhrchen mit. einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:

8 56

0,5 i

1 i

0,5 $

Spur

Spur

0,01 $

. Stärke .

• Äthanol

• Na-Citrat

ι Glucose

MgSO4

CaCl2

> FeSO^

1,0 $> (NHk)₀HPO₁, pH 7 vor pH 6,8 naehi

■ _o V ■ ■■ ^■* -*■'.' Sterisilation 1,8 $> Agar.

Das beimpfte Röhrchen wird 3 - 4 Tage bei +28⁰C bebrütet. Danach wird das Zellmaterial mit 10 ml physiologischer NaCl-Lösung abgeschwemmt und die Zellsuspension in einen Anzuchtkolben überimpft· Dazu sind 5 derartige Röhrchen nötig· Sie ergeben Inoculum für einen 1000 ml Erlenmeyer-Kolben mit einer Füllung von 250 ml folgender Nährlösung:

0,75 7»	löel. Stärke
0,5 ^	Sojaschrot
0,5 $>	Cornsteep
0,05 S^	Trockenschlempe
0,005 5δ	Trypticase
1,0 i»	Caseinpepton
1,0 ?δ	Stärke
0,25 ■■*.	NaCl.

Dieser Kolben wird mit 220 U/min auf einer Schuttelmaschin® 1 Tag bei +28⁰C geschüttelt. Danach werden 5 weiter® t000ml Brlenmeyerkolben mit gleicher Nährlösung tsad .Füllung mit 50 ml

au« dem Vorkulturansatz-beimpft« Die. 5 Kolbe» steiles dio

I/

Hauptkultur dar und werden bei +28°C mit 200 ü/min auf einer Schüttelmaschine 2-3 Tage geschüttelt« Jeden Tag wird eine Probe steril entnommen und die antibiotische Aktivität der Kulturlösung im Agardiffusionstest gegen verschiedene Mikroorganismen getestet· Zur Anwendung kamen Blättchen- und Lochteste · Testkeime waren E. coli und Proteus vulgaris. Hemmhöfe von 25 mm gegen E, coli und 37 mm gegen Proteus zeigen, maximale antibiotische Aktivitäten an, was einer Konzentration von 98 mg Reinsubstanz pro Liter entspricht« Wenn im Test diese höchsten Aktivitäten gemessen werden, wird die Kultur abgebrochen (in der Regel nach 5° ^^is 60 Stunden) und der chemischen Aufarbeitung zugeleitet·

Beispiel 2

Der Stamm B· licheniformis var, mesentericus ATCC_ 21552 wird auf Sehrägagarröhrchen geimpft, die mit folgendem Nährboden beschickt wurdenJ

0,1	*	Hefeextrakt -
0,1	*	Malzextrakt
1,0		hoßlelm
0,1		Fleischextrakt
2,5	$	Caseinpeptoa
0f01		Tryptieos®
0,5	*	Glucose
1,8	f	Agar
0,01	$	SoJaSl
0,5	$	Corast@ep
1,0		CaCO1
1,0	a
1,0		Sojameiil
1,0	$	Stärk®
ad 1	000

Röhrchen werden 3 Tage bet +28⁰C bebrütet. Danach werden sie 5 Tage bei Zimmertemperatur gehalten, bis völlige Versporung eingetreten ist· Mit 10 ml physiologischer NaCl-Lösung wird das Sporenmaterial abgeschwemmt und die Sporensuspension in einem 1000 ml Anzuchtkolben mit 250 ml obiger Nährlösung ohne Agar überimpft· Für zwei Anzuchtkolben werden 5 Röhrchen, somit pro Kolben 50 ml Sporensuspension gebraucht. Diese Vor- . kultüren werden 2 Tage mit 220 TJpm bei +28⁰C auf einer Schüttelmaschine geschüttelt· Danach wird ein 30 1-Permentationsgefäß mit Rührer, Lufteinleitungsrohr, Probenehmeranschluß und automatischer Anti schaumzugabe mit 10 1 folgender Nährlösung beschickt«

4 #	Stärke
0,4 $	Oornsteep
1,0 %	ι Glucose
0,8 £	' (NHk)9 HPOk
0,4 5«	> Sojamehl
1,0 f	< Caseinpepton

pH 7,2 - 7,^ Aqua dest. ad 10 1

und 45 ■· bei 121⁰C und T atti sterilisiert. Dem Fermenter inhalt sind 0,1 <fo Polypropylen als Antischaummittel zugegeben. Als Inoculum kommen 5 $ der obengenannten Vorkultur zum Einsatz. Es wird bei +28⁰C unter Durchlauf von 500 1 Luft/Std. 48 Stunden lang fermentiert· Durch sterile Probeentnahme wird der Fermentationsverlauf verfolgt und die antibiotische Aktivität wie in Beispiel 1 bestimmt· Bei Beendigung der Kultivierung beträgt die Antibiotikumkonzentration 111 mg/l; der End-pH schwankt zwischen 6,7 void 7#0»

Beispiel 3

Der Stamm Bacillus ATCC 21552 wird auf einem Schrägagarröhrchen derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 2 gezüchtet· Die erhaltene Sporensuspension wird in 5 1000 ml Erlenmeyer-

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kolben mit je 250 ml der ia Beispiel 2 als Hauptkultur ver~ ■wendeten Nährlösung steril überführt. Nach 2-tägiger Kultivierung bei +28°C und 220 U/min auf der Schüttelmaschine wird das erhaltene Inoculum einem Fermenter von 100 1 Gesamtvolumen und 50 1 Arbeitsvolumen mit einer Nährlösung nach Beispiel 2 als Hauptkultur zugeführt·

Der Fermenter wird ko min. bei 121⁰C und 1 atü unter Rühren sterilisiert, mit 0,5 $ Inoculum beimpft und 60 Stunden bei +30⁰C mit einer Umdrehungszahl von 150 U/min gerührt. Die Belüftung beträgt 3OOO 1 Luft/Std. Als Antischaummittel wird 0,1 $ Polypropylen zugegeben. Der Fermentationsablauf wird durch Probenahme überwacht und nach Beispiel 1 getestet. Bei Abbruch der Fermentation beträgt der pH 6,6, die Ausbeute ist 10^ mg Proticin je 1 Kulturflüssigkeit.

II. Aufarbeitung

Beispiel k

Die nach Beispiel 1 gewonnenen, vereinigten KuItürlösungen (1 l) werden zentrifugiert. Der wäßrige Überstand, der den größten Teil der antibiotischen Aktivität enthält, wird abgetrennt. Der Hinterbliebene Rückstand aus Bakterienzellen und ungelöstem Nährboden wird zur Gewinnung der restlichen Aktivität mit der dreifachen Menge Methanol übergössen und T Stunde gerührt. Danach wird erneut zentrifugiert. Die ungelösten Bestandteile werden verworfen, der klare methanolische Überstand/ϊπι Vakuum vom Methanol weitgehend befreit und das entstandene Konzentrat zur zentrifugieren Kulturlösung gegeben. Die vereinigten Lösungen werden zweimal mit je 5OO ml Butanol ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird verworfen, die Butanolextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf etwa 10 ml eingeengt. Beim Fällen mit Petroläther (Siedebereich ^O - 60°c) entsteht ein graubrauner, pulvriger Niederschlag, der gesammelt wird. Das Trockenprodukt wiegt 1,6 g und weist eine Aktivität von 56 meg

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Reinsubstanz/mg auf·

Das Fällungsprodukt wird säulenchromatographiseh auf Phosphatpuff or- imprägniertem Kieselgel aufgetrennt. Der entsprechende Träger wird durch Zusatz von 1 1 O,4n Phosphatpuffer aus 'NeHgPOjj. und Na₂PO^ (pH 6,7) zu 1 kg Kieselgel der Korngröße 0,05 - 0,2 mm bereitet. Man verrührt die Mischung innig und trocknet bei 110 C 2 Tage. Dann werden 50 ml Wasser hinzugefügt und 2.Stunden geschüttelt. 50 g des jetzt gebrauchsfähigen Trägers werdeniin Chloroform aufgeschlämmt und in eine Glassäule von 2,5 cm Innendurchmesser gefüllt. Man löst das Fällungsprodukt in 5 - 10ml Chloroform, notfalls unter Zugabe von etwa Methanol, und trägt auf die Säule auf. Dann wird mit je 200 ml Chloroform-Methanol-Mischung im Volumenverhältnis 9 ϊ 1» 8 x 2 und 7 '*■ 3 vorhandene Verunreinigung von der Säule gewaschen. Elüierung mit Chloroform-Methanol (6 : 4 Volumina) führt schließlich zur Abtrennung des Antibiotikums von der Säule· Die Fraktionen mit einer Aktivität gegen Proteus vulgar is werden gesammelt. Sie enthalten 3^1 mg Festsubstanz gelöst mit einer Aktivität von 220 meg Proticin je mg Trockensubstanz.

Die weitere Reinigung des Antibiotikums geschieht mit Hilfe der Gelchromatographie· Hierzu werden 36 g Sephadex LH 20 in einer Mischung von Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis 1 : 1 aufgequollen und in eine Glassäule von 30 cm Länge und 2,5 cm Innendurchmesser gefüllt· Dann werden 320 mg der obigen Substanz in Chloroform-Methanol gelöst, aufgetragen und fraktioniert. Als Lauf mittel dient Chloroform-Methanol (1 : i). Die Fraktionen (je 10 ml) werden auf antibiotisehe Wirksamkeit untersucht, die aktiven vereinigt und eingeengt. Man erhält 98 mg Roh-Antibiotikum mit einer spezifischen Aktivität von 69k mcg/mg» Di· Gelchromatographie wird an einer 2 η langen Säule mit 1 1 Inhalt wiederholt. Nach der Aufgab« von 95 mg Roh-Antibiotikum werden 10 mli"-Franktionen abgenosunen· In der

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193· his 206. Fraktion befindet sich die Hauptmenge des Proticins. Aus den Röhrchen 198 - 206 werden 28 mg reines Proticin mit einem Drehwert von 78° erhalten.

Beispiel 5 < ...

Die gemäß Beispiel 2 erhaltene Fermentationslösung (9»1 1 mit. einem Gehalt von 106 mg Reinsubstanz/l) wird mit 3 1 Butanol und 3 1 Äthylacetat versetzt und 30 Minuten gerührt. Danach wird zentrifugiert, die organische Phase abgetrennt und im Vakuum auf 20 ml eingeengt· Die wäßrige Schicht und der Schlamm werden verworfen· Das Konzentrat der organischen Phase wird mit 2 1 Petroläther gefällt. Es resultieren 12g eines Pulvers mit 66 meg Reinsubstanz/mg. Dann werden 500 g Kieselgel (Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) in einer Mischung von Isopropanol-ffasser-2n Ammoniak (90 : 6 : k) aufgeschlämmt und in eine Glassäule gefüllt (Innendurchmesser 6 cm, Länge 5° cm). Der Niederschlag wird in 50 ml des gleichen Lösungsmittels gelöst und auf die Säule gegeben· Die Säule wird mit Isopropanol-Wasser-än Ammoniak (90 : 6 : h) so lange gewaschen, bis das Eluat weitgehend farblos ist, wozu ca· 6 1 des Gemisches nötig sind; die Waschlösungen werden verworfen. Anschließend wird mit Isopropanol-Wasser (9 : 1) eluiert; das Eluat wird in Fraktionen von je 100 ml gesammelt und auf antihiotische Aktivität geprüft. Die mehr als 0,1 mg Antibiotikum im ml enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit· Der amorphe, hellgelbe Rückstand enthält das Ammoniumsalz des Proticins. Ausbeute: 1,1 g mit einer spezifischen Aktivität von 4^3 mcg/mg. Eine weitere Reinigung über Sephadex^ LH 20 gemäß Beispiel k ergibt das reine Antibiotikum als Ammoniumsalζ·

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Beispiel 6 · ■

< kk 1 der nach Beispiel 3 gewonnenen Feriaentationsbrühe werden . entsprechend Beispiel 4 oder 5 extrahiert, eingeengt und gefällt. Das so entstandene Pulver (58 g» 63 mcg Reinsubstanz/mg) wird mit 1,5 1 Wasser Übergossen und mit 2n NaOH vorsichtig neutralisiert. Es entsteht eine klare, dunkelbraune Lösung, zu der 100 ml 2n Bariumehloridlösung Unter Rühren hinzugegeben werden. Nach 15 Minuten wird zentrifugiert.'Das Antibiotikum befindet sich als Bariumsalz im Niederschlag. Der dunkle Überstand wird verworfen. Das Fällungsprodukt wird mit Wasser, dem etwas Barlumchlorid zugesetzt ist, aufgeschlämmt und erneut zentrifugiert. Das Waschwasser wird abgegossen und der Niederschlag in 400 ml einer 5$igen Natriumsulfatlösung gerührt. Hierbei löst sich das voluminöse Fällungsprodukt allmählich, während feinkörniges Bariumsulfat ausfällt. Nach 1 Stunde wird zweimal mit 250 ml n-Butanol extrahiert. Der wäßrige Rest wird verworfen, die organischen Phasen werden vereinigt, mit wenig destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum schonend eingeengt. Es hinterbleiben 11 g eines dunklen, zähen Schaumes mit einer Aktivität Von 277 meg Proticin/ml der nach Beispiel k oder 5 weiter gereinigt werden kann.

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Claims (1)

1. S5812-

   Patentanspruch

   Verwendung von Bacillus lichenicPormis vas*, mesenterlcue PH-G-439 ATCC 21552 bzw. seiner Varianten und Mutanten zur Herstellung von Proticin auf üblichem biologischem Wege, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturansatz und Reinigung des Antibiotikums.

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   Lee rs e ι. te.