CH628680A5 - Verfahren zur herstellung des neuen antibioticums thienamycin. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her-

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Thie- Stellung einer neuen antibiotisch wirksamen Verbindung, des namycin aus Gärbrühen oder Lösungen, welche das Antibioti- Thienamycins, welchem die folgende Strukturformel zukommt: cum enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gärbrühe oder Lösung durch eine Säule leitet, die mit einem Sul- 5 qj _ qjj (qh ) j fonsäure-Austauschgruppen aufweisenden Kationen-Austau- 3 I l \_o_cH —CH -NH

scherharz gefüllt ist, dass man das gebundene Antibioticum mit I // 2 2 2

einer Base eluiert, die Eluate sammelt und die aktiven Fraktionen vereinigt, dass man die vereinigten aktiven Fraktionen durch eine Säule leitet, die mit Polyacrylamid- oder Dextrangel 10 (ÎOOH X

gefüllt ist, wobei die Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb 1800 bzw. 700 ausgeschlossen werden, dass man die aus Gärbrühen, in welchen das Antibioticum erzeugt wurde, Säule mit Wasser oder einem wässrigen niederen Alkohol oder aus Lösungen, welche das Antibioticum enthalten.

eluiert, und dass man die Eluate sammelt und die aktiven Frak- Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekenn-tionen vereinigt. 15 zeichnet, dass man die Gärbrühe oder Lösung durch eine Säule

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- leitet, die mit einem Sulfonsäure-Austauschgruppen aufweisen-net, dass man die aus der Kationen-Austauschersäule gewönne- den Kationen-Austauscherharz gefüllt ist, dass man das gebun-nen vereinigten Fraktionen vor dem Durchleiten durch die dene Antibioticum mit einer Base eluiert, die Eluate sammelt Polyacrylamid- oder Dextrangelsäule durch eine Säule perko- und die aktiven Fraktionen vereinigt, dass man die vereinigten liert, die mit einem Anionen-Austauscherharz gefüllt ist, wel- 2° aktiven Fraktionen durch eine Säule leitet, die mit Polyacryl-ches quaternäre Ammoniumgruppen an Polystyrol aufweist. amid- oder Dextrangel gefüllt ist, wobei die Moleküle mit einem

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 und Patentanspruch 2, Molekulargewicht oberhalb 1800 bzw. 700 ausgeschlossen wer-dadurch gekennzeichnet, dass man den Ablauf der Anionen- den, dass man die Säule mit Wasser oder einem wässrigen nie-Austauschersäule durch eine Säule leitet, die mit einem an aro- deren Alkohol eluiert, und dass man die Eluate sammelt und die matische Kerne gebundene Sulfonsäuregruppen aufweisenden 25 aktiven Fraktionen vereinigt.

Kationen-Austauscherharz gefüllt ist, dass man die an das Harz Thienamycin verhindert auf wirksame Weise das Wachsgebundenen Substanzen mit einem Puffer oder mit Wasser tum verschiedener gram-negativer und gram-positiver eluiert, die aktiven Fraktionen vereinigt und die vereinigten Mikroorganismen.

Fraktionen der Polyacrylamid- oder Dextrangelsäule zuführt, Thienamycin wird bei der Aerobenfermentierung geeigne-

und dass man die vereinigten aktiven Fraktionen der Eluate die- 30 ter wässriger Nährmedien durch einen Stamm von Streptomy-ser Säule aufkonzentriert, das Konzentrat an einer Säule chro- ces cattleya, der in der Lage ist, diese Verbindung zu erzeugen, matographiert, die ein mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol hergestellt, beispielsweise durch den Stamm, der dauernd in der als hydrophobes, vernetztes Polymer enthält, mit Wasser Kulturensammlung der Abteilung Northern Utilization Re-

eluiert, die Eluate sammelt und die aktiven Fraktionen ver- search and Development des USA-Landwirtschaftsdeparte-

einigL 35 ments in Peoria, III., unter der Registriernummer NRRL 8057

4. Verfahren nach Patentanspruch 1,2 oder 3, dadurch hinterlegt ist (am 19. November 1974).

gekennzeichnet, dass das Kationen-Austauscherharz eine Sty- Wässrige Medien, wie sie zur Produktion anderer Antibio-

rol-Divinylbenzol-Matrix aufweist, an welche Sulfonsäure-Aus- tica geeignet sind, können auch zur Herstellung von Thienamy-tauschergruppen in Form ihres Natriumsalzes gebunden sind. c'n verwendet werden. Solche Medien enthalten gewöhnlich

5. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeich- 40 Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, net, dass das Anionen-Austauscherharz eine Styrol-Divinylben- welche durch den Mikroorganismus assimilierbar sind. Im all-zol-Polymermatrix aufweist, an welche quaternäre Ammonium- gemeinen kann man im Nährmedium Kohlenhydrate wie Zuk-gruppen in Form ihres Chloridsalzes gebunden sind. ker, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Sacharose,

6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- Xylose, Mannit und ähnliche sowie Stärken wie Getreidenet, dass man das Polyacrylamidgel mit einem Gemisch aus 1 45 stärke, beispielsweise Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl Teil Butanol und 99 Teilen Wasser eluiert. usw. für sich oder in Kombination als Quellen für assimilierba-

7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- ren Kohlenstoff verwenden. Die jeweilige Menge an Kohlenhy-, net, dass die mit dem Kationen-Austauscherharz gefüllte Säule drat oder Kohlenhydraten im Nährmedium hängt teilweise von mit einer wässrigen Lösung einer organischen Base eluiert den anderen Bestandteilen des Mediums ab, wobei jedoch im wird, worin die Base Pyridin, a-ß- y-Picolin, 2,3-, 2,4- oder 5° allgemeinen die Menge an Kohlenhydraten zwischen etwa 1 2,6-Lutidin, 2,4,6-Collidin oder ein Alkylamin ist, worin die und 6 Gew.-% des Mediums schwankt. Diese Kohlenstoffquel-Alkylgruppen 2 bis 10 C-Atome aufweisen. len können einzeln vorhanden sein, oder man kann mehrere sol-

8. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeich- eher Quellen im Medium kombinieren. Ganz allgemein können net, dass man als Puffer einen solchen verwendet, der tris- viele proteinhaltige Stoffe als Stickstoffquellen beim Fermen-(HydroxymethyO-aminomethan-maleat, Cacodylsäure, 55 tierungsverfahren angewendet werden. Geeignete Stickstoff-KH2PO4, NaHzPO*, N-Ethylmorpholin, a-, ß- oder y-Picolin quellen sind beispielsweise Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojaoder 2,3-, 2,4- oder 2,6-Lutidin enthält. bohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Caseinhydrolysate, Maisein-

9. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeich- weichwasser, lösliche Destillierrückstände, Tomatenpaste und net, dass die Säulen, die mit einem mit Divinylbenzol vernetz- ähnliche. Die Quellen für Stickstoff, entweder eine oder meh-ten Polystyrol als hydrophobes, vernetztes Polymer gefüllt sind,60 rere, werden im allgemeinen in Mengen angewendet, die zwi-mit einem Phosphatpuffer bei neutralem pH eluiert werden. sehen etwa 0,2 und 6 Gew.-% des wässrigen Mediums betragen.

10. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1, Unter den anorganischen Nährsalzen, welche dem Nährauf die Gewinnung des Antibioticums Thienamycin aus Gär- medium zugegeben werden können, seien die üblichen Salze brühen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibioticum in genannt, welche Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phos-einem Gärmedium durch Fermentierung eines thienamyeiner- 65 phat, Sulfat, Chlorid, Carbonat und andere Ionen abgeben kön-zeugenden Mikroorganismus erzeugt. nen. Ausserdem sieht man in der Regel Spurenmetalle wie

Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium usw. vor.

Es sollte erwähnt werden, dass die in den nachfolgenden

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Beispielen angegebenen Nährmedien nur Beispiele einer Viel- bzw. Streckmittel andere Bestandteile enthalten, beispielsweise zahl verschiedener Medien darstellen, die verwendet werden Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungskönnen, und dass die angegebenen Beispiele nicht einschrän- mittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsregler,

kend aufzufassen sind. Aromastoffe usw.

Die Fermentierung wird vorzugsweise bei Temperaturen s In der Veterinärmedizin, beispielsweise bei der Behandlung zwischen 20 °C und 37 °C ausgeführt; zur Erzielung der besten von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen usw. können die PräErgebnisse wird die Ausführung der Fermentierung bei Tempe- parate beispielsweise derart formuliert werden, dass sie über raturen zwischen etwa 22 °C und 30 °C bevorzugt. Das pH des lange Zeiträume oder sehr schnell abgegeben werden. Nährmediums, welches zum Wachstum des Streptomyces catt- Bei der Behandlung bakterieller Infektionen des menschli-leya und zur Produktion von Thienamycin geeignet ist, kann io chen Körpers wird die erfindungsgemäss herstellbare Verbin-zwischen etwa 6,0 und 8,0 schwanken. dung gewöhnlich oral oder parenteral verabreicht, nach den

Obwohl das Antibioticum Thienamycin sowohl durch Ober- üblichen Methoden zur Verabreichung von Antibiotica, in flächenkultur als auch durch Tauchkultur erzeugt werden kann, Mengen von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und vorzugsweise etwa wird bevorzugt, die Fermentierung in der Tauchkultur durchzu- 5 bis 100 mg/kg/Tag, insbesondere in Mehrfachdosierung, d. h. führen. . 15 drei-bis viermal pro Tag. Die Verbindung kann im allgemeinen

Die Erzeugung des Antibioticums Thienamycin ist nicht auf in Form von Dosierungseinheiten gegeben werden, die beiden Organismus Streptomyces cattleya beschränkt. Es ist viel- spielsweise 25,250,500 oder 1000 mg an Wirkstoff enthalten, mehr erwünscht auch die Verwendung von Mutanten vorzuse- zusammen mit geeigneten physiologisch brauchbaren Trägern hen, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschie- oder Exzipienzien. Die Dosierungseinheiten liegen in Form von dene Mittel erhalten werden können, beispielsweise durch 20 flüssigen Präparaten wie Lösungen oder Suspensionen oder als Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Senfgas, in wel- feste Präparate wie Tabletten oder Dragées vor.

chem S durch N ersetzt ist, Einwirkung von Bakterien u. ä., und Die zu verabreichende Menge an Wirkstoff hängt in gros-auch die Verwendung anderer Mikroorganismen, welche Thie- sem Masse vom Befinden der zu behandelnden Person ab, vom namycin liefern können. Gewicht der Person und der Art der Infektion, dem Weg und

Thienamycin ist ein wertvolles Antibioticum, welches 25 der Häufigkeit der Verabreichung, wobei für Allgemeininfek-gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakte- tionen die parenterale Verabreichung und für Intestinalinfek-rien wirksam ist und demgemäss in der Human- und Veterinär- tionen die orale Verabreichung bevorzugt gewählt werden, medizin mit Vorteil angewendet werden kann. Die Verbindung Selbstverständlich wird man bei der Behandlung von Kindern kann als antibakterielles Medikament zur Behandlung von kleinere Dosierungen anwenden, und die Einzelheiten der

Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder 30 Behandlung sind Sache des praktizierenden Arztes, gram-negative Bakterien verursacht werden, beispielsweise Die erzeugten, das Antibioticum enthaltenden Gärbrühen gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia besitzen in der Regel Aktivitäten, die bei etwa 50 bis 400 Einhei-coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und En- ten pro ml liegen, wenn man die Gärbrühen im Scheiben-Diffu-terobacter cloacae. Die neue antibakterielle Material kann wei- sionstest unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC terhin als Zusatz zu tierischen Futtermitteln, zur Konservie- 35 6538P untersucht. Es können antibiotische Präparate mit min-rung von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwen- destens 2 Aktivitätseinheiten pro mg an Teststoffen der Gär-det werden. Beispielsweise kann es in Form wässriger Mittel in brühe gereinigt werden, und das Antibioticum kann dann nach Konzentrationen von 0,1 bis 100 Teile Antibioticum auf eine einer ganzen Anzahl von Verfahrensvarianten gewonnen wer-Million Teile Lösung angewendet werden, um schädliche Bäk- den.

terien auf medizinischen und zahnärztlichen Geräten zu ver- 40 Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, dass man Thie-nichten und deren Wachstum zu verhindern, als Bakterizide in namycin an einem stark sauren Kationen-Austauscherharz und der Industrie, beispielsweise in wässrigen Anstrichmitteln und bei einem sauren pH adsorbiert und dann mit einer wässrigen im Betriebswasser von Papierfabriken, um das Wachstum organischen Base eluiert. Das so gewonnene Eluat kann nach schädlicher Bakterien zu verhindern. den folgenden Verfahren weiter gereinigt werden: Chromato-

Tabletten und Dragées zur oralen Verabreichung können 45 graphie an einem Anionen-Austauscherharz, welches an Poly-das Antibioticum in Einheitsdosen enthalten und weiterhin ver- styrol gebundene quaternäre Ammoniumgruppen aufweist; schiedene übliche Verdünnungsmittel aufweisen. Die Tabletten Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz mit können nach bekannten Arbeitsweisen überzogen werden. einem Puffer oder Wasser; Gelfiltration und Chromatographie Oral anwendbare flüssige Präparate können in Form wässriger an einem adsorbierenden Harz.

oder öliger Suspension, Lösung, Emulsion, Sirup, Elixiere usw. so Die Reihenfolge, mit der diese Verfahrensschritte ausge-vorliegen, oder man kann sie als ein trockenes Produkt formu- führt werden, ist nicht kritisch; es wird jedoch bevorzugt, eine lieren, welches vor der Verwendung mit Wasser oder anderen solche Reihenfolge zu wählen, bei der die Reinigung durch flüssigen Trägerstoffen zum oral anwendbaren flüssigen Medi- Ionenaustauscherharze für unreinere Gärbrühen und Lösun-kament formuliert wird. Derartige flüssige Präparate können gen angewendet wird, während man die Gelfiltration und dié die üblichen Zusätze aufweisen. Suppositorien können die übli- 55 Adsorption an polymerer Harze für solche Stoffe vorsieht, die chen Grundlagen für Suppositorien enthalten, beispielsweise bereits mindestens teilweise gereinigt wurden.

Cacaobutter oder andere Glyceride. Beispiele bevorzugter Reihenfolgen von Verfahrensschrit-

Zubereitungen zur Injektion können in Form von Einheits- ten zur Gewinnung des Antibioticums Thienamycin aus Gärdosen in Ampullen oder in Form von Vielfachdosen in Behäl- brühen oder aus Lösungen, welche das Antibioticum enthalten, tern mit zugegebenem Konservierungsmittel vorliegen. Die 60 werden nachfolgend beschrieben.

Präparate können Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Erfindungsgemäss leitet man eine Gärbrühe oder eine öligen oder wässrigen Trägern sein können die üblichen For- Lösung, welche das Antibioticum enthalten, durch eine Säule, mulierungshilfsmittel wie Suspensionshilfsmittel, Stabilisatoren die mit einem Kationen-Austauscherharz gefüllt ist, welches und/oder Dispersionshilfsmittel enthalten. Die Wirkstoffe kön- Sulfonsäure-Austauschgruppen aufweist. Dann eluiert man die nen aber auch in Form eines Pulvers zur Verdünnung mit einem 65 am Harz gebundene Substanz mit einer Base, sammelt die geeigneten Verdünnungsmittel vorliegen, beispielsweise steri- Eluate und vereinigt die aktiven Fraktionen. Dann leitet man lem, pyrogenfreiem Wasser. die vereinigten aktiven Fraktionen durch eine Säule, die mit

Die vorliegenden Präparate können ausser dem Trägerstoff einem Polyacrylamidgel oder einem Dextrangel gefüllt ist, wel

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ches Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb 1800 die aktiven Fraktionen, leitet die vereinigten aktiven Fraktio-

bzw. 700 nicht zurückhält. Schliesslich eluiert man das Gel mit nen durch eine mit Polyacrylamid- oer Dextrangel gefüllte ■

Wasser oder mit einer wässrigen Lösung eines niederen Alko- Säule, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb hols, sammelt die Eluate und vereinigt die aktiven Fraktionen. 1800 bzw. 700 nicht zurückhält, eluiert das Gel mit Wasser,

Eine bevorzugte Aufeinanderfolge von Schritten zur 5 einem verdünnten Puffer oder mit einer wässrigen Lösung

Gewinnung des Antibioticums Thienamycin aus Fermenta- eines niederen Alkohols, sammelt die Eluate, vereinigt die akti-

tionsbrühen oder aus Lösungen, welche das Antibioticum ent- ven Fraktionen, konzentriert diese Fraktionen, adsorbiert die halten, besteht in folgendem: Man leitet eine Fermentations- konzentrierten vereinigten Fraktionen an einer mit dem «Poly-

brühe oder eine Lösung, die das Antibioticum enthalten, durch styrolharz XAD-2» gefüllten Säule und eluiert schliesslich mit eine Säule, die mit einem Kationen-Austauscherharz gefüllt ist, m Wasser.

welches Sulfonsäure-Austauschgruppen enthält. Dann eluiert Beispiele wichtiger Reihenfolgen von Reinigungsschritten,

man die am Harz gebundene Substanz mit einer Base, sammelt die ausgeführt werden können, sind die folgenden:

die Eluate und vereinigt die aktiven Fraktionen. Diese vereinig- 1. Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz;

ten aktiven Fraktionen aus den Eluaten der Kationen-Austau- Chromatographie an einem Anionen-Austauscherharz; wieder-

scherharzsäule perkoliert man dann durch eine Säule, die mit 's holte Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz;

einem Anionen-Austauscherharz gefüllt ist, welches quaternäre Adsorption und Eluierung an bzw. aus einem adsorbierenden

Amoniumgruppen an Polystyrol gebunden enthält. Man sam- Harz unter nachfolgender zweiter Adsorption und Eluierung melt den Ablauf, leitet ihn durch eine Säule, die mit feinem Poly- an bzw. aus einem Adsorberharz.

acrylamid- oder Dextrangel gefüllt ist, welches Moleküle mit 2. Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz ; einem Molekulargewicht oberhalb 1800 bzw. 700 nicht zurück- 20 Chromatographie an einem Anionen-Austauscherharz; wiederhält, eluiert das Gel mit Wasser oder mit einer wässrigen holte Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz; Lösung eines niederen Alkohols, sammelt die Eluate und ver- Adsorption und Eluierung an bzw. aus einem Adsorptionsmit-einigt die aktiven Fraktionen. tel; Gelfiltration.

Eine weitere bevorzugte Aufeinanderfolge von Schritten 3. Chromatographie an einem Anionen-Austauscherharz ;

zur Gewinnung des Antibioticums Thienamycin aus Gärbrühen 25 Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz; Gelfil-

oder aus Lösungen, die dieses Antibioticum enthalten, besteht tration; Adsorption und Eluierung an bzw. aus einem adsorbie-

darin, dass man eine Gärbrühe oder eine Lösung, die das Anti- renden Harz.

bioticum enthalten, durch eine Säule leitet, die mit einem Katio- Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung von Thienamycin nen-Austauscherharz gefüllt ist, welches Sulfonsäure-Aus- besteht in der Bindung des Thienamycins an ein stark saures tauschgruppen aufweist. Man eluiert die am Harz gebundene 30 Kationen-Austauscherharz, wobei das freigegebene Ion am Substanz mit einer Base, sammelt die Eluate, vereinigt die akti- Harz unter solchen Ionen ausgewählt wird, die als ausge-ven Fraktionen und perkoliert die vereinigten aktiven Fraktio- tauschte Ionen geeignet und gegenwärtig bekannt sind, bei-nen aus dem Eluat der Kationen-Austauschersäule durch eine spielsweise Natrium oder Calium. Beispiele für solche Harze Säule, die mit einem Anionen-Austauscherharz gefüllt ist, wel- sind Sulfonsäureharze mit einem Styrol-divinylbenzol-Gerüst, ches quaternäre Ammoniumgruppen an Polystyrol enthält. 35 beispielsweise das «Polystyrol-Sulfonsäureharz Dowex 50x2» Sodann konzentriert man den Ablauf und adsorbiert den kon- (hergestellt durch Dow Chemical Co, Midland, Michigan), wel-zentrierten Ablauf an einer Säule, die mit einem Polymer aus ches Natriumionen aufweist. Andere wichtige Beispiele für Polystyrol und hydrophob vernetztem Divinylbenzol-polymer stark saure Kationen-Austauscherharze sind die folgenden: gefüllt ist. Man eluiert das Polymer mit Wasser oder einem «Dowex 50x4», «Dowex 50x8» (hergestellt durch Dow Phosphatpuffer, sammelt die Eluate und vereinigt die aktiven 40 Chemical Co, Midland, Michigan), «Amberlite IR120» (herge-Fraktionen und wiederholt im Falle der Verwendung eines stellt durch Rohm & Haas Co, Philadelphia, Pennsylvanien), Phosphatpuffers den letzten Schritt der Absorption und Eluie- «Duolite C25D» (hergestellt durch Chemical Process Co, Red-rung aus dem Divinylbenzol-Polymer unter Verwendung von wood City, Kalifornien), «Permutit Q» (hergestellt durch PerWasser als Eluierungsmittel. mutit Co, Birmingham, New Jersey), Ionac C-249 (hergestellt

Lösungen, welche das Antibioticum Thienamycin sowie 45 durch Ionac Chemical Co, Birmingham, New Jersey) und anorganische Ionen enthält, beispielsweise Puffersalze, können «Amberlite 200».

an einer Säule, die mit dem Polystyrolharz «XAD-2» gefüllt ist, Das gebundene Antibiotikum kann man aus dem Kationenadsorbiert werden, und man eluiert gewöhnlich mit Wasser, um Austauscherharz leicht mit wässrigen Lösungen organischer Thienamycin frei von anorganischen Ionen zu erhalten. (Das Basen wie Pyridin, a-, ß- oder y-Picolin, 2,3-, 2,4- oder 2,6-Lutidin, Polystyrolharz «XAD-2» wird von Rohm und Haas bezogen so 2,4,6-Collidin sowie Alkylaminen eluieren, worin die Alkylgrup-und es ist ein Polymer aus Polystyrol und hydrophob vernetz- pen 2 bis 10 C-Atome enthalten, vorzugsweise 2 bis 6 C-Atome, tem Divinylbenzol-Polymer.) Die bevorzugte Base zur Eluierung des Kationen-Austauscher-Eine weitere bevorzugte Aufeinanderfolge von Schritten harzes ist Pyridin. Das so erhaltene Eluat kann weiter gereinigt zur Gewinnung des Antibioticums Thienamycin aus Gärbrühen werden, falls dies erwünscht ist, und zwar durch andere Reini-oder Lösungen, welche dieses Antibioticum enthalten, besteht ss gungsvorgänge. Diese weitere Reinigung kann beispielsweise darin, dass man eine Gärbrühe oder eine Lösung, die dieses durch eine Chromatographie an einem Anionen-Austauscher-Antibioticum enthalten, durch eine Säule leitet, die mit einem harz geschehen, welches ein Trimethylammoniumpolystyrol ist Kationen-Austauscherharz gefüllt ist, welches Sulfonsäure- und worin das negative Gegenion ein geeignetes, heute Austauschergruppen aufweist. Dann eluiert man die am Harz bekanntes Gegenion ist, beispielsweise Chlorid oder Acetat. gebundene Substanz mit einer Base, sammelt die Eluate und 60 Das so erhaltene Eluat kann weiter gereinigt werden, beispielsvereinigt die aktiven Fraktionen. Die vereinigten Fraktionen, weise durch Chromatographie bei konstantem pH-Wert mit die aus der Kationen-Austauschersäule eluiert wurden, perko- einem flüchtigen oder nicht flüchtigen Puffer an einem Katio-liert man dann durch eine Säule, die mit einem Anionen-Austau- nen-Austauscherharz von der Art des Polystyrol-sulfonat. scherharz gefüllt ist, welches quaternäre Ammoniumgruppen Die verwendbaren Puffer sind solche, die das pH im an Polystyrol aufweist. Man sammelt den Ablauf, leitet ihn 65 Bereich von 6 bis 8 aufrechterhalten. Geeignete nicht flüchtige durch eine Säule, die mit einem Kationen-Austauscherharz Puffer werden aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanmaleat, gefüllt ist, welches an aromatische Kerne gebundene Sulfon- Cacodylsäure, KH2PO4 oder NaH2PC>4 hergestellt. Der bevor-säure-Austauschergruppen aufweist. Man eluiert die an Harz zugte nicht flüchtige Puffer ist NaHîPCk Geeignete flüchtige gebundene Substanz mit einem Puffer oder Wasser, vereinigt Puffer können aus N-äthylmorpholin, a-, ß- oder y-Picolin oder

2,3-, 2,4- oder 2,6-Lutidin hergestellt werden. Der bevorzugte flüchtige Puffer ist 2,6-Lutidin.

, Das aus der Kationen-Austauscherharz-Chromatographie erhaltene Eluat wird einer Gelfiltration unterworfen, nämlich an einem Polyacrylamidgel oder einem Dextrangel. Im allgemeinen gestattet ein Gel mit einer Teilchengrösse von 0,149 bis 0,297 mm die Fraktionierung und Entsalzung von Substanzen mit Molekulargewichten von 200 bis 2000. Es können aber auch Gele mit einer Teilchengrösse von 0,037 bis 0,297 mm verwendet werden, wobei die angewendete Teilchengrösse von der Grösse der verwendeten Säule abhängt. Beispiele geeigneter Gele sind Dextran, welches mit Epichlorhydrin vernetzt ist und in Form von Kügelchen als «Sephadex G-10» von der Pharmacia Company in Schweden erhältlich ist, und welches Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb 700 nicht zurückhält, sowie Polyacrylamid, das mit Methylen-bis-acrylamid vernetzt ist und in Form von Kügelchen als «Bio-Gel P-2» von den Bio Rad Laboratorien, Richmond, Kalifornien erhältlich ist und Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb 1800 nicht zurückhält. Der pH-Wert der Antibioticum-Lösung, die zu reinigen ist, wird vorzugsweise etwa auf den Neutralpunkt eingestellt, und die Lösung wird mit dem Gel in Berührung und ins Gleichgewicht gebracht. Das Antibioticum wird dann mittels Wasser oder einem anderen geeigneten Eluierungsmittel, nämlich einer wässrigen Lösung eines niederen Alkohols, vom Gel abgetrennt. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und diejenigen Fraktionen, die die höchste Aktivität gemäss einer biologischen Untersuchung aufweisen, werden kombiniert.

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Thienamycin besteht darin, dass man eine Lösung des Antibioticums, beispielsweise eine filtrierte Gärbrühe,

deren pH auf einen Wert zwischen 3 und 5 eingestellt wurde, durch eine Säule leitet, die ein starkes Kationen-Austauscherharz mit Sulfonatgruppen im Natriumcyclus enthält («Dowex 50x2»). Das adsorbierte Produkt wird dann mit einem geeigneten Eluierungsmittel wie 2%igem wässrigem Pyridin eluiert. Die Eluate werden als Fraktionen gesammelt, deren Grösse von der Grösse der verwendeten Kolonne abhängt. Eine weitere Reinigung kann durch die folgende Aufeinanderfolge von Verfahrensschritten erreicht werden: Chromatographie an einem Anionen-Austauscherharz Typ Polystyroltrimethylammonium (beispielsweise «Dowex-1 x2» im Chlorid- oder Acetatcyclus); Chromatographie an einem Kationen-Austauscherharz Typ Polystyrol-sulfonat (beispielsweise «Dowex-50» im Cyclus 2,6-Lutidinium), wobei man die Säule mit einem 2,6-Lutidin-ace-tat-puffer bei einem pH von 6,3 eluiert; Gelfiltration durch Gel-Permeationsharze (beispielsweise «Bio-Gel P-2», ein Polyacryl-amidharz) und eine oder mehrere Adsorptionen an und Eluierung aus einem polymeren Absorptionsmittel (beispielsweise «XAD-2», ein Polystyrolharz) unter Verwendung von verdünnten Phosphatpuffern bei einem neutralen pH oder Wasser. Die Bioaktivität der Eluate wird dadurch bestimmt, dass man Staphylococcus aureus ATCC 6538P als Testorganismus für die Eluate verwendet.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren, nach dem das Antibioticum erhalten werden kann. Die Beispiele sind jedoch nur zur Erläuterung gedacht, und dem Fachmann ist klar, dass die vorliegende Erfindung die funktionell äquivalenten Produkte und deren Herstellungsverfahren mit einschliesst. Beliebige Abänderungen der hierin beschriebenen Verfahren, die zu der Bildung eines gleichen Produktes führen, sind daher als analoge und äquivalente Methoden zu betrachten. Die beschriebenen Verfahren können nämlich in grossem Ausmass abgewandelt werden, und diese Abwandlungen und geringe Abweichungen oder Erweiterungen müssen als Massnahmen gelten, die der Fachmann in normaler Weiterentwicklung der Technik ohne weiteres erbringen kann und die daher unter den Schutzbereich dieser Erfindung fallen.

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Untersuchungsmethoden

Die Untersuchung der antibakteriellen Aktivität wird nach dem Scheiben-Diffusionsverfahren folgendermassen durchgeführt, wenn später nichts anderes angegeben ist. Man lässt den Testorganismus, nämlich Staphylococcus aureus ATCC 6538P, in einer Nährbrühe, welche 0,2% Hefeextrakte enthält, über Nacht wachsen und verdünnt dann die Kultur mit Nährbrühe, die 0,2% Hefeextrakt enthält, auf eine Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit von 55% bei einer Wellenlänge von 660 mn,. Diese Suspension wird zu einem Difco-Nähragar bei 47 bis 48 °C gegeben, welcher zusätzlich 2,0 g/1 Difco-Hefeextrakt enthält, derart, dass man eine Mischung erhält, welche 33,2 ml der Suspension pro Literagar enthält. Aliquote Teile von jeweils 5 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, diese Platten gekühlt und vor ihrer Verwendung mindestens 5 Tage lang bei 4 °C gehalten.

Proben des zu bestimmenden Antibioticums werden mit einem Phosphatpuffer bei pH 7 auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,25 cm werden in die Untersuchungslösung getaucht und auf die Oberfläche der Testplatte gelegt; normalerweise bringt man zwei Scheiben mit der Probe auf eine Platte, wo sie sich über einem Durchmesser gegenüberstehen. Die Platten werden dann über Nacht bei 37 °C inkubiert, und die Inhibitionszone wird mit ihrem Durchmesser in mm gemessen. Die in Millimeter Durchmesser gemessene Inhibitionszone bestimmt die relativen Aktivitäten, oder, wenn man sie mit einem gereinigten Bezugsnormal wie Cephalothin vergleicht, die absolute Aktivität des Antibioticums in Einheiten/ml. Die Aktivitätseinheit der Beispiele 4 bis 7 bezieht sich auf Cephalothin-Normallösungen mit einem Gehalt von 8,4,2 und 1 ng/ml. Eine Einheit wird definiert als die Menge, welche nach Berechnung die gleiche Inhibierung wie 1 |ig Cephalothin/ml ergibt, wobei die Inhibierungs-zone einen Wert von 16 bis 21 mm im Durchmesser aufweist.

Beispiel 1

Ein Röhrchen mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Röhrchen suspendiert, welches 0,7 ml einer sterilen Davis-Salzlösung mit der folgenden Zusammensetzung aufweist:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

KzHPO« 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

(NH4)zS04 1,0 g

MgS04.7H2O 0,1g destilliertes Wasser 1000 ml

Ein Anteil von 0,2 ml dieser Suspension wird dazu verwendet, um eine Schrägkultur von Medium A (plus Agar) mit der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren:

Medium A

Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g

Glucose 10,0g Phosphatpuffer** 2,0 ml MgSÛ4.7H2O 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml pH: wird auf 6,5 unter Verwendung von NaOH eingestellt * Ardamine: Yeast Products Corporation

** Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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6

Zur Schrägkultur werden 25,0 g/1 Agar gegeben.

Die inokulierte Schrägkultur wird 8 Tage lang bei 28 °C inkubiert und dann bei 4 °C gelagert.

Ein Anteil der Sporen und des Luftmycels dieser Schrägkultur wird dazu verwendet, um einen mit Wattebausch verschlossenen Kultur-Ërlenmeyerkolben von 250 ml, welcher 50 ml an Medium A (ohne Agar) enthält, zu inokulieren. Dieser Kulturkolben wird auf einer Schüttelmaschine mit einer Exzentrizität von 5 cm bei 220 U/min zwei Tage lang bei 28 °C geschüttelt, und danach ist das Wachstum befriedigend.

15 Erlenmeyerkolben von je 250 ml, die jeweils 40 ml Medium B enthalten, werden mit jeweils 1 ml der Kultur aus dem Kulturkolben inokuliert. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B

Maismehl 20,0 g lösliche Destillatrückstände 10,0 g

Sojabohnenmehl 15,0 g

Natriumeitrat 4,0 g

CaCh. 2H2O 0,5 g

MgSCk 7H2O 0,1g

C0CI2.16H2O 0,01 g

FeSC>4.7H2O 0,01g

»Polyglycol 2000 0,25Vol.-%

destilliertes Wasser 1000 ml

Das pH wird mittels NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Polyglycol 2000: Dow Chemical Co.

Diese 15 Produktionskolben werden auf der oben beschriebenen Schüttelmaschine bei 220 U/min bis zu 3 Tagen bei 28 °C geschüttelt, wobei während der Fermentation Proben entnommen und untersucht werden. Die Bestimmungen werden unter Verwendung der zentrifugierten Proben ausgeführt. Vor der Untersuchung wird das pH der Brühe so eingestellt, wie in der folgenden Tabelle angegeben ist:

Gärzeit (Stunden) 48 53 72

Aktivität gegen ATCC6538P 34/40 h 35/41 h 34

(Zonendurchmesser, mm)

Anfangs-pH 6,3 5,9 5,0

eingestelltes pH - 6,8 6,2

h = trübe

Nach einer Gärzeit von 53 Stunden werden die Brühen aus 13 Kolben miteinander vereinigt. Ein aliquoter Teil wird zentri-fugiert und biologisch untersucht. Die übrige Brühe wird filtriert, auf pH 7 eingestellt, und 500 ml werden gefriergetrocknet, wobei man 10,7 g Feststoffe ërhâlt. 1,5 g von diesen Feststoffen wird in 25 ml eines Gemisches aus ein Teil n-Butylalko-hol und 99 Teilen Wasser aufgenommen. Das pH der Lösung beträgt 7,0. Diese Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 5x 118 cm gegeben, welche mit Bio-Gel P-2 (Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm) gefüllt ist und die vorher mit dem n-Butylalkohol-Wasser-Gemisch ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird mit der gleichen Lösung bei 10 ml/min entwickelt, wobei man einen Vorlauf von 650 ml und danach 75 Fraktionen von jeweils 20 ml auffängt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differential-Refraktometer Mecco-matic ständig untersucht. Jede Fraktion wird auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Man findet Thienamycin in den Fraktionen 34 bis 40 mit einer Höchstmenge in der Fraktion 37. Zehn ml der Fraktion 37 werden gefriergetrocknet, wobei man 2,0 mg an Feststoffen enthält. Diese nimmt man in 5 ml Wasser zwecks Untersuchung auf. Die Untersuchungsplatten werden über Nacht bei 28 °C inkubiert. Die Resultate, die man erhält, sind die folgenden:

Konzentration

Zonendurchmesser in mm

gemessen gegen Staph. Aureus

ATCC6538P

80 Jig/ml

30 mm

40 (ig/ml

25 mm

20 ng/ml

21 mm

10 ng/ml

17 mm

Beispiel 2

Ein Röhrchen mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml steriler Davis-Salzlösung mit der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

K2HPO4 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

(NH4)2S04 1,0 g

MgSOt. 7H2O 0,1 g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird dazu verwendet, um 4 Schrägkulturen von Medium A (plus Agar) mit der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren:

Medium A

Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g

Glucose 10,0g **Phosphatpuffer 2,0 ml MgSOt. 7H2O 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml

Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Ardamine: Yeast Products Corporation

* Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

NaîHP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Den Schrägkulturen wird 25,0 g/1 Agar zugesetzt.

Die inokulierten Schrägkulturen werden eine Woche lang bei 28 °C inkubiert und dann bei 4 °C aufbewahrt.

Ein Teil der Sporen und des Luftmycels aus einer der Schrägkulturen wird zur Inokulierung eines mit Wattebausch verschlossenen Erlenmeyer-Kulturkolbens mit einem Inhalt von 250 ml verwendet, welcher 50 ml Medium A enthält. Dieser Kulturkolben wird bei 28 °C zwei Tage lang auf einer Schüttelmaschine mit einer Exzentrizität von 5 cm bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 220 U/min geschüttelt, wonach das Wachstum befriedigend erscheint.

15 Erlenmeyer-Kolben von 250 ml, die jeweils 40 ml Medium B enthalten, werden mit 1 ml pro Kolben der Kultur aus dem Kulturkolben inokuliert. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B

Maismehl 20,0 g lösliche Destillatrückstände 10,0 g

Soj abohnenmehl 15,0 g

Natriumeitrat . 4,0 g

CaCh. 2H2O 0,5 g

MgS04.7H2O 0,1 g

C0CI2.6H2O 0,01g

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

628680

FeSO-t. 7H2O *Polyglycol 2000 destilliertes Wasser

0,01g 0,25 Vol.-% 1000 ml

Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Polyglycol 2000: Dow Chemical Co.

Diese Kolben werden mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 220 U/min bei 28 °C bis zu drei Tagen lang auf der oben beschriebenen Schüttelmaschine geschüttelt. Während der Gärung werden Proben entnommen und biologisch untersucht. Als Untersuchungsflüssigkeit wird die überstehende Flüssigkeit einer zentrifugierten Probe verwendet. Als Resultate erhält man die folgenden:

werden zusammengegeben. Eine Probe von 1 ml der vereinigten Fraktionen wird zur erneuten Untersuchung entnommen und der Rest gefriergetrocknet, wobei man 4,2 mg teilweise gereinigtes Antibioticum erhält.

5

Beispiel 3

Ein Röhrchen mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml einer sterilen Davis-Salz-Lösung der folgenden Zusam-10 mensetzung suspendiert:

Gärzeit (Stunden)

48

53

72

pH

6,7

6,4

5,5

Aktivität gegen ATCC 6538P

38

40

38 mm

Davis-Salze Natriumeitrat K2HPO4 15 KH2PO4 (NH4)2SO MgS04.7H2O destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml

Nach einer Gärzeit von 53 Stunden schüttet man die Brühen aus 13 Kolben zusammen und filtriert. Das pH von 400 ml des Filtrâtes wird mit verdünnter HCl auf 4,8 eingestellt, und diese Lösung wird an 140 ml Dowex 50x2 Na+ mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min chromatographiert. Das Harz wird dann mit 200 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit einer 2%igen wässrigen Pyridinlösung eluiert, und man sammelt 6 Fraktionen von jeweils 70 ml. Das pH dieser Fraktionen wird auf 7,0 eingestellt.

Sämtliche Fraktionen werden biologisch untersucht, und die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Filtrierte Nährbrühe

Verdünnung

Zonendurchmesser

1:4

33 mm

1:8

30 mm

1:16

27 mm

1:32

24 mm

Eluatfraktionen

Verdünnung

Zonendurchmesser

1:51

22,5 mm

1:5 2

36 mm

1:5 3

20 mm

1:5 4,5 und 6

0 mm

Diese Untersuchungen zeigen an, dass 45% der Aktivität in den Eluaten wiedergefunden wird. Die Eluatfraktion Nr. 2 wird gefriergetrocknet, wobei man 117 mg Feststoffe enthält.

Diese 117 mg an Feststoffen löst man in 1,5 ml eines Gemisches aus 1 Teil n-Butylalkohol und 99 Teilen Wasser auf. Diese Lösung wird auf eine Schicht von Bio-Gel P-2 mit den Abmessungen 1,4x81,5 cm gebracht, welche zuvor mit der Mischung aus n-Butanol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird nun mit der Lösung von n-Butylalkohol in Wasser mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min entwickelt, wobei man Fraktionen von 2 ml auffängt. Der Ablauf wird ständig mit einem registrierenden Refraktometer Meccomatic gemessen. Die Fraktionen werden bei einer Verdünnung von 1:20 auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Eine Bioaktivität von Thienamycin wird bei den Fraktionen 44 bis 53 beobachtet. Die Fraktionen 46 bis 49 und die Hälfte der Fraktion 50

20 Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen des Medium A (plus Agar) mit der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A

25 Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g

Glucose 10,0g

*Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04.7H2O 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml

30

Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Ardamine: Yeast Products Corporation

*Phosphatpufferlösung

35KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Den Schrägkulturen wird 25,0 g/1 Agar zugesetzt. 40 Die inokulierten Schrägkulturen werden eine Woche lang bei 28 °C inkubiert und bei 4 °C aufbewahrt. Ein Anteil der Sporen und des Luftmycels aus einer der Schrägkulturen wird zur Inokulierung von drei mit Wattebausch verschlossenen Erlen-meyer-Kulturkolben von 250 ml verwendet, deren jeder 50 ml 45 Medium A enthält. Diese Kulturkolben schüttelt man einen Tag lang bei 28 °C auf einer Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 U/min und einer Exzentrizität von 5 cm,

wonach das Kulturwachstum befriedigend erscheint.

12 Erlenmeyer-Kolben von je 2000 ml, deren jeder 250 ml 50 Medium C enthält, werden mit jeweils 7 ml der Suspension inokuliert, welche man durch die aseptische Vereinigung der Inhalte der drei Kulturkolben erhält. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

55 Medium C Maismehl lösliche Destillierrückstände Sojabohnenmehl CaCk 2H2O 60 MgS04.7H2O C0CI2.6H2O FeS04.7H20 CaCÛ3

Polyglycol 2000 65 destilliertes Wasser

20,0 g 10,0 g 15,0 g 0,5 g 0,1g 0,01g 0,01g 4,0 g

0,25 Vol.-% 10000 ml

Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

Diese Kolben schüttelt man 72 Stunden lang bei 28 °C auf

628680

8

der oben beschriebenen Schüttelmaschinf; unter den gleichen Bedingungen. Dann vereinigt man die Gärbrühen und zentrifu-giert eine aliquote Probe zwecks Untersuchung. Die geerntete Brühe hat ein pH von 7,4, und die antibakterielle Aktivität,

welche durch Untersuchung der überstehenden Flüssigkeit der zentrifugierten Gärbrühe bestimmt wird, beträgt 43 mm (Zonendurchmesser).

Die Gärbrühe wird filtriert und das pH des Filtrats mit verdünnter HCl auf 4,0 eingestellt. 3000 ml des Filtrats wird mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min an 300 ml Dowex 50 x 2 "> Na+ adsorbiert. Das Harz wird dann mit 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit einer 2%igen wässrigen Pyridinlö-sung eluiert, und man sammelt 8 Fraktionen von jeweils 150 ml. Das pH der Fraktionen wird auf 7,0 eingestellt. Die Eluatfrak-tionen Nr. 2 und Nr. 3, zusammen 300 ml, werden vereinigt und is enthalten 48% des gesamten bioaktiven Materials, welches man auf die Dowex 50x2 Na+-Säule gebracht hatte.

280 ml der vereinigten Fraktionen des Eluats der Dowex 50x2 Na+-Säule mit einem pH von 7,0, wie sie oben erhalten wurden, werden durch eine 40 ml fassende Säule aus Dowex 20 1 x2 Cl~ perkoliert. Das Harz wird dann mit 160 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Die Fraktionen des Ablaufs und das Waschwasser werden vereinigt, und man erhält 440 ml Lösung. Diese Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf ein pH von 8,2 eingestellt, unter vermindertem Druck auf 300 ml eingeengt, 25 auf pH 7,0 mit verdünnter Salzsäure eingestellt und gefriergetrocknet, wobei man 189 mg Feststoffe erhält.

Die gefriergetrockneten Feststoffe, 189 mg, die man erhalten hat, löst man n einem Gemisch aus 1 Teil n-Butylalkohol und 99 Teilen Wasser. Die Lösung, welche 25 ml ausmacht,

wird auf eine Säule mit «Bio-Gel P-2» (Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm) mit den Abmessungen 5 x 108 cm gebracht, welche zuvor mit der erwähnten Mischung aus n-Butylalkohol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird dann mit der n-Butylalkohol-Wasser-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 6,7 ml/min entwickelt. Der Ablauf wird ständig mit einem registrierenden Differential-Refraktometer Mecco-matic überwacht. Man nimmt einen Vorlauf von 500 ml und dann Fraktionen von jeweils 20 ml ab. Jede Fraktion wird bei einer Verdünnung von 1:25 auf antibakterielle Aktivität untersucht. Die Bioaktivität findet man in den Fraktionen 37 bis 42, wobei die Fraktion 39 die Höchstmenge enthält. Die Fraktionen 38 bis 41 vereinigt man, und man erhält ein Gesamtvolumen von 80 ml. Diese Lösung wird bei pH 7,0 auf 10 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Feststoffe, nämlich 13,5 mg, haben eine relative Aktivität, die etwa sechsmal grösser als diejenige der Probe ist, die man auf die «Bio-Gel P-2»-Säule gebracht hatte, gemäss Vergleich der Scheibendiffusionsuntersuchungen mit Staphylococcus aureus.

Medium A

Hef eautolysat (Ardamine*) 10,0 g

Glucose 10,0g **Phosphatpuffer 2,0 g MgSÛ4.7H2O 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml

Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt. * Ardamine: Yeast Products Corporation

** Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HPÛ4 95,0 g destilliertes W asser 1000 ml

30

35

40

45

Den Schrägbodenkulturen wird 25,0 g/1 Agar zugesetzt.

Die inokulierten Schrägkulturen inkubiert man eine Woche lang bei 28 °C und bewahrt sie dann bei 4 °C auf.

10 ml an Medium A wird aseptisch einer dieser Schrägbodenkulturen zugegeben, die Sporen und das Luftmycel abgekratzt und in Suspension gebracht, und man verwendet 3,3 ml dieser Suspension zur Inokulierung eines mit Wattebausch verschlossenen Erlenmeyer-Kulturkolbens mit einem Inhalt von 2 Liter, welcher 500 ml Medium A enthält. Dieser Kulturkolben wird bei 28 °C 48 Stunden lang auf einer Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 160 U/min und einer Exzentrizität von 5 cm geschüttelt, und danach erscheint das Wachstum ausreichend.

Die Kultur aus diesem Kulturkolben wird zur Inokulierung eines 190 Liter fassenden Kulturbehälters aus rostfreiem Stahl verwendet, der 160 Liter Medium A enthält. Dieser Tank wird bei 28 °C bebrütet, wobei mit 150 U/min gerührt wird und man 24 Stunden lang 54 Liter Luft pro Minute durchleitet. Soweit nötig, wird als Entschäumungsmittel «Polyglycol 2000» (Dow Chemical Corp.) zugesetzt, wobei die zugegebene Menge jedoch 0,1% nicht überschreitet. Das pH ändert sich im Verlaufe der Fermentation folgendermassen:

Gärdauer, Stunden pH

0 12 24 6,4 6,4 6,3

50

Beispiel 4

Ein Röhrchen mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml einer sterilen Davis-Salz-Lösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

55

43 Liter der Kultur in diesem Gärtank wird dazu verwendet, um einen Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl, welcher 756 Liter fasst und 467 Liter Medium E enthält, zu inokulieren, wobei Medium E die folgende Zusammensetzung hat:

Medium E

Cerelose 25,0 g

Maiseinweichwasser 15,0g lösliche Destillationsrückstände 10,0 g

Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) 5,0 g

C0CI2.6H2O 0,01g

CaCOî (nach Einstellung des pH) 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25%

Leitungswasser 1000 ml

Davis-Salze

Natriumeitrat

K2HPO4

KH2PO4

(NHO2SO4

MgSÛ4.7H2O

destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml

Das pH wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Dieser Gärtank wird 120 Stunden lang bei 24 °C betrieben, wobei man mit 95 U/min rührt und Luft mit einer Menge von > 280 Liter/min einleitet. Soweit notwendig, wird zusätzliches Entschäumungsmittel, nämlich Polyglycol 2000, zugegeben, dessen Menge jedoch 0,1% nicht übersteigt. Es werden anti-bakterielle Untersuchungen vorgenommen, und die Ergebnisse sind die folgenden:

Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägbodenkulturen von Medium A (plus Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

9

628680

welche 27 ml ausmacht, wird auf eine Säule aus «Bio-Gel P-2» gebracht, Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm, Abmessungen 5x 108 cm, welche zuvor mit Hilfe des beschriebenen 0,1M-Puf-fers ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird s dann mit dem gleichen Puffer und einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird ständig mit einem registrierenden Diffe-rential-Refraktometer Mecco-matic überwacht. Man setzt die Entwicklung fort, bis man 105 Fraktionen von jeweils 20 ml io erhalten hat. Jede Fraktion der Nr. 51 bis 90 wird mit einer Verdünnung von 1:50 biologisch untersucht. Diese Untersuchungen zeigen einen Anstieg der Bio-Aktivität in den Fraktionen 67 bis 75, und der Höchstwert liegt in den Fraktionen 70 und 71. Die Fraktionen 68 bis 75 vereinigt man, wobei man ein Volu-15 men von 162 ml erhält. Zu 145 ml dieser kombinierten Fraktionen gibt man 3 ml eines 360-mM-Natriumphosphat-Puffers vom pH 7,0, und man konzentriert die Lösung auf 9 ml. Das Konzentrat, welches 78% des gesamten bioaktiven Materials enthält, welches man auf die «Bio-Gel P-2»-Säule gegeben hatte, wird 20 gefriergetrocknet, und man erhält 185 mg. Die übrigen 17 ml der Fraktionen 68 bis 75 werden gefriergetrocknet und ergeben 1,9 mg von Feststoffen, welche eine biologische Aktivität einer Geschwindigkeit von 4 Liter/min chromatographiert. Das von 1050 Einheiten/mg aufweist.

Harz wird dann mit 401 entionisiertem Wasser gewaschen. Es wird dann mit einer 2%igen wässrigen Pyridinlösung eluiert, 25 Beispiel 5

und man sammelt drei Fraktionen von je 191 und untersucht Ei" Röhrchen mit einer gefriergetrockneten Kultur von sie. Die antibakterielle Untersuchung zeigt, dass die Eluatfrak- Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in tionen 2 und 3 22% der ursprünglichen Aktivität enthalten. °>8 ml einer sterilen Davis-Salz-Lösung der folgenden Zusam-

Diese Fraktionen werden vereinigt, auf 3,81 eingeengt und das mensetzung suspendiert:

pH des Konzentrats auf 7 eingestellt. 30

Dieses Konzentrat von 3,8 Litern, was man erhalten hat, Davis-Salze wird an 2,5 Litern Dowex 1x2, Teilchengrösse 0,149 bis 0,297 Natriumeitrat 0,5 g mm, welches in Chloridform vorliegt, mit einer Geschwindig- K2HPO4 7,0 g keit von 200 ml/min chromatographiert. Das Harz wird mit KH2PO4 3,0 g entionisiertem Wasser und der gleichen Geschwindigkeit 35 (NH4>2S04 1,0 g eluiert. Man sammelt 10 Fraktionen von jeweils einem Liter MgStX 7H2O 0,1 g und stellt das pH jeder Fraktion, soweit nötig, auf 7,0 ein. Die destilliertes Wasser 1000 ml Untersuchungen zeigen, dass 75% der Bio-Aktivität in den

Fraktionen 5 bis 8 vorliegt. Diese Fraktionen vereinigt man und Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägbo-filtriert sie durch ein 0,45-Mikron-Milliporfilter. Ein Anteil von 40 denkulturen an Medium A (plus Agar) mit der folgenden drei Litern dieses Filtrats wird gefriergetrocknet, und man Zusammensetzung verwendet:

erhält 16,6 g an Feststoffen mit einer Aktivität von 70 Einheiten/mg. Medium A

4 g der gefriergetrockneten Feststoffe, die man wie oben Hefeautolysat (Ardamine*)

beschrieben erhalten hat, werden in 50 ml eines 0,1 M 2,6-Luti- 45 Glucose din-Acetat-Puffers mit einem pH von 6,3 aufgenommen. Die **Phosphatpuffer Lösung wird durch Zugabe von Essigsäure auf ein pH von 6,3 MgSCk 7H2O gebracht und dann über eine Säule mit einem Austauscherharz destilliertes Wasser Dowex 50x8 geleitet, die man folgendermassen hergestellt hat:

2,5 Liter des Harzes Dowex 50x 8, Teilchengrösse 0,037 bis 50 Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

0,074 mm, Wasserstofform, werden in die 2,6-Lutidin-Form * Ardamine: Yeast Products Corporation

überführt. Dazu wird das Harz mit dem 5fachen des Säulenvolumens an 0,1 M 2,6-Lutidin-Acetat-Puffer von 6,3 ins Gleichge- **Phosphatpufferlösung wicht gebracht. Die Abmessungen des ins Gleichgewicht KH2PO4

gebrachten Harzbettes betragen 5x114 cm. Die Kolonne wird 55 Na2HP04 mit dem 0,1 M-Puffer bei 14 ml/min entwickelt. , destilliertes Wasser

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differential-Refraktometer Mecco-matic ständig gemessen. Die Entwick- Den Schrägbodenkulturen wird 25,0 g/1 Agar zugegeben,

lung wird fortgesetzt, bis man 220 Fraktionen von jeweils 20 ml Die inokulierten Schrägbodenkulturen werden eine Woche erhalten hat. Jede zweite Fraktion der Nr. 44 bis 142 wird bei 60 lang bei 28 °C inkubiert und dann bei 4 °C aufbewahrt.

einer Verdünnung von 1:50 biologisch untersucht. Die Bio-Akti- 10 ml Medium A bringt man aseptisch auf eine der Schräg-vität wird in den Fraktionen 78 bis 136 beobachtet, wobei die bodenkulturen, schabt die Sporen und das Luftmycel in Suspen-Höchstmenge in den Fraktionen 92 bis 94 gefunden wird. Man sion und verwendet 3,3 ml dieser Suspension zur Animpfung vereinigt die Fraktionen 82 bis 116 und erhält dabei 700 ml eine" mit Wattebausch verschlossenen Erlenmeyer-Kolbens einer Lösung. Diese Lösung wird in zwei Teile von jeweils 350 65 mit einem Inhalt von 21, der 500 ml Medium A enthält. Dieser ml aufgeteilt und diese werden gefriergetrocknet. Kulturkolben wird 48 Stunden lang bei 28 °C und einer Umdre-

Ein Teil der gefriergetrockneten Feststoffe wird in einem hungsgeschwindigkeit von 160 U/min auf einer Schüttelma-0,1 M-2,6-Lutidin-Acetat-Puffer von pH 7,0 gelöst. Diese Lösung schine mit einer Exzentrizität von 5 cm geschüttelt.

Gärdauer pH

Antibiotische

Dextrose

Aktivität gegen mg/ml

ATCC 6538P (mm)

0

6,8

_

22

12

6,6

-

21,3

24

6,2

-

16,5

36

5,8

25

12,1

48

5,7

25

7,8

60

5,8

21,5

4,3

72

6,1

25

2,5

84

6,6

33

1,6

96

6,7

41,5

1,0

108

6,5

45

1,0

120

6,5

45

0,5

400 Liter der Gärbrühe werden auf einer Filterpresse filtriert, wobei man Filterhilfsmittel verwendet. Zum Filtrat gibt man 1,2 G (Äthylendinitrilo>tetraessigsäure, Natriumsalz. Das Filtrat wird auf 6 °C gekühlt, sein pH auf 4,0 ± 0,2 eingestellt und das ganze bei 6 °C gehalten. Das kalte Filtrat wird an 38 Liter Dowex 50x4 Na+,Teilchengrösse 0,297 bis 0,84 mm, mit

10,0 g 10,0 g 2,0 ml 0,05 g 1000 ml

91,0 g 95,0 g 1000 ml

628680

10

Das Wachstum aus diesem Kulturkolben wird zur Inokulierung von 160 Liter Medium A verwendet, welches sich in einem 190 Liter fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl befindet. Die Gärung wird 24 Stunden bei 28 °C, einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Luftdurchleitung von 541/min ausgeführt. Wenn nötig, setzt man als Entschäumungsmittel «Polyglycol 2000» (Dow Chemical Corp.), jedoch in Mengen, die 0,1% nicht überschreiten. Die Änderung des pH-Wertes war die folgende:

Gärzeit, Stunden 0 12 24

pH 6,3 6,6 5,6

35 Liter des Inhalts dieses Gärtanks wird zur Inokulierung von 467 Litern an Medium E verwendet, welches sich in einem 756 Liter fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl befindet, und Medium E hat folgende Zusammensetzung:

Medium E

Cerelose 25,0 g

Maiseinweichwasser 15,0g löstliche Destillatrückstände 10,0 g

Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) 5,0 g

C0CI2.6H2O 0,01g

CaCCh (nach pH-Einstellung) 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25%

Leitungswasser 1000 ml

Das pH wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Dieser Tank wird 120 Stunden lang bei 24 °C mit einer Rührgeschwindigkeit von 95 U/min betrieben, wobei man pro Minute 280 Liter Luft durchleitet. Soweit nötig wird als Entschäumungsmittel «Polyglycol 2000» zugegeben, jedoch nicht mehr als 0,1%. Es werden antibakterielle Untersuchungen vorgenommen, und die gefundenen Werte sind die folgenden):

Gärzeit pH

Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P

0

6,9

12

6,8

-

24

6,3

-

36

6,4

26

48

6,3

32

60

6,4

25

72

6,8

25

84

7,0

25

96

7,1

37

108

7,2

41,5

120

7,1

44,5

400 Liter der gesamten Gärbrühe werden an einer Filterpresse unter Zusatz von 4% (Gewicht/Volumen) eines Filterhilfsmittels filtriert. Zum Filtrat gibt man 1,2 G des Natriumsalzes der Äthylendinitrilo-tetraessigsäure. Das Filtrat wird auf 6 °C abgekühlt, sein pH auf 4,0 ± 0,2 eingestellt und die Lösung bei 6 °C gehalten. Das kalte Filtrat wird an 38 Litern Dowex «50x4 Na+», Teilchengrösse 0,297 bis 0,84 mm, mit einer Geschwindigkeit von 41/min chromatographiert. Das beladene Harz wird mit einer 2%igen wässrigen Pyridinlösung eluiert, und man gewinnt drei Fraktionen von jeweils 19 Liter, welche man auf biologische Aktivität untersucht. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass 27% der ursprünglichen Bioaktivität in den Fraktionen 2 und 3 wiedergefunden werden. Man vereinigt diese Eluatfraktionen 2 und 3, engt auf 3,7 Liter ein und stellt das pH auf 7 ein.

Das pH dieser 3,7 Liter Eluatkonzentrat wird auf 7,4 eingestellt, und man chromatographiert das Konzentrat an 2,5 Litern

«Dowex-2x 2», Chloridform, Teilchengrösse 0,149 bis 0,297 mm, mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min. Das Harz wird dann mit der gleichen Geschwindigkeit mit entionisiertem Wasser eluiert. Man sammelt die folgenden Fraktionen: zwei Fraktionen zu 2 Litern, eine Fraktion zu 800 ml, eine Fraktion zu 4 Litern und eine Fraktion zu 2 Litern. Deren pH wird,

soweit erforderlich, auf einen Wert von 7,0 eingestellt. Die Fraktion 4,4 Liter, welche 50% der im Konzentrat anwesenden Aktivität enthält, wird durch ein Milliporfilter von 0,45 Mikron filtriert. Das klare Filtrat wird auf Böden gefriergetrocknet, und man erhält 12,4 g Feststoffe mit einer biologischen Aktivität von 270 Einheiten/mg.

4 g des gefriergetrockneten Produktes nimmt man in 0,1 M 2,6-Lutidin-Acetatpuffer,pH 6,3, auf. Diese Lösung, nämlich 50 ml, bringt man durch Zugabe von Essigsäure auf ein pH von 6,3 und chromatographiert an einer Säule mit Dowex 50x8, das in der 2,6-Lutidin-Form vorliegt, eine Teilchengrösse von 0,037 bis 0,074 mm aufweist und die Abmessungen 5x 114 cm hat. Diese Säule ist zuvor mit dem erwähnten 0,1M-Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden. Das Harz wird dann mit dem gleichen 0,1M-Puffer, pH 6,3, mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem schreibenden Differential-Refraktometer Mecco-matic ständig überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis man 150 Fraktionen von jeweils 20 ml erhalten hat. Jede zweite Fraktion der Nummern 72 bis 150 wird bei einer Verdünnung von 1:50 biologisch untersucht. Man findet eine biologische Aktivität in den Fraktionen 76 bis 148, wobei die Fraktionen 92 bis 102 den Höchstgehalt aufweisen. Man vereinigt die Fraktionen 86 bis 113, und man erhält 580 ml einer Lösung, die 71% derjenigen Bioaktivität aufweist, welche man auf die Säule mit Dowex 50x8 gegeben hat. Diese Lösung wird dann gefriergetrocknet.

Das gefriergetrocknete Produkt, was man so erhalten hat, wird in einem 0,1 M-2,6-Lutidin-Acetat-Puffer von pH 7 zu einem Volumen von 25 ml aufgelöst. Diese Lösung bringt man auf eine Schicht von «Bio-Gel P-2» (Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm) mit den Abmessungen von 5x 108 cm, die zuvor mit dem erwähnten 0,1M-Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird dann mit dem gleichen Puffer bei einer Geschwindigkeit von 9 ml/min entwickelt. Der Ablauf wird ständig mit einem registrierenden Differential-Refraktometer Mecco-matic überwacht. Man setzt die Entwicklung fort, bis man 105 Fraktionen von jeweils 20 ml erhalten hat. Jede Fraktion der Nummern 65 bis 80 wird bei einer Verdünnung von 1:200 biologisch untersucht. Die Fraktionen 67 bis 76 weisen eine merkliche Bioaktivität auf. Man vereinigt die Fraktionen 70 bis 72 und erhält nach Gefriertrocknung 16,0 mg einer Substanz mit einer biologischen Aktivität von 13 800 Einheiten/mg. Die Fraktionen 69,73 und 74 werden vereinigt und gefriergetrocknet, und man erhält 20,2 mg mit einer biologischen Aktivität von 5200 Einheiten/mg.

Die zuerst genanruv.« 15 mg an gefriergetrocknetem Produkt werden im 0,lM-2,6-Lutidin-Acetat-Puffer vom pH 7,0 zu einem Volumen von 10 ml gelöst. Die Lösung wird auf eine Schicht von «Bio-Gel P-2» gebracht, Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm, Abmessungen 5 x 108 cm, welche zuvor mit dem erwähnten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird mit dem gleichen Puffer und einer Geschwindigkeit von 9 ml/min entwickelt. Dabei wird der Ablauf ständig mit einem Differential-Refraktometer Mecco-matic überwacht. Man setzt die Entwicklung fort, bis man 105 Fraktionen von jeweils 20 ml erhalten hat. Die Fraktionen mit den Nummern 65 bis 80 werden biologisch bei einer Verdünnung von 1:200 untersucht.

Die Fraktionen 67 bis 75 enthalten wesentliche Mengen an biologisch aktivem Material. Man vereinigt die Fraktionen 68 bis 72 und unterwirft sie einer Gefriertrocknung. Man erhält 9,1 mg mit einer biologischen Aktivität von 15 000 Einheiten /mg.

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Beispiel 6

Ein Röhrchen mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 50 ml an sterilem Medium A suspendiert, das sich in einem 250 ml fassenden, mit Wattebausch verschlossenen Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium A weist die folgende Zusammensetzung auf:

Medium A

H efeautolysat (Ardamine*) 10,0g i

Glucose 10,0g Phosphatpuffer 2,0 ml MgSCk 7H2O 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml

1

Das pH wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

* Ardamine: Yeast Products Corporation

C0CI2.6H2O

CaC03 (nach der pH-Einstellung) Polyglycol 2000 Leitungswasser

0,01g 3,0 g 0,25% 1000 ml

Phosphatpufferlösung

KH2PO4

N32HP04

destilliertes Wasser

91,0 g 95,0 g 1000 ml

Der inokulierte Kolben wird 48 Stunden lang bei 28 °C bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 220 U/min auf einer 25 Schüttelmaschine mit einer Exzentrizität von 5 cm geschüttelt. Man entnimmt dann 40 ml der 48 Stunden lang inkubierten Brühe aseptisch und vermischt diese mit 40 ml einer sterilen Mischung aus 20 Volumenteilen Glycerin und 80 Volumenteilen Wasser. Anteile von jèweils 2 ml dieser Mischung pipettiert 30 man in sterile Ampullen, die für ein Fassungsvermögen von 1,7 g ausgelegt sind, und friert sie ein. Sie werden im Dampfraum eines Gefrierapparates mit flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Der Inhalt der eingefrorenen Ampullen wird dazu verwen- 35 det, um einen Erlenmeyer-Kolben von 250 ml, der 50 ml Medium A enthält und mit einem Wattebausch verschlossen ist, zu inokulieren. Dieser Kulturkolben wird 24 Stunden lang bei 28 °C und mit 160 U/min auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. 40

Proben von jeweils 10 ml dieses Kulturkolbens verwendet man zur Inokulierung von mit Wattebausch verschlossenen, 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben, welche 500 ml Medium A enthalten. Diese Kulturkolben schüttelt man mit 160 U/min 24 Stunden lang bei 28 °C auf der Schüttelmaschine. 45

Ein Liter des vereinigten Inhaltes dieser Kulturkolben wird zur Inokulierung von 467 Litern an Medium A verwendet, welches sich in einem 756 Liter fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl befinden. Man fermentiert 24 Stunden lang bei 28 °C und einer Rührgeschwindigkeit von 130 U/min, wobei man 280 50 Liter Luft pro Minute hindurchleitet. Als Entschäumungsmittel setzt man, soweit nötig, Polyglycol 2000 (Dow Chemical Corp.), jedoch nicht mehr als 0,1%. Man ermittelt laufend das pH und den Dextrosegehalt und findet die folgenden Werte:

55

Das pH wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Dieser Tank wird 144 Stunden lang bei 24 °C, einer Rührgeschwindigkeit von 70 U/min und einem Luftdurchfluss von 1550 1/min betrieben. Nach Bedarf wird als Entschäumungsmittel Polyglycol 2000 zugesetzt, dessen Menge jedoch 0,1% nicht überschreitet. In der überstehenden Flüssigkeit zentrifugierter Proben der Gärbrühe wird die biologische Aktivität laufend bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusam-mengefasst, nämlich unter der Rubrik «antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P». Weitere Untersuchungen werden nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 9,5 mm und Untersuchungsschalen von 10 ml ausgeführt, und die erhaltenen Ergebnisse finden sich in der untenstehenden Tabelle unter der Rubrik «antibiotische Aktivität (10-ml-Schalen)». Diese 10 ml fassenden Untersuchungsschalen werden folgendermassen hergestellt: Eine über Nacht gezüchtete Kultur des Testorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt wird mit Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt auf eine Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 mp, eine Durchlässigkeit von 40% aufweist. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar gegeben, dem man 2,0 g/1 Difco-Hefeextrakt zugegeben hat, und zwar bei 47 bis 48 °C, und man erhält eine Mischung, welche 33,2 ml der Suspension pro Liter Agar enthält. 10 ml dieser Suspension giesst man in Petrischalen mit einem Durchmesser von 85 mm, kühlt diese Schalen und bewahrt sie vor der Verwendung, jedoch höchstens 5 Tage, bei 4 °C auf.

Gärzeit, Stunden

0

12

24

pH

6,4

6,4

6,6

Dextrose, mg/ml

8,1

8,1

8,1

Gär pH

Dextrose

Antibiotische

Antibiotische zeit mg/ml

Aktivität gegen ATCC 6538P (mm)

Aktivität

(10-ml-Schalen)

(mm)

0

6,6

22,2

12

6,3

20,2

24

5,8

18,0

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13,2

21,5

48

6,0

8,6

21,5

60

5,7

6,4

26,5

72

5,8

2,7

25,5

84

6,2

0,3

27,5

96

6,4

0,2

36,0

108

6,4

0

35,0

120

6,3

41,5

37,0

132

5,8

37,5

144

5,9

43,0

37,5

453 Liter der Gärbrühe verwendet man zum Inokulieren von 4082 Litern Medium E, welches sich in einem 5670 Liter fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl befindet, wobei Medium E die folgende Zusammensetzung aufweist:

Medium E

Cerelose 25,0 g

Maiseinweichwasser 15,0g lösliche Destillatrückstände 10,0 g

Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) 5,0 g

60

Man filtriert die erhaltenen 4082 Liter an Gärbrühe mit einer Filterpresse von 76 cm, wobei man 4% (Gew/Vol.) eines Filterhilfsmittels zugibt. Zum Filtrat gibt man 12 g des Natriumsalzes der Äthylendinitrilo-tetraessigsäure. Das Filtrat wird auf 6 °C gekühlt, sein pH auf 4,5 ± 0,2 eingestellt und die Lösung 65 bei 6 °C gehalten. Das kalte Filtrat wird an 480 Litern «Dowex-50x4», Natriumform, Teilchengrösse 0,297 bis 0,84 mm, mit einer Geschwindigkeit von etwa 481/min chromatographiert. Das Harz wird dann mit 4801 entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit einer 2%igen wässrigen Pyridinlösung bei

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einer Geschwindigkeit von 241/min eluiert, und man fängt drei Fraktionen von 3001,5201 und 2401 auf, die bei einem pH von 7,0 untersucht werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Eluatfraktionen 4%, 16% bzw. 6% der biologischen Aktivität aufweisen, welche man auf die Säule mit Dowex 50x4 gebracht hatte. Die Eluatfraktion Nr. 2 wird auf 48 Liter eingeengt und sein pH auf 7 eingestellt.

Diese 48 Liter Konzentrat bringt man auf ein pH von 7,3 und chromatographiert sie an 76 Liter Dowex 1 x 2, Teilchengrösse 0,149 bis 0,297 mm, Chloridform, mit einer Geschwindigkeit von 7,61/min. Das Harz wird mit entionisiertem Wasser und der gleichen Geschwindigkeit eluiert. Man sammelt vier Fraktionen, nämlich zwei von 481, eine von 701 und eine von 481. Das pH dieser Fraktionen wird nach dem Abtrennen auf einen Wert von 7 eingestellt. Untersuchungen zeigen, dass sich 68% der ursprünglichen Bioaktivität in der Fraktion zu 701 befinden. Diese Fraktion wird bei einem pH von 7,0 auf 181 eingeengt und durch ein 0,45-Mikron-Milliporfilter filtriert. Das Filtrat wird auf Böden gefriergetrocknet, und man erhält 99 g eines Produkts mit einer biologischen Aktivität von 310 Einheiten/mg.

10 g dieses gefriergetrockneten Produktes werden in einem 0,lM-2,6-Lutidin-Acetat-Puffer vom pH 6,3 zu 125 ml aufgenommen. Das pH dieser Lösung wird mit Essigsäure auf 6,3 eingestellt, und die Lösung wird an einer Säule aus Dowex 50x8, Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm, in der 2,6-Lutidinform, Abmessungen 7,6 x 142 cm, chromatographiert, wobei die Säule zuvor mit dem oben genannten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Dann entwickelt man mit dem genannten 0,1M-Puffer bei einer Geschwindigkeit von 25 ml/min. Man nimmt zunächst einen Vorlauf von 31 ab und sodann 200 Fraktionen von jeweils 20 ml. Jede vierte Fraktion der Nummern 36 bis 192 wird bei einer Verdünnung von 1:200 biologisch untersucht. Die Bioaktivität befindet sich in den Fraktionen Nr. 56 bis 192, wobei die Höchstmenge in den Fraktionen 92 bis 96 vorhanden ist. Man vereinigt die Fraktionen Nr. 80 bis 136 und gibt 590 ml entionisiertes Wasser zu, wobei man insgesamt 1760 ml erhält. Die vereinigte und verdünnte Lösung, welche 62% der ursprünglichen, auf die Säule mit Dowex 50 x 8 gegebenen Bioaktivität enthält, wird gefriergetrocknet.

Das gefriergetrocknete Produkt wird im 0,lM-2,6-Lutidin-Acetat-Puffer vom pH 7,0 aufgelöst. Man erhält 27 ml einer Lösung, die man auf eine Säule mit Bio-Gel P-2, Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm, Abmessungen 5x 112 cm bringt, welche zuvor mit dem erwähnten 0,1 M-Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Dann wird das Gel mit dem gleichen Puffer bei einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird ständig mit einem registrierenden Differential-Refraktometer Mecco-matic überwacht. Man setzt die Entwicklung fort, bis man 105 Fraktionen von jeweils 20 ml erhalten hat. Jede Fraktion der Nummern 70 bis 93 wird bei einer Verdünnung von 1:300 biologisch untersucht. Die biologische Aktivität wird in den Fraktionen 73 bis 82 gefunden, wobei die Fraktionen 77 und 78 die Höchstmenge aufweisen. Die Fraktionen 75 bis 80 werden gefriergetrocknet, und man erhält 90 mg eines Antibioticums mit einer biologischen Aktivität von 10 000 Einheiten/mg.

Die erhaltenen 90 mg an gefriergetrocknetem Produkt werden in 4 ml eines 0,01 M-Caliumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 aufgenommen. Diese Lösung, welche 596 mit Hydroxylamin löschbare Einheiten der optischen Dichte aufweist (diese Messung des Thienamycingehalts wird am Ende dieses Beispiels beschrieben), wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 1,7 cm gegeben, die mit 90 ml gewaschenem «XAD-2» gefüllt ist und vor der Verwendung mit 180 ml eines 0,1 M-Caliumphosphatpuffers vom pH 7 bei 5 °C ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das «Harz XAD-2» wird vor der Verwendung nacheinander mit 5 Volumina lN-NaOH und danach bis zur Neutralität mit entionisiertem Wasser, dann mit 5 Volumina 1N-HC1 und sodann bis zur Neutralität mit entionisiertem Wasser und schliesslich mit 5 Volumina Methanol, Aceton, 0,001 M EDTA-Tetranatriumsalz und schliesslich mit destilliertem Wasser gewaschen. Vor ihrer Verwendung werden sämtliche Lösungsmittel im Vakuum entgast.

Nach der Aufgabe der Probe auf die Säule werden zweimal je 2 ml Phosphatpuffer aufgegeben. Die Säule wird bei 5 °C mit dem Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Man sammelt Fraktionen des Eluats von jeweils 4 ml. Man nimmt die Fraktionen nach 100 ml Vorlauf ab und vereinigt diese, wenn insgesamt 253 ml Eluat angefallen sind. Die vereinigten Fraktionen engt man in einem Rotationsverdampfer im Vakuum unter 10 °C auf ein Volumen von 6 ml ein.

Diese Lösung, welche 436 hydroxylamin-Iöschbare Einheiten der optischen Dichte aufweist, bringt man auf eine Säule mit einem Durchmesser von 1,7 cm, die 90 ml wie vorstehend gewaschenes «Harz XAD-2» enthält, welches zuvor bei 5 °C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach der Probe gibt man zweimal 2 ml destilliertes Wasser auf. Dann entwickelt man die Säule mit destilliertem Wasser bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 4 ml aufgeteilt. Die Fraktionen, die man nach 100 ml Vorlauf bis zu einem Gesamtvolumen von 151 ml erhält, wird vereinigt und am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 2,73 ml gebracht. Die Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 6,49 mg Thienamycin. Die Fraktionen zwischen einem Durchlaufvolumen von 152 ml und 345 ml werden ebenfalls vereinigt und am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 3,34 ml eingeengt. Nach Gefriertrocknung erhält man 11,53 mg des Antibioticums. Diese Fraktionen enthalten insgesamt 369 hydroxylaminlöschbare Einheiten der optischen Dichte. Dies bedeutet eine 3,lfache Reinigung des Materials, welches man auf die erste Säule mit «Harz XAD-2» gegeben hat, und man erhält eine berechnete biologische Aktivität von 31 000 Einheiten/mg. Eine spektrophotome-trische Analyse einer Probe dieses Produktes zeigt einen Wert von E1"0) cm = 253 bei Messung in einem Phosphatpuffer von pH 7 bei einer Wellenlänge von 297 nm.

Die durch Hydroxylamin löschbare Absorption

Der Anteil der Absorption bei 297 nm, welcher auf den Gehalt an Antibioticum in unreinen Proben enthält, wird dadurch bestimmt, dass man die selektive Löschung dieser Absorption nach einer Umsetzung mit verdünntem Hydroxylamin bestimmt, wobei gleichzeitig die antibiotische Aktivität beseitigt wird.

Man bereitet Proben in 0,01 M- Caliumphosphat-Puffer bei pH 7,0 bis zu einer ursprünglichen Absorption bei 297 nm zwischen 0,05 und 2,0. Bis zu einer Endkonzentration von 10 mM wird frisch bereitetes, neutrales Hydroxylamin (NH2OH. HCl, mit NaOH bis zu einem End-pH von 7 versetzt) zugegeben, und man lässt bei Zimmertemperatur mindestens 30 min lang reagieren. Der verbleibende Wert von A297 liefert nach Abziehen vom Ursprungswert (nach Korrektur der Verdünnung durch das zugegebene Reaktionsmittel) die durch Hydroxylamin löschbare Absorption. Lösungen von reinem Thienamycin zeigen eine Hydroxylamin-Iöschbare Absorption von 94,5%.

Beispiel 7

10 g der Gesamtmenge von 99 g an gefriergetrocknetem Produkt, welches nach der Reinigung an Dowex 1x2 gemäss Beispiel 6 erhalten wurde, werden in einem 0,lM-2,6-Luitidin-Acetat-Puffer vom pH 6,3 aufgenommen. Diese Lösung, welche 125 ml ausmacht, wird auf ein pH von 6,3 mit Essigsäure eingestellt und auf eine Säule des Harzes Dowex 50x8 mit den Abmessungen 7,6x 142 cm gegeben, wobei das Harz als 2,6-Lutidinsalz vorliegt und vorher mit dem angegebenen Puf-

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fër ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wird mit dem 0,1M-Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 35 ml/min entwickelt. Zunächst nimmt man einen Vorlauf von 3,61 ab, sammelt dann 200 Fraktionen von je 20 ml. Jede vierte Fraktion der Nummern 6 bis 194 wird bei einer Verdünnung von 5 1:200 biologisch untersucht. Die biologische Aktivität findet sich in den Fraktionen 62 bis 82. Die Fraktionen 42 bis 102 werden vereinigt und mit 640 ml an entionisiertem Wasser versetzt, wobei man insgesamt 1920 ml Lösung erhält. Die vereinigte und verdünnte Lösung, welche 63% der auf die Säule Dowex io 50x8 gegebenen Mischung enthält, wird gefriergetrocknet.

Das gefriergetrocknete Produkt wird in einem 0,lM-2,6-Lutidin-Acetat-Puffer von pH 7,0 aufgelöst. Die Lösung, welche 25 ml ausmacht, wird auf eine Säule von Bio-Gel P-2, Teilchengrösse 0,037 bis 0,074 mm, Abmessungen 5x112 cm, gegeben, 15 welche zuvor mit dem genannten 0,1 M-Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Gel wird dann mit dem gleichen Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird ständig mit einem registrierenden Diffe- 20 rential-Refraktometer Mecco-matic überwacht. Man setzt die Entwicklung fort, bis man 125 Fraktionen von jeweils 20 ml erhalten hat. Jede Fraktion der Nummern 70 bis 89 wird bei einer Verdünnung von 1:300 biologisch untersucht. Die biologische Aktivität wird in den Fraktionen 72 bis 81 gefunden, wobei 25 die Fraktion 77 die Höchstmenge enthält. Man unterwirft die vereinigten Fraktionen 75 bis 79 der Gefriertrocknung und erhält 100,5 mg eines Antibioticums mit einer biologischen Aktivität von 8320 Einheiten/mg.

Die erhaltenen 100,5 mg an gefriergetrocknetem Produkt 30 werden in 4 ml eines 0,01M-Caliumphosphat-Puffers vom pH 7 aufgenommen. Diese Lösung, welche 692 hydroxylamin-Iöschbare Einheiten der optischen Dichte aufweist, wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 1,7 cm gebracht, welche 90 ml eines zuvor gewaschenen Harzes XAD-2 enthält, das vor 35 der Verwendung mit 180 ml eines 0,01M-Caliumphosphat-Puf-fers vom pH 7 bei 5 °C ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Harz XAD-2 wurde vor der Verwendung folgender-massen und nacheinander gewaschen: 5 Volumina lN-NaOH und nachfolgendes Waschen mit entionisiertem Wasser bis zur 40 Neutralität; 5 Volumina 1N-HC1 mit nachfolgendem Waschen mit entionisiertem Wasser bis zur Neutralität; 5 Volumina Methanol, Aceton, einer 0,001-M-EDTA-Tetranatriumsalz-Lösung, und schliesslich mit destilliertem Wasser. Sämtliche Lösungsmittel werden vor der Verwendung im Vakuum entgast. 45

Nach der Aufgabe der Probe auf die Säule gibt man zweimal je 2 ml des Phosphatpuffers nach. Man entwickelt die Säule bei 5 °C mit dem Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min. Das Eluat wird in Form von Fraktionen zu je 4 ml gesammelt. Die Fraktionen werden vereinigt, die man nach 109 50 ml Eluat bis einschliesslich 309 ml Eluat erhalten hat. Zu diesen vereinigten Eluaten gibt man 11,53 mg der Probe des über XAD-2 gereinigten Antibioticums, welches man gemäss Beispiel 6 erhalten hat und welches 186 hydroxylaminlöschbare Einheiten der optischen Dichte aufweist. Die vereinigten 55 Eluate werden zusammen mit dem zugegebenen Antibioticum auf dem Rotationsverdampfer im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 10 °C bis auf ein Volumen von 7 ml eingeengt.

Diese Lösung, welche 720 hydroxylamin-Iöschbare Einheiten der optischen Dichte aufweist, wird auf eine Säule gegeben, die einen Durchmesser von 1,7 cm aufweist und mit 90 ml Harz XAD-2 gefüllt ist, welches, wie oben beschrieben wurde, zuvor gewaschen und vor der Verwendung bei 5 °C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach der Probe gibt man zweimal je 2 ml destilliertes Wasser nach. Dann wird die Säule mit destilliertem Wasser bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Man sammelt das Eluat in Fraktionen zu je 4 ml. Die Fraktionen nach dem Durchlauf von 109 ml Eluat bis zum Durchlauf von 301 ml Eluat werden vereinigt und im Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 10,3 ml gebracht. Diese Lösung, welche 589 hydroxylamin-Iöschbare Einheiten der optischen Dichte aufweist, wird gefriergetrocknet, woei 23,6 mg eines Antibioticums mit einer berechneten antiakteriellen Aktivität von 30140 Einheiten/mg anfallen.

Das so hergestellte Antibioticum ist ein weisser, amorpher Feststoff mit faserartiger Konsistenz, von dem eine Probe, die man in einem Glasröhrchen mit einer Geschwindigkeit von 3 °C pro Minute erwärmt, sich ohne Durchgang durch die flüssige Phase auf die folgende Weise zersetzt: Erweichung bei 130 bis 140 °C und gleichzeitige Volumenkontraktion des Feststoffes bis 170-174 °C, wo das Material sich gelb färbt; Sintern und allmähliches Stärkerwerden der Farbe bis zu rotbraun im Gebiet von 180 bis 200 °C und schliesslich Carbonisierung mit verbleibenden Spuren des Feststoffes bei 205 °C.

Eine weitere Probe dieses Stoffes zeigt bei spektrophoto-metrischer Analyse eine Absorptionsspitze bei 296,5 nm mit einem Wert von E1%lcm = 168,2. Die Elementaranalyse ergibt die folgenden Resultate: 1) einen Gewichtsverlust von 5,67% beim Trocknen bei Zimmertemperatur während 4 Stunden im Vakuum, und 2) die Zusammensetzung von 47,68% Kohlenstoff, 6,22% Wasserstoff und 11,48% Stickstoff. Diese Resultate stehen in Übereinstimmung mit der empirischen Formel C11H16N2O4S. (NH3)o,28> und die berechnete Elementarzusammensetzung entsprechend dieser empirischen Formel ist C = 47,68%, H = 6,13%, N = 11,52%, S = 11,57% und O = 23,1%. Eine polarimetrische Analyse einer Lösung von 1 mg/ml dieser Probe in einem 10-nM-Caliumphosphatpuffer zeigt eine spezifische optische Drehung (a)27 °CD von + 80°. In Fig. 1, welche das Infrarotspektrum eines Nujolmulls dieser Probe wiedergibt, ist auf der Ordinate die Absorption, auf der oberen Abszisse die Wellenlänge in Mikron und auf der unteren Abszisse die Frequenz in cm-1 angegeben. Dieses in Fig. 1 wiedergegebene Infrarotspektrum zeigt charakteristische Absorptionsspitzen bei 1765 cm"1,1650-1550 cm"1,2800-2500 cm"1 und bei 3500-3100 cm-1. Ein NMR-Spektrum bei 100 MHz einer Probe dieses Produktes, gelöst in D2O, zeigt ein Dublett bei 5 1,275, ein Dublettenpaar bei ô 3,39 und Multipletts bei ô 3,15 und 8 4,20, wobei diese Spitzen charakteristisch für Thienamycin sind.

Eine Abweichung von der obigen Beschreibung zur Isolierung und Reinigung von Thienamycin, die der vorliegenden Erfindung entspricht, ist im Schutzbereich der folgenden Ansprüche inbegriffen.

G

1 Blatt Zeichnungen