DE1768965C

DE1768965C - (-)-(cis-1 ^-EpoxypropyOphosphonsäure und deren Salze und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen

Info

Publication number: DE1768965C
Authority: DE
Inventors: David Springfield; Stapley Edward Olley Spotswood; NJ. Hendlin (V.St.A.); Mata, Justo Martinez Del VaI, Sagrario Mochales, Madrid
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Publication date: 1972-08-03

Description

Die Erfindung betrifft eine neue, antibiotisch wirk- Die freie Säure in kristalliner Form ist ein weißer

same Verbindung. Feststoff, der bei oder oberhalb etwa 94"C schmilzt.

Die AKtivjtät der bekannten Antibiotika, wie Penicil- wenn er in ein Bad mit dieser oder höheren Temperatulin, Streptomycin, Chlortetracyclin oder Oxytetracyclin, ren gebracht wird.

ist gewöhnlich auf einige pathogene Mikroorganismen 5 (-Hcis-U-EpoxypropyU-phosphonsäureistinwäßbegrenzt.' rigen Lösungen bei alkalischen Bedingungen bis zu

Gegenstand der Erfindung sind (-Mcis-l.Z-Epoxy- etwa pH-Wert von 11 mit Ammoniak oder organischen prppyO-phosphonsäure und deren Salze sowie ein Ver- Aminen sehr stabil. 15 Minuten Erhitzen von wäßrigen fahren zur Herstellung dieser Verbindungen, das da- Lösungen mit einem pH-Wert von 8 bis 9 auf 100" C durch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm von io scheint das Antibiotikum nicht zu inaktivieren. Unter Streptomyces fradiae (ATCC 21 096, 2L 097, 21 098 etwa pH 3 ist es unstabil. Bei pH 1,5 beträgt die HaIb- oder 21 099 oder NRRL 3417), Streptomyces virido- wertszeit bei Raumtemperatur weniger als 24 Stunden, chromogenes(NRRL3413,3414,3415,3416oder3427) Instabilität, auch bei einem höheren pH, ist in Berüh- oder Streptomyces wedmorensis (ATCC 21 239) in rung mit Sulfonsäure- oder Phosphonsäureionenauseinem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingun- 15 tauscherharzen beobachtet worden. Auch bei relativ gen kultiviert, bis das Medium eine beträchtliche anti- kurzem Kontakt mit 1 larzen dieses Typs bei pH 3 wird biotische Aktivität besitzt, die gebildete ( )-(cis- eine unvollständige Rückgewinnung erhalten. l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure in an sich bekannter Die Verbindung ist ausgeprägt polar. Auf der Basis

Weise isoliert und gegebenenfalls in an sich bekannter von Papierstreifenuntersuchungen ist die Substanz Weise in ein entsprechendes Salz überführt. *<> (Jluconsäure ähnlich.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind antibio- Sie wird durch polare Lösungsmittel, wie Phenol,

tisch wirksam und inhibieren das Wachstum von ver- auch in Gegenwart von organischen Aminen nicht schiedenen gramnegativen und grampositiven Mikro- leicht extrahiert. Chromatographie an Kationcnausorganismen. tauscherharzen in der Wasserstofform zeigt ebenfalls

Die erfindungsgemäße l-cis-l^-Fpoxy-l-propyl- 25 polare Eigenschaften an. So wird auf derartigen Harzen phosphonsäure kann strukturell folgendermaßen dar- das Antibiotikum viel weniger verzögert als Zitronengestellt werden: säure. Die polare Natur des neuen Antibiotikums zeigt

sich auch an dem fast vollständigen Fehlen von Ad-O OH sorption aus wäßrigen Lösungen durch Aktivkohle bei

H Ht/ 30 einem pH von 5.

HjC—C C—P Das Antibiotikum wird auf sauren Tonen nicht

\q/ \ adsorbiert, während Aluminiumoxid, sowohl basisch

OH als auch sauer gewaschen, ein gutes Adsorbens für das

Antibiotikum darstellt. Aus wäßriger Lösung wird die

Diese Substanz ist eine saure Verbindung, die nun- 35 Verbindung bei pH 5 stark adsorbiert, bei pH 9 jedoch mehr in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen ehe- eluiert. Bei pH 9 ist die Adsorption aus 75% Methamischen Nomenklatorpraxis wohl richtiger als (-)-(cis- nol/Wasser stark, jedoch relativ schwach in 25% 1,2-F.poxypropyl)-phosphonsäure bezeichnet wird, wo- Methanol/Wasser. Die Zugabe von Barium- oder bei das Symbol ( —) ebenso wie der Buchstabe I an- Kalziumsalzen zu wäßrigen Lösungen fällt das Antizeigt, daß diese Phosphonsäure linear polarisiertes 40 biotikum nicht aus. Das Ammoniumsalz des Antibio-Licht im Gegenuhrzeigersinn (vom Betrachter aus ge- tikums scheint begrenzte Löslichkeit in wasserfreiem sehen nach links) dreht, wenn die Rotation ihres Di- Methanol zu besitzen, jedoch ist das Natriumsalz in natriumsalzes in Wasser (Konzentration 5%) ^hei 90%igem Methanol/Wasser löslich. 405 ηψ gemessen wird. Die bei der Beschreibung der Die (-)-(cis-1,2-1 poxypropyD-phosphonsäure ist

1,2-Epoxypropylphosphonsäureverbindungverwendete 45 eine wasserlösliche same Substanz, die mit salzbilden-Bezeichnung »eis« sagt aus, daß die an die Kohlenstoff- den Stoffen, wie anorganischen und organischen Basen, atome 1 und 2 der Propylphosphonsäure gebundenen unter Bildung von Salzen reagiert. So wird bei der Wasserstoffatome auf d'sr gleichen Seite des Oxidringes Umsetzung mit Alkalimetall- und Erdalkalinietallsitzen. hydroxiden, -carbonaten, -bicarbonaten das entspre-

Dic Strukturformel dieser antibiotischen Substanz 5° chemie Alkalimetall- oder Frdalkalimetallsalz erhalten, ist der Bequemlichkeit halber in der planaren Formel Andere Metallsalze, beispielsweise von Silber, AIugczeigl. Das Antibiotikum kann jedoch auch folgender- minium oder F.isen können ebenso durch doppelte maßen räumlich dargestellt werden: Umsetzung oder nach anderen Arbeitsweisen hergell 11 stellt werden, die dem Fachmann geläufig sind. F.benso

55 werden Salze von organischen Basen, wie primären,

C C O OH sekundären und tertiären Aminen, beispielsweise

/ ^v- / ·\/ Monoalkylaminen, Dialkylammcn, Trialkylumincn,

CW^ ^ P Alkyldiamineii und stickstoffhaltigen heterocyclischen

\ Aminen, gumäli dein Fachmann geläufigen Methoden

OU ^6o hergestellt. Die Salze können Monosal/.e, wie das Mo-

nonatriumsal/, erhallen beispielsweise durch Umsetzung von 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit 1 Äqui-

() OH vulent Säure, Disalzc, erhalten beispielsweise durch

[ / Umsetzung von 2 Äquivalenten Natriumhydroxid n\it

("H₃ [> ⁶S I Äquivalent der Säure, gemischte Disalze, erhalten

\ durch Umsetzung von 1 Äquivalent des Monosalzcs

C C OH mit I Äquivalenteincrzweiten Base, Diphosphonatsalze,

/ / erhalten beispielsweise durch Umsetzung von 1 Äqui-

Il ^(> H

/alent Kalziumhydroxid mit 2 Äquivalenten der Säure Die obenerwähnten vier Pilzstämme erfüllen diese

)der gemischte Salze, wie Kalziumhydrogenlactat, er- allgemeine Beschreibung mit der Ausnahme, daß oft iialten durch Umsetzung von 1 Äquivalent Milch- auf organischen Medien das Luftmycel beobachtet wir/i, säure mit dein Kalziumdiphosphonatsalz, sein. Die Streptomyces-fradiae-Kultur der Hinterlegungs-

Repräsentativc Beispiele von Salzen von organischen 5 nummer NRRL 3417 wurde nus der Erde Isoliert. Basen, die erwähnt werden können, sind Salze mit Die Streptomyces-viridochromogenes-Kulturen mit

Aminen, wie x-Phenäthylainin, Diethylamin, Chinin, den llinterlegimgsnummern NRRL 3413 bis 3416 und Brucin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanol- 3427 wurden ebenfalls aus der Erde isoliert .Die Kultur amin. Morphin, Benzylamin, Älhylendiainin, N,N'-Di- NRRL 3415 ist auch unter der Nummer ATCC 21 240 benzyläthylendiamin. Diethanolamin, Piperazin, Di- »o hinterlegt worden. Die Kulturen mit den Nummern inethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, NRRL 3413 bis 3416 und" 3427 unterscheiden sich Thiophyllin, Ester von Aminosäuren und N-Methyl- von der veröffentlichten Beschreibung von Streptomyglucamin. Gewünschtenfalls kann der basische Teil des ces viridochromogenes nur durch dasFehlen der grauen Salzes aus biologisch aktiven Aminen bestehen, wie bis schwarzen Mycelfärbung bei Wachstum auf synthe-Erythromycin, Oleandomycin oder Novobiocin. 15 tischem Agar. Da dies der einzige bedeutende Uhter-

Die Salze der (- Mcis-l^-EpoxypropylJ-phosphon- schied ist, wird es nicht als berechtigt angesehen, diesen säure, die pharmazeutisch verträglich und im wesent- Kulturen einen neuen Artnamen zuzuordnen. Die liehen nicht toxisch sind, sind besonders wertvoll und Untergruppe viridochromogenes der Streptoinyceten können bei der Herstellung von geeigneten pharma- umfaßt eine Gruppe von eng verwandten Kulturen, zeutischen Dosierungseinheitsformen verwendet wer- 20 Manche Fachleute verwenden getrennt Artnamen, den. Alle Salze sind als Zwischenprodukte bei der unter anderem S. chartreusis, S. cyaneus, sowie bicolor, Herstellung der freien Säure und zur Herstellung von coeruleofuscus, coeruleorubidis, cocrulescens und anderen Salzen brauchbar. Die Salze von optisch akti- longisporus, den russische Klassifizierungstachleute bei ven Basen, wie Aminen, sind brauchbar bei der Treu- Actinomyces einordnen, was der Streptomyces-Gruppe nung der optisch aktiven Fnantiomeren der Phosphon- 25 anderer Wissenschaftler äquivalent ist. säuren. Die Kultur mit der Nummer ATCC 21 239 gehört

Die bei dem erfindungsgeniäßcn Verfahren ver- eindeutig zur Art Cinereus, wie sie in S. A. W a k swendeten Streptomyces-Stämme waren bislang unbe- man, »The Actinomycetes«, Bd. II, definiert ist. Auf kannt. Die ATCC-Nummern beziehen sich auf die der Grundlage der sporophoren Morphologie fällt Kultursammlung der American Type Culture Collec- 30 die Kultur in die Untergruppe Rectus-Flexibilis, wie tion, die NRRL-Nummern auf die Sammlung der von Pridham, Hesselt ine und Benedict Northern Utilization Research and Development in »Applied Microbiology«, Bd. 6, S. 52 (1958), be-Branch des US. Department of Agriculture in Peoria, schrieben. Sie unterscheidet sich in mancher Hinsicht Illinois, USA. Die Kulturen von Stveptomyces fradiae von allen bisher beschriebenen Streptomyccs-Arten. mit den Hinterlegungsnummern ATCC 21 0%, 21 097, 35 Sie ist Strcptomyces wedmorensis am nächsten ver-21 098 und 21 099 sind auch unter den Nummern wandt. Eine relativ schnelle Peptonisierung \on Milch NRRLB-3357, NRRLB-3358, NRRl B-3359 bzw. und die Erzeugung eines weichen Koagulums sind NRRL-B 3360 hinterlegt worden. Von diesen ist die bedeutende Unterschiede, werden jedoch nicht für aus-Kultur ATCC 21 096 die Stammkultur, während die reichend betrachtet, um eine neue Art festzulegen. Aus Kulturen ATCC 21 097, 21 098 und 21 099 Subisolate ίο diesem Grund ist die Kultur der Art S. wedmorensis davon sind. zugeordnet worden. Diese Kultur ist nicht nur unter

Die Klassifizierung dieser vier Kulturen als Strep- der Nummer ATCC-21 239 hinterlegt, sondern auch toniyccs fradiae erfolgte auf der Basis von ausgedehn- unter der Nummer NRRL 3426. ten Klassifizierungsuntersuchungcn. Hierzu wurden die Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum wird

Stammkultur und die Kolonieisolate durch das Lyo- 45 während der aeroben Fennentation in geeigneten wäßphilisierungsverfahrcn von Sporenmatctial stabilisiert, rigen Nährnicdicn durch die angegebenen Stämme von um reproduzierbare Erbgenisse sicherzustellen. Die Mikroorganismen erzeugt. Man kann wäßrige Medien für die Untersuchung der morphologischen und physio- verwenden, wie sie für die Herstellung von anderen logischen Eigenschaften verwendeten Kulturen wurden Antibiotika üblich sind. Derartige Medien enthalten aus diesem stabilen Sporenmaterial gezogen. Bestimmte 5° Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die für die einzelne Kolonieisolate unterscheiden sich so stark von Mikroorganismen assimilierbar sind, und anorganische der Standardbeschreibung von S. fradiae, daß sie für Salze. Außerdem enthalten die Ferinentationsmedien sich allein als neue Art bezeichnet werden könnten. Spuren von Metallen, die für das Wachstum der Mikro-Die Tatsache, das alle einzelnen Kolonieisolate von Organismen notwendig sind und im allgemeinen als /ueiiieni ein/igen Sporenmaterial stammen, und die 55 fällige Verunreinigungen bei der Zugabe von anderen Tatsache, daß die Slaminkultur eine höhere Grollen- Bestandteilen des Mediums zugeführt werden. Ordnung der Variabilität zeigt, rechtfettigen die Be- Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff können

zeichnung der Kultur und ihrer Varianten im weitesten z.B. Kohlehydrate, wie Zuckerstoffc, beispielsweise Rahmen ihrer Eigenschaften als Släiiiine von S. fra- Saccharose, Maltose, Fructose und Lactose oder diac. In »The Actinomycetes«, Bd. II, S. 212, ist 6° Stärkestoffe, wie Getreide, beispielsweise Hafer und S. fradiae allgemein folgendermaßen definiert: Roggen, Maisstärke und Maismehl in dem Nährme-

»Die Art hat die Eigenschaften, daß sie nicht-chromo- dium verwendet werden. Im allgemeinen beträgt die gen und stark proteolytisch ist und das charakterisli- Kohlehydratinenge zwischen etwa 1 und 6 Gcwichtssche Luftmycel mit der rosa Farbe der Schale von Mee- pro/ent des Mediums.

rcsweichtieren auf verschiedenen synthetischen Medien 65 Zu befriedigenden Stickstofiquellen gehören proteinerzeugt, wobei auf organischen Medien ein organe- haltige Stoffe, beispielsweise verschiedene Formen von farbencs Wachstum ohne ein Luftmycel hervorgerufen Hydrolysate!! von Casein, Sojabohnenmehl, Maiswird.« quellllüssigkeit, lösliche Schlempebeslandteile, Hefe-

iydrolysatc und Tomatenpaste. Die Stickstoffquellen werden in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent jes wäßrigen Mediums verwendet,

Die Temperatur der Fermentation kann etwa 25 bis 38"C, vorzugsweise 26 bis 30"C betragen. Der geeignete pH-Wert der Nährmedien beträgt etwa 5,5 bis 7,5. ' Das erfindungsgcinäße neun Anüuiotikum wird sowohl durch Obcrnächcnkulturcn als auch durch Submcrskulturcn erzeugt, bevorzugt ist die Fermentation im Submerszustand. Fermentationen in kleinem Maßstab werden zweckmäßig durchgeführt, indem das Nährmedium in Kolben gegeben, die Kolben und der. Inhalt durch Erhitzen auf 1Λ)"C sterilisiert, die Kolben entweder mit Sporen oder einem vegetativen ZcIlwachstum eines (—)-(cis-l ,2-[ipoxypropyl)-phosphoiisäure erzeugenden Stammes von Slreptom^ccs inokuliert, die Kolbcnhälsc lose mit Baumwolle verschlossen werden und die Fermentation in einem Kaum mit konstanter Temperatur bei etwa 28¹C 3 bis 5lage auf einer Schüttclcinnchtung durchgeführt wird. Für die Durchführung in größcrem Mabstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem Rührer und Einrichtungen versehen sind, um das Fermentationsmedium zu belüften. Bei dieser Arbeitsweise wird das Nährmedium in dem Tank gebildet und durch Erhitzen auf 120' C sterilisiert. Nach Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einer geeigneten Quelle eines vegetativen Zellwachslums des Streptomyscc inokuliert, und die Fermentation wird 2 bis 4 Tage vorgenommen, während das Nährmedium gerührt und/oder belüftet und die Temperatur bei etwa 28^ÜC gehalten wird.

Bei der Durchführung der Erzeugung des Antibiotikums im Submerszustand kann eine kleine Menge eines geeigneten Antischaummittcls, beispielsweise Sojabohnenöl, Rizinusöl, 1% Octadecanol in Mineralöl oder ein polymerisiertes Propylenglykol, wie Polyglykol 2000, zu der Fermentationsbrühc gegeben werden, um übermäßiges Schäumen während üer Fermentation zu bekämpfen.

(—) - (eis -1,2 -Epoxypropyl) - phosphorsäure wird zweckmäßig unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21 100 und NKRL B-33M) als lcstorganismus mittels einer Schcibcnschalcnarbeitswcisc untersucht. Die Testkuluir wird als Schrägkultur auf Nähragar plus 0,2 °/₀ Hefeextrakt gehalten. Die inokulierten Schrägkulturen werden bei J7°C 18 bis 24 Stunden lang inkubiert und bei Eisschranktemperaturen 1 Woche gelagert, wobei frische Schrägkulturen jede Woche hergestellt werden.

Das Inokulum für die Versuchsschalen wird jeden Tag durch Inokulieren eines 250-ml-Erlenineycr-Kolbens, der 50 ml Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt enthält, mit abgeschabtem Material aus der Schrägkultur hergestellt, Der Kolben wird bei 37^UC 18 bis 24 Stunden lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Die Kulturbrühc wird dann durch Zugabe von 0,2¹V₀IgCr Ucfccxtraktlösung zu dem Wachstum auf 4O"/o Durch-, lässigkeit bei einer Wellenlänge von 600 ιημ eingestellt. Nichtinokulicrte Brühe wird für diese Bestimmung als Leerprobe verwendet. 30 ml der eingestellten Brühe werden verwendet, um 1 1 Medium zu inokulieren. Ah Vcrsudisnicdium wird Nähragar plus 0,2^(l/_n Hefeextrakt verwendet. Dieses Medium wird hergestellt, durch Autoklavcnbchandlung sterilisiert und auf 50"C abkühlen gelassen. Nach dem Inokulieren des Mediums werden 10 ml in sterile l'ctrischalcn gegeben, und das Medium wird fest werden gelassen.

Die Aktivität wird in Einheilen ausgedrückt, wobei eine Einheit als die Konzentration des Antibiotikums pro Milliliter definiert ist, die auf einer 1,27-cm-Papierscheibe einen Zonendurchmesser von 28 mm erzeugt. Vier Konzentralionen von ( — )-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure werden zur Herstellung der Eichkurve verwendet, nämlich 0,3, 0,4, 0,6 und 0,8 Einheilen pro Milliliter, wobei jede Konzentration durch Verdünnen in tris-CHydroxymelhyO-aminomethanpuffcr, eingestellt

jo auf pH 8,0, erhalten wird. Vier Scheiben werden auf jede der fünf Schalen für die Herstellung der Eichkurvc aufgebracht, so daß jede Schale eine Scheibe mit jeder der obigen vier Konzentrationen des Antibiotikums enthält, Die Schalen werden bei 37"C 18 Stunden lang

i_S inkubierl, und die Durchmesser der Inhibierungszoncn in Millimeter werden gemessen. Es wird für jede Konzentration ein durchschnittlicher Zonendurchmesser berechnet, woraus eine Eichkurvc auf halblogarithmischcm Papier hergestellt wird. Die Neigung der erhaltenen Linie liegt zwischen 4 und 5.

Proben des zu untersuchenden Antibiotikums werden in 0,05 molarem Puffer bei pH 8,0 auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Scheiben werden in die Tcstlösung eingetaucht und auf die Oberfläche der Testschale gebracht, wobei normalerweise zwei Scheiben für jede Probe auf einer Schale entgegengesetzt zueinander angeordnet werden. Zwei Scheiben, eingetaucht in (—Hcis-l^-EpoxypropyO-phosphonsäurelösung mit 0,4 Einheiten pro Milliliter, werden in abwechselnder Stellung zu der Probe auf die Schale gebracht. Die Schalen werden bei 37"C 18 Stunden lang inkubiert, und die Zonendurchmesser in Millimeter werden bestimmt. Die Stärke der Probe wird mit Hilfe eines Nomogramms oder aus der Eichkurve bestimmt.

1 mg reine (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure enthält 357 Einheiten.

Die gemäß den hier beschriebenen Arbeitsweisen erzeugten Fcrmentalionsbrühcn, die das Antibiotikum enthalten besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 1 bis 20 Einheilen pro Milliliter, wenn sie gemäß dem oben beschriebenen Standardtest unter Verwendung von Proteus vulgaris getestet werden. Das Antibiotikum kann durch eine Anzahl von Arbeitsweisen gereinigt und in einer reineren Form gewonnen werden.

Eine derartige Arbeitsweise umfaßt die Adsorption des Antibiotikums an Anionenaustauscherharzcn, beispielsweise Harzen, die sich aus quaternären Ammoniumaustausch- oder Polyalkylamingruppcn, verknüpft mit einem Styrol-Divinylbenzol-Polymerisatgerüst, zusammcnsetzcn. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem Harzadsorbai leicht mit wäßrigen oder wäßrigalkoholischen Lösungen von Salzen, wie Ammoniumchlorid, Natriumchlorid oder Natriurracetat, cluiert. Das so erhaltene Eluat kann gcwünschtenfalls durch andere Reinigungsverfahren weiter gereinigt werden. So kann das Eluat gereinigt werden, indem es durch ein Polyacrylamidgelbett mit Porengrößen geleitet wird, die die Fraktionierung von Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 200 und 2000 erlauben. Die Reinigung des Antibiotikums kann auch erreicht werden, indem die unreine Antibiotikumlösung durch ein stark saures Kationenaustauschcrharz geleitet wird, das sich aus Kern-SulfonsäurcausUiuschgruppcn, verknüpft mit einem Styrol-Divinylbenzol-Polymcrisatgcrust, zusammensetzt, und das Harz mit Wasser entwickelt wird.

Alternativ kann das Antibiotikum durch Adsorption auf Aluminiumoxid gereinigt werden, wobei für diese

Reinigung entweder basisch oder sauer gewaschenes Aluminiumoxid geeignet ist. Das adsorbierte Antibiotikum kann von dem Aluminiumoxid am zweckmäßigsten durch wäßrige oder wäßrig-alkoholische Ammoniumhydroxidlösungen mit einem pH von etwa 11,2 eluiert werden, wobei das niuat fraktioniert gesammelt wird. Die Reinigung der unreinen festen Fraktionen, die das Ammoniumsalz der (—)-(cis-l ,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure enthalten, kann auch erreicht werden, indem dieses Material in Methanol gelöst, ein gleiches Volumen n-Butanol zugesetzt, das Methanol abgedampft, etwaiges butanolunlöslichcs Material abfiltriert und eine Butanollösung gewonnen wird, die das Ammoniumsalz des Antibiotikums mit erhöhter Reinheit enthält. Das Ammoniumsalz kann dann in fester Form durch Eindampfen der Butanollösung bei vermindertem Druck zur Trockne erhalten werden. Alternativ kann das Ammoniumsalz mit Wasser aus der Butanollösung extrahiert werden, wobei eine wäßrige Lösung des Ammoniumsalzes der (— )-(cis-l,2-Epoxypropyl)-pliosphonsäure erhalten wird. Das Kalziumsalz des Antibiotikums wird hergestellt, indem Kalziumhydroxid zu der wäßrigen Lösung des Ammoniumsalzes gegeben und die sich ergebende Lösung bei vermindertem Druck erwärmt wird. Alternativ wird das Kalizumsalz auch erhalten, indem eine Lösung eines anderen Salzes des Antibiotikums über ein Kationenaustauscherharz in der Kalziumform geleitet wird. Das Kalziumsalz kristallisiert aus wäßrigen Lösungen mit einer Konzentration von 10 mg/ml beim Stehen oder beim Rühren.

(—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihre Salze sind z. B. wirksam gegen die pathogenen Erreger Bacillus, Escherichia, Staphylococci, Salmonella und Proteus. Beispiele derartiger Pathogene sind Baccillus subtilis, Escherichia coli. Salmonella schottmuejleri. Salmonella gallinarum. Salmonella pullorum, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus Morgana, Staphylococcus aureus und Staphylocossus pyogenes.

(—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihre Salze können somit als antiseptische Mittel zur Entfernung von empfänglichen Organismen von pharmazeutischer, dentaler und medizinischer Ausrüstung verwendet werden, die der Infektion durch derartige-Organismen ausgesetzt sind. Ebenso können sie zur Abtrennung von bestimmten Mikroorganismen aus Mischungen von Mikroorganismen verwendet werden. Salze der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure sind auch bei der Behandlung von bakteriellen lnfektionen bei Mensch und Tieren von Nutzen, sie sind auch gegen resistente Stämme von pathogenen Erregern wirksam. Das Antibiotikum und seine Salze können als Desinfektionsmittel in Waschmittelpräparaten und in Gebieten verwendet werden, die der Infektion

ίο durch Salmonella ausgesetzt sind. Die Salze der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure sind auch als Bakterieide in verschiedenen industriellen Anwendungen von Wert, beispielsweise bei der Inhibierung von unerwünschtem Bakterienwachstum in dem Weißpapier in Papiermühlen und in Anstrichen, wie Polyvinylacetatlatex-Anstrich.

Wenn (—) - (eis -1,2 - Epoxy propyl) - phosphorsäure oder ihre Salze zur Bekämpfung von Bakterien beim Menschen oder bei niedrigeren Tieren verwendet werden, können sie oral, beispielsweise'als Kapseln oder Tabletten, oder in Lösung oder Suspension verabreicht werden. Alternativ kann das Antibiotikum parenteral durch Injektion verabreicht werden. Diese Formulierungen können unter Verwendung von geeigneten Verdünnungsmitteln, Streckmitteln, Granulierungsmitteln, Konservierungsstoffen, Bindemitteln, Geschmacksstoffen und Oberzugsmitteln hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig sind.

Die (—)-(cis-l,2-EpoxypropyI)-phosphonsäure wird als antibaktcrielles Mittel vorzugsweise in Form eines Salzes verwendet. Bei der Behandlung und Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei erwachsenen Menschen werden gute Ergebnisse durch Verabreichung von etwa V4 bis_4g/Tag (—Mcis-l^-EpoxypropyO-phosphon-

säure-Äquivalent erhalten, wobei das tatsächliche Gewicht von dem speziellen Salz abhängt.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Antibiotikums zeigen die folgenden Versuche.
Weibliche weiße Mäuse mit einem Durchschnittgewicht von 21 bis 24 g wurden intraperitoneal mit 3 bis 30 LDjo-Dosen des Testorganismus infiziert und zur Zeit der Infektion und nochmals 6 Stunden später mit dem Wirkstoff oral behandelt. Die ED₆₀ wurde berechnet aus der überiebensrate 7 Tage nach der Infektion.

	ED₅₀<\|i«/Dosis)	Chloramphenicol
Dinatriumsalz
der (-MdS- 1,2-Epöxypropyl)-	Tetracyclin	160
phosphonsäure		- 160
330	125	320
760	2020	5000
220	>5000	500
1110	>10000	275
80	1110	570
4	690	675
90	250
1130	130

Escherichia coli 2017

Klebsiella pneumoniae 3068 ...

Proteus vulgaris 1810

Pseudomonas aeruginosa 3210 .
Salmonella schottmuelleri 1814
Salmonella schottmuellerie 3010

Staphylococcus aureus 2949

Streptococcus pyogenes 3009

Die Toxizität des erfindungsgemäßen Dinatriumsalzes ist äußerst gering. Die LD₅₀ bei Mäusen beträgt intraperitoneal 4000 mg/kg.

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Beispiel 1

Eine lyophilisierte Kultur von Streptomyces fradiae ATCC 21 096 wird verwendet, um 50 ml sterilisiertes Medium zu inokulieren, das die folgende Zusammensetzung besitzt:

Hefeextrakt 10 gl/

Glucose 10 g/l

MgSO₄ -7H₂O 0,5 g/l

Phosphatpuffer* 2 ml Destilliertes Wasser Rest

* 91 g KH₁PO₄ und 95,0 g Na₁HPO₁, mit destilliertem Wasser auf 11 gebracht.

Der inokulierte Kolben wird dann auf einen Drehschüttler mit 220 UpM und 5,08 cm Ausschlag gebracht und 48 Stunden bei 28⁰C inkubiert.

Ein Inokulum von 10 ml des sich ergebenden vegetativen Wachstums wird dann verwendet, um einen 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Stopfen zu inokulieren, der ao 500 ml sterilisiertes Medium mit der gleichen, oben angegebenen Zusammensetzung enthält. Der inokulierte Kolben wird dann auf einenDrehschüttlermit220UpM gebracht und 48 Stunden bei 28° C inkubiert

Die sich ergebende Fermentationsbrühe wird ver- «5 wendet, um einen 189-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 1601 steriles Medium mit der gleichen, oben angegebenen Zusammensetzung enthält. Das inokulierte Medium wird unter Rühren bei 28 ° C inkubiert, während ein Luftstrom von 0,08496 m^s/ Min. durch die Fermentierungsbrühe geführt wird. Während der Fermentationsperiode werden kleine Mengen Polypropylenglykol zugesetzt, um das Schäumen der Charge zu regeln.

Ein Inokulum von 251 der sich ergebenden Fennentationsbrühe wird dann verwendet, um einen 757-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 5101 steriles Medium mit folgender Zusammensetzung enthält:

Haferflocken 20 g/l Schlempebestandteile

(Distillers Solubles) 10 g/l

Sojabohnenmehl 20 g/l Natriumeitrat 2 g/l Natriumascorbat 0,5 g/I Destilliertes Wasser Rest

Das pH dieses Mediums wird vor der Sterilisisrung auf 6,5 eingestellt Die inokulierte Brühe wird dann bei einer Temperatur von 28° C unter Rühren inkubiert, während ein Luftstrom von 0,2832 m³/Min. 3 Tage lang durchgeleitet wird. Während der Fermentation wird Polypropylenglykol als Antischaummittel in kleinen Mengen zugesetzt, um übermäßiges Schäumen der Fermentationsbrühe zu verhindern. Die Fermentationsbrühe wird dann mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert Die filtrierte Brühe hat einen pH von 7,9 und enthält 13,4 mg/ml Gesamtfeststoffe. Die Untersuchung der filtrierten Brühe nach dem Scheibenschalentestverfahren mit Proteus vulgaris zeigt, daß die Brühe 0,8 Ein- heiten/ml (—Hcis-l,2-.Epoxypropyl)-phosphonsäure enthält, was einer Aktivität der Feststoffe der Brühe von 0,06 Einheiten/mg entspricht.

3791 der filtrierten Brühe werden auf pH 7 gestellt und durch eine Säule geleitet die ein stark basisches Anionenaustauscherharzvomquaternaren Ammoniumtyp mit einer Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat-Grundsubstanz enthält Das sich ergebende Harzadsorbat wird mit einer 3%igen Lösung von Ammoniumchlorid in 90°/_oigem Methanol eluiert und das Eluat wird in Fraktionen von 7,571 gesammelt. Die Fraktionen 4, 5 und 6, die die Hauptmenge des Antibiotikums enthalten, ergeben die folgende Analyse:

45

Fraktion Nr.	Gesamt- feststofte mg/ml	Prüfung Einheiten/ml	Stärke Einheiten/mg
4 5 6	15,1 21,7 36,2	14 14 4	0,93 0,65 0,11

Die Fraktionen 4 und 5 werden getrennt bei vermindertem Druck zur Entfernung von Methanol bis zu einer Konzentration von etwa 200 mg/ml Gesamtfeststoffe konzentriert. 275 ml des Konzentrats der Fraktion 5 mit einem Gesamtgehalt von etwa 51 g Feststoffen werden durch 8,91 kugelförmiges Polyacfylamidgel mit 0,3 bis 0,15 mm Teilchengröße geleitet, die die Fraktionierung, Entsalzung und Konzentrierung von Stoffen mit Molekulargewichten von 200 bis 2000 erlauben. Das sich ergebende Geladsorbat wird mit Wasser mit der Geschwindigkeit von 50 ml pro Minute entwickelt, während das Eluat mit einem Refraktometer überprüft wird. Das Eluat wird in Fraktionen gewonnen, geprüft und die geeigneten aktiven Fraktionen werden vereinigt. Die 635 ml Eluat zwischen 5600 ml und 6230 ml enthalten 19,1 mg/ml Gesamtfeststoffe und haben eine Aktivität von 68 Einheiten/ml, wenn sie in, dem oben beschriebenen Scheibentestverfahren mit Proteus vulgaris untersucht werden. Dies entspricht (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure mit einer Stärke von 3,6 Einheiten/mg.

Auf die gleiche Weise werden vier weitere Chromatogramme durchgeführt, wobei Anteile von 275 ml bzw. 287 ml des Konzentrats von Fraktion 5 und zwei Anteile von 285 ml des Konzentrats von Fraktion 4 verwendet werden. Die reichen Fraktionen von allen .fünf Chromatogrammen werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf etwa IGO mg/ml konzentriert. Die 660 ml des sich ergebenden Konzentrats haben eine Stärke von 4,1 Einheiten/mg.

100 ml dieses Konzentrats werden durch eine Säule geleitet, die 2480 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes des Sulfonattyps mit einer Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat-Grundsubstanz in der Wasserstofform enthält. Das sich ergebende Harzadsorbat wird mit Wasser mit der Geschwindigkeit von 19 ml pro Minute entwickelt, und es werden 20,5-ml-Fraktionen des sich ergebenden Eluats gesammelt, wobei das Eluat durch ein Aufzeichnungsrefraktometer überprüft wird. Die Fraktionen 45 bis 65 werden getrennt mit Ο,ΐη-Natriumhydroxid auf pH 7 titriert Die Fraktionen 52 und 62 werden dann untersucht und vereinigt, um eine wäßrige Lösung des Antibiotikums zu erhalten.

In der gleichen Weise werden fünf weitere 100-ml-Anteile des Konzentrats auf dem stark sauren Kationenaustauscherharz chromatographiert, und die aktivsten Fraktionen der sich ergebenden Harzeluate werden mit den Fraktionen 52 bis 62 vereinigt, wobei insgesamt 1870 ml erhalten werden. Diese wäßrige Lösung der (—Hcis-l,2-EpoxypropyO-phosphonsäure hat ein pH von 6,8, einen Gesamtfeststoffgehalt von 2,9 mg/ml

und zeigt 70 Einheiten/ml. Die Stärke des Natriumsalzes des Antibiotikums in dieser wäßrigen Lösung beträgt somit 24 Einheiten/mg. Die wäßrige Lösung wird dann bei vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 4,7 g Produkt erhalten werden.

Das so erhaltene getrocknete Produkt zeigt folgendes antibakterielles und Cross-Resistenz-Spektrum:

Antibakterielles Spektrum

	Durchmesser der
Test-Organismus	Inhibierungszone, mm (Scheibe = 7 mm;
	4 mg/ml
Escherichia coli MB-60	25
Bacillus sp. M B-833	7
Proteus vulgaris M B-IO12	42
Pseudomonas aeruginosa MB-979	7
Serratia marcescens MB-2S2 ...	15
Staphylococcus aureus MB-108	17
Bacillus subtilis MB-965	29
Sarcina lutea MB-1101	20
Staphylococcus aureus MB-698	29
(Streptothricin-resistent)
Streptococcus faecalis MB-753..	12
Alcaligenes faecalis MB-IO	13
Bruceila bronchiseptica MB-96S	7
Salmonella gallinarum MB-1287	35
Vibrio percolans MB-1272	34
Xanthomonas vesicatoriaMB-815	7

Cross-Resistenz-Spektrum Test-Organismus* Escherichia coli MB-60

(empfindlicher rviuüersiarnm) Streptomycin-resistenter Stamm Streptothricin-resistenter Stamm OXAMYCIN-resistenter Stamm

Pleocidin-resistenter Stamm Chloramphenicol-resistenter

Stamm

Chlortetracyclin-resistenter

Stamm

Oxytetracyclin-resistenter Stamm Neomycin-resistenter Stamm ... Jetracyclin-resistenter Stamm .. Viomycin-resistenter Stamm ... Polymyxin-resistenter Stamm ... Grisein-resistenter Stamm

Durchmesser der Inhlbierungsrone,

mm (Scheibe=7 mm)

4 mg/ml

25

23 18 18 39

12

17 7 45 33 17 15 24

•Die Versuche weiden gegenüber einer Reihe von gegen Antibiotika resistenten Stämmen von E. coli durchgeführt, die durch Einwirkung von inhibierenden Konzentrationen des Antibiotikums auf den Mutterstamm (ΜΝ-6Ό) isoliert worden «hd.

Papierstreifenchromatographie auf Whatman-3-rnm-Filterpapier, getrocknet nach Sättigung mit 0,033;m Phosphatpuffer vom pH 7,0 und entwiclcelt^iti^uanoL gesättigt mit Ό.033 in Ehösipna|pjffel*%m pH 7,0, zeigt, daß das Antibiotikum eme wasserlösliehe Verbindung mit einem RF=O ist. Papierstreifenelektrophorese, 2¹I₂ Stunden bei 600 Volt mit 0,165 m Phosphatpuffer vom pH 7,0 in einer gekühlten Vorrichtung entwickelt, zeigt einen ungewöhnlich bewegliehen sauren Fleck 11,5 cm von der Ursprungsstelle entfernt. Das Vorhandensein der Aktivität wird sowohl für die Papierstreifenchromatographie als auch für die Papierstreifenelektrophorese durch Bioautographie auf Agarschalen, beimpft mit Escherichia coli MB-60, ίο sichtbar gemacht.

Beispiel 2

500 ml einer vegetativen Kultur von Streptomyces fradiae ATCC 21096, hergestellt durch Ziehen des Mikroorganismus in einem 2-Liter-Erlenmeyer-K.olben mit Stopfen gemäß der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise, werden verwendet, um einen 757-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 4671 so steriles Medium mit folgender Zusammensetzung enthält:

Hefeextrakt 10 g/l

Glucose 10 g/l

_a5 MgSO₁-7H₈O 0,05 g/l

Phosphatpuffer * 2 ml Destilliertes Wasser Rest

*91g KH₁PO, und 95,0 g "Na₁HPO₁, mit destilliertem Wasser auf 11 gebracht.

Das inokulierte Medium wird bei 28°C 24 Stunden lang unter mechanischer Rührung inkubiert, während ein Luftstrom von 0,2832 m^s/Min. durch das Fermentierungsmedium geleitet wird, wobei eine kleine Menge Polypropylenglykol zur Schaumbekämpfung zugesetzt wird. 2151 der sich ergebenden Fermentationsbrühe werden verwendet, um einen 5680-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 45401 steriles Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung enthält:

Haferflocken 20g/l Lösliche Schlempebestandteile ... 10 g/l Sojabohnenmehl 20 g/l Natriumeitrat 2 g/l Natriumascorbat 0,5 g/l Destilliertes Wasser Rest

Das Medium wird vor der Sterilisierung auf pH 6,5 eingestellt

Die inokulierte Brühe wird bei einer Temperatur von 28° C unter Rühren inkubiert, während 2 Tage lang ein Luftstrom von 1,55 m³/Min. durchgeleitet wird, wobei Polypropylenglykol in kleinen Mengen zugegeben wird, um das Schäumen zu regeln.

Die sich ergebende Fermentationsbrühe wird mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. 20821 der filtrierten Brühe mit einer Aktivität von 0,34 Einheiten/ml werden durch eine Säule mit vorher verwendetem Anionenaustauscherharz vom quaternären AmmöniunrtyJ) auf

emerStyrol-Drvmylbeaizol-Pbl^eniä^GR^^ _ _ _T

in der Chloridform geleitet DaIs sich crgebeHie Harzädsorbat wird matt feiner 3°ygen wife%en "" " chloridlösung elmert, und das i5ch<

ν 3jfa Fraktionen von __,_ _ _β

BrÜherach DurchlaufenderSätileistrnaVtiv,wi

Fraktionen 5 bis 1% die die Häuptrnenge tischen Aktivität enthalten, werden vereinigt

2478

Weitere 20821 der filtrierten Fermentationsbrühe werden durch eine Säule geleitet, die 151 1 eines neuen Anioncnauslauscherhai7.es vom oben beschriebenen Typ enthält, und das sich ergebende Harzadsorbat wird mit einer 3%igen wäßrigen Nalriumchloridlösung cluicrt, wobei das Eluat in Fraktionen von 18,9 1 gesammelt wird. Die Fraktionen 2 bis 11, die die Hauptmcnge der anlibiolisch.cn Aktivität enthalten, werden mit den Fraktionen 5 bis 12 aus der ersten Chromatographie vereinigt und bei vermindertem Druck auf etwa 26,5 1 konzentriert. Das sich ergebende Konzentrat hat einen pH von 8,5 und eine Stärke von 0,2 Einheiten/mg, bestimmt nach dem oben beschriebenen Standardversuchsverfahren gegen Proteus vulgaris. Dieses Harzelualkonzentrat wird auch durch ein modifiziertes Testverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris als Testorganismus untersucht. Bei diesem modifizierten Verfahren werden 5 ml des inokulierten Mediums in der Pctri-Schale verwendet, und das zu untersuchende Antibiotikum wird auf eine 1,27-cm-Papierscheibe gebracht. Die Schale mit den Testscheiben wird dann 18 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert, und die lnhibierungszonen werden gemessen. Die Stärke wird ausgedrückt als die Menge Feststoff pro Millimeter, die unter diesen Bedingungen eine Inhibierungszone von 25 mm erzeugt. Es wird gefunden, daß das Harzelual (25,85 1) 10,4 kg Feststoffe enthält und eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Konzentration von 2,7 mg/ml ergibt.

Zu diesen 25,85-1-Eluatkonzentrat werden 15 kg sauer gewaschenes Aluminiumoxid gegeben, und die Mischung wird 30 Minuten bei einem pH von 5,7 gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, und es wird gefunden, daß das Filtrat 9,5 kg Feststoffe enthält und eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Konzentration von 6,1 mg/ml ergibt, wenn das oben beschriebene modifizierte Testverfahren verwendet wird. Das auf dem Aluminiumoxid adsorbierte Antibiotikum wird mit 251 Wasser eluiert, wobei die Aluminiumoxidaufschlämmung durch Zugabe von konzentriertem Ammoniumhydroxid auf pH 11,1 gestellt wird. Nach 40 Minuten Rühren wird das Aluminiumoxid abfiltriert, und das sich ergebende Eluat wird bei vermindertem Druck auf 1 1 konzentriert. Dieses Konzentrat enthält 361 g Feststoffe und ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Konzentration von 0,17 mg/ml.

Zu 850 ml dieses reichen Konzentrats werden 7650 ml Methanol gegeben und die unlöslichen Stoffe werden durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat, das praktisch das gesamte Antibiotikum enthält, wird durch eine Säule geleitet, die 1 kg sauer gewaschenes Aluminiumoxid enthält. Dann werden ein Methanolgradient, der 2n-Ammoniak in 75%igem, 50%igem und 25°/_oigem Methanol enthält, und schließlich 2normales wäßriges Ammoniak verwendet, um das Aluminiumoxidadsorbat zu eluieren, wobei 4000 ml von jeder Methanolkonzentration und das gleiche Volumen wäßriges Ammoniak für die Elution verwendet werden. Das Eluat aus der Elution mit 2n-Ammoniak in 75%igem Methanol wird in vier 1-1-Fraktionen gesammelt und untersucht. Die Untersuchungen zeigen, daß diese Fraktionen unbedeutende Aktivißt enthalten, und sie werdeiudeshalb verworfen.

Das Eluat aus der Elution mit 2n-Ammomak in 50°/ igem Methanol wird ebenfalls in vier Fraktionen mit jeweils 11 gesammelt. Der Feststoffgehalt und die Prüfung dieser Fraktionen ergeben sich wie folgt:

Fraktion	GcsainlfcststofTc ε	Prüfung mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone
⁵ 1 2 3 4	15 31 16 5	0,75 0.24 0,13 0,06

Das Eluat aus der Elution mit 2n-Ammoniak in 25%igeni Methanol wird in vier Fraktionen von jeweils 1 1 gesammelt. Der Fcststoffgehall und die Prüfung jeder dieser Fraktionen ergeben sich wie folgt:

15 Fraktion	Gesamt feststoffe B	Prüfung mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone
1 20 2 3 4	4,99 8,1 4,4 2,0	0,10 0,04 0,03 0,04

Das Eluat aus der Elution mit wäßrigem 2n-Ammoniak wird in vier Fraktionen von jeweils 1 1 gesammelt. Die erste Fraktion enthält insgesamt 2,9 g Feststoffe mit einem Gehalt von 0,12 mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone, und die zweite Fraktion enthält 4,0 g Feststoffe und einen Gehalt von 0,16 mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone. Die restlichen zwei Fraktionen enthalten nur geringe Mengen antibiotischcr Aktivität und werden verworfen.

Jede der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Eluatfraktionen wird lyophilisicrt. Die Feststoffe aus den letzten drei Fraktionen, die bei der Elution mit 2n-Ammoniak in 50°/₀igem Methanol erhalten worden sind, werden vereinigt und dreimal mit 500 ml aufgeschlämmt und dann filtriert. Die Methanolextrakte werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 500 ml konzentriert. Das sich ergebende Konzentrat enthält 7,5 g Feststoffe und ergibt eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Konzentration von 0,006 mg/ml.

134 ml dieses Konzentrates werden an 100 g sauer

gewaschenem Aluminiumoxid unter Verwendung eines kontinuierlichen (exponentieiien) Gradienten chromatographiert, wobei mit 21 in-ammoniakalischem 75°/_oigem Methanol mit der Geschwindigkeit von 1 ml/Minute begonnen wird und kontinuierlich die 21 Elutionslösung durch Zugabe von 2n-wäßrigem Ammoniak bei dem gleichen Volumen gehalten werden. Das sich ergebende Eluat wird in Fraktionen von 20 ml gesammelt. Die aktivsten Fraktionen 10 bis 25 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert, wonach in 12 ml Methanol gelöst und ein gleiches Volumen n-Butandol zugegeben wird. Das Methanol wird bei vermindertem Druck verdampft. Das in Butanol unlösliche Material wird entfernt Die Prüfung der Butanollösung des Antibiotikums durch das im vorliegenden Beispiel beschriebene modifizierte Testverfahren ergibt eine 25 mm Inhibierungszone bei einer Konzentration von 0,005 mg/ml.

Die vereinigten Eluate aus 2n-ammoniakalischem 50%igem und 25%Jgeni Methanol aus der Aluminiumoxidchromatographie werden bei vermindertem Druck auf 500 ml konzentriert. Zu diesem Konzentrat werden 1500 ml Methanol gegeben, und die sich ergebende Lösung wird filtriert. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck eingedampft, wobei eine wäßrige Lösung

2478

•v₅ Cf

15 16

des Antibiotikums erhalten wird, die bei der Prüfung 210 ml eines stark basischen Anionenaustauschergemäß dem oben in diesem Beispiel beschriebenen harzes in der Chloridform enthält, das sich aus. modifizierten Testverfahren mit Proteus vulgaris eine quaternären Ammoniumaustauschgruppen, verknüpft 25-mm-Inhibierungszone bei einer Verdünnung von mit einem Styrol-Divinylbenzol-Polymerisatgerüst, zu-0,0055 mg/ml ergibt. . 5 sammensetzt. Das sich ergebende Harzadsorbat wird Zu 2 ml des obigen Konzentrats werden 20 ml Me- mit 300 ml Wasser gewaschen und'zuerst mit 11 thanol gegeben, und die sich ergebende Lösung wird 3%iger wäßriger Ammoniumbicarbonatlösung und filtriert. Das Filtrat wird mit 60 ml n-Butanol verdünnt dann mit 11 3%igem Ammoniumbicarbonat in 70%i- und die unlöslichen Stoffe werden durch Filtrieren ent- gem Methanol eluiert. Die Eluate werden in. 100-mlfernt. Das Filtrat, das das Antibiotikum enthält, ergibt io Fraktionen gesammelt, und jede der Fraktionen wird eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Verdünnung geprüft. Das wäßrige Eluat enthält 20% der Aktivität, von 0,0025 mg/ml. Das Filtrat wird auf 8 ml einge- und das Methanoleluat enthält 30% der Aktivität, bedampft, und das unlösliche Material wird durch Filtrie- stimmt durch die Standardprüfung unter Verwendung ren abgetrennt. Die sich ergebende n-Butänollösung von Proteus vulgaris MB-838. Die wäßrigen Eluatdes Antibiotikums ergibt bei dem modifizierten Test- 15 fraktionen werden direkt gefriergetrocknet, während verfahren mit Proteus vulgaris eine 25-mm-Inhibie- die Methanoleluatfraktionen im Vakuum konzentriert rungszone bei einer Verdünnung von 0,0014 mg/ml. und dann gefriergetrocknet werden. Die gefriergetrock-

neten Feststoffe werden in Wasser gelöst und wiederum

Beispiel j geprüft, um die Stäike der verschiedenen Fraktionen Zu 50 ml sterilem wäßrigem Medium mit der föl- ao zu bestimmen. Losungen der ersten zwei wäßrigen

genden Zusammensetzung: 100-ml-Eluatfraktionen werden unter Bildung der

Caseinhydrolysat (N-Z-Amin) 1 % ^P*^{obe Nr}; 62-2 vereinigt und Lösungen der ersten drei Dextrose I⁰/ Methanoleluatfraktionen werden unter Bildung der

j^_aQ Q 50; Probe Nr. 62-3 vereinigt. Die Probe Nr. 62-2 mit

Fleischextrakt 0 3V° *^{5 β}'^ηεπι Gesamtvolumen von 45 ml und einem Gesamt-

' ° feststoffgehalt von 30 mg/ml ergibt eine Inhibierungsund einem pH von 7,2 vor der Sterilisation wird 1 ml zone von 25 mm bei Verdünnung 1: 200, wenn sie nach eines Inokulums gegeben, das durch Suspendieren einer dem Standardprüfverfahren unter Verwendung von Agarschrägkultur von S. viridochromogenes NRRL- Proteus vulgaris untersucht wird. Die Probe Nr. 62-3 3414 in 10 ml des gleichen Mediums hergestellt worden 30 mit einem Gesamtvolumen von 27 ml und einem Geist. Das inokulierte Medium in einem 250-ml-Erlen- samtfeststoffgehalt von 47 mg/ml ergibt eine Inhibiemeyer-Kolben mit Stopfen wird 2 Tage bei 28 ⁰C auf rungszone von 25 mm bei einer Verdünnung 1: 400. einem Drehschüttler inkubiert, und 10 ml der sich er- Die Beweglichkeiten bei der Papiersticifenchromatogebenden Fermentationsbrühe werden verwendet, um graphie von (1) einer Probe Nr. 62-2 und (2) einer 500 ml steriles wäßriges Medium mit der oben ange- 35 Probe Nr. 62-2, gemischt mit einer gleichen Menge gebenen Zusammensetzung in einem 2-1-Erlenmeyer- Natrium-(-)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, wer-Kolben mit Stopfen zu inoku'ieren. Dieses inokulierte den bestimmt, indem Streifen von Whatman-Nr.-3-Fil-Medium wird dann 2 Tage bei 28° C auf einem Dreh- terpapier entwickelt werden, die ursprünglich mit Spots schüttler gezogen, und die sich ergebende Brühe wird der nach 4tägiger Inkubation erhaltenen Brühe ververwendet, um einen 189-1-Fermenter aus rostfreiem 40 sehen und mit Lösungsmittel »K« (70% Isopropanol Stahl zu inokulieren, der 1001 steriles Medium mit und 30% pH 6,0 Phosphatpuffer [0,0Im]) oder der gleichen Zusammensetzung wie oben enthält. Die- Lösungsmittel »C« (2% Natriumchlorid in 75%igem ses inokulierte Medium wird 40 Stunden unter Rühren wäßrigem Methanol) entwickelt worden s^;nd. Die Erbei 28 ⁰C inkubiert, während ein Luftstrom von gebnisse werden durch Bioautographie auf Schalen mil 0,085 m³/Min. durch die Fermentationsbrühe geleitet 45 dünnem Nähragar plus 0,2% Hefeextraktmedium wird. Während der Fermentation werden kleine Men- beimpft mit bakteriellem Inokulum, sichtbar gemacht gen Polypropylenglykol zugegeben, um das Schäumen Die als R. F. bezeichneten Beweglichkeiten des Zen· des Fermentationsmediums zu regeln, trums der Inhibierungszone, beobachtet nach Inkuba· Ein Inokulum von 431 der sich ergebenden Fermen- tion über Nacht, ergeben sich wie folgt:

tationsbrühe wird dann verwendet, um einen 757-1- 50

Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der „. .. .

5101 eines sterilen wäßrigen Mediums enthält, das 2 % oSanismus Tomatenpaste und 2% Hafermehl enthält. Die mo

kulierte Brühe wird 90 Stunden unter Rühren bei 28⁰C gezogen, während ein Luftstrom vom 0,2832 m^s/ 55 (1) Proteus vulgaris MB-838
Min. durch das !fermentierende Medium geleitet wird. (2) Proteus vulgaris MB-838

lt. F. in

Lösungsmittelsystem »K«

0,42
0,44

0,79 0,78

Eine nitrierte Probe der sich ergebenden Fermentationsbrühe ergibt eine Inhibierungszone von 33 mm, Mit diesen beiden Proben werden Papierstreifen wenn sie nach den oben beschriebenen Standardver- elektrophorese-Tests durchgeführt. Papierstreifen wei fahren unter Verwendung von Proteus vulgaris 60 dem mit Spots der Proben versehen, mit 0,165 molarer MB-838 geprüft wird. Phosphatpuffer vom pH 7,0 eingeweicht und in eine Ein Teil dieser Brühe wird nach 48 Stunden aus dem gekühlten Einheit 2V₂ Stunden mit 600 Volt enl Fermenter entfernt und filtriert. Die nitrierte Brühe wickelt. Die Ergebnisse werden durch Bioautographi ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm, wenn sie un- auf Schalen mit dünnem Nähragar plus 0,2% Heft ter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 mit dem 65 extrakt sichtbar gemacht und die Stellung des aktive Standardverfahren geprüft wird. 10,51 der filtrierten Materials wird in Form der Bewegung vom Ursprung! Brühe werden mit verdünntem Natriumhydroxid auf punkt zum Zentrum der Inhibierungszone aufgezeict pH 8,5 gestellt und an einer Säule adsorbiert, die net. Auf einer mit Erwina atroseptica beimpften bi(

9Π9 AÜ9/3C

17

autographischen Schale zeigt die Probe Nr. 62-2 eine Bewegung von 13,0 cm und die Probe Nr. 62-2 plus das Natriumsalz der (—Hcis-l>2-Epoxypropyl)-pnosphonsäure eine Bewegung von 12,4 cm.

Die Probe NrI 62-2 zeigt das folgende antibakterielle und Cross-Resistenz-Spektrum bei Versuchen, die gleichzeitig mit Kalzium-(—)-(^cis-l,2-epoxypropyi)-phosphonat durchgeführt werden:

Test-Organismus

Escherichia coli MB-60 ..

Bacillus sp MB-833

Proteus vulgaris MB-1012 Pseudomonas aeruginosa

MB-979

Serratia marcescens

MB-252

Staphylococcus aureus

MB-108

Bacillus subtilis MB-965 Sarcina lutea MB-1101 ... Staphylococcus aureus MB-698 (Streptothricin-

resistent)

Streptococcus faecalis

MB-753

Alcaligenes faecalis MB-IO Brucella bronchiseptica

MB-965

Salmonella gallinarum

MB-1287

Vibrio percolans MB-1272 Xanthomonas vesicatoria

MB-815

Escherichia coli MB-60 empfindlicher Mutterstamm

Streptomycin-resistenter

Stamm

Streptothricin-resistenter

Stamm

OXAMYCIN-resistenter

Stamm

Pleocidin-resistenter

Stamm «..

Chloramphenicol-resisten-

ter Stamm

Chlortetracyclin-resisten-

ter Stamm

Oxytetracyclin-resistenter

Stamm

Neomycin-resistenter

Stamm

Tetracyclin-resistenter

Stamm

Viomycin-resistenter

Stamm

Polymyxin-resistenter

Stamm

Grisein-resistenter Stamm

Inhibierangszone, Durchmesser in mm (Scheibe = 7 mm) Kalrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phos-

phonat 4O/

26

39

17

18 36 25

29

12 11

34 37

15

26 23 21 26 36 11 13 13 45 31 15

12 23

Probe Nr. 62-2

19

36

13

12 19 19

30

28 32

19 18 12 15 36

9 13

40 29 15

10 19 Die Ergebnisse der Papierstreifenchromatographie, der Papierstreifeneiektrophorese und das antibakterielle und Cross-Resistenz-Spektrum zeigen, daß die antibiotische Aktivität der Probe Nr. 62-2 auf der (—>(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphoDsäure beruht.

Beispiel 4

Eine lyophilisierte Kultur von Streptomyces wedmorensis ATCC 21239 wird verwendet, um 50 ml ίο steriles Hefeextrakt-Glucosemedium der im folgenden angegebenen Zusammensetzung in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Stopfen zu inokulieren.

He'feextrakt. 10 g/l

,, Glucose:... .· lOg/1

MgSO₄-7H₂O 0,05 g/l

Phosphatpuffer* 2 ml

Destilliertes Wasser bis auf das Volumen

• 91 g ΚΗ,ΡΟ« plus 95,0 g Na₁PO₄, in destilliertem Wasser so auf 11 gebracht.

Dieses negative Inokulum wird durch 3tätige Inkubation bei 28° C auf einem Drehschüttler mit 220UpM entwickelt. Das sich ergebende Inokulum as wird verwendet, um 50 ml steriles Caseinhydrolysat-Fleischextraktmedium der im folgenden angegebenen Zusammensetzung in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben unter Verwendung von 3% Inokulum (1,5 ml/Kolben) zu inokulieren:

Caseinhydrolysat (N-Z-Amin) 1%

Dextrose 1 %

NaCl

0,5%

Fleischextrakt 0,3%

Die inokulierten Kolben werden 4 Tage bei 28 ° C auf einem Drehschüttler mit 220 UpM gezogen. Die sich ergebende Brühe wird zentrifugiert, und die geklärte Brühe ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm mit 7-mm-Papierscheiben, wenn sie mit dem Standardverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 als Testorganismus geprüft wird.

Weitere Untersuchungen an dieser Brühe unter Verwendung des gleichen Scheibenager-Diffusionsverfahrens, die bei 25° C und 37° C 20 Stunden lang durchgeführt werden, zeigen Inhibierungszonen von 7 mm (die Zone der Scheibe) bzw. 26 mm. Dieser Unterschied in den Inhibierungszonen bei den beiden Temperaturen ist charakteristisch für (—)-(cis-l,2-EpoxypropyO-phosphonsäure.

Die Beweglichkeiten bei der Papierstreifenchromatographie, bestimmt an der geklärten Brühe gemäß der in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 als biographischer Organismus, zeigen einen R. F. von 0,25 in dem Lösungsmittelsystem »K« und von 0,75 in dem Lösungsmittelsystem »Cd.

Beispiel 5

Ein Eluat aus 2n-ammoniakalischem 25%igeni Methanol, erhalten nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise, wird gefriergetrocknet, wobei 250 mg Feststoffe erhalten werden, die bei dem im Beispiel 2 beschriebenen modifizierten Testverfahren gegen Proteus vulgaris eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Verdünnung von 0,028 mg/ml ergeben. Der getrocknete Feststoff wird in 5 ml Methanol gelöst, und zu der Methanollösung werden 5 ml n-Butanol gegeben. Die sich ergebende Lösung wird nitriert, und das Filtrat

» 20

wird bei vermindertem Druck zur Entfernung des phonsäure enthält, mit einem F. 139 bis 142⁰C erMethanols eingedampft Die Butanollösung wird mit geben. Dieses Produkt wird in 40 ml heißem Äthanol 0,3 Raumteilen Wasser extrahiert und die wäßrige aufgenommen, das ungelöste Material wird abfiltriert, Schicht abgetrennt. und J_{38 s}i_ch ergebende Filtrat wird auf 10 ml konzen-Zu 20 ml einer derartigen wäßrigen Lösung des 5 triert Diese Lösung wird zur Wiederauflösung von Ammoniumsalzes der (—Mcis-l^-Epoxypropy^phos- etwa ausgefallenem Material erwärmt, gekühltunddann phonsäure, die 1020 mg Feststoffe enthält und nach der mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Bestimmung gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Das kristalline Benzylaminsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxymodifiziertea Proteus-vulgaris-Test eine Aktivität von propyl)-phosphonsäure, das sich aus der Lösung ab-204 000 Einheiten besitzt, werden 440 mg Kalzium- 10 setzt, wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und hydroxid gegeben; die sich ergebende Lösung hat ein getrocknet, wobei sich 0,170 g Benzylaminsalz mit pH von 10,2. Die Lösung wird dann im Vakuum unter einem F. 156 bis 160⁰C ergeben. Wenn dieses Produkt Erhitzen auf etwa Vz Volumen eingedampft, wonach aus 2,5 ml einer Äiiianol-Methanol-Mischung umdas pH mit. 7,4 gefunden wird. Zu diesem Konzentrat kristallisiert wird, so werden 0,15 g des Benzylaminweiden etwa 10 ml Wasser und 100 mg Kalziumhydro- 15 salzes der (—>(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure xid gegeben, und die sich ergebende Mischung wird mit einem F. 153 bis 158°C erhalten. Die Elementarwiederum im Vakuum auf etwa V« Volumen mit einem analyse des Produkts bestätigt die empirische Formel pH von 7,5 eingedampft. Dieses Konzentrat wird mit C₁₀H_1?NPO₄. Weiteres Monobenzylaminsalz wird bei Wasser auf etwa 40 ml verdünnt und dann filtriert. der Aufarbeitung der Mutterlaugen erhalten.
Das klare Filtrat wird im Vakuum auf 15 ml einge- ao

dampft, und das Konzentrat wird über eine Säule mit Beispiel 7
star!·; saurem Kationenaustauscherharz in der Kalzium-

form geleitet. Die Harzsäule wird mit Wasser ent- Zu 4 ml einer Methanollösung, die 60 mg Ammo-

wickelt, und es werden 10-ml-Fraktionen des sich er- nium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat (erhalten

gebenden Abstroms abgenommen und mit dem modi- 35 durch Extraktion einer Butanollösung des Salzes mit

fizic! ten Proteus vulgaris-Test geprüft. Die Fraktionen Wasser wie im Beispiel 5 beschrieben und Gefrier-

3 bis 9, die die Hauptmenge der antibiotischen Aktivi- trocknen des sich ergebenden wäßrigen Extrakts) ent-

tät enthalten, werden vereinigt und im Vakuum unter hält, werden 48 mg d-a-Phenyläthylamin gegeben. Die

Erhitzen auf etwa 8 ml konzentriert. Das sich ergeben- sich ergebende Lösung wird unter einem Stickstoff-

de Konzentrat wird filtriert und unter Rühren etwa 30 strom eingedampft, und es wird eine kleine Menge

3 Stunden kristallisieren gelassen. Das kristalline Kai- Methanol zu dem teilweise kristallinen Rückstand geziumsalz der (—Hcis-l^-Epoxypropyty-phosphon- geben. Nach Zugabe eines geringen Volumens Aceton säure wird durch Filtrieren entfernt und mit Wasser und nachfolgend eines kleinen Volumens Äther, um und dann mit Methanol gewaschen, bevor es im Vaku- weitere Kristallisation des d-*-Phenyläthylaminsalzes um getrocknet wird. Das so erhaltene Produkt wiegt 35 der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure einzu-240 mg und besitzt bei der Prüfung nach dem modifi- leiten, wird das kristalline Produkt abfiltriert und gezierten Proteus vulgaris-Testverfahren eine Aktivität trocknet, wobei sich ein Produkt mit einem F. 139 bis von 220 Einheiten/mg. Die optische Drehung des Pro- 140⁰C ergibt.

duktes beträgt [α]_58β = -5,7°, [<%]_Ηβ = -6°, [<χ]«_β

= —12,5° und [λ]₄₀₆ = —14,8°. Die Elementarana- 40 Beispiele

Iy se nach 2stündigem Trocknen im Vakuum bei 125° C

ergibt: C 22,51 %, H 4,2% und P 15,3°/₀. Zu 27,7 g Mono-(+)-a-phenäthylammonium-(-)-

Zu dem Filtrat wird eine kleine Menge Methanol (eis -1,2 - epoxypropyl) - phosphonat werden 87 ml

gegeben, und es werden weitere 96 mg des kristallinen l,18n-methanolische Natriummethylatlösung gegeben,

Kalziumsalzes erhalten. 45 und die Mischung wird gerührt, bis alle Feststoffe gelöst sind. Die Lösung wird auf 10° gekühlt und filtriert.

B e i s ρ i e 1 6 Zu dieser Lösung werdan 87 ml l,15n-äthanolische

Natriummethylatlösung (hergestellt durch Auflösen

Zu 118 ml einer wäßrigen Lösung des Ammonium- von 57,87 g Natriummethylat in 900 ml wasserfreiem

(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonats mit einem Fest- 50 Äthanol) unter Rühren unter einer Stickstoff atmo-

stoffgehalt von 7,2 mg/ml und einer Aktivität von Sphäre gegeben. Zu dieser Lösung werden 81 ml abso-

250 Einheiten/mg (erhallen durch Wasserextraktion lutes Äthanol gegeben, und die Mischung wird bei

eines Butanolkonzentrats wie im Beispiel 5 beschrieben) 0⁰C 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur

werden 2 g Benzylamin, gelöst in etwa 5 ml Äthyläther 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird dann filtriert

gegeben, und die sich ergebende Lösung wird im 55 und das feste Dmatrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-

Vakuum zur Trockne konzentriert. Zu dem Rückstand phosphonat wird mit 200 ml Äthanol gewaschen und

werden etwa 5 ml Methanol und anschließend etwa im Vakuum bei 60° C zur Gewichtskonstanz getrocknet.

5 ml Benzol gegeben, und die Lösung wird wiederum Eine 5°/^ Lösung des Dinatriumsalzes hat ein

konzentriert und im Vakuum getrocknet. Zu dem sich pH von 8,85, ein [«]JS°₅m_M = —13,9° und ein [«]d°^c

ergebenden, getrockneten, partiell kristallinen Produkt 60 =—5,1°.
werden 6 ml Äthanol und 2 ml Benzol gegeben. Die

Lösung wird dann gekühlt und es werden weitere 10 ml B e i s ρ i e 1 9
Benzol zugesetzt. Es beginnen sich Kristalle zu bilden,

und es wird eine Mischung von Benzol/Äthyläther 5:1 Eine Lösung von 4,9 g des Monobenzylaminsalzes

zugegeben. Die Kristalle werden abfiltriert und mit 65 der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure in 50ml

4 ml einer Mischung von Benzol/Äthyläther 1:1 ge- Wasser wird auf 0 bis 5°C gekühlt und mit 2 bis 4 ml waschen, wobei sich 1,082 g Produkt, das das Mono- pro Minute über eine Säule geschickt, die 33 ml eines benzylaminsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phos- Sulfonsäurekationenaustauscherharzes vom Polysty-

roltyp in der sauren Form enthält, wobei das Harz vorher auf 0 bis 2 ° C gekühlt worden ist. Die Harzsäule wird dann mit 225 ml Wasser mit 0 bis 5° C mit dergleichen Geschwindigkeit gewaschen. Die Abströme werden direkt in einer gerührten Lösung von 1,50 g Natriumhydroxid in 10 ml Wasser gesammelt, und das pH der sich ergebenden Lösung wird dann durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxid auf pH 8,7 gestellt. Diese Lösung wird im Vakuum bei 25° C oder darunter auf ein Nettogewicht von etwa 15 bis 20 g konzentriert und zu diesem in weitem Maß verfestigten Produkt werden unter Rühren 30 ml Methanol gegeben. Zu der sich ergebenden Aufschlämmung werden 125 ml Isopropanol gegeben, und die Mischung wird im Vakuum bei unter 25 ⁰C auf etwa 75 ml konzentriert. Das VoIumen wird dann mit Isopropanol wieder auf 125 ml gebracht, es wird 15 Minuten gerührt und filtriert. Der feste Filterkuchen, der aus Dinatrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat besteht, wird über Nacht im Vakuum bei 60° C getrocknet. Eine 5°/_oige Lösung des Dinatriumsalzes in Wasser hat ein pH von 8,5 und ein

Γ_Λ128°Ο 14 "JO

l^aj495ulM Ml^ ·

Wenn die vorstehende Arbeitsweise unter Verwendung einer äquivalenten Menge an Kaliumhydroxid an Stelle des Natriumhydroxids wiederholt wird, so wird das Dikalium-(—Hcis-l^-epoxypropyty-phosphonat erhalten. Eine 5°/o'g^e wäßrige Lösung dieses Produktes in Wasser hat ein pH von 8,8 bis 9,0 und ein

r„i28°c

L^Äj40Smp — —

Beispiel 10

Zu 3,6 g des Dinatriumsalzes und 4,28 g des Dikaliumsalzes wird ausreichend Wasser gegeben, um die Salze zu lösen. Die sich ergebende Lösung wird im Vakuum bei unter 25 ⁰C zur Trockne konzentriert, wobei das gemischte Mononatriummonokaliumsalz der (—) - (eis -1,2 - Epoxypropyl) - phosphonsäure erhalten wird. Eine 5%'ge Lösung dieses gemischten Salzes hat ein pH von 8,8 bis 9,0 und ein [ot]«^ = -12,8°.

B ei spi el 11

Eine gekühlte Lösung (0 bis 5°C) von 32 g Mono-(+)-(a)-phenäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypro- pyl)-phosphonat in 480 ml Wasser wird über 200 ml eines Sulfonsäurekationenaustauscherharzes des Polystyroltyps in der Wasserstofform mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 15 ml pro Minute geleitet. Der Abstrom und die nachfolgenden 400 ml kaltes Waschwasser werden in einer Lösung von 4,6 g Natriumhydroxid in 50 ml Wasser gesammelt. Das pH der sich ergebenden Lösung ist 5,4 und wird mit 6n-Natriumhydroxidlösung auf 7,0 gestellt. Die sich ergebende Lösung wird im Vakuum bei 25°C auf ein Volumen von etwa 75 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird dann filtriert, wobei eine 20°/₀ige Lösung von Sesquinatrimm-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosponat erhalten wird. Eindampfen der Lösung im Vakuum bei einer Temperatur unter 25°C liefert das Sesquinalriumsalz als weißen Feststoff. Eine 2%ige Lösung dieses Produkts in Wasser hat einen pH von 6,8 und ein MJSsmu = -14,9°.

Bei spiel 12

Folgt man den Arbeitsweisen von Beispiel 11, wobei jedoch eine äquivalente Menge des entsprechenden Amins verwendet wird, so werden die folgenden Aminsalze erhalten:

Mono-(+>amphetammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 163,5 bis 165° C,
Monoäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-

phosphonat, F. 152 bis 153"C,
Monodiäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 120,5 bis 122,5 ⁰C,
Mono-e-threo-l-phenyl-l^-dihydroxy^-propylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyI)-phosphonat, F. 103 bis 105⁰C,

Äthylendiaminsalz der (-)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 98 bis 100°C,
Mono-piperazinsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 188° C,
Diäthylentriaminsalz der (—)-(cis-l,2-EpoxypropyO-phosphonsäure, F. 177 bis 179⁰C,
Hexamethylen-l,6-diaminsalz der (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 194°C,
Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiaminsalz der (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 151 bis
152°C,

Bis-guanidinsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 235 bis 260⁰C,
Äthylendiamin-Ν,Ν '-bis(—)-(cis-l ,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 175 bis 21O⁰C,
Mono-L-(+)-lysin-(-)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 165 bis 195°C,
Mono-(—)-brucin-(—)-<cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 210 bis 220° C und
Monoprocain-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 121 bis 125 ⁰C.

Beispiel 13

Eine gekühlte Lösung (0 bis 5°C) von 11,08 g Mono-(+)-«-phenäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat in 160 ml Wasser wird über ml eines Sulfonsäure-Kationenaustauscherharzes vom Polystyroltyp in der Wasserstofform mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 5 ml pro Minute geleitet. Der Abstrom und die nachfolgenden 125 ml kaltes Waschwasser werden gesammelt, und es werden 7,5 g Aluminiumnitratmonohydrat zugesetzt. Das pH der Lösung wird dann mit 50°/₀igem Natriumhydroxid auf 6,0 gestellt, dann wird im Vakuum bei unter 25°C auf etwa 32,3 g eingedampft. Zu diesem Konzentrat werden 58 ml Äthanol gegeben, und die Lösung wird 1 Stunde gerührt. Es werden 25 ml Äthanol zugegeben und die Lösung wird filtriert. Das feste Aluminiumsalz der _J—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure wird mit Äthanol gewaschen und bei 6O⁰C im Vakuum getrocknet.

Claims

Patentansprüche:

1. (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und deren Sülze.

2. Dinatriumsalz der Verbindung nach Anspruch 1.

3. Kalziumsalz der Verbindung nach Anspruchl.

4. Verfahren zur Herstellung der (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihrer Salze gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces fradiae (ATCC 21 096, 21 097, 21 098 oder 21 099 oder NRRL 3417), Streptomyces viridochromogenes (NRRL 3413, 3414, 3415, 3416 oder 3427) oder Streptomyces wedmorensis (ATCC 21 239) in einem

23

un-

>xyyl).

•yi)-

wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis das Medium eine beträchtliche antibiotische Aktivität besitzt, die gebildete (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure in an sich bekannter Weise isoliert und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise in ein entsprechendes Salz übe führt.

5. Antibiotisches Mittel, gekennzeichnet dur einen Gehalt au einer Verbindung nach Ansprucl und einem inerten Stoff.

,08 g -epoüber arzes einer

e ge-25 ml i es setzt.

riumdun- Konisung zugelumi- phon-

-eund An-

•uchl.

Salze chnet, radiae ' oder jgenes ) oder einem