DE1236727B - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums Kasugamycin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums KasugamycinInfo
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Description
AUSLEGESCHRIFT
Deutsche Kl.: 30h-6
Nummer: 1236 727
Aktenzeichen: Z 11248 IV a/30 h
J 236 727 Anmeldetag: 24. Dezember 1964
Auslegetag: 16. März 1967
Die Erfindung betrifft die Gewinnung einer neuen wirksamen Substanz, die Kasugamycin benannt wurde,
und bezieht sich insbesondere auf die Erzeugung dieser Substanz durch Fermentwirkung und Methoden der
Abtrennung und Reinigung. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die anfallende neue antibiotische
Substanz sowie deren Säureadditionsverbindungen in Form von verdünnten Lösungen, als Rohkonzentrate,
als Rohfeststoffkörper oder als gereinigte feste Substanzen und in reiner Kristallform anfallen.
Die erfindungsgemäß gewonnene Substanz wirkt gegen Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Brucella und
einige Klebsiella. Sie ist nichttoxisch und zeigt Heilerfolge bei Infektionen von Pseudomonas und sonstigen
sensitiven Organismen bei Mäusen. Die erfindungsgemäß gewonnene Substanz wirkt auch heilend bei
Infektionen von Pseudomonas und sonstigen sensitiven Organismen bei Menschen und Tieren. Ferner wirkt
diese Substanz inhibierend auf das Wachstum von Piricularia oryzae, die eine schwerwiegende Krankheit
von Reispflanzen verursacht. Die erfindungsgemäß gewonnene Substanz verhält sich auch gegen Pflanzen
nichttoxisch und dient zur Vorbeugung gegen Infektionen mit Piricularia oryzae bei Reispflanzen. Sie
läßt sich daher zur vorbeugenden Behandlung von Reispflanzen gegen Krankheitsbefall verwenden.
Die erfindungsgemäß gewonnenen antibiotische Substanz, die inhibierend wirkt gegen Pseudomonaceae,
Salmonella, Shigella, Brucella und einige Klebsiella und Blastmyces, ist in Wasser löslich, in Methanol,
Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform und Benzol weitgehend unlöslich; sie zeigt keine Absorption
im UV-Licht von 220 bis 400 πιμ, weist positive Reaktion gegen Ninhydrin-Reagenz in Pyridin auf,
reagiert jedoch negativ auf folgende Reaktionen: Sakaguchi, Molisch, Elson-Morgan, Fehling, Tollens und
Ferrichlorid. Das Hydrochlorid ist eine kristalline Substanz, die mit KBr zu Pellets gepreßt charakteristische
Absorption im IR-Spektrum bei folgenden Wellenlängen aufweist: 3520, 3350, 3200, 3070, 2950,
2050, 1695, 1670, 1625, 1522, 1462, 1379, 1323, 1286, 1224, 1180, 1135, 1120, 1090, 1080, 1060, 1042, 1025,
975, 945, 908, 890, 870, 846, 825, 783, 709 cm-1. Die Substanz ist optisch aktiv, rechtsdrehend und hat eine
spezifische Drehung von [«]!? = +120° (c = 1,6 in H2O); sie entspricht der empirischen Formel
C15H27O10N3 · HCl · H2O
und schmilzt bei 202 bis 204° C unter Zersetzung. Bei der Titration ergibt sich ein ExponentPK a von /,1,
und der Äquivalentwert liegt bei etwa 453; ferner läßt sich von dem erfindungsgemäß gewonnenen Kasug-Verfahren
zur Herstellung und Gewinnung des
neuen Antibiotikums Kasugamycin
neuen Antibiotikums Kasugamycin
Anmelder:
Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyukai,
Tokio
Tokio
Vertreter:
Dipl.-Ing. R. H. Bahr und Dipl.-Phys. Ε. Betzier, Patentanwälte. Herne, Freiligrathstr. 19
Als Erfinder benannt:
Hamao Umezawa,
Tomio Takeuchi,
Yoshiro Okami,
Masa Hamada, Tokio
Hamao Umezawa,
Tomio Takeuchi,
Yoshiro Okami,
Masa Hamada, Tokio
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 28. Dezember 1963 (70718),
vom 9. April 1964 (19 767)
Japan vom 28. Dezember 1963 (70718),
vom 9. April 1964 (19 767)
amycin ein kristallines Salz mit HBr, Schwefelsäure usw. herstellen; bei saurer Hydrolyse von Kasugamycin
fällt (+)-Inositol an, und bei der Methylierung erhält man den restlichen Teil in methylierter Form,
während bei Hydrolyse mit Baryt
Ci4H26O10N2 · H2O
anfällt, das weiterhydrolysiert werden kann zu
C12H26O7N2
anfällt, das weiterhydrolysiert werden kann zu
C12H26O7N2
und Oxalsäure.
In den Zeichnungen gibt
F i g. 1 das Infrarot-Absorptions-Spektrum des erfindungsgemäß gewonnenen Kasugamycin-Hydrochlorids,
aufgenommen in KBr, wieder, während
F i g. 2 das kernmagnetische Resonanzspektrum, aufgenommen in D2O gegen das Natriumsalz von
3-(Trimethylsilyl)-propansulfonsäure als Standard wiedergibt.
Erfindungsgemäß stellt man das Antibiotikum Kasugamycin in einer wäßrigen Kohlehydratlösung,
die stickstoffhaltiges Material enthält, unter aeroben Bedingungen dar, und zwar über eine solche Zeit, bis
sich eine nennenswerte Menge an Kasugamycin in dieser Lösung angesammelt hat.
709 519/514
Der Organismus, aus dem erfindungsgemäß dieses neue Antibiotikum Kasugamycin gewonnen wird,
wurde erstmals von dem Erfinder dieses Verfahrens gefunden und wurde aus einer bei Kasuga shrine, Nara
city, Japan, entnommenen Bodenprobe gesammelt. Es handelt sich um eine neue, als Streptomyces
kasugaensis bezeichnete Art der Streptomyceten. Eine Kultur der lebenden Organismen, die aus dem Boden
isoliert und im Laboratorium mit der Kennziffer M338-M1 versehen wurde, ist in der American Type
Culture Collection, Washington D. C, hinterlegt und ist dort der ständigen Kollektion der Mikroorganismen
als ATCC Nr. 15714 und 15715 zugefügt worden.
Streptomyces kasugaensis hat die folgenden Merkmale:
1. Mikroskopische Untersuchung: Das Myceliensubstrat zeigt gute Verzweigung und bringt lange
Luftmycelien hervor, deren Spitzen zum Teil schleifenförmig oder spiralisch mit ausgebildeten ao
Sporenketten erscheinen. Es wurden aber keine quirlförmigen Ausbildungen beobachtet. Unter
dem Elektronenmikroskop ist die Oberfläche der Sporen glatt und zeigt keine Spinn- oder Haarstruktur.
2. Auf einer bei 27 0C bebrüteten Lage Glyzerin Czapek-Agar-Platte (Glyzerin-Nitrat-Agar) ergab
eine cremefarbige bis olivgrüne oder gelblich braungefärbte Wuchsmasse, ein dürftiges weißes Luftmycelium,
und blaßolivfarben oder blaßgelblichbraunes Pigment in dem Medium.
3. Bei 27°C auf Krainsky-Glucose-Asparagin-Agar-Nährboden bebrütet entstand eine Wuchsmasse
mit gelblicher bis hellbrauner Färbung oder rötlichbraunem Ton. Das Luftmycelium war weißlich
bis helloliv oder olivgrau, und das Pigment in dem Medium war dunkelgelblich oder dunkelgelblichbraun
gefärbt.
4. Auf Calcium-Malat-Agar-Nährboden bei 270C bebrütet hatte die Wuchsmasse eine elfenbeingelbe
Färbung. Das Luftmycelium war weiß bis sandfarben gefärbt, und es war kein lösliches Pigment
vorhanden. Das Calciummalat war um die Wuchsmasse herum gewöhnlich gelöst und transparent
geworden, wenn jedoch das Wachstum nur gering war, wurde dieses Merkmal nicht beobachtet.
5. Auf Stärke-Agar-Nährlösung, bebrütet bei 27° C, war die Wuchsmasse elfenbeingelblich gefärbt;
das Luftmycelium war weiß, und es ■ war kein lösliches Pigment vorhanden. Die hydrolytische
Aktivität ist sehr schwach oder fehlt ganz.
6. In Peptonlösung mit 0,2% NaNO3, bebrütet bei 37° C, war die Wuchsmasse an der Oberfläche
farblos; es waren kein Luftmycelium und kein Pigment vorhanden. Nitrat wurde reduziert.
7. Auf einem schräggeneigten Nähragar bei 37° C bebrütet, zeigte die Wuchsmasse eine cremefarbene
bis blaßgelblichbraune Färbung oder einen rötlichbraunen Ton. Es wurde kaum Luftmycelium gebildet,
und es waren keine löslichen Pigmente vorhanden.
8. In abgerahmter Milch bei 37° C war die Wuchsmasse farblos, und es wurden keine Luftwurzeln
ausgebildet. In der Regel wurde keine Koagulation oder Peptisation beobachtet, jedoch trat
manchmal eine geringe Koagulation und schwache Peptonisation auf. Lösliches Pigment war nicht
vorhanden.
9. Auf Gelatinekultur, bebrütet bei 18 bis 20°C, fiel die Wuchsmasse farblos und nur gelegentlich
rötlichbraungefärbt an. Es war ein blaßbräunliches lösliches Pigment vorhanden, und gelegentlich
wurde Verflüssigung der Gelatine beobachtet.
10. Als Kohlenstoffquellen für den Wuchs auf Pridham-Gottlieb's Flächenmedium beim Bebrüten
bei 27 0C sind verwendbar Glucose, Fruktose, Galaktose, Mannose, Inositol, Maltose
und Raffinose, und darauf war das Wachstum sehr reichlich. Rhamnose, Sorbitol, Salicil, Dulcitol,
Saccharose und Inulin sind schlechter verwendbar. Arabinose, Lactose, Dextrin und Stärke kann
man kaum verwenden.
11. Die Merkmale des für die erfindungsgemäße Gewinnung des Antibiotikums Kasugamycin eingesetzten
Stammes Nr. M 338-M1 können wie folgt zusammengefaßt werden: Er gehört zu der Art
der Streptomyceten und hat lange Luftmycelien, deren Spitzen schleifenförmig oder spiralisch geformt
sind. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Die proteolytische Aktivität ist schwach. Das
Luftmycelium ist weiß bis olivgrau, und die Wachstumsmasse ist cremefarben bis blaßgelblichbraun
gefärbt oder rötlichbraun getönt. Es gehört nicht zu den chromogenen Typen. Es bildet
Kasugamycin.
Beim Vergleich mit bekannten Arten von Streptomyceten wurden Streptomyces galvus und Streptomyces
fulvissimus als dem Stamm Nr. M 338-M1 verwandt gefunden. Jedoch sind S. galvus auf der Oberfläche
der Sporen haarförmig ausgebildet, und S. fulvissimus ergibt goldgelbes lösliches Pigment und
zeigt starke proteolytische Wirksamkeit. Der Stamm M338-M1 dient auch, wenn er aus dem Boden isoliert
ist, zur Gewinnung anderer Antibiotika, Aureothricin und Thiolution. Daher kann man den Stamm
M 338-M1 vergleichen mit Streptomyces thiluteus, Streptomyces celluloflavus und Streptomyces cyanoflavus.
Streptomyces· thioluteus bildet quirlförmige Spitzen. S. celluloflavus bildet gelblichgrünes Pigment
und zeigt starke proteolytische Wirkung. S. cyanoflavus ist nicht spiralisch geformt, bildet grünlichblaues Pigment und zeigt starke proteolytische Wirkung.
Durch diese Merkmale kann der Stamm M 338-M1 von den anderen Arten unterschieden
werden. Außerdem ist der Stamm M 338-MI von diesen Arten hinsichtlich deren Sensitivität gegen verschiedene
Antibiotika unterschiedlich.
Die vorgenannten Merkmale reichen aus, um den erfindungsgemäß gewonnenen Mikroorganismus von
den bisher beschriebenen Arten an Streptomyceten zu unterscheiden und zu zeigen, daß der Stamm M 338-MI
zu einer neuen Art gehört. Variationen und Mutationen des zuvor beschriebenen Organismus können natürlich
auftreten, wie dies bei einem Actinomyces üblich ist.
Unter Streptomyces kasugaensis ist demnach der zuvor beschriebene typische Stamm sowie alle natürlichen
und künstlichen Varianten und Mutanten dieses Stammes zu verstehen. Das bedeutet, daß der
erfindungsgemäß eingesetzte Stamm Streptomyces kasugaensis alle diejenigen Stämme einschließt, aus
denen Kasugamycin gewonnen werden kann, es sei denn, sie seien ersichtlich unterschiedlich. Beispielsweise
kann ein Streptomyces, der Aureothricin, Thiolutin und Kasugamycin bildet, als ein Streptomyces
kasugaensis im Sinne der vorliegenden Erfindung be-
zeichnet werden, sofern er sich nicht vollständig unterscheidet von dem Stamm Nr. M 338-M1 und den
Varianten und Mutanten, die man von diesem Stamm erwartet.
Mutanten des Stammes Nr. M 338-M1 haben verstärkt intensive Gelbfärbung und lassen sich durch
Monosporenselektion aus dem Stamm M 338-M1 gewinnen, und Mutanten mit einer purpurroten oder
rötlichen Färbung konnten gewonnen werden, wenn jede einzelne Kolonie nach ultravioletter Bestrahlung
abgetrennt wurde. Mutanten, mit denen kein Aureothricin und Thiolutin, wohl aber Kasugamycin gewonnen
werden konnte, wurden aus dem Stamm M 338-M1 erhalten, mit dem seinerseits Aureothricin
und Thiolutin dargestellt werden können.
In einem Beispiel, bei dem mittels eines Grundmediums aus 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,1 % K2HPO4,
0,05 °/o MgSO4-7 H2O und 0,3% NaCl gearbeitet wurde, konnte die Gewinnung von Kasugamycin
mit den nachfolgenden Kulturen aus M 338-M1 beobachtet werden: Die Mutante Nr. Ml, die dem
Orinigal entspricht:
504 γ/ccm in einem Medium mit
1,0 °/0 Glucose am 6. Tag (pH 8,0);
390 γ/ccm mit 1,0 % Glucose und
0,35% CaCO3 am 6. Tag (pH 8,0);
488 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 5. Tag (pH 7,2);
488 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 5. Tag (pH 7,2);
666y/ccm mit Maltose 1,5% und
0,35%CaCO3 am 5. Tag (pH 7,4).
Die Mutante Nr. M 2, die dem Originalstamm ähnlich war:
126 γ/ccm Kanamycin, hergestellt in einem 1,0 % Glucose enthaltendem Medium am 5. Tag
(pH 7,4);
(pH 7,4);
504 γ/ccm mit 1,5 % Glucose und
0,35% CaCO3 am 6. Tag (pH 8,0);
702 γ/ccm mit 1,5 % Maltose am 4. Tag (pH 6,6);
576 γ/ccm mit 1,5% Maltose und
0,35 % CaCO3 am 5. Tag (pH 7,4).
Eine gelbliche Mutante Nr. 5 wurde nach einzelner Sporenselektion erhalten:
414y/ccmin einem 1,5% Glucose enthaltendem Medium am 6. Tag (pH 8,2);
396 γ/ccm mit 1,5% Glucose und
0,35% CaCO3 am 4. Tag (pH 6,6);
900 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 4. Tag (pH 6,4);
702 γ/ccm mit 1,5% Maltose und
0,35% CaCO3 am 6. Tag (pH 7,6).
Eine purpurrote Mutante Nr. Ul wurde nach Ultraviolettbestrahlung erhalten:
414y/ccm in einem Medium von 1,5% Glucose
am 6. Tag (pH 8,2);
am 6. Tag (pH 8,2);
504y/ccm mit 1,5% Glucose und
CaCO3 am 5. Tag (pH 8,0);
630 γ/ccm mit 1,5% Maltose am 6. Tag (pH 8,0);
468 γ/ccm mit 1,5% Maltose und
CaCO3 am 6. Tag (pH 7,8).
Eine rötliche Mutante Nr. U 2 wurde nach Ultraviolett-Bestrahlung erhalten:
324y/ccm in einem 1,5% Glusoce enthaltendem Medium am 6. Tag (pH 8,0);
558 γ/ccm mit 1,5 % Glucose und
0,35% CaCO3 am 5. Tag (pH 6,4);
684 y/ccm mit 1,5% Maltose am 4. Tag (pH 6,4);
ίο 540 γ/ccm mit 1,5% Maltose und
0,35% CaCO3 am 5. Tag (pH 7,4).
Aureothricin und Thiolutin werden oft gleichzeitig mit Kasugamycin gewonnen. Jedoch ändern sich die
Mengen in Abhängigkeit von den Stämmen und Medien, die verwendet werden. Beispielsweise gewinnt
man aus der Mutante Nr. M 5 und einigen der nach Ultraviolettbestrahlung erhaltenen Stämme Kasugamycin,
jedoch keinerlei Aureothricin und Thiolutin.
Wenn S. kasugaensis unter geeigneten Bedingungen sich vermehrt, kann man Kasugamycin gewinnen. Man
kann einen zum Bebrüten geeigneten Ansatz mit Kasugamycin herstellen in der Weise, daß man Sporen
oder Mycelien von Kasugamycin hervorbringenden Organismen in ein geeignetes Medium gibt und dann
unter aeroben Bedingungen bebrütet. Man kann für die Gewinnung von Kasugamycin feste Nährböden
einsetzen, jedoch ist es für die Herstellung größerer Mengen vorteilhafter, das Kulturmedium in flüssiger
Form einzusetzen. Es kann bei irgendeiner Temperatur bebrütet werden, die innerhalb des Bereiches liegt, bei
dem die Kasugamycin hervorbringenden Organismen wachsen können und das Kasugamycin bilden können,
dabei wird eine Temperatur von 25 bis 3 5 0C bevorzugt.
Es können mit Erfolg alle solche Medien für die Gewinnung von Kasugamycin eingesetzt werden, die
irgendeine Art von Nährstoffquelle für Actinomyceten enthalten. Beispielsweise kann man handelsübliche
Produkte wie Pepton, Fleischextrakt, Getreideweichwasser, Baumwollsaatmehl, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl,
Hefeextrakt, N-Z-Amine, Kasein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat oder andere
stickstoffhaltige Materialien, wie beispielsweise Mehltau u. dgl. als Stickstoffquelle, mit Vorteil einsetzen.
Die im Handel erhältlichen Produkte wie beispielsweise Lactose, Glyzerin, Saccharine, Stärke, Glucose,
Maltose, Melasse und andere kohlehydrathaltige Stoffe oder Fette im reinen oder rohen Zustand können als
Kohlenstoffquelle mit Vorteil verwendet werden. Reine oder rohe Maltose oder Stärke, die zu Maltose hydrolysiert
ist, gehört zu denjenigen Kohlenstoffquellen, die für die erfindungsgemäße Gewinnung von Kasugamycin
bevorzugt werden. Natriumchlorid, Natriumoder Kaliumphosphat, Calciumcarbonat oder Magnesiumsulfat
können ebenfalls zugegeben werden. Es können, falls erforderlich, Spuren von Metallsalzen
zugegeben werden. Demzufolge sind alle Arten von Zusätzen erlaubt, die verwendet werden können von
den Kasugamycin hervorbringenden Organismen für die Produktion des Kasugamycins. Dazu gehören alle
diejenigen Materialien, die bei der Züchtung von Actinomyceten, die beispielsweise in der USA.-Patentschrift
2 931 798 beschrieben, mit Vorteil eingesetzt werden.
Die Bebrütung wird fortgeführt, bis sich eine nennenswerte Menge an Kasugamycin gebildet hat.
Beispielsweise wurden Sporen und Mycelien von der schräg angeordneten Kultur von Streptomyces ka-
sugaensis in ein aus 2% Glucose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1 % K2HPO4, 0,05 % MgSO4 7 H2O und 0,3 %
NaCl bestehendes Medium eingepflanzt, dann wurde der pH-Wert auf 7,0 einreguliert, und durch Schütteln
der Kultur wurden darin die aeroben Bedingungen bei 5 27 °C eingestellt. Es wurde dann in 3 bis 5 Tagen die
Ansammlung von Kasugamycin beobachtet. In diesem Falle wurden Aureothricin, Thiolutin und polyene antifungicide
Substanzen gleichzeitig gewonnen. Kasugamycin läßt sich schwierig aus der Gärlösung in organische
Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Butylacetat, Äthylacetat u. dgl., überführen, während
Aureothricin, Thiolutin und Polyenantibiotika von den organischen Lösungsmitteln ausgezogen werden,
insbesondere von Butanol. An Hand dieser Eigenschäften kann man Kasugamycin aus der Gärlösung
von den anderen Antibiotika in der Gärlösung abtrennen.
(1) Probe von Kasugamycin
a) 100 g grüner Blätter oder Stroh von Reispflanzen wurden in kleine Stücke geschnitten, und dazu wurde
11 Wasser gegeben. Nachdem man 30 Minuten gekocht hatte, wurde durch vier Schichten Gaze filtriert,
und das Filtrat wurde mit Wasser auf 11 aufgefüllt. Zu dieser Lösung wurden Saccharose und Agar zügegeben,
und zwar in solchen Mengen, daß eine Konzentration von 5 bzw. 2,2% vorlag. Dann wurde 20 Minuten
bei 1200C im Autoklav behandelt. Alsdann wurde eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5,
die aus M/15-Na2HP04 und M/15-HC1 (oder M/10-Zitronensäure
und M/5-Natriumphosphat, gemischt in einem Verhältnis von 24,3:25,7, so daß sich ein
pH-Wert von 5,0 ergab) sterilisiert. Das zuvor genannte Medium und die Pufferlösung wurden im Verhältnis
von 1:1 vermischt, und von dieser Mischung wurden 10 ecm in einer Petrischale (mit einem Durchmesser
von 10 cm) zum Erstarren gebracht. In dieses Medium wurden Sporen von Piricularia oryzae suspendiert.
In üblicher Weise wurde auf dieses geimpfte Agarmedium zylinderförmige Gefäße aufgesetzt und
mit einer Untersuchungsprobe oder einer Standardlösung gefüllt. Der pH-Wert der Probelösung wird dem
des Mediums angeglichen. Es wird 48 Stunden lang bei 27 0C bebrütet. Der Durchmesser der inhibierten
Zone rund um jeden Zylinder wird dann gemessen. Kasugamycin-Hydrochlorid von 30y/ccm zeigte eine
Inhibitionszone von etwa 30 mm Durchmesser. Wenn Aureothricin, Thiolutin oder Polyensubstanz in der
Probelösung enthalten ist, wird die Untersuchung durchgeführt, nachdem diese Antibiotika durch Butanol
bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiertworden sind.
b) Pseudomonas tabaci wird auf eine schräggestellte Kultur, bestehend aus 0,2% Natriumglutamat, 0,2%
K2HPO4, 0,1% MgCl2 · 7 H2O, FeSO4 · 7 H2O, 2,0%
Saccharose, 0,2% Hefeextrakt, 0,5 % Pepton (Polypepton) und 1,2% Agar (pH 6,8) geimpft und bei
27° C 24 Stunden lang bebrütet. Von dieser Kultur wurde ein schleifenreicher Impfling in eine 1% Glucose
enthaltende Bouillon gebracht und 24 Stunden bei 27°C bebrütet. Dann wurden 5 ecm eines aus 0,5%
Glusoce, 0,5 % Pepton (Polypepton) und 2,0 % Agar (pH 7,0) bestehendes Medium in eine Petrischale mit
einem Durchmesser von 9 cm eingebracht, und darauf wurde eine aus 5 cm des gleichen Mediums, das mit
der zuvor beschriebenen Kulturmasse in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 % beimpft worden war, darübergeschichtet.
Eine Scheibe (8 mm Durchmesser), die eine Prüfprobe enthielt, wurde auf die Platte aufgesetzt
und bei 270C 17 bis 18 Stunden lang bebrütet. Das Beispiel und die Standardprobe wurden mit Phosphatpuffer
vom pH 7,0 verdünnt. Gewöhnlich zeigt Kasugamycin dann bei 400 γ/ccm einen Inhibitionsdurchmesser
von etwa 18 mm.
(2) Eine Schüttelkultur wurde in einer Flasche mit einem Inhalt von 500 ecm, die 125 ecm eines Mediums
enthielt, bei 27 bis 29° C auf einer hin- und hergehenden Schüttelmaschine (mit einer Amplitude von 8 cm bei
200 Gängen je Minute) dargestellt.
(3) Eine Behälterkultur wurde in einem 30-1-Tank aus rostfreiem Stahl angesetzt, der 15 1 eines Mediums
enthielt, das mit 201 Luft je Minute belüftet wurde und worin mit 600 Umdrehungen pro Minute gerührt
wurde. Wenn man einen 400-1-Behälter einsetzt, dann benötigt man 180 bis 2001 des Mediums. Man muß
dann mit 2001 je Minute belüften und mit 200 Umdrehungen pro Minute rühren.
(4) Der Ansatz für die Schüttelkultur und für die Behälterkultur wurde wie folgt hergestellt: Ein
schleifenreiches Impfstück von einer schräg angeordneten Kultur des Stammes Nr. M 338-M1 oder seiner
Nachkulturen, wurde auf das Medium (pH 7,0), bestehend aus 1,5 % Glucose, 1,5 % Sonnenblumenmehl,
0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4-7 H2O, 0,3% NaCl
und 0,5 % CaCO, aufgeimpft, und dann wurde 3 Tage lang bei 27 bis 29 0C unter Schütteln bebrütet. Die dabei
erhaltene Brutmasse wurde für die Kulturansätze verwendet.
Gewinnung von Kasugamycin durch Fermentation
Bei einem Beispiel, bei dem zu einem Basismedium, bestehend aus 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% K2HPO4,
0,05 % MgSO4 · 7 H2O und 0,3 % NaCl, verschiedene Kohlenstoffquellen zugegeben und das pH auf 7,0
eingestellt war, wurden unter Verwendung einer Schüttelkultur die nachfolgenden Ergebnisse erzielt:
Dauer der Fermentation in Tagen | ||||||
1 | 2 | 3 | 5 | 6 | ||
1,5% Maltose | ||||||
pH-Wert | 6,6 | 6,8 | 7,0 | 6,6 | 7,0 | 7,0 |
Kasugamycin, μg/ccm | 0 | 216 | 763 | 1037 | 1224 | 1224 |
Reduzierender Zucker, mg/ccm | 20,0 | 18,5 | 12,0 | 10,2 | 8,6 | 8,4 |
1,5% Maltose und 0,5% CaCO3 | ||||||
pH-Wert | 6,4 | 6,8 | 7,0 | 6,6 | 7,0 | 7,2 |
Kasugamycin μg/ccm | 0 | 180 | 799 | 907 | 1044 | 900 |
Reduzierender Zucker, mg/ccm | 21,2 | 17,0 | 11,9 | 5,8 | 8,4 | 8,3 |
9 10
Tabelle (Fortsetzung)
Dauer der Fermentation in Tagen | |||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
1,5% Glucose und CaCO3 = 0,5% | |||||||
_TT pH |
6,0 | 6,2 | 6,4 | 6,2 | 7,0 | Π Λ 7,4 |
|
υ | 117 | 547 | 576 | 410 | |||
ID, I | 15,4 | 6,7 | 2,6 | 6,0 | A ά. | ||
1,0% lösliche Stärke und 0,5% Glucose | |||||||
pH | 6,U | 6,8 | 8,0 | 8,0 | 8,4 | ο,δ | |
U | 95 | 86 | 187 | 122 | yu | ||
1? OniiTiAiiATinor f 11 r* L*O r ύυ\ rr I r*r*fv\ | 1 J, J. | 12,6 | 11,3 | 6,0 | 12,1 | ||
1,0% Glyzerin und 0,5% Glucose | |||||||
PH | 5,6 | 5,2 | 6,8 | 6,8 | 7,6 | 8,4 | |
Kasugamycin, μg/ccm | 0 | 54 | 112 | 241 | 130 | 85 | |
Reduzierender Zucker, mg/ccm | 11,4 | 10,0 | 4,2 | 2,5 | 5,1 | 4,6 | |
Hydrolysierte Stärke 3,0% | |||||||
pH-Wert | 6,0 | 6,4 | 7,0 | 7,0 | 7,2 | 7,4 | |
Kasugamycin, u.g/ccm | 0 | 36 | 299 | 563 | 439 | 504 | |
Reduzierender Zucker, mg/ccm | 27,1 | 23,7 | 12,5 | 5,0 | 18,0 | 11,8 |
Wenn Medien, die verschiedene Stickstoifquellen aufweisen, untersucht wurden, unter Verwendung des
Grundmediums, bestehend aus Maltose 1,5%, 0,3% NaCl, 0,1% K2HPO4, 0,1% MgSO4 · 7 H2O, 0,0007%
CuSO4-5 H2O, 0,0001% FeSO4-7 H2O, 0,0008 % MnCl2 · 4 H2O und 0,0002% ZnSO4-7 H2O (pH 7,0),
wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
Tage
Stickstoffquellen | 3 pH |
μg/ccm | pH | 4 μg/ccm |
pH | μg/ccm | pH | |
6 | ||||||||
0,75% Pepton \ 0,3% Fleischextrakt J |
7,8 | 450 | 8,0 | 324 | 8,0 | 576 | 7,8 | 324 |
0,75% Pepton \ 0,3% Hefeextrakt J |
6,8 | 252 | 6,8 | 324 | 6,4 | 360 | 5,6 | 396 |
0,75 % Kaseinhydrolysat \ 0,3% Fleischextrakt J |
8,0 | 342 | 8,2 | 216 | 8,4 | 270 | ||
0,75% NZ-Amin A ) 0,3% Fleischextrakt J |
8,2 | 198 | 8,4 | 144 | 8,6 | 270 | ||
1,5% Sojabohnenmehl | 6,6 | 6,4 | 396 | 6,6 | 720 | 6,6 | 396 | |
1,5 % Sojabohnenmehl 1 0,2% (NH4)2SO4 J |
7,0 | 414 | 6,8 | 342 | 7,0 | 864 | 6,6 | 540 |
1,5 % BaumwolIsaatmehI | 6,0 | 6,0 | 360 | 6,2 | 360 | 6,4 | 216 | |
1,5 % Sojabohnenmehl \ 0,3 % Fleischextrakt J |
6,6 | 252 | 6,4 | 432 | 6,4 | 612 | 7,6 | 900 |
Die Ergebnisse zeigen, daß vielerlei stickstoffhaltige dies notwendig ist. Wenn beispielsweise Aureothricin
Materialien bei der erfindungsgemäßen Herstellung 55 und Thiolutin vorhanden sind, so können diese
von Kasugamycin brauchbar sind. Substanzen durch Extraktion mit solchen Lösungsmitteln
entfernt werden. Wenn ein Polyen-Antibioti-Extraktion und Reinigung des Kasugamycins Jcurtl5 das näufig durch vieie Arten von Streptomyceten
Das erfindungsgemäße Verfahren enthält die Extrak- produziert wird, vorhanden ist, so kann man dieses
tion und Reinigung von Kasugamycin und dessen 60 durch Extraktion mit Butanol in saurem Medium
Säureadditionsverbindungen. Kasugamycin, dessen entfernen. Aureothricin-Antibiotika und Polyen-Anti-Säurechlorid
oder dessen Sulphat sind in Wasser biotika können auch durch Adsorptionsmethoden
leicht löslich, und in der Gärbrühe befindet sich das unter Verwendung von aktiver Kohle oder von
Kasugamycin zur Hauptmenge in der flüssigen Phase. Ionenaustauscherharzen abgetrennt werden.
Kasugamycin _ ist weitgehend unlöslich in Butanol, 65 Wenn man Kasugamycin in wäßriger Lösung bei Allylacetat, Äther, Chloroform und Benzol, und die verschiedenen pH-Werten bei 60° C 1 Stunde lang Behandlung mit diesen Lösungsmitteln kann dazu erhitzt, so behält es beim pH-Wert von 2,0 82,5% dienen, einige Verunreinigungen abzuziehen, wenn seiner Aktivität, bei einem pH-Wert von 5,0 99,0%
Kasugamycin _ ist weitgehend unlöslich in Butanol, 65 Wenn man Kasugamycin in wäßriger Lösung bei Allylacetat, Äther, Chloroform und Benzol, und die verschiedenen pH-Werten bei 60° C 1 Stunde lang Behandlung mit diesen Lösungsmitteln kann dazu erhitzt, so behält es beim pH-Wert von 2,0 82,5% dienen, einige Verunreinigungen abzuziehen, wenn seiner Aktivität, bei einem pH-Wert von 5,0 99,0%
seiner Aktivität und bei pH-Werten von 7,0 und 9,0 100 % seiner Aktivität. Nach Aufbewahren in 0,1 n-HCI
bei Zimmertemperatur über 6 Stunden trat kein Abbau ein, und nach 6stündiger Lagerung in Ο,Ιη-NaOH verblieben
noch 85% der Aktivität. Demzufolge ist das beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende Kasugamycin
so ausreichend beständig, daß es im Vakuum destilliert, versprüht, getrocknet oder sonstwie behandelt
werden kann zwecks Konzentrierung, Trocknung aus der Gärlösung oder aus wäßrigen Kasugamycin
enthaltenden Lösungen.
Das beim Konzentrieren und Trocknen der Gärflüssigkeit gewonnene Pulver kann zur Vorbeugung
gegen den Befall von Reis mit Mehltau benutzt werden. Falls erforderlich, kann dieses Pulver mit Methanol,
Äthanol, Aceton oder Butanol zwecks Entfernung von Verunreinigungen gewaschen werden. Mit Adsorbentien
kann Kasugamycin ebenfalls aus der Gärlösung oder aus seiner wäßrigen Lösung abgetrennt werden.
Als Adsorbens nimmt man zu diesem Zweck vorteilhaft Aktivkohle. Wenn Kasugamycin an Aktivkohle
adsorbiert ist, kann man es wirksam mit Methanol, wäßrigem Äthanol, wäßrigem Aceton oder mit
butanolgesättigtem Wasser eluieren, insbesondere bei saurem pH, nachdem man mit Salzsäure angesäuert hat.
Da Kasugamycin in einen sehr schwach basischen Charakter aufweist, kann man es auch an Ionenaustauscherharzen
adsorbieren. IR-120, das Sulfcnsäurereste hat, adsorbiert Kasugamycin besser als ein
Kationenaustauscherharz wie IRC-50, das Carboxylsäurereste aufweist, Man eluiert mit wäßriger Säurelösung
oder noch wirksamer mit wäßrigem Ammoniak. Wenn man Schwefelsäureharze einsetzt, erhält man
gute Elution, wenn man mit erhöhter Konzentration an Salzsäure oder Schwefelsäure, beispielsweise mit
einer Konzentration von über 0,5 normal arbeitet.
Das erfindungsgemäß gewonnene Kasugamycin zeigt in wäßrigem Ammoniak bei 37°C folgende Stabilität:
In 0,5n-Ammoniak wurde es bei der Zeit 0 nicht zerstört, 45 % der Aktivität lagen auch nach 4 Stunden
noch vor und 15% der Aktivität nach 18 Stunden; in Ι,Οη-Ammoniak verblieben bei der Zeit 0 95%, nach
4 Stunden 25% und nach 18 Stunden 5,0%; in 2,0n-Ammoniak verblieben bei der Zeit 0 76 und
12,5% oach 4 Stunden; in 4,0n-Ammoniak verblieben bei der Zeit 0 55 % und nach 4 Stunden 5,0 %. Es ist
daher wünschenswert, die Elution mit Ammoniak bei Temperaturen vorzunehmen, die so niedrig wie möglich
liegen und ebenfalls bei den geringstmöglichen Konzentrationen von Ammoniak. Weiterhin ist es
wünschenswert, den pH-Wert des Eluates so einzustellen, daß die Reaktion so schnell wie möglich neutralisiert
ist, und dann im Vakuum zu konzentrieren, nachdem der pH-Wert eingestellt ist. Kasugamycin ist
im Hinblick auf seine Struktur eine Art Zucker, und es kann daher an Anionenaustauscherharzen, die mit
Borsäure behandelt worden sind, adsorbiert werden und kann mit wäßriger Salzsäurelösung eluiert werden.
Die Anionenaustauscherharze vom OH-Typ sind Mittel, die vorzüglich geeignet sind, um die saure
Lösung von Kasugamycin zu neutralisieren. Der KationenexponentPK des Kasugamycins beträgt 6,6
bis 7,1, d. h. Kasugamycin ist eine schwache Base. Adsorption von Kasugamycin an Kationenaustauscherharzen
wird verringert oder inhibiert durch starke basische Verunreinigungen. Daher läßt sich Kationenaustauscherharz
auch mit Vorteil einsetzen, und zwar zur Entfernung von stark basischen Verunreinigungen,
wenn dies erforderlich ist. Ein Material, das Kasugamycin und stark basische Verunreinigungen enthält,
wird dazu durch eine eine ausreichende Menge von IRC-50 als Na- oder H-Typ enthaltende Kolonne
geleitet, und dabei werden die stark basischen Verunreinigungen entfernt; danach wird das Kasugamycin
an IRC-120-Harz adsorbiert, und aus diesem wird es eluiert.
Danach zentrifugiert, filtriert man oder benutzt ίο sonstige übliche Methoden, um die MyceHummasse
von der fermentierten Brühe abzutrennen. Die Abtrennung des Myceliums wird leichter, wenn die
fermentierte Brühe auf einen sauren pH-Wert eingestellt und aktive Kohle hinzugegeben wird. Die fermentierte
Brühe wird zunächst von den Feststoffen befreit, zu denen auch das Mycelium gehört, und dann kann
man es durch eine Ionenaustauscherharzkolonne durchschicken. Man kann auch als erstes durch ein Sieb
hindurchfiltrieren, das fein genug ist, um das Harz zu tragen; und dann kann man dieses feine Mycelien
enthaltende Filtrat einem Ionenaustauschertunn aufgeben.
Die Fermentierungsbrühe wird auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, dann wird die aktive Kohle in einer
Menge bis zu 0,5 % Endkonzentration hinzugegeben. Nachdem man genügend gerührt und filtriert hat, wird
das Filtrat auf einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5 eingestellt. Dieses Harz wird auf eine Säule mit einer
solchen Menge an Austauscherharz IRC-50 vom H-Typ aufgegeben, daß sie nicht zur Adsorbierung
von Kasugamycin ausreicht. Der pH-Wert der durchlaufenden Lösung wird auf 4,0 eingestellt, und dann
wird die Lösung auf eine Kolonne aufgegeben, die IR-120-Harz (Η-Typ oder Ammoniak-Typ, die dem
Na-Typ vorgezogen werden), und an dieser Säule wird das Kasugamycin adsorbiert. Danach wird mit
wäßrigem Ammoniak eluiert, und das Eluat wird neutralisiert. Dabei sollte die Elution möglichst bei
Temperaturen von weniger als 15° C vorgenommen werden, und das Eluat sollte 5 Stunden nach der
Elution neutralisiert werden. Das Eluat wird zur Trockene verdampft oder durch Gefriertrocknung
konzentriert, und man erhält das Kasugamycin als Rohpulver. Bei einer anderen Art des erfindungsgemäßen
Verfahrens fügt man Aktivkohle zu dem Gärbrühefiltrat hinzu. Das adsorbierte Kasugamycin
wird mit wäßrigem, Salzsäure enthaltendem Methanol eluiert, und das Eluat wird konzentriert und getrocknet.
Das so erhaltene Rohpulver kann weiterhin durch IR-120-Austauscherharz gereinigt werden, wie dies
zuvor beschrieben wurde.
Bei einer anderen Verfahrensvariante wird das rohe Pulver in Wasser gelöst und durch eine Kolonne mit
aktiver Kohle hindurchgeleitet. Nach dem Waschen wird mit Salzsäure (beispielsweise mit 0,05 n-Salzsäure)
eluiert, und die aktive Fraktion wird durch Anionenaustauscherharze neutralisiert. Nachdem man
im Vakuum konzentriert hat, wird das 10- bis 25fache Volumen an Äthanol zugegeben. Danach wird bei
niedrigen Temperaturen stehengelassen, und dabei erscheinen dann Kristalle von Kasugamycin-Hydrochlorid.
Dieses zuvor beschriebene Verfahren ist eines der bevorzugten Verfahren zur Extraktion und Reinigung
von Kasugamycin.
Wie üblich bei der Gewinnung von verschiedenen Antibiotika können die Kristalle auch ohne den
Zwischenschritt der KohlenstofFchromatographie gewonnen werden, wenn die Konzentration des Kasu-
gamycins in der Brühe ausreichend erhöht ist. So erhält man z. B., wenn man das Eluat aus dem
IR-120-Harz im Vakuum eindampft, kristallines Kasugaymcin-Hydrochlorid, wenn die Fermentationsbrühe
mehr als 500 jAg/ccm an Kasugamycin enthält. Wenn man an Stelle von Salzsäure Schwefelsäure einsetzt,
so kann man Kasugamycin-Sulfat erhalten. Wie weiter unten noch in den Beispielen näher dargelegt wird,
geht man bei einer der bevorzugten Arbeitsweisen zur Gewinnung von Kasugamycin in der Weise vor, daß
man das Kasugamycin an einem Kationenaustauscherharz direkt aus dem Filtrat der Fermentationsbrühe
adsorbieren läßt und dann eluiert.
Infolge der schwach basischen Natur des Kasugamycin kann man es aus wäßrigen Lösungen mit
Säuren und wasserunlöslichen Substanzen wie beispielsweise Pentachlorphenol, Laurylsulfonsäure usw.
entfernen.
Es seien nun die Eigenschaften von Kasugamycin näher beschrieben. Kasugamycin ist farblos und seine
Salzsäureadditionsverbindung erhält man in Form von weißen Kristallen. Die Salzsäureverbindung zersetzt
sich bei 202 bis 204° C Die Salzsäureverbindung ist leicht löslich in Wasser, fast unlöslich in Methanol
und unlöslich in Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Benzol. Die maximale Löslichkeit des Hydrochlorids
in Wasser beträgt etwa 1 g/80 ecm. Im Ultraviolettlicht innerhalb des Bereiches von 220 bis 400 ηιμ
findet keine maximale Adsorption statt. Das IR-Spektrum ist in F i g. 1 dargestellt. Die spezifische optische
Drehung beträgt +120° (1,6% in Wasser). Die Substanz ist schwach basisch und hat einen Kationenexponenten
PKa' von 7,1. Das Molekulargewicht wurde osmotisch auf 449 und durch Titration auf 453
ermittelt. Die Elementaranalyse und die Bestimmung des Kristallwassers ergeben die folgende Formel für
das Hydrochlorid:
C 15H 27O 10N3-HCl-H 2O:
Berechnet
Berechnet
C 38,84, H 6,52, N 9,06, O 37,94, Cl 7,64;
gefunden
gefunden
C 38,58, H 6,94, N 9,66, O 37,05, Cl 8,16,
38,34, 6,62, 9,04, 37,54, 8,39.
38,34, 6,62, 9,04, 37,54, 8,39.
Die Elementaranalyse des Hydrobromids war folgende :
Ci 5H 27O 10N3-HBr-H 2O:
Berechnet
Berechnet
C 35,44, H 5,95, N 8,27, O 34,62, Br 15,72;
gefunden
gefunden
C 35,27, H 6,00, N 8,48, O 33,31, Br 16,94.
Das kernmagnetische Resonanzspektrum des Hydrochloride in D 2O-Losung mit Natriumsalz der 3-(Trimethylsilyl)-propansulfonsäure
als Standardprobe und aufgenommen mit einem Varian-60-Instrument ist in Fig. 2 veranschaulicht. Man erkennt Linien an den
folgenden Stellen ppm: 1,22, 1,32, 2,25, 2,33, 2,42, 2,50, 3,55, 3,79, 4,05, 4,38, 4,50, 4,70, 5,32, 5,35. Die
Ninhydrinreaktionen unter Verwendung von Pyridin und Perjodatpermanganat sind positiv, dagegen sind
die Reaktionen von Seliwanoff, Sakaguchi, Ferrichlorid und Fehlingsche Lösung negativ. Die Anthron-
und Elson-Morgan-Reaktionen, ausgeführt unter üblichen Bedingungen, verlaufen negativ. Bei der Anthron-Reaktion
tritt nach Behandlung mit salpetriger Säure eine rotbraune Färbung auf. Elektrophorese
unter hoher Spannung mit
HCOOH — CH3COOH — H2O
(25 : 75 : 900) bei einem pH-Wert von 1,8, 3000 V/
ίο 40 cm, 15 bis 20mA/10cm und IO0C 15 Minuten lang ergibt eine Verschiebung zur Anode hin von
3,7 cm. Der Rf-Wert auf einem Perchromatogramm unter Verwendung von Toyo-Filterpapier Nr. 519 und
Butanol—Essigsäure—Wasser (2:1:1) liegt bei 0,28, der Rf-Wert in gleicher Weise bestimmt, jedoch unter
Verwendung von Butanol—Äthanol—-Wasser und Ammoniak (4:1: 4,9 : 0,1) liegt bei 0,07, der Rf-Wert
von der Substanz, die unter Verwendung von Butanol—Essigsäure—Wasser
(6,3:1:2,7) erhalten wurde, beträgt 0,06.
Auf einem Agarmedium aus Pepton und Fleischextrakt, inhibierte Kasugamycin-Corynebacteriumxerosis
bei 50μg/ccm, Sarcina lutea (X-Stamm) bei 100 ^g/ccm, einen Stamm von Klebsiella pneumoniae
bei 50 μg/ccm, Proteus vulgaris (OX19) bei 100 μg/ccm, Pseudomonas aeriginos bei 10Ö μg/ccm, verschiedene
Stämme von Ruhrbakterien bei 100 μg/ccm und Brucella melitensis bei 6,25 μg/ccm, während 100 μ§/εεηι
keine sonstigen Arten von Bakterien, die geprüft wurden, inhibierten. Auf einem synthetischen Medium
von Stephenson —Whetham wurde eine höhere antibakterielle Aktivität gewonnen als auf
einem Pepton-Fleischextrakt-Medium. In Peptonlösung wurden von 6,25 bis 25,0μg/ccm an Kasugamycin
zwanzig klinische Isolierungen an Pseudomonas inhibiert, während 25,0 bis 50,0 μg/ccm zwölf
Isolierungen inhibierten. Die Zugabe von Serum verschlechterte die Antibakterielle Aktivität nicht, verstärkte
jedoch die Aktivität gegen S. typhi, S. paratyphi, K. pneumoniae, Shigella. In 10%iger Serumbrühe
wurden S. flexneri und Kl. pneumoniae bei Konzentrationen von 6,25 μg/ccm inhibiert. Auf
Blutagar wurde Pneumococci bei 50 bis 100 μg/ccm inhibiert.
Die Toxität ist sehr niedrig. Die Verträglichkeit bei Mäusen bei intravenöser, subkutaner oder intraperitonealer
Injektion von 1000 mg/kg blieb ohne jede Nebenwirkung. Affen vertrugen 800 mg/kg bei intravenöser
Injektion. Tägliche Gaben von 2 g, die injiziert wurden, zeigten keinerlei Nebenwirkung bei Menschen.
Wenn oral genommen, so wurden durch eine Gabe von 3 g täglich keine Zeichen von Toxidität bei Menschen
beobachtet. Es erfolgt keine Reizung. Die toxische Wirkung auf Fische ist ebenfalls niedrig.
Killifish überlebte in 100 μg/ccm Kasugamycin enthaltendem Wasser. Das nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren gewonnene Kasugamycin dient als chemotherapeutisches Mittel gegen Bakterieninfektionen,
einschließlich Pseudomonas. Die hohe Schutzwirkung gegen Reismehltau wird erreicht, ohne daß die Substanz
auf die Pflanzen toxisch wirkt. Obgleich das beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende Kasugamycin
bei 100μg/ccm in Sabouraudmedium nicht gegen Piricularia oryzae wirksam ist, inhibiert es dessen
Entwicklungjedoch bei 0,1 bis 1 μg/ccm in auf saurem pH-Wert eingestelltem Reissaftmedium. Es ist auch
bei Topftesten wirksam. Die Topfteste werden wie folgt ausgeführt: Die Blätter werden mit Reismehltau
infiziert und in steriles Wasser eingebracht, wobei sich eine Sporensuspension von Piricularia oryzae bildet.
Nach ausreichendem Schütteln wird diese Suspension über die Blätter junger Reispflanzen gesprüht, die aus
direkter Aussaat von Reiskornmasse auf »Moko-Filter« (Moko strain) in dem Topf gewachsen waren,
nachdem zwei bis drei Blätter sich an jeder Pflanze gebildet hatten. Nach dem Besprühen wurde der Topf
20 bis 24 Stunden lang in dem feuchtigkeitshaltigen Treibhaus stehengelassen, und dann wurden die Testproben
versprüht. Anschließend wurde wieder 7 Tage lang in dem Treibhaus stehengelassen, und dann wurden
die Stellen mit Krankheitsbefall auf zehn Blättern in drei verschiedenen Töpfen gezählt. Bei einem Versuch
wurde gefunden, daß durch Besprühen mit Kasugamycin in einer Konzentration von 5 μg/ccm die
Anzahl der Krankheitsstellen je zehn Blättern auf 8 und in einer Konzentration von 20 fxg/ccm auf 0,3
und in einer Konzentration von 40 μg/ccm auf 0 verringert wurde, während die Kontrollprobe, die nicht
mit Kasugamycin besprüht war, 176 Stellen mit Krankheitsbefall zeigte, die auch noch in der Weiterentwicklung
begriffen waren. Dieser Besserungseffekt war weitaus höher als derjenige von Blasticidin S.
lCK^g/ccm Kasugamycin zeigten keinerlei Toxität gegenüber den Reispflanzen. Wenn man das nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Kasugamycin zum Schutz gegen Reismehltau einsetzen
will, so ist es nicht erforderlich, es bis zu einem Reinheitsgrad zu reinigen. Es kann vielmehr bereits die
Nährflüssigkeit des erfindungsgemäß zur Herstellung des Kasugamycins eingesetzten Organismus als solche
oder aber in Form eines getrockneten Pulvers verwendet werden.
Blasticidin S. ist bekannt als ein wirksames Antibiotikum gegen Reismehltau, das von Organismen
produziert wird, die zu den Actinomyceten gehören, und Blasticidin S läßt sich leicht von Kasugamycin
unterscheiden an Hand der physicochemischen Eigenschaften, der antimikrobialen Wirkungen und der
Toxidität. Blasticidin S wirkt stark toxisch gegen Tiere und Menschen und ist bei einer Konzentration von
mehr als 20 μg/ccm auch toxisch gegenüber Pflanzen. Kasugamycin, das man auf Grund seiner physicochemischen
Eigenschaften als einen Aminozucker ansehen kann, läßt sich von Trehalosamin auf Grund
der Molekularformel, auf Grund der antimikrobialen Aktivität und an Hand der papierchromatographischen
Analyse unterscheiden, und es läßt sich ebenfalls leicht unterscheiden von Hygromycin B und B2 an Hand des
optischen Drehvermögens, der antimikrobialen Aktivität und sonstiger Kennzeichen. Das nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren gewonnene Kasugamycin zeigt ein spezielles antimikrobiales Spektrum unter
Spezialbedingungen, und es gibt keine ähnliche Kornponente unter den bekannten Antibiotika. Durch
Säurehydrolyse erhält man aus Kasugamycin (+^Inositol. Es ist dies die erstmalige Isolierung von (+)-Inositol
aus mikrobialen Produkten.
Nachfolgend ist das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise veranschaulicht, ohne daß jedoch die
Erfindung darauf beschränkt sein soll. Da die Kennwerte des Kasugamycins inzwischen klar erkannt
wurden, ist es leicht, verschiedene Modifikationen der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Wie vorstehend
ausgeführt, enthält das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung des Kasugamycins und schließt
weiterhin die mittels bekannter Methoden durch-
geführte Konzentrierung, Extraktion und Reinigung des Kasugamycins ein.
Ein 1,5% Glucose, 1,2% Sojabohnenmehl, 0,1% K2HPO, 0,05% MgSO4 ·7Η20, 0,3% NaCl, 0,5 %
CaCO3 und Silikonharz (40 ecm) enthaltendes Medium (1801) wurde in jeden der 400 1 großen Edelstahlgärbehälter
eingefüllt. Nach dem Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 6,6 eingestellt. Ein weiterer Behälter mit
900 ecm Sojabohnenöl wurde innen in die Gärvorrichtung eingesetzt, und nach 30stündiger Bebrütung wurden zusätzlich 500 ml Sojabohnenöl zugegeben. Einer
Anbaukultur des Stammes M 338-M1 wurde in dem gleichen Medium 48 Stunden lang bei 27 bis 29° C
unter Schütteln gezüchtet, worauf die Gärlösung mit 11 der auf diese Weise erhaltenen Kulturbrühe beimpft
wurde.Es wurden folgende Kulturbedingungen verwendet: Es wurde mit 200 Umdr./Min. gerührt, und
1801 Luft je Minute durchgeleitet. Die Bebrütungstemperatur betrug 27° C Die pH-Werte nach 24stündiger
Bebrütung und jeweils weiteren 6 Stunden bis zu 90 Stunden waren folgende: 6,2, 5,4, 5,1, 5,2, 5,3,
5,8, 5,8, 5,9, 6,0, 5,7, 6,6 und 6,6. Nach 92stündiger Gärung wurde die Kulturfiüssigkeit abgezogen. Das
in dieser Kulturflüssigkeit vorhandene Kasugamycin zeigte eine inhibierende Wirkung von 30 mm Durchmesser
bei einem Versuch nach Methode (a), und die 128mal verdünnte Lösung war gegen Reismehltau in
dem Topftest wirksam. Die Nährbrühe wurde scharf zentrifugiert, und dabei wurde das Mycelium von 3101
Filtrat abgetrennt. Der pH-Wert des Filtrates wurde auf 7,0 eingestellt, und dann wurden 12,5 kg Aktivkohle
zugegeben. Es wurde gerührt, und danach wurde die Kohle durch Filtertuch und Filterpapier abfiltriert.
Das Filtrat zeigte nur 5 bis 10% der Wirkung des Kulturfiltrates. Zu dem kohlehaltigen Filterkuchen
wurden 37,51 Lösungsmittel, das aus Butanol und Wasser (1:2) bestand, hinzugegeben, und es wurde
bei 45° C und einem mit Salzsäure auf 2,0 eingestellten pH-Wert eluiert. Diese Arbeitsweise wurde dreimal
wiederholt. Die Eluate wurden vereinigt. Das Gesamteluat (112,5 1) wurde stehengelassen und die 901
ausmachende Wasserschicht wurde im Vakuum auf 3,58 1 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde
der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 1,253 g eines braunen Pulvers mit einer l,8%igen Reinheit an Kasugamycin anfielen.
Es wurden 1801 des wie im Beispiel 1 beschriebenen Mediums mit 18 ecm eines Silikonharzes versehen und
in einen 4001 fassenden Gärbehälter eingefüllt. Der pH-Wert wurde mit 1 n-NaOH auf 7,0 eingestellt und
danach wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Zu diesem Medium wurden 1500 ecm einer 3 Tage lang
geschüttelten Kulturbrühe des Stammes Nr. M338-M1 zugegeben. Der mit 900 ecm Sojabohnenöl gefüllte
Behälter wurde innen in die Gärvorrichtung eingesetzt, um ein Schäumen zu verhindern. Es wurden zusätzlich200
ecm Sojabohnenöl nach 21stündiger Bebrütung und 300 ecm nach 22stündiger Bebrütung zugegeben.
Es wurde mit 200 Umdr./Min. gerührt und während der Gärperiode wurde mit 1501 Luft je Minute belüftet. Die Temperatur wurde bei 27 bis 28 0C gehalten. Nach 12 Stunden, 24 Stunden und den jeweils
folgenden 6 Stunden bis zu 92 Stunden wurden der
pH-Wert, der Gesamtzuckergehalt und die Menge an Kasugamycin bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend
aufgezeichnet. Bei diesem Gärprozeß wurden gleichzeitig Aureothricin (oder Thiolutin) gebildet.
Fermen
tation Stunden |
pH |
Gesamt
zucker mg/ccm |
Kasug
amycin y/ccm |
Aureothricin
y/ccm |
O | 6,2 bis 6,4 | 23,0 | 0 | 0 |
12 | 6,4 | 22,7 | 0 | 0 |
24 | 6,4 | 19,1 | 0 | 0 |
30 | 6,4 | 17,8 | 0 | 0 |
36 | 6,4 | 15,7 | 57,6 | 8 |
42 | 5,8 | 12,4 | 144 | 18 |
48 | 5,4 | 8,94 | 198 | 26 |
54 | 5,6 bis 5,8 | 7,04 | 252 | 36 |
60 | 6,2 | 6,56 | 432 | 15 |
66 | 6,2 bis 6,4 | 5,39 | ||
72 | 6,4 | 5,28 | 396 | 14 |
78 | 6,2 bis 6,4 | 5,23 | 504 | 11 |
90 | 6,4 | 5,61 | 450 | 18 |
92 | 6,8 | 5,61 | 518 | 24 |
Die so erhaltene Gärlösung (die 518 μg/ccm an Kasugamycin, insgesamt 82,994 g enthielt), wurde mit
1 n-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, und dann wurden 0,5% Aktivkolhe zugegeben. Die
Mischung wurde mit 15 000 Umdr./Min. scharf zentrifugiert, und es wurden 1601 an Filtrat (460μg/ccm,
insgesamt 73,728 g Kasugamycin) erhalten. Das Filtrat wurde mit 1 n-NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt,
und dann wurden 3,2 kg Aktivkohle (2,0 %) zwecks Adsorbierung des Kasugamycins zugegeben.
Alsdann wurde erneut scharf zentrifugiert und der kohlenhaltige Kuchen gesammelt. Die Flüssigkeitsanteile enthielten Kasugamycin in einer Konzentration
von 17,12 μg/ccm, und die Aktivität belief sich auf 29,1% derjenigen der Originalgärfiüssigkeit. Zu dem
kohlenstoffhaltigen Kuchen wurden 22,51 90%iges Methanol zugegeben, und dann wurde der pH-Wert
mit 1 n-HCl auf 2,0 eingestellt. Alsdann wurde bei 40 °C eluiert, es wurde weiteres 80%iges Methanol
zugegeben und zum zweiten Mal eluiert, und dabei fielen dann 45,211 an Eluat an. Dieses Eluat enthielt
851,8 μg/ccm an Kasugamycin (insgesamt 38,501 g), und die Ausbeute aus der Original-Gärflüssigkeit betrug
46,41 %. Der pH-Wert des Eluates wurde auf 4,0 bis 5,0 eingestellt, und das Methanol wurde im Vakuum
entfernt. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, und das resultierende
blaßgelbliche Pulver hatte eine Wirksamkeit von 54μg/mg (insgesamt 36,504 g, als Kasugamycin berechnet).
Die Ausbeute an Pulver, bezogen auf die Original-Gärfiüssigkeit, betrug 44,0%, und die Reinheit
des Pulvers wurde zu 5,4% berechnet.
150 g des rohen Pulvers (1,8 % Reinheit), wie es aus Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 21 destilliertem
Wasser gelöst, und auf eine 100 cm lange und 5 cm im Durchmesser Kolonne, die mit für chromatographische
Verwendung bestimmter Kohle gefüllt war, aufgegeben. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug
3 ccm/Min., und es wurde bei Zimmertemperatur gearbeitet. Die durchgelaufene Flüssigkeit zeigte keine
Anwesenheit von Kasugamycin. Die mit Kohle ge-
füllte Kolonne wurde mit 41 destilliertem Wasser gewaschen, und eine 0,05 n-HCl-Lösung wurde durchlaufen
gelassen. Die erste Fraktion von 1600 ecm hatte einen pH-Wert von 5,6 und enthielt kein Kasugamycin.
Die nächste 3000 ecm starke Fraktion hatte einen pH-Wert von 1,0, und die folgende 200 ecm starke
Fraktion hatte einen pH-Wert von 1,0. Diese beiden Fraktionen enthielten Kasugamycin. Diese aktiven
Fraktionen wurden mit Ionenaustauscherharz neutralisiert und im Vakuum auf 10 ecm konzentriert. Dazu
wurden 200 ecm Äthanol zugegeben, und es wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen. Dabei fiel ein
leicht gelblichgefärbter weißer Niederschlag aus. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlages wurden
10,84 g eines weißen Pulvers erhalten. Die Reinheit dieses Pulvers betrug 24,4%. Die Ausbeute wurde
auf 97,8% berechnet.
Ein in gleicher Weise wie im Beispiel 3 beschrieben erhaltenes Pulver hatte eine Reinheit von 36 %· 1*15 g
dieses Pulvers wurden in 150 ecm destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.
Die Lösung wurde auf eine mit Kohlenstoff gefüllte Kolonne von 29 cm Länge und 3 cm Durchmesser
aufgegeben. Es wurde bei Raumtemperatur gearbeitet, und die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1 ccm/Min.
Die Kolonne wurde mit 350 ecm destilliertem Wasser gewaschen, dann wurden 0,02 n-HCl durchlaufen gelassen,
und die durchlaufende Flüssigkeit wurde jeweils in 10-ccm-Fraktionen aufgeteilt. Die erste Fraktion
von 520 ecm wies einen pH-Wert von 5,6 auf und enthielt kein Kasugamycin. Die nächsten beiden
Fraktionen von 20 ecm hatten einen pH-Wert von 4,0 und enthielten kein Kasugamycin. Die folgende
10-ccm-Fraktion wies einen pH-Wert von 2,0 auf und enthielt Kasugamycin, jedoch zeigte sich bei der
Papierchromatographie, daß noch andere ninhydrinpositive Substanzen darin enthalten waren. Die folgenden
130 ecm hatten einen pH-Wert unter 1,0 und enthielten Kasugamycin, jedoch enthielten auch sie
andere ninhydrinpositive Substanzen. Die folgenden 430 ecm zeigten einen pH-Wert unter 1,0 und enthielten
Kasugamycin ohne sonstige ninhydrinpositive Substanzen. Diese letzte Fraktion wurde mittels Ionenaustauscherharz
neutralisiert und im Vakuum auf ein Volumen _ von 5 ecm konzentriert. Dann wurden
100 ecm Äthanol zu diesem Konzentrat zugegeben, und man erhielt 301 mg eines weißen Pulvers mit einer
92%igen Reinheit (was einer Ausbeute von 66,8% entspricht). Dieses Pulver wurde aus Wasser umkristallisiert,
und es resultierten 120 mg Kasugamycin-Hydrochlorid in Kristallform.
Das aus 1,5% Maltose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4 · 7H20, 0,3% NaCl
bestehende Medium (pH 7,0) wurde mit dem Stamm M338-M1 angeimpft und in Schüttelkultur bebrütet.
Die 3450 ecm der Lösung, die das Kasugamycin enthielt, wurde mit 1 n-HCl auf einen pH-Wert von 2,0
einreguliert, und es wurden Hyflosuper-Zellmaterial (1%) un(i Aktivkohle (0,5%) zugegeben und dann
filtriert. Bei diesem Verfahren zeigte sich, daß Kasugamycin praktisch nicht adsorbiert wurde. Das Filtrat
wurde auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4 eingestellt,
709 519/514
und dann wurde Aktivkohle in einer Menge von 2% zugegeben, um das Kasugamycin zu adsorbieren. Der
das adsorbierte Kasugamycin enthaltende kohlenstoffhaltige Kuchen wurde gesammelt. In diesem Falle
enthielt das Filtrat noch etwa 10 bis 23 % Kasugamycin. Es wurden dann 690 ecm 80%iges Methanol zu dem
kohlenstoffhaltigen Kuchen zugegeben, und der pH-Wert wurde mit 1 n-HCl auf 2,0 eingestellt. Alsdann
wurde bei 450C eluiert. Danach wurden weitere 350 ecm 80%igen Methanols zugegeben und das
Eluieren wiederholt. Die beiden Eluate wurden vereinigt, und die Ausbeute an Kasugamycin in diesem
Gesamteluat wurde auf 62% berechnet. Das methanolische Eluat wurde mit 1 n-NsOH auf einen pH-Wert
von 4,0 eingestellt und dann im Vakuum zu einem Sirup konzentriert. Zu dem Konzentrat wurde Äthanol
zugegeben, bis keine weitere Ausfällung mehr auftrat. Der Niederschlag enthielt Kasugamycin, und die überstehende
Flüssigkeit enthielt nur noch 5 bis 10 %· Der Niederschlag wurde gesammelt, und man erhielt ein
gelblichweißes Pulver von Kasugamycin, das eine Reinheit von 5,3 % hatte. Die Ausbeute, bezogen auf
die Original-Gärfiüssigkeit, betrug 45 %·
Beispiel 6 a5
5 g eines Pulvers mit einer Reinheit von 1,8 %, wie es gemäß Beispiel 1 gewonnen wurde, wurden in
500 ecm Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde auf eine mit
100 ecm Austauscherharz (H-Typ) gefüllte Kolonne aufgegeben, und die Durchflußgeschwindigkeit wurde
auf 1 ccm/Min. eingestellt. Nach dem Auswaschen der Kolonne mit 11 destillierten Wassers wurden 0,5 n-NH4OH
mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ecm/ Min. hindurchgeleitet. Die durchgelaufene Lösung
von 100 ecm wurde mit 1 n-HCl neutralisiert und dann einer Gefriertrocknung unterzogen, wobei 1,6 g eines
hellgelben Pulvers mit einer Reinheit von 9 % anfielen. Es wurde berechnet, daß die Ausbeute 88,9% betrug.
Ein vom Stamme M338-M1 durch Monosporenkultur erhaltener Stamm wurde in einem wie im Beispiel
1 beschriebenen Medium 72 Stunden lang einer Schüttelgärung unterzogen, und dann wurde 11 der
Gärflüssigkeit zu 1001 eines Mediums hinzugegeben, das 1,5% Sojabohnenmehl, 1,5% Maltose, 0,3%
NaCl, 0,1% MgSO4 · 7H20, 0,0007% CuSO4 · 5H20,
0,0008% MnCI2 ·4Η20, 0,0001% FeSO4 · 7H20,
0,0002% ZnSO4 · 7H20 enthielt und einen pH-Wert von 7,4 hatte in einen 2001 großen Gärbehälter eingefüllt,
und die Gärung wurde unter Belüftung mit 1001 Luft je Minute und unter Rühren mit einer
Geschwindigkeit von 200 Umdr./Min. bei 28 0C durchgeführt. Nach 48 Stunden wurde diese Lösung zu
14001 des gleichen Mediums, das sich in einem 20001 großen Gärbehälter befand, eingebracht, und die
Gärung wurde fortgeführt. Nach weiteren 48 Stunden betrug der pH-Wert 6,9, und es waren 160 μg/ccm an
Kasugamycin hergestellt, und nach 90 Stunden betrug der pH-Wert 7,2, und das gewonnene Kasugamycin
betrug 530 μg/ccm. Diese Gärlösung enthielt 8,4 μg/ ecm an Aureothricin. Die Bebrütung wurde abgebrochen,
und die Gärflüssigkeit wurde über Diatomeenerde filtriert. Einschließlich des zum Auswachsen des
Filters benötigten Wassers wurden insgesamt 15701
an Filtrat erhalten. 3001 Austauscherharz wurden in die H-Form übergeführt, und es wurde Ammoniak in
einer solchen Menge zugegeben, daß ein Viertel des Harzes in die Ammoniumform gebracht wurde, und
dann wurde weiter mit Wasser gewaschen. Das Filtrat aus der Gärlösung wurde durch eine dieses zuvor beschriebene
Harz enthaltende Kolonne durchlaufen gelassen. Die ersten 6101 des Auslaufes enthielten kein
Kasugamycin, die weiteren 9501 des Durchlaufes enthielten 65,2 g Kasugamycin, diese Fraktion wurde über
eine andere mit Austauscherharz gefüllte Säule geleitet. Dann wurde das Austauscherharz auf der ersten
Säule unter Verwendung von 0,5 Ii-NH4OH eluiert. Der erste Durchlauf von 53 1 enthielt 28,5 g an Kasugamycin.
Der zweite Durchlauf von 2001 enthielt 780 g an Kasugamycin. Der dritte Durchlauf von 2001
enthielt 44,2 g an Kasugamycin. Das durchgelaufene Eluat wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 6,6
neutralisiert. Das zweite Eluat wurde im Vakuum auf 6,321 konzentriert, und dazu wurden 601 Äthanol
zugegeben. Man erhielt dann 580 g an Rohkristallen von Kasugamycin-Hydrochlorid (90% Reinheit).
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene neue antibiotische Substanz Kasugamycin
ist also wirksam zum Inhibieren von Brucella, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, einigen Klebsiella- und
Blastmyceten-Arten, sie dient zum Schutze von Reispflanzen gegen progressive Infektion von Piricularis
oryzae. Es handelt sich um eine in Wasser lösliche, in Methanol wenig lösliehe, in Äthanol, Butanol,
Estern, Chloroform und Benzol praktisch unlösliche Substanz, die kein Absorptionsspektrum im ultravioletten
Licht von 220 bis 350 τημ. zeigt, die eine positive Ninhydrinreaktion gibt, dagegen negativ
reagiert bei der Tollens-, Skaguchi-, Anthron- und Elson-Morgan-Reaktion. Die Substanz enthält die
Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, sie enthält freie primäre Aminogruppen,
die schwach basisch reagieren und einen Kationenwert PKa' von 7,1 ergeben, und die mit Säuren Additionssalze
zu bilden vermögen. Das kristalline Kasu·* gamycin-Hydrochlorid hat die empirische Formel
C15H27O10N3 · HCl · H2O
und weist eine spezifische Drehung von [x]2i = +120*
(1,6% in H2O) auf. Sie schmilzt bei 202 bis 204° C unter Zersetzung und zeigt ein Absorptionsspektrum
im infraroten Spektralbereich, wenn sie in Kaliumbromid pelletisiert ist, mit folgenden Wellenzahlen,
angegeben in cm-1: 3520, 3350, 3200, 3070, 2950,2050, 1695, 1670, 1625, 1522, 1462, 1379, 1323, 1286, 1224,
1180, 1135, 1120, 1090, 1080, 1060, 1042, 1025, 975, 945, 908, 890, 870, 846, 825, 783 und 709. Das Kernresonanzspektrum
in D2O zeigt Linien bei den folgenden ppm: 1,22, 1,32, 2,25, 2,33, 2,42, 2,50, 3,55,
3,79, 4,05, 4,38, 4,50, 4,70, 5,32 und 5,35. Die Substanz zeigt ein Titrationsäquivalent von etwa 453, und
bei der sauren Hydrolyse fällt (+)-Inositol an, während bei der Hydrolyse mit Baryt
Cl4H20O10N2 · H2O
anfällt, das weiter hydrolysiert zu
C12H28O7N2
und Oxalsäure. Das Kasugamycin-Hydrobromid weist die empirische Formel
C15H27O10N3· - H 35 BHO
Claims (1)
- auf. Das Kasugamycin-Sulfat ist in Wasser löslich. Es zersetzt sich bei 210 bis 218 0CPatentanspruch:Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums Kasugamycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces kasugaensis (ATCC 15 714, ATCC 15 715) ineiner üblichen Nährlösung unter submersen Bedingungen züchtet und das Antibiotikum aus der Nährlösung durch an sich bekannte Methoden gewinnt.In Betracht gezogene Druckschriften:
Korzybski und Kurylowicz »Antibiotika«, 1961, S. 452 bis 460.Hierzu 1 Blatt Zeichnungen709 519/514 3.67 © Bundesdruckerei Berlin
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