DE2737944A1

DE2737944A1 - Verfahren zur herstellung von maltopentaose und maltohexaose

Info

Publication number: DE2737944A1
Application number: DE19772737944
Authority: DE
Inventors: Takashi Hisamatsu; Shigeharu Inoue; Katsuyoshi Iwamatsu; Taro Niida; Shoji Omoto; Takashi Shomura; Shingo Uchida; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1976-08-23
Filing date: 1977-08-23
Publication date: 1978-03-02
Also published as: JPS5326390A; US4151041A; GB1567403A; FR2362926A1; JPS5941720B2; DE2737944C2; FR2362926B1

Description

MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. No. 8, 2-chome, Kyobashi, Chuo-ku, Tokio, Japan

Verfahren zur Herstellung von Haltopentaose und Maltohexaose

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und Maltohexaose durch Kultivieren eines zur Gattung Strptomyces gehörenden Mikroorganismus.

Bekannte Verfahren zur Herstellung von Maltpentaose und Maltohexaose umfassen die Isolierung aus einem Maissirup (R. L. Wistler et al.,J. Am. Chem. Soc. 2Z (1951)» S. 5761) oder die Säurehydrolyse von Stärke (W. J. Whelan et al., J. Chem. Soc. (1953), S. 1293) oder die Behandlung von Stärke mit einer Amyläse, welche aus Fermentationsbrühen von Bakterien oder Pilzen oder aus Verdauungssaften von Tieren isoliert wurde, (Kainuma et al., FEBS Letters, 26 (1972), S. 281). Diese Arbeitsweisen besitzen einige Nachteile hinsichtlich der geringen Ausbeute von Haltopentaose und Maltohexaose oder hinsichtlich des mühseligen Arbeitsvorganges zur Isolierung der zu verwendenden Amylase und daher sind sie auf die Produktion von Maltopentaose und Maltohexaose im technischen Maßstab weniger anwendbar.

809809/0890

Aufgabe der Erfindung ist ein technisch und wirtschaftlich vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von I'Ialtopentaose und Maltohexaose. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß diese Substanzen direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden können, in welcher ein bestimmter Stamm der Gattung Streptomyces aerob inkubiert bzw. gezüchtet wurde.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Haltopentaose und/oder Maltohexaose, welches die Züchtung eines zur Bildung von Maltopentaose und/oder Maltohexaose fähigen Stammes der Art Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffquellen enthaltenden Kulturmedium für eine ausreichend lange Zeitspanne zur Bildung und zur Ansammlung von Maltopentaose und/oder Maltohexaose in der Kultur und die Gewinnung der so gebildeten Substanz bzw. so gebildeten Substanzen aus der Kultur umfaßt.

Weiterhin wurde gefunden, daß Maltopentaose und Maltohexaose welche selbst keine antimikrobielle in-vitro-Aktivität besitzen, einen günstigen Einfluß zur Erhöhung der Abwehraktivität des Wirtes gegenüber Infektion oder den ergänzenden Effekt der Potenzierung der Immunität und der antibakteriellen Aktivität der neuen Antibiotika, der Substanzen SF-II30 X^. und X₀, besitzt, die in der gleichzeitig hinterlegten, deutschen Patentanmeldung der Anmelderin (Priorität der japanischen Patentanmeldung Nr. 99757/76) beschrieben sind.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein beliebiger Stamm der Gattung Streptomyces verwendet werden, solange er im wesentlichen Maltopentaose und/oder Maltohexaose bildet. Ein spezifisches Beispiel für einen Stamm, der in geeigneter Weise verwendet werden kann, ist ein die Substanz SF-II30 bildender Stamm, der von der Anmelderin aus einer Erdprobe isoliert wurde und der als Stamm Streptomyces myxogenes SF-II30 bezeichnet wurde, siehe japanische

809809/0890

Patentveröffentlichung 30393/73· Dieser Stamm wurde bei der öffentlichen, japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Eesearch Institute" unter der Hinterlegungsnumaer FERM-P 676 hinterlegt, weiterhin bei der American Type Culture Collection, Vaehington S.C, USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31305·

Der Stamm SF-II30 besitzt die folgenden, mikrobiologischen Eigenschaften:

1. Morphologische Beobachtung

Substratmycelien wachsen gut auf verschiedenen Kulturmedien, während die Bildung von Luftmycelen im allgemeinen schlecht ist. Auf Stärkeagar und auf Stärke-Hefe-Extrakt-agar, wo sich Luftmycele entwickeln, werden kurze, dichte Luftmycele aus dem Substratmycel gebildet. Die Mycele bilden einftißige Verzweigungen, wobei keine quirlständigen Verzweigungen beobachtet werden.

Die Luftmycele tragen an ihren Spitzen Spiralen, die meisten hiervon sind vom kompakten, geschlossenen Typ und einige hiervon sind vom nicht-vollständigen oder offenen Typ. Es wird keine Bildung von Sklerotium beobachtet. Die Beobachtung im Elektronenmikroskop zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt iet. Die Sporen sind von elliptischer oder zylindrischer Gestalt und besitzen eine Größe von 0,6 - 0,7 χ 0,9 -1,0 Mikron.

2. Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

809809/0890

	X3	Luftmycel	27379U
	Tabelle I	gering, weiß
			lösliches
Kulturmedium	Wachstum	keines	Pigment
Saccharose-	schlechtes Wachs		keines
Nitrat-agar	tum, farblos
Glucose-	braun bis gräu		keines
Asparagin-	lich-braun, die
agar	Rückseite ist	keines
	matt in roter
	Farbe gefärbt
Glyzerin-	braun	keines	keines
Asparagin-
agar		keines
Calciummalat-	dünnes Wachstum,		keines
agar	blaß-braun
Glyzerin-	braun	pulverförmig,	keines
Calciummalat-		gräulich-braun
agar		Entwicklung
Stärkeagar	blaß-braun bis	hauptsächlich	keines
(anorgani sehe	braun	an der Peri
Salze/Stärke-.		pherie der
agar)		Kolonie
		grau
		keines

Hafermehlagar	gut, blaß-braun		keines
Nähragar	gutes Wachstum		braun
	mit Falten,	gräulich-braun
	braun auf der	bis grau
	Rückseite	keines
Stärke-Hefe	blaß-braun biß		blaß-braun
extrakt -agar	braun
Hefeextrakt-	gut, rötlich	keines	braun
Malzextrakt-	braun
agar		keines
Tyrosinagar	dunkelbraun		schwärzlich
			braun
Kartoffel	hochstehendes	keines	braun
stück	Wachstum mit
	Falten, braun
Karotten	gräulich-braune s	blaß-braun
stück	Wachstum mit
	Falten

809809/0890

27379U

Tabelle I (Fortsetzung)

KuIturmedium	Wachstum	Luftmycel	lösliches Pigment
Gelatine (20°C)	cremefarbig	keines	dunkelbraun bis schwarz
Magermilch (37 ⁰C)	Wachstum am Boden, blaß braun	keines	keines
koagulier- tes Löffler- Serum (37 ⁰C)	dunkelgrau	keines	keines
Ei (37 °C)	dunkelgrau bis dunkel braun	keines	graues Pig ment an der Peripherie des Wachstums
Czapek¹s- Glucose- lösung	Wachstum am Boden, creme farbig	keines	keines
Cellulose	kein Wachstum
AmaerkunK: Die Inkubatxonstemperatur betrug	28 ⁰C, falls

kein anderer Wert angegeben ist.

809809/0890

- fir-

* 27379AA

3. Physiologische Eigenschaften

Verflüssigung von Gelatine positiv

Hydrolyse von Stärke positiv

Bildung von Tyrosinase positiv

Bildung von Schwefelwasserstoff positiv

Farbgebungsvermögen positiv

Abbau von Cellulose negativ

Reduktion von Nitrat negativ

Peptonisierung von Magermilch negativ

Koagulation von Magermilch negativ

Auflösung von koaguliertem Löffler-Serum negativ

Zusätzlich zu den oben genannten, physiologischen Eigenschaften bildet der Stamm SF-II30 auf Agarmedium und in einem flüssigen Medium Schleim, wobei dies ein wesentliches Merkmal des betreffenden Stammes ist.

Auf einem Agarmedium wie einem Stärke-Hefeextrakt-agar, Stärke-agar oder Glucose-Asparagin-agarmedium wurde beobachtet, daß der Schleim massiv auf der Kolonie in etwa 10 Tagen nach der Inkubation gebildet wird. Weiterhin wurde beobachtet, daß bei der Schüttelkultivierung des Stammes SF-I130 in einem flüssigen Medium, welches geeignete Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärke usw.) und Stickstoffquellen (Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Weizenkeime usw.) enthält, die Kulturbrühe allmählich viskos unter Bildung eines Schleimes wird.

4. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

(1) Ausgenutzt: Xylose, Glucose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Dextrin, Stärke, Glyzerin, Inosit, Natriumacetat, Natriumeitrat und Mannose.

(2) zweifelhaft: Arabinose, Fructose und Salicin.

(3) nicht ausgenutzt: Bhamnose, Inulin, Dulcit, Mannit, Sorbit, Natriumsuccinat und Cellulose.

809809/0690

Die zuvor genannten, mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-II30 können wie folgt zusammengefaßt werden:

(1) Das Luftmycel bildet geschlossene Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt.

(2) Das Luftmycel, das gräulich-braun bis grau gefärbt ist, wird nur sehr gering gebildet.

(3) Das Wachstum auf synthetischen Kulturmedien ist braun bis gräulich-braun in seiner Färbung.

(4) Auf organischen Kulturmedien wird Farbgebungsvermögen (Chromogenität) beobachtet.

(5) Auf Agarmedium und in flüssigen Medien wird Schleim gebildet.

Im Hinblick auf die zuvor beschriebene mikrobiologischen Eigenschaften können Streptomyces phaeoochromogenes, Streptomyces purpureochromogenes und Streptomyces noboritoensis als bekannte, mit dem Stamm SF-II30 verwandte Stämme genannt werden. Jedoch gehört der Stamm SF-II30 nicht zu einem dieser bekannten Stämme, wie im folgenden gezeigt wird:

erzeugt große Mengen an Luftmycel und bildet ein braunes, lösliches Pigment auf Czapek-Saccharoseagar und Calciummalat-agar als Kulturmedien, während der Stamm SF-I13O nur eine geringe Bildung von Luftmycel und keine Bildung von löslichem Pigment auf diesen Kulturmedien zeigt.

Obwohl Stregtornjces^urgureochromogenes orange bis rötlichorange gefärbtes Wachstum auf Kartoffelscheibenmedium zeigt, bildet dieser Stamm keinen Schwefelwasserstoff und bewirkt die Koagulierung von Magermilch, während der Stamm SF-II30 auf dem gleichen Medium ein braunes Wachstum zeigt und die Bildung von Schwefelwasserstoff jedoch keine Koagulierung von Magermilch hervorruft.

809809/0890

40 27379U

Stre£tom2ces_noboritoensis bildet keine Spiralen und erzeugt ein grünes, lösliches Pigment auf Stärkeagarmedium (die Bildung des grünen, löslichen Pigmentes ist nicht in den früheren Dokumenten erwähnt, Jedoch wird sie tatsächlich für diesen Typ von Stamm in nennenswerter Weise beobachtet)» während der Stamm SF-II30 Spiralen bildet jedoch kein lösliches Pigment auf Stärke-synthetischen Agar bildet. Darüber hinaus unterscheidet sich der Stamm SF-II30 von Streptomyces noboritoensis auch in der Ausnutzung bzw. Annahme von Mannit und Saccharose.

Daher unterscheidet sich der Stamm SF-II30 deutlich von jedem der bekannten, verwandten Arten der Gattung Streptomyces. Der Stamm SF-I13O unterscheidet sich weiterhin von irgendwelchen anderen bekannten Specien von Streptomyces dadurch, daß der Stamm SF-II30 die besondere Eigenschaft der Bildung von Schleim, wie bereits zuvor beschrieben, zeigt, während die anderen Specien von Streptomyces keinen Schleim entsprechend c.en früheren Veröffentlichungen bilden.

Hieraus ergibt sich, daß der Stamm SF-II30 als neue Specie der Gattung Streptomyces identifiziert wurde, wobei er als "Streptomyces myxogenes SF-II30" bezeichnet wurde.

Der Stamm SF-II30 besitzt Eigenschaften, die variieren können, wie dies üblicherweise auch bei anderen Specien von Streptomyces beobachtet wird. So kann beispielsweise der Stamm SF-I130 Varianten oder Mutanten bilden, wenn er mit verschiedenen Mutagenen wie UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten elektramagaetisehen Wellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien behandelt wird. Jede natürliche oder künstliche Variante oder Mutante des Stammes SF-I130 kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, solange er noch die Fähigkeit zur Bildung von Maltopentaose und/oder

809809/0890

M 27379U

Maltohexaose aufweist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der eingesetzte Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Nährstoffquellen, die durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind, enthält. Zu diesem Zweck kann jeder bekannte Nährstoff verwendet werden, der ganz allgemein bei der Kultivierung von bekannten Stämmen von Streptomyces verwendet wurde. Beispiele von anwendbaren Nährstoff quellen umfassen: Glucose, Stärke, Maltosesirup und Melassen als Kohlenstoffquellen und Sojabohnenmehl, Weizenkeime, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Gegebenenfalls können anorganische Salze wie Calciuracarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen zugesetzt werden. Zusätzlich können solche organischen und anorganischen Materialien, welche das Wachstum des verwendeten Stammes unterstützen und die Bildung von Maltopentaose und/oder Maltohexaose fördern, in das Kulturmedium eingegeben werden.

Als Züchtungsaiethode, die gemäß der Erfindung angewandt werden kann, ist die Flüssigkeitskultivierung, insbesondere unter aeroben Tauchbedingungen bevorzugt, wie sie im allgemeinen bei der Herstellung von Antibiotika angewandt wird. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorteilhafterweise bei einer Temperatur von 25 bis 38 ⁰C und. besonders häufig bei einer Temperatur in der Nähe von 28 ⁰C durchgeführt. Unter diesen Umständen erreicht die Bildung von Maltopentaose und/ oder Maltohexaose in der Kulturbrühe ein Maximum nach einer Schüttelkultivierung oder einer Tankkultivierung während einer Periode von 2 bis 5 Tagen.

809809/0890

Sowohl Maltopentaose als auch Maltohexaose, welche zur Kategorie der Oligosaccharide mit neutralen Eigenschaften, v/ie im folgenden beschrieben, gehören, zeigen selbst keine antimikrobiell Aktivität in vitro, jedoch besitzen sie die physikalischchemischen Merkmale, die im folgenden beschrieben werden. Unter Ausnützung dieser physikalisch-chemischen Merkmale können diese Substanzen aus der Kulturbrühe, in welcher sie gebildet und angesammelt wurden, gewonnen werden. Beispielsweise können Maltopentaose und Maltohexaose, welche bei der Kultivierung des Stammes SF-II30 gebildet wurden, aus der Kulturbrühe nach folgender Arbeitsweise gewonnen werden: Die Kulturbrühe wird unter sauren Bedingungen zur Entfernung der Mycele und der unlöslichen Anteile filtriert, und das Brühenfiltrat wird bei pH = 3 durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes (z. B. das Produkt mit der Warenbezeichnung Dowex 50 W χ 2 von Dow Chemical Co., USA) zur Abtrennung der in dem Brühenfiltrat aufgelösten, basischen Substanzen durchgeschickt, anschließend wird es über eine Säule von Aktivkohle zur Absorption von Maltopentaose und Maltohexaose auf der Aktivkohle durchgeschickt. Die Aktivkohlesäule wird dann mit Wasser gewaschen und aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen eluiert, welche Äthanol in stufenweise ansteigenden Konzentrationen von 10 % bis 15 %, 20 und 25 % enthalten. Jedes der Eluate wird in Fraktionen aufgefangen und einer Papierchromatographie unterzogen, wobei hier mit einem Lösungsmittel entwickelt wird, das aus n-Butanol-Pyridin-Wasser-Esßigsäure (6:4:3:1 im Volumen) besteht. Die Fraktionen, die einen einzigen Fleck bei dem R-Wert für Raffinose = 0,25 ergeben (berechnet unter der Annahme, daß Raffinose einen Rf-Wert von 1,00 ergibt und im folgenden als Raffinose-R-Wert bezeichnet), werden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei Maltohexaose in Form eines farblosen Pulvers erhalten wird. Die Fraktionen, die einen einzigen Fleck bei einem Raffinose-R-Wert = 0,41 ergeben,

809809/0690

werden ebenfalls miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein farbloses Pulver von Maltopentaose erhalten wird.

Ähnliche Arbeitsweisen, bei denen die Papierchromatographie durch Säulenchromatographie auf Cellulose unter Anwendung eines Entwicklungslöeungsmittels aus n-Butanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure (6:4:3:1 im Volumen) verwendet wird, ermöglichen ebenfalls die Gewinnung der Maltopentaose und Ilaltohexaose aus der Kulturbrühe. Gegebenenfalls können die so gewonnenen Substanzen weiter durch Auflösen in Wasser und Zugabe von Äthanol zur Wiederausfällung gereinigt werden.

Der Anteil von Maltopentaose und Ilaltohexaose, welcher durch Kultivieren des Stammes SF-II30 gebildet wurde, hängt von den Kulturbedingungen ab, obwohl ein überwiegender Anteil von Maltopentaose im allgemeinen gebildet wird.

Wenn der Stamm SF-H30 entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird, werden zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Substanzen Maltopentaose und Maltohexaose noch die Substanzen SF-I13O -x,. und -Xp (entweder nur eine oder beide dieser Substanzen werden generisch als Substanz SF-II30-X bezeichnet) als neue Verbindungen ebenfalls gebildet und in der Kulturbrühe angesammelt. Die Substanz SF-I13O-X ist ein Oligosaccharid von schwach basischer Natur, das eine antibakterielle Aktivität zeigt, in Wasser leicht löslich, in Methanol und Äthanol schwer löslich und in Aceton unlöslich ist. Andererseits sind sowohl Maltopentaose als auch Maltohexaose Oligosaccharide von neutraler Natur, die selbst keine antibakterielle Aktivität in vitro zeigen und die in Wasser leicht löslich jedoch in Äthanol und Aceton unlöslich sind. Die den Gegenstand der Erfindung bildenden Substanzen können

809809/0690

ft 27379U

von der Substanz SF-1130-x als Folge des Unterschiedes ihrer zuvor beschriebenen Eigenschaften abgetrennt werden. Wenn beispielsweise das FiItrat, das durch Filtrieren der angesäuerten Kulturbrühe aus der Kultivierung des Stammes SF-II30 erhalten wurde, durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes durchgeschickt wird, ist die in dem Filtrat enthaltene Substanz SF-II3O-X auf diesem Harz adsorbiert, während Maltopentaose und Maltohexaose hierauf nicht adsorbiert sind. Die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit, welche die beiden letztgenannten Verbindungen enthält, wird dann über eine Aktivkohlensäure geschickt, um sie auf der Aktivkohle zu adsorbieren. Die Aktivkohlesäule wird mit Wasser gewaschen und aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen eluiert, die Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 10 bis 25 % enthalten, wodurch Maltopentaose und Maltohexaose nacheinander eluiert werden. Dann werden die Fraktionen, welche nur Maltopentaose enthalten, und die Fraktionen, welche nur Maltohexaose enthalten, getrennt voneinander dank des Unterschiedes der Elutionsfolge dieser Substanzen aufgefangen.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft daher eine Arbeitsweise, welche die aufeinanderfolgenden Stufen der Züchtung von Streptomyces myxogenes SF-HJO unter aeroben Bedingungen in einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium bei einer Temperatur von 25 bis 38 ⁰C, das Filtrieren der Kulturbrühe unter sauren Bedingungen, das Durchschicken des Filtrates durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes, das Durchschicken der abgegebenen Flüssigkeit aus der Säule über Aktivkohle, das Waschen der Aktivkohlesäule mit Wasser und die anschließende, aufeinanderfolgende Elution mit wäßrigen, Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltenden Lösungen, das Auffangen der Fraktionen

809809/0890

der Eluate, das Einengen dieser Fraktionen zur Trockne unter Bildung eines rohen Pulvers, das ein Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose enthält, das Durchschicken des in Wasser aufgenommenen, rohen Pulvers durch eine Säule von Aktivkohle, die dann mit Wasser gewaschen und mit wäßrigen Lösungen von Äthanol eluiert wird, wobei die Eltiate in Fraktionen aufgefangen werden, die Durchführung einer Papierchromatographie an den Fraktionen unter Entwicklung mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser, das Auffangen der Fraktionen, die einen einzelnen, für Maltopentaose charakteristischen Fleck ergeben, die anschließende Konzentration zur Trockne unter Bildung von Maltopentaose in Form eines farblosen, reinen Pulvers, und das Auffangen von weiteren Fraktionen, die einen einzelnen, für Maltohexaose charakteristischen Fleck ergeben und die anschließende Konzentration zur Trockne unter Bildung von Maltohexaose,ebenfalls in Form eines farblosen, reinen Pulvers, umfaSt.

Die gemäß der Erfindung gebildete Maltopentaose und Maltohexaose besitzen die in der folgenden Tabelle II zusammengestellten, physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Eigenschaften

Tabelle II Maltopentaose

Maltohexaose

Aussehen

Schmelzpunkt

Elementaranalyse

gefunden: C

berechnet: C

(Molekularformel) (C

Molekulargewicht, gemessen durch Massen spektrometrie für das vollständig methylierte Produkt

spez. Drehung

farblos, amorphes Pulver

190 ⁰C (Zers.)

,3; 40,8;

30^H52°26

1066

H H

7,2; 6,62;

+ 134 "

(c = 1 in Wasser)

farblos, amorphes Pulver

186 ⁰C (Zers.)

C = 43,48; E = 6,30;

⁼ S⁵I^3H63

1270

+ 169 °

(c = 1 in Wasser)

809809/0890

27379U

Im folgenden wird auf die "beigefügte Zeichnung Bezug genommen; in der Zeichnung ist:

Fig. 1 ein Ni¹IR-Spektrum (NMR = kernmagnetisehe Resonanz) der erfindungsgemäß hergestellten Iialtopentaose.

Bei weiteren Versuchen wurden jede der erfindungsgemäß erzeugten Substanzen in 1N Schwefelsäure auf 100 ⁰C für 5 bis 6 Stunden erhitzt, und das Produkt wurde einer Papierchrornatrographie unterzogen, wobei als Entwickler n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3 im Volumen) verwendet wurde. Hierbei wurde in jedem Fall ein einziger Fleck erhalten, der mit demjenigen von Glucose identisch war. Bei der gleichen Papierchrooiatographie von mit ß-Amylase enzymatisch abgebauten Produkten ergab das abgebaute Produkt von Maltopentaose zwei Flecke von Maltose und Maltotriose, und das abgebaute Produkt von Maltohexaose ergab nur einen einzigen Fleck von Maltose.

Im Hinblick auf die zuvor gemachten Ausführungen ist klar, daß die erfindungsgemaßen Substanzen, welche als Maltopentaose und Maltohexaose identifiziert wurden, Oligosaccharide von neutralem Charakter sind.

Ein Test auf Zellimmunität nach der verzögerten Hautreaktionstechnik bei mit Bauchwassersuchttumor von "Sarcoma 180" infizierten Mäusen zeigte, daß sowohl Maltopentaose als auch Haltohexaose den Hilfseffekt der Erhöhung der die Immunität potenzierenden Aktivität, welche durch die Substanz SF-II30-X ausgelöst wird, haben.

809809/0890

Der Test wurde nach folgender Arbeitsweise durchgeführt: Eine Gruppe von ICR-JCL-Häusen (männlich) mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 51,58 - 4 g (Alter 8 Wochen) (sechs Mäuse pro Gruppe) wurden mit Bauchwassersuchttumor von "Sarcoma 180" geimpft. 24 Stunden nach der Einimpfung der Tumorzellen wurde jede der zu untersuchenden Arzneimittelproben subkutan einmal bei den Mäusen appliziert. 2 Tage nach der Einimpfung wurde eine äthanolische Lösung von 5 % Picrylchlorid auf die Bauchseite der Mäuse, wobei die Haare abrasiert waren,zur Herbeiführung der Sensibilisierung aufgebracht. Anschließend wurde jede untersuchte Arzneimittelprobe subkutan einmal am Tag an vier aufeinanderfolgenden Tagen appliziert. 9 Tage nach der Einimpfung wurde eine Lösung von 1 % Picrylchlorid in Olivenöl auf die beiden Seiten der beiden Ohren der Mäuse aufgebracht, um eine zweite Sensibilisierung herbeizuführen. 24 Stunden nach der zweiten Sensibilisierung wurde das Ausmaß (%) der Zunahme der Dicke der Ohren bei den Testmäusen bestimmt. Das Ausmaß der verzögerten Hautreaktion kann sus der prozentualen Zunahme abgeschätzt werden.

Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

	Tabelle III	Ausmaß nähme ke (x1	der Zu- der Stär- 0"^ cm)	prozentuale Zunahme (%)
Applizierte Arznei mittelprobe	Dosis (rag/kg Körpergewicht)	7,3 i	1,550	135,2
SF-II30-X * + Maltohexaose	100 + 200	7,0t	1,240	129,6
SF-I13O-X * + Maltopentao se	100 + 200	6,5 t	2,890	116,7
SF-II30-X *	100	4,7 i	0,988	87,0
Maltohexaose	200	5,4 i	1,156	100,0
Kontrolle (keine Behandlung)	-

809809/0830

- 46--

I? 27379U

χ Die hier genannte Substanz SF-II30-X ist ein Gemisch der Substanz SF-1130-x^ und der Substanz SF-1130-Xp, wie bereits zuvor angegeben.

Weitere Untersuchungen zeigten, daß sowohl Haltopentaose als auch Haltohexaose, die selbst keine antimikrobielle Aktivität in vitro aufweisen, die Wirkung der Verbesserung der antibakteriellen Aktivität der Substanz SF-I13O-X haben.

Dieser Test wurde nach einer konventionellen Papierscheiben-Plattenmethode durchgeführt. Hierzu wurde die Substanz SF-1130-Xp in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 1. ag/ml oder 2 mg/ml aufgelöst, und mit den so hergestellten Testlösungen wurden Papierscheiben imprägniert, die aus Filtrierpapier von ο mm Durchmesser hergestellt worden waren. Diese wurden anschließend an der Luft getrocknet. Diese Papierscheiben wurden auf eine obere Plattenschicht des bekannten Inkubationsmediums für den Mycintesb aufgebracht, welches 0,5 ^c/° Pepton, 0,3 % Fleischextrakt und 1,5 % Agar (pH = 6) enthielt, und welches die hierin zu inkubierenden Testmikroorganisaien enthielt. Diese Platte wurde über die untere Schicht des Agarmediums in der Untersuchungsschale gelegt. Die Inkubation wurde bei einer Temperatur von 37 °C über Nacht durchgeführt, anschließend wurde der Durchmesser der rings um die Papierscheiben gebildeten Hemmzonen ausgemessen. Die so erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt. Diese Tests wurden in der gleichen Weise wie zuvor jedoch unter zusätzlicher Eingabe von 1,25 mg/ml an Maltopentaose oder llaltohexaose in die obere Plattenschicht des Inkubationsmediums für die Micinuntersuchung wiederholt. Die εο erhaltenen Testergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle IV zusammengestellt, hieraus ergibt sich, daß die zusätzliche Anwesenheit von Maltopentaose oder llaltohexaose die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-1130-x₂ erhöht. Bei

809809/0890

273794Α

gleichartigen Tests wurde weiterhin gefunden, daß bei der Verwendung von Maltopentaose oder Maltohexaose in Kombination mit der Substanz SF-1130-x,. die erstgenannten Verbindungen im allgemeinen die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-HJO-x^ ebenfalls verbessern, jedoch mit der Ausnahme, daß die Verbesserung der antibakterxellen Aktivität nicht gegenüber Klebsiella pneumoniae beobachtet wird. Kontrolltests wurden ebenfalls durchgeführt, bei denen die antibakterielle Potenz der Substanz SF-1130-Xp alleine bei Abwesenheit von Maltopentaose oder Maltohexaose abgeschätzt wurde. Alle Ergebnisse der zu diesem Zweck durchgeführten Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

	Tabelle IV	an	Zusatz von Malto- Zusatz von Malt pentaose hexaose	an	Gehalt an SF-1130-x₂
		1 mg/ml	Gehalt SF-1130	1 mg/ml	2 mg/ml 1 mg/ml
Test-	Durchmesser der Hemmzone (mm)	12,0	2 mg/ml	24,1	26,2 24,3
OX gaUXο— mu s	Kontrolle	13,5	26,0	21,0	24,0 21,1
	Gehalt ι	gering	23,9	18,2	20,0 18,1
Escherichia coli K-12R	2 mg/'ml	O	20,1	12,7	16,4 13,0
Escherichia coli (resis- tent gegen Chloramphe nicol)	16,0	12,1	16,0	18,0	19,7 17,9
Shigella sonnei	14,7		19,8
Proteus vulgaris	13,0
Salmonella typhi	gering
	13,8

809809/0830

So

273.79U

Weiterhin ist darauf hinzuweisen, daß keine antibakterielle Aktivität von Maltohexaose oder Maltopentaose selbst unter den oben angegebenen Testbedingungen gefunden wurde.

Noch weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß sowohl Maltopentaose als auch Maltohexaose das Wirtsabwehrsystem in lebenden Tieren gegenüber bakteriellen Infektionen stimulieren. Der Test wurde wie folgt durchgeführt: Das in Beispiel 1 erhaltene, rohe, gelblich-braune Pulver wurde aus Wasser/Äthanol umgefällt, und der umgefällte Niederschlag wurde in einer mit Phosphorat gepufferten Salzlösung bei pH = 7,2 aufgelöst. Die erhaltene Lösung, die ein Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose enthielt, wurde intraperitoneal bei einer Gruppe von JCL/IRC-Mäusen (männlich) mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g (Alter 4· Wochen) (acht Mäuse pro Gruppe) in einer Dosismenge von 100 mg/kg Körpergewicht bzw. 20 mg/kg Körpergewicht appliziert. Die Applikation wurde dreimal in einem Intervall von 48 Stunden durchgeführt.

72 Stunden nach der letzten Applikation wurden die Mäuse intraperitoneal mit 0,5 ml/Maus einer Zelldispersion von Staphylococcus aureus, Stamm Smith S-4-24-beimpft, der durch Verdünnung der inkubierten Kultur mit physiologischer Salzlösung und anschließende Zugabe von 5 % Mucin hergestellt worden war. Die Anzahl der überlebenden Mäuse wurde während 5 Tagen nach dem Impfen beobachtet, und der LD,-Q-Wert der Bakterienzellen (die Anzahl der zur Tötung von 50 % der Mäuse erforderlichen Bakterienzellen) wurde in jedem Fall berechnet. Weiterhin wurden Kontrolltests durchgeführt, bei welchen die Behandlung mit dem Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose ausgelassen wurde.

Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt. Es wurde gefunden, daß das Gemisch von Malt'opentaose

809809/0880

49--

und Maltohexaose eine Erhöhung des LD(-₀-Wertes (nämlich des Preventativeffektes) um etwa das 4-2,9-fache bei einer Dosis von 100 mg/kg und von etwa dem 6,2-fachen bei einer Dosis von 20 mg/kg ergibt.

Tabelle V

Dosierung Überleben der liäuse bei unterschiedlichen der Test- Dosen von eingeimpften Bakterien mischung (Zellen/Haus)

9,3x1o⁷i,9xio⁷5,7x1o⁶7

jq der zellen

100 mg/kg 3/8 200 mg/kg 1/8 Kontrolle

6/8 3/8 0/8

8/8 8/8 2/8

8/8
8/8
8/8

9,0x1O⁷ 1,3x1O⁷ 2,1x1O⁶

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispxele näher erläutert.

Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces myxogenes SF-I13O (identifiziert als FERM-P 676 oder ATCC 31305) wurde in 20 1 eines flüssigen Kulturmediums (pH = 7,0) eingeimpft, das 5,0 % Maltosesirup, 2,5 % Sojabohnenmehl, 1,0 % Weizenkeime und 0,25 % Natriumchlorid enthielt. Das beimpfte Medium wurde unter Belüftung und Rühren bei 28 ⁰C während 66 Stunden in einem Behälter-Fermentationsgerät inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die erhaltene Eulturbrühe unter sauren Bedingungen (pH = 3) filtriert, wobei 15 1 eines Brühenfiltrates erhalten wurden·

Das FiItrat wurde durch eine Säule von 2 1 eines stark sauren Ionenaustauscherharzes (Dowex 50 W χ 2 von Dow Chemical Co., USA) durchgeschickt, und die aus der Säule ausströmende Flüssigkeit wurde dann über eine Säule (8 χ 50 cm) mit 2,5 1 Aktivkohle (Produkt von Wako Junyaku K.K., Japan) geschickt.

809809/0890

Die Aktivkohlesäule wurde gut mit Wasser gewaschen und aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen von 10 %, 15 %, 20 %, 25 % und 30 % Äthanol eluiert.

Die bei der Elution mit den 20 %igen bzw. 25 %igen äthanolischen, wäßrigen Lösungen erhaltenen Fraktionen (10 1) wurden zur Trockne eingeengt, wobei 20 g eines Gemisches von roher lialtopentaose und Maltohexaose in Form eines gelblich-braunen Fulvers erhalten wurden.

15 g des Pulvers wurden in 100 ml Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule (A-,0 χ 35 cm) von 350 ml Aktivkohle (Produkt von Waco K.K., Japan) geschickt, um die gewünschten Substanzen auf der Aktivkohle zu adsorbieren.

Die Säule wurde gut mit Wasser gewaschen, anschließend wurde aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen von 10 %, 15 %> 20 % und 25 % Äthanol eluiert. Das Eluat wurde in 15-rnl-Fraktionen gesammelt, und jede der Fraktionen wurde einer Papierchromatographie unterworfen, wobei sie mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1:3 im Volumen) eluiert wurden. Die Fraktionen 261-340, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert = 0,41 ergaben (unter der Annahme berechnet, daß der Rf-Wert von Raffinose = 1,00 ist), gefärbt mit Hilfe eines Silbernitratreagens, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 5>2 g eines farblosen Pulvers von Haltopentaose erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und die Lösung wurde filtriert. 180 nil Äthanol wurden langsam zu dem Filtrat hinzugegeben, um das Produkt erneut auszufällen, wobei 4,8 g reine Maltopentaose als farbloses Pulver erhalten wurden.

Weiterhin wurden die Fraktionen 396-500, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert = 0,25 gaben, nach der zuvor

809809/0830

27379ΛΑ

beschriebenen Arbeitsweise behandelt, wobei 3,1 g reine Maltohexaose als farbloses Pulver erhalten wurden.

Beispiel 2

4,0 g des rohen, gelblich-braunen Pulvers, das in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgenommen, auf einer kleinen Menge Cellulosepulver adsorbiert und getrocknet. Das getrocknete Pulver wurde auf eine Säule (4,5 x 13 cm) von 300 g Cellulose aufgegeben und mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/ Wasser (6:4:1:3 im Volumen) eluiert. Das Eluat wurde in 12-ml-Fraktionen gesammelt, und jede der Fraktionen wurde der Fapierchromatographie unter Verwendung des zuvor genannten Mischlösungsmittels als Entwickler unterzogen. Die Fraktionen 143-224, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert = 0,41 ergaben, gefärbt durch ein Silbernitratreagens, wurden miteinander vereinigt und entsprechend der Arbeitsweise von Beispiel 1 behandelt, wobei 1,05 g farbloses Pulver'von Maltopentaose erhalten wurden.

Die Fraktionen 250-345» die einen einzigen Fleck bei einem R-Raf finose-Wert = 0,25 ergaben, wurden in gleichartiger Weise behandelt, wobei 7^> mg eines farblosen Pulvers von Maltohexaose erhalten wurden.

809809/0890

Le

erseile

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Ilaltopentaose und/oder Maltohexaose, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm der Art Streptomyces, der zur Bildung von Maltopentaose und/oder Haltohexaose in der Lage ist, unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffquellen enthaltenden Kulturmedium für eine ausreichende Zeitspanne zur Bildung und Ansammlung von Maltopentaose und/oder Maltohexaose in der Kultur gezüchtet wird, und daß die so gebildete Substanz/en aus der Kultur gewonnen wird/werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Streptomyces myxogenes SF-I130 (identifiziert als PSRfI-P 676 oder ATCC 31305) aerob bei einer Temperatur von 25 bis 38 ⁰C kultiviert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces myxogenes SG-II30 unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 38 ⁰C kultiviert wird, daß die Kulturbrühe unter sauren Bedingungen filtriert wird, daß das Piltrat durch eine Säule von stark sauren Ionenaustauscherharz geschickt wird, daß die austretende Flüssigkeit durch eine Aktivkohlesäule geschickt wird, daß die Aktivkohlesäule mit Wasser gewaschen wird und anschließend stufenweise mit wäßrigen, Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltenden Lösungen eluiert wird, daß die vorgegebenen Fraktionen der Eluate gesammelt werden, daß die Fraktionen zur Trockne konzentriert werden, um ein rohes, ein Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose enthaltendes Pulver zu erhalten, daß das in Wasser aufgenommene, rohe Pulver durch eine Säule von Aktivkohle geschickt

809809/0890

ORIGINAL INSPECTED

wird, welche dann mit Wasser gewaschen und mit wäßrigen Lösungen von Äthanol eluiert wird, daß die Eluate in Fraktionen gesammelt werden, daß die Fraktionen der FapierChromatographie unter Entwicklung mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser unterworfen werden, daß die Fraktionen, die einen einzigen, für Maltopentaose charakteristischen Fleck ergeben, gesammelt werden und anschließend zur Trockne unter Lieferung von Maltopnetaose in Form eines farblosen, reinen Pulvers konzentriert werden, und daß die weiteren Fraktionen, welche einen einzelnen, für Maltohexaose charakteristischen Fleck ergeben, gesammelt und anschließend zur Trockne unter Lieferung von Maltohexaose ebenfalls in Form des farblosen, reinen !Silvers konzentriert werden.

809809/0890