DE2728596A1

DE2728596A1 - Antibiotikum bl580 delta und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2728596A1
Application number: DE19772728596
Authority: DE
Inventors: Martin Roy Hertz; John Henry Edward James Martin
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1976-06-30
Filing date: 1977-06-24
Publication date: 1978-01-12
Also published as: PT66700A; CA1093999A; SE7707552L; NZ184262A; IL52205A0; AU2582377A; JPS5356668A; IE45349L; ATA463077A; DD144561A5; AR212717A1; FR2356667B1; ES460266A1; CH636642A5; IL52205A; FR2356667A1; PT66700B; NL7707283A; AT358725B; GR73051B

Description

PFENNINQ-MAAS MEINlG - LEMKE - SPOTT

eCHLEISSHEIMERSTR. 299

§000 MÜNCHEN 40

American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, V. St. A.

Antibiotikum BL58O/\ und Verfahren zu seiner Herstellung

709882/0801

-S-

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung BL58O/\ , seine Herstellung durch Fermentation, Verfahren zu seiner Gewinnung und Anreicherung aus Rohlösungen sowie Verfahren zu seiner Reinigung. Im Rahmen der Erfindung liegen auch eine verdünnte Form des Antibiotikums BLSeo/N^ , sowie ein Rohkonzentrat und seine reine kristalline Form. Die Wirkungen dieses neuen Antibiotikums als anticoccidiales Mittel sowie seine chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden dieses von früher beschriebenen Antibiotika.

Das Antibiotikum BL58O^ läßt sich durch die im folgenden angegebene Strukturformel beschreiben. Ein alpha-Substituent liegt hiernach hinter der Papierebene und wird durch eine gestrichelte

Linie ( Bindung) bezeichnet, während ein ß-Substituent aus

der Papierebene herausragt und durch eine keilartige Bindung (•^^Bindung) bezeichnet wird.

70988270801

O*

709882708Of

272B596

Das neue erfindungsgemäße Antibiotikum ist eine organische Carbonsäure und kann daher mit nichttoxischen pharmazeutisch unbedenklichen Kationen Salze bilden. Die Herstellung solcher Salze erfolgt durch Vermischen der freien Säure des Antibiotikums mit stöchiometrischen Mengen entsprechender Kationen, zweckmäßigerweise in einem neutralen Lösungsmittel. Hierzu geeignete Kationen sind die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- oder Ammoniumionen sowie Kationen organischer Amine, wie Tri(niederalkyl)aminkationen (beispielsweise Triäthylamin, Triäthanolamin) oder Procain. Die kationischen Salze des Antibiotikums BL58O /S^ sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die sich in Wasser verhältnismäßig schlecht lösen, in den meisten üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Äther oder Benzol, jedoch löslich sind.

Das neue Antibiotikum, dem die Bezeichnung BL58O/S,, zugeordnet worden ist, entsteht während der Züchtung eines neuen Stamms von Streptomyces hygroscopicus unter gesteuerten Bedingungen, und dieser Stamm produziert ferner auch die bekannten Antibiotika BL58Oalpha und BL58Oß (US-PS 3 812 249). Dieser neue Stamm ist eine durch Behandlung von S. hygroscopicus NRRL 5647 mit N-Methyl-N'-nitro-N"-nitrosoguanidin abgeleitete Mutante. Eine lebende Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei dem Culture Collection Laboratory, Northern utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und in die dortige ständige Kultursammlung aufgenommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 8180 frei erhältlich.

Eine Bestimmung der physiologischen, morphologischen und Kulturmerkmale von NRRL 8180 nach Dr. H. D. Tresner, Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, ergibt, daß diese Merkmale im wesentlichen die gleichen sind wie diejenigen von NRRL 5647. Die allgemeine Beschreibung des Mikroorganismus aufgrund beobachteter diagnostischer Eigenschaften ist die gleiche wie sie für den

709882/0808

-X-

Mikroorganismus NRRL 5647 in US-PS 3 812 249 veröffentlicht ist, wobei diese Beschreibung jedoch im folgenden der Einfachheit halber wiederholt wird.

Die Ermittlung der KuIturmerkmaIe, physiologischen Merkmale und morphologischen Merkmale des Mikroorganismus NRRL 8180 erfolgt hier nach den Methoden wie sie von Shirling und Gottlieb in Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. ^6 , 313-340 (1966) näher beschrieben sind. Die unterstrichenen beschreibenden Farbangaben und die Farbplättchenbezeichnungen wurden nach Jacobsen et al. aus Color Harmony Manual, 3. Auflage (1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois, ermittelt. Die Beschreibungsexnzelheiten finden sich in den folgenden Tabellen I bis IV.

Stärke des Wachstums

Gutes Wachstum auf Hefeextrakt-, Kuster-Haferflocken-, Tomatenpaste-, Hafermehl- und Kartoffel-Dextrose-Agar, mäßiges Wachstum auf Asparagin-Dextrose-Agar, Hickey und Tresner-Agar, anorganische Salze-Stärke-Agar sowie Bennett-Agar, schwaches Wachstum auf Czapek-Lösung-Agar.

Luftmycel·

Das Luftmycel ist gelblich und wird in den Sporulationszonen gräulich, wobei seine Farbe von rehfarben (4 ig) zu biberfarben (4 Ii) zu aschfarben (5 fe) reicht, die Sporulationszonen werden bei älteren Kulturen schwarz und hygroskopisch.

Lösliche Pigmente

Auf den meisten Medien keine löslichen Pigmente, auf Hefeextrakt-Bennett- und Kartoffel-Dextrose-Agar gelbliche lösliche Pigmente, die nur in geringen Mengen vorhanden sind.

708882/0808

Unterseitenfarbe

Im allgemeinen gelbliche Schattierungen auf den meisten Medien.

Verschiedene physiologische Reaktionen

Nitrate werden zu Nitriten reduziert, vollständige Gelatineverflüssigung, keine Bildung melanoider Pigmente auf Pepton-Eisen-Agar, völlige Peptonisierung auf Purpurmilch innerhalb von 7 Tagen, Natriumchloridtoleranz im Wachstumsmedium = 7 %, jedoch <10 %, Kohlenstoffverwertung nach Pridhain und Gottlieb, J. Bacteriol. ]56_ , 107-114 (1948): Gute Verwertung von Adonit, d-Galactose, d-Fructose, d-Raffinose, Salicin, d-Xylose und Dextrose, schlechte oder keine Verwertung von d-Melezitose, d-Melibiose, 1-Arabinose, i-Inosit, Lactose, d-Mannit, 1-Rhamnose, Saccharose und d-Trehalose.

Mikromorphologie

Aus dem Luftmycel wachsen sporentragende Elemente heraus, die in enggewickelten Spiralen mit mehreren Windungen enden. Die Sporen sind meistens isodiometrisch, zylindrisch und phalangiform und haben Abmessungen von 0,6 - 0,7 μΐη χ 0,7 0,8 μΐη. Die Sporen sind aufgrund einer elektronenmikroskopischen Untersuchung glatt. Die Sporenscheiden sind fein gerunzelt.

Auf Basis der beobachteten allgemeinen Eigenschaften handelt es sich bei dem Mikroorganismus NRRL 8180 um einen Vertreter aus einer großen Gruppe von Streptomyceten, dessen charakteristische Merkmale graue Sporen, spiralenförmige Sporenketten, glattwandige Sporen und das Fehlen von Melaninpigmenten sind.

709882/0808

-H-

Die hygroskopische Natur der Kultur zusammen mit allen ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften macht sie zu einem typischen Stamm von Streptomyces hygroscopicus, wie entsprechende Bestimmungen nach H. D. Tresner und E. J. Backus, "A Broadened Concept of the Characteristics of Streptomyces hygroscopicus", Appl. Microbiol. £ , 243-250 (1956) und H. D. Tresner, E. J. Backus und J. A. Hayes, "Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicus-like Complex", Appl. Microbiol. 15, 637-639 (1967) zeigen.

709882/0808

Tabelle Kulturcharakteristiken von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

Inkubationszeit: 14 Tage

Temperatur: 28 ⁰C

Medium

Ausmaß des
Wachstums

Luftmyzel und/oder Sporen

lösliches Pigment

Unterseitenfarbe

Bemerkungen

Czapek-Lösi mgs-Agar

gering Spur eines weißlichen Luftmyzels, keine Sporulation

keines

farblos bis
weißlich

Hefeextrakt-Agar

gut

GO
OO
N>

weißliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation

gelblich, gering

bambusfarben
(2 fb)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen

Kuster-Haferflocken-Agar

gut

keines

hellsenffarben

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen; gelbliches Exudat in Randzonen

Asparagin-Dextrose-Agar

mittelmäßig

weißliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen aschfarben (5 fe) bis rehfarben (4 ig) wird; mittelmäßige Sporulation

keines

bambusfarben
(2 fb)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Kolonie-

zonen

C¹O OO

CO

cn

Tabelle I (Fortsetzung) Kulturcharakteristiken von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

K) 00

cn co

Inkubationszeit: 14 Tage Temperatur: 28 ⁰C

Medium

Ausmaß des Wachstums

Luftmyzel und/oder Sporen

lösliches Pigment Unterseitenfarbe

Bemerkungen

Hickey- und Tresner Agar

mittelmäßig weißliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation

keines bambusfarben (2 fb)

ausgedehnte hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen

anorganische Salze-Stärke-Agar

mittelmäßig weißliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben ( 4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulation

keines pastellgelb (1 db)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Kolonie

zonen

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

gut

weißliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; sehr starke Sporulation

keines gelb-

ahornfarben (3 ng)

ausgedehnte hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen, gelbliches Exudat in Randzonen

Bennet-Agar

mittelmäßig weißliches Luftmyzel, das gelblich, in Sporulationszonen biber- gering farben (4 Ii) wird; starke Sporulation

bambusfarben (2 fb)

schwärzlich« hygroskopische Flächen in zentralen KoLo eu«-

zonen

Tabelle I (Fortsetzung) Kulturcharakterlstlken von Streptomyces hygrosooplcus NRRL 8180

Inkubationszeit: 14 Tage

Temperatur: 28 ⁰C

Medium

Ausmaß des Wachstums

Luftmyzel und/oder Sporen

lösliches
Pigment

Unterseitenfarbe

Bemerkungen

Kartoffel-Dextrose-Agar

gut weißliches bis gelbliches Luftmycel, das in Sporulationszonen aschfarben (5 fe) bis rehfarben (4 ig) wird; mittelmäßige Sporulation

gelblich,	gelb-	schwärzliche hygro
gering	ahornfarben	skopische Flächen
	(3 ng)	in zentralen Kolo
		niezonen

ro

-j

co

cn

CD

Tabelle II Mikromorphologie von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

Medium Luftmyzel und/oder Sporenstrukturen Sporenaussehen Sporengröße Sporenoberfläche

Kuster-Hafer- aus dem Luftmyzel wachsen Sporen die Sporen sind groß- 0,6 bis 0,7 μυ χ aufgrund einer

flocken-Agar heraus, die Verzweigungen tragen, teils isodiametrisch, 0,7 bis 0,8 μΐη elektronenmikro-

^_ welche in dicht gewundenen Spiralen zylindrisch, phalanx- skopischen Bestim-

_o mit mehreren Gängen enden artig mungen glatt; die

(Ο Sporenscheiden

oat . sind fein gerun-

CO zelt

Tabelle

III

Verschiedene physiologische Reaktionen von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

O OO O

Medium

organische Nitrat-Brühe organische Nitrat-Brühe Gelatine Pepton-Eisen-Agar

Purpurmilch

Hefeextrakt-Agar plus (4, 7, 10 und 13 %) NaCl

Inkubation (28 ⁰C)	Wachs tumsmenge
7 Tage	gut
14 Tage	gut
7 Tage	gut
24 bis 48 Stunden	gut
7 Tage	gut
10 Tage	gut

physilogische Reaktionen Nitrate werden zu Nitriten reduziert Nitrate werden zu Nitriten reduziert vollständige Verflüssigung

es werden keine melanoide Pigmente gebildet

vollständige Peptonisierung

NaCl-Toleranz gleich oder über 7 %, jedoch unter 10 %

ro

-j to

CJO

cn

CD

- 11 -

Tabelle IV

Kohlenstoffverwertungsverhalten von Streptomyces hygroscopicus

NRRL 8180

Inkubation: 10 Tage

Temperatur: 28 ⁰C

Kohlenstoffquelle

Adonit

1-Arabinose

Dextran

d-Fruktose

i-Inosit

Lactose

d-Mannit

d-Melezitose

d-Melibiose

d-Raffinose

1-Rhamnose

Salicin

Sacharose

d-Trehalose

d-Xylose

Dextrose

Negative Kontrolle

Verwertung*

3 O 3 3 0 0 0 1 1 3 0 3 0 0 3 3 O

*3 = gute Verwertung
2 = ausreichende Verwertung 1 = schlechte Verwertung 0 = keine Verwertung

709882/OBOI

- yi -

Mo

Die Produktion des Antibiotikums ΒΙι58θ^ ist selbstverständlich nicht auf diesen besonderen Mikroorganismus oder die Organismen beschränkt, die völlig dem oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften für NRRL 8180 genügen. Zur Erfindung gehört daher auch der Einsatz von Mutanten, die aus dem Mikroorganismus NRRL 8180 durch verschiedene Mittel gebildet werden, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Aktinophage oder dergleichen.

Das Antibiotikum BL58O/S^ ist ein äußerst wirksamer Wirkstoff zur Bekämpfung von Coccidieninfektionen bei warmblütigen Tieren. Das Antibiotikum BL58O £\^ ist darüber hinaus auch wesentlich weniger toxisch als das Antibiotikum BL58Oalpha (dessen Struktur in NL-PS 74 02 938 angegeben ist. Die Wirksamkeit des Antibiotikums BLSeo/N^ als Mittel gegen Coccidiosis wird anhand der folgenden in-vivo-Untersuchungen gezeigt, für die das im folgenden genannte Geflügelfutter verwendet wird:

Vitamin-Aminosäure-Vorgemisch O,5 %

Spurenmineralien 0,1 %

Natriumchlorid 0,3 %

Dicalciumphosphat 1,2 %

gemahlener Kalkstein O,5 %

stabilisiertes Fett 4,0 %

entwässerte Luzerne (17 % Protein) 2,O %

Maisglutenmehl (41 % Protein) 5,0 %

Menhadenfischmehl (60 % Protein) 5,0 %

Sojabohnenmehl (44 % Protein) 30,0 %

gemahlener gelber Mais, Feinstoffe auf 100 %

Das in obiger Geflügelfuttermischung angegebene Vitamin-Aminosäure-Vorgemisch wird aus folgender Formulierung hergestellt. Die Mengenangaben beziehen sich auf Einheiten pro Kilogramm Geflügelfutter.

709882/1)801

-M-

Butyliertes Hydroxytoluol 125 mg

dl-Methionin 500 mg

Vitamin A 3300 I.E.

Vitamin D₃ 1100 I.C.E. Riboflavin 4,4 mg

Vitamin E 2,2 I.E.

Niacin 27,5 mg Pantothensäure 8,8 mg

Cholinchlorid 500 mg

Folsäure 1,43 mg Menadionnatriumbxsulfat 1,1 mg

Vitamin B..- 11 mcg

gemahlener gelber Mais, Feinstoffe auf 5 gm

Mischcoccidienxnfektionen von Eimeria tenella und Eimeria acervulina

Ein Mischinokulum aus 5000 sporulierten Oozyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oozyten von Eimeria tenella, so daß sich bei unbehandelten Kontrollen eine Mortalität von 85 bis 100 % ergibt, gibt man Gruppen aus sieben Tage alten Küken durch direkte Inokulation in den Kropf. Während der gesamten Versuchsdauer können die Küken nach Belieben Geflügelfutter fressen und Wasser trinken. 2 Tage nach erfolgter Inoku- j lation bietet man den verschiedenen Kükengruppen des Versuchs ί ein wirkstoffhaltiges Futter an, das aus dem Geflügelfutter und i mehreren Dosen des Antibiotikums BLSeOA₁ zusammengesetzt ist.

10 Tage nach erfolgter Inokulation werden die Untersuchungen !

beendet. Die Tiere werden gewogen und getötet, worauf man ihren !

Intestinaltrakt auf Schädigungen untersucht. Die bei diesem Ver- ;

such erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle V j

hervor. Die Ergebnisse zeigen, daß die Verabreichung von 125 ppm !■

oder 250 ppm Antibiotikum BL58O/^ zusammen mit dem Futter an j

infizierte Küken ein 100-prozentiges Oberleben dieser infizier- ;

ten Küken ergibt. Ferner geht aus den Versuchsdaten hervor, daß |

709882/08Oi ORIGINAL INSPECTED

man durch Verabreichung von 30 ρρτη oder 60 ppm Antibiotikum BL 5 8 O^ an infizierte Küken iusammen mit dem Futter eine ganz starke Unterdrückung der durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina hervorgerufenen Schädigungen erhält.

709882/0808

Tabelle V Konzentration an BL58O£n> im Futter, Anzahl der % überlebende

ppm Versuchstiere Tiere

	250
«0 de α»	125
α»	60
•	30

60 5 5

24 25

17 100 100

91,6

60 % Tiere mit verringerten Schädigungen Eimeria tenella Eimeria acervulina 0 100 100 100 64

ro

ISJ

CO

- vT -

Mischcoccidieninfektion von Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti und Eimeria maxima

Ein handelsübliches Vaccin (Coccivac D, Sterwin Laboratories, Opalika, Alabama), das ein Gemisch aus wenigstens fünf Arten von Eimeria coccidia enthält, verabreicht man Küken in einer gegenüber der normalen Immunisierungsdosis 70-fachen Menge. Das Vaccin gibt man Gruppen aus sieben Tage alten Küken durch direkte Inokulation in den Kropf aller Tiere. Die Tiere haben während der gesamten Versuchsdauer freien Zugang zu Wasser und dem oben genannten Geflügelfutter. Zwei Tage nach erfolgter Inokulation bietet man den verschiedenen Kükengruppen des Versuchs wirkstoffhaltiges Futter an, das aus dem Geflügelfutter und mehreren Dosen Antibiotikum BL58O/^ besteht. 10 Tage nach Inokulation werden die Untersuchungen beendet, wobei man die Tiere wiegt, tötet und ihre Intestinaltrakte auf Schädigungen bzw. Verletzungen hin untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß eine Verabreichung von 120 ppm Antibiotikum ΒΙι580/Ν^ an infizierte Küken zusammen mit dem Futter zu einem 100-prozentigen Überleben der infizierten Küken führt. Ferner ergibt sich bei dieser Wirkstoffkonzentration auch eine ziemlich starke Unterdrückung von Schädigungen oder Verletzungen, die durch Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria brunetti und Eimeria maxima hervorgerufen werden.

709882/08G8

Tabelle VI

Konzentration an

BLSeo/N^ im Futter, Anzahl der % überlebende % Tiere mit verringerten Schädigungen

ppm Versuchstiere Tiere tenella acervulina necatrix brünettι maxima

0 15 0 0 0 60 0 20

120 15 100 100 100 100 100 100

O
£ 60 15 100 40 93 100 48 80

^ 30 15 100 7 7 86 0 21

O ISJ CO

Fermentationsverfahren

Die Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 kann in einer großen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Zur Bildung dieses Antiotikums BL58O/\ geeignete Medien enthalten eine assimilierbare Kohlenstoff quelle, z.B. Stärke, Zucker, Melasse oder Glycerin, eine assimilierbar Stickstoffquelle, z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser, sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Ammoniumsulfat, Carbonat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän und Kupfer, liegen als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vor. Die Belüftung in Tanks und Kolben erfolgt durch Durchleiten steriler Luft durch das gärende Medium oder Aufblasen von steriler Luft auf die Oberfläche des Mediums. Außerdem wird in Tanks durch mechanische Mittel für Bewegung gesorgt. Je nach Bedarf kann ein Entschäumer zugesetzt werden, beispielsweise 1 % Octadecanol in Lardöl.

Inokulumherstellung

Ein Schüttelkolbeninokulum von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 wird durch Beimpfen von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 500 ml Kolben mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen einer Schrägagarkultur hergestellt. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise folgendes:

Soj abohnenmehl	1,0 %
Glucose	2,0 %
Maisquellwasser	0,5 %
CaCO₃	0,3 %
Wasser	auf 1OO %

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, unter kräftiger Bewegung auf einem Rotationsschüttler 48 bis 96 Stunden inkubiert.

70988 2/0801

Xi

Zwei Mengen von jeweils 1OO ml dieses Inokulums verwendet man dann zur Beimpfung von 12 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem 20 Liter fassenden Kolben. Dieses Inokulum wird unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, inkubiert.

Mit dem in dieser Weise erhaltenen Inokulum beimpft man dann 300 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem Fermentationstank. Dieses Inokulum inkubiert man unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C.

Mit dem dabei erhaltenen Inokulum beimpft man dann einen 40OO Liter fassenden Fermentationstank, der 3000 Liter eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthält: «

Maisquellwasser 0,5 %

Sojabohnenmehl 1,0 %

Maisstärke 4,0 %

CaCO₃ 0,1 %

Wasser auf 100 %

Das obige'Medium fermentiert man 100 bis 200 Stunden bei einer Temperatur von 27 bis 32 ⁰C unter Bewegung mit einem Rührer und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 0,8 Liter Luft pro Liter Medium pro Minute. Normalerweise setzt man auch einen Entschäumer zu, beispielsweise Hodag FD82, und zwar in einer Menge von etwa 1,3. Liter pro 1000 Liter Medium.

Reinigungsverfahren

Nach beendeter Fermentation vereinigt man die das Antibiotikum BL58O/\ enthaltende Fermentationsmaische mit etwa der Hälfte ihres Volumens an Äthylacetat und rührt das Ganze dann 2 bis

709882/080«

3 Stunden. Sodann gibt man etwa 8 % Diatomeenerde zu und filtriert das Gemisch durch eine Platten- und Rahmen-Filterpresse. Der Filterkuchen wird auf der Presse mit Äthylacet-'i gewaschen. Die Äthylacetatextxakte werden gesammelt und in einer lestillationsvorrichtung zu einem Sirup konzentriert.

Der auf diese Weise erhaltene Sirup wird mit einer gegenüber seinem Volumen zweifachen Menge Heptan gewaschen und dam über Nacht bei 4 ⁰C aufgehoben. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und zu einem guiraniartigen Rückstand eingeengt.

Das gumraiartige Konzentrat behandelt man mit 10 Liter Methanol, worauf man das Ganze mehrere Stunden unter Verwendung von Trockeneis kühlt. Anschließend filtriert man das Gemisch durch eine Sinterglasnutsche, auf der sich eine Schicht Diatomeenerde befindet, wobei man mit kaltem Methanol wäscht. Die Methanollösung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft.

Sodann bereitet man eine Chromatographiesäule vor, die Aktivkohle in einer Menge von etwa 1 Liter Kohle pro 50 g Beschickung enthält. Der getrocknete Rückstand wird in Methylenchlorid in einer Menge von 40 g pro Liter gelöst und auf die Säule gegeben. Das Methylenchlorideluat wird als eine einzige Fraktion gesammelt und zur Trockne eingedampft. Den dabei erhaltenen Rückstand vermischt man dann mit Methanol und lagert das Ganze anschließend in einem Kühlraum mit Trockeneis, um die Temperatur 15 Minuten auf -10 ⁰C zu reduzieren. Nach 15 Minuten filtriert man das verfestigte öl ab und engt das methanollösliche Material unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man zu einem öl gelangt.

Dieses öl löst man dann in einer minimalen Menge Metyhlenchlorid, worauf man Silicagel zugibt, das Ganze zur Trockne einengt und schließlich auf eine Trockensilicagelsäule aufgibt. Die Entwicklung der Säule erfolgt zuerst mit 10 % Äthylacetat in Benzol und anschließend mit 20 % Äthylacetat in Benzol. Anschließend läßt man die Säule ablaufen. Die Säule wird in

709882/089« ORIGINAL INSPECTED

⁴IS

1O gleiche Teile (einschließlich der Beschickung) eingeteilt. Kernproben werden über die Länge der gesamten Säule bei Rf-Werten von 0,05, 0,15, 0,25, 0,35 usw. entfernt und mit einem entsprechenden Volumen eines Gemisches aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) eluiert. An Stellen, an denen das Antibiotikum überlappt, sammelt man an jedem 1/8 einer Rf-Einheit eine Kernprobe. Die Stelle, an der das Antibiotikum kommt, ermittelt man durch dünnschichtchromatographisehe Untersuchung der Kerneluate unter Verwendung handelsüblicher Dünnschichtchromatogrammplatten (Silplate-22 von Brinkmann Instrument Co., Westbury, New York 11590). Die Detektion der jeweiligen Zonen erfolgt durch Verkohlung in Gegenwart von Schwefelsäure.

Diejenige Sektion der Säule, die ein Material mit Rf-Werten von 0,11 bis O,35 enthält, wird aus der Säule herausgeschnitten und in einem Gemisch aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1, auf Volumen bezogen) aufgeschlämmt. Das dabei erhaltene Gemisch wird filtriert, mit weiterem Lösungsmittelgemisch gewaschen und dann unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Der hierbei anfallende Rückstand wird in tert.-Butanol gelöst, worauf man das Ganze filtriert und gefriertrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu einem flockigen Feststoff.

Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:75:37, auf Volumen bezogen) stellt man ein Zweiphasensystem her. Mit der unteren Phase dieses Systems vermischt man dann eine bestimmte Sorte Diatomeenerde (Celatom von Eagle-Picher Industries, Cincinnati, Ohio) in einer Menge von 800 g auf 6OO ml untere Phase und bepackt mit diesem Gemisch anschließend in gewissen Anteilen eine Säule (Durchmesser 7,5 cm). Als Säulenbeschickung verwendet man ein Gemisch aus Diatomeenerde, unterer Phase und lyophilisiertem Produkt (40 g:3O ml:13,8 g). Die Ent-

709882/0801

idung von

wicklung der beschickten Säule erfolgt unter Verwendung unterer Phase, wobei man Fraktionen von 25 ml auffängt. Zur Detektion der wirkstoffhaltigen Fraktionen unterzieht man ausgewählte Fraktionen einer dünnschichtchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von GeIp]atten, wobei man mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat (1:1) als Entwicklungsmittel arbeitet und die eigentliche Detaktion durch Verkohlung vornimmt. Die Fraktionen 90 bis 150 werden vereinigt und eingedampft, wodurch man das Antibiotikum EL58O/\ erhält.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Herstellung des Inokulums

Ein beispielhaftes Medium, das zur Züchtung des Inokulums der ersten Stufe verwendet wird, wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Sojabohnenmehl 1,0 g

Glucose 2,0 g

Maisquellwasser 0,5 g

CaCO₃ 0,3 g

Wasser auf 100 ml

Unter Verwendung abgewaschener oder abgekratzter Sporen aus einer Agarschräge von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 beimpft man dann zwei 500 ml Kolben, die jeweils 100 ml des obigen Mediums in sterilisierter Form enthalten. Die Kolben werden anschließend auf einen Rotationsschüttler gegeben und kräftig 72 Stunden bei einer Temperatur von 28 ⁰C durchmischt.

Das in obiger Weise gebildete Kolbeninokulum überträgt man dann in einen 19 Liter Glaskolben, der 12 Liter des gleichen sterilen Mediums enthält. Dieses zweite Inokulum wird mit steriler Luft belüftet,

709882/0808

während man es 48 Stunden bei einer Temperatur von 28 ^C wachsen läßt.

Das in obiger Weise hergestellte zweite Inokulum überträgt man hierauf in einen 380 Liter fassenden Fermentationstank, der 300 Liter des gleichen sterilen Mediums enthält. Die Belüftung dieses dritten Inokulums erfolgt mit steriler Luft in einer Menge von 1 Liter Luft pro Liter Medium pro Minute, wobei man das Ganze mit einem Rührer unter einer Geschwindigkeit von 173 Umdrehungen pro Minute rührt. Man läßt den Ansatz 48 Stunden bei 28 ⁰C wachsen. Der pH-Wert beträgt zu dieser Zeit 6,9 bis 7,0.

Beispiel 2
Fermentation

Zur Herstellung eines Fermentationsmediums geht man von folgenden Bestandteilen aus:

Maisquellwasser 0,5 g

Sojabohnenmehl 1,0g

Maisstärke 4,0 g

CaCO₃ . 0,1 g

Wasser auf 100 ml

30OO Liter eines Fermentationsmediums der obigen Formulierung sterilisiert man in einem 4000 Liter fassenden Tank 60 Minuten bei 120 ⁰C. Nach erfolgter Sterilisation hat das Medium einen pH-Wert von 6,4 bis 6,5. Im Anschluß daran inokuliert man dieses Medium mit 3OO Liter des nach Beispiel 1 hergestellten dritten Inokulums. Die Fermentation wird bei 28 bis 30 ⁰C durchgeführt, wobei man als Entschäumer 4,0 Liter Hodag FD82 verwendet. Der Ansatz wird mit 0,6 Liter steriler Luft pro Liter Maische und pro Minute belüftet. Die Maische rührt man mit einem unter einer

709882/080·

Geschwindigkeit von 150 Umdrehungen pro Minute laufenden Rührer. Nach insgesamt 138,5 Stunden langer Fermentation wird die Maische geerntet.

Beispiel 3 Isolierung und Reinigung

2550 Liter der nach Beispiel 2 hergestellten fermentierten Maische, die einen pH-Wert von 7,4 hat, vereinigt man mit 1275 Liter Äthylacetat und rührt das Ganze dann 2,5 Stunden. Im Anschluß daran gibt man 8 Gewichtsprozent Diatomeenerde zu. Das so erhaltene Gemisch filtriert man hierauf in mehreren Anteilen unter Rühren durch ein paar Rahmenpressen. Die Wasser-Äthylacetat-Filtrate werden vereinigt, wodurch man insgesamt 3250 Liter Material erhält, das man dann zur Schichtentrennung stehen läßt. Auf diese Weise ergeben sich 1000 Liter Äthylacetatextrakt. Nach Filtrieren einer jeden Teilmenge des Gemisches aus Maische, Äthylacetat und Diatomeenerde durch die entsprechende Presse wäscht man den auf der Presse vorhandenen Filterkuchen jeweils mit Äthylacetat. Die Äthylacetatwaschflüssigkeiten werden vereinigt und abgetrennt, wodurch man zu 535 Liter Äthylacetatwaschflüssigkeit gelangt. Die obigen 1000 Liter Äthylacetatextrakt und 535 Liter Äthylacetatwaschflüssigkeit werden vereinigt und dann in einer 1515 Liter fassenden Destilliervorrichtung auf 225 Liter konzentriert. Diese 225 Liter Material konzentriert man dann in einer 190 Liter fassenden Destilliervorrichtung weiter auf ein Volumen von 20 Liter. Im Anschluß daran konzentriert man diese 2O Liter Material in einer Glasdestilliervorrichtung weiter, wodurch man zu einem Sirup gelangt.

709882/0808

Der in obiger Weise erhaltene Sirup wird 48 Stunden aufgehoben und anschließend mit der zweifachen Volumenmenge Heptan gerührt. Das Gemisch läßt man hierauf über Nacht bei 4 ⁰C stehen. Die überstehende Flüssigkeit wird sodann dekantiert und anschließend zu einem gummiartigen Rückstand konzentriert.

Den gummiartigen Rückstand versetzt man mit 10 Liter Methanol, worauf man das Gemisch unter Verwendung von Trockeneis mehrere Stunden kühlt. Anschließend wird das Gemisch durch eine Sinterglasnutsche, die eine Schicht aus Diatomeenerde enthält, filtriert, wobei man mit kaltem Methanol nachwäscht. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 1353,5 g Rückstand gelangt.

Den in obiger Weise erhaltenen Rückstand (1353,5 g) löst man derart in Methylenchlorid, daß sich eine Konzentration von 40 g pro Liter ergibt. Im Anschluß daran bepackt man eine Chromatographiersäule mit 27,07 Liter Kohlegranulat mit einer Korngröße von 0,83 χ 0,44. Sodann führt man die obige Methylenchloridlösung unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 375 bis 4OO ml pro Minute durch diese Säule. Das Methylenchlorideluat wird in Form einer einzigen Fraktion aufgefangen und zur Trockne eingedampft, wodurch man 153 g Rückstand erhält. Den Rückstand vermischt man gründlich mit 8 bis 9 Liter Methanol. Das dabei erhaltene Gemisch kühlt man dann in einem Kühlraum unter Verwendung von Trockeneis auf -10 ⁰C ab und hält es 15 Minuten bei -10 ⁰C. Das hierbei anfallende verfestigte öl wird abfiltriert, und das Methanolfiltrat konzentriert man unter Vakuum zur Trockne, wodurch man zu 781,4 g eines Öls gelangt.

Zur Herstellung einer trocken bepackten Chromatographiersäule gibt man 4 kg Silicagel in eine Kunststoffsäule mit einem Umfang von 3O,5 cm. 200 g des obigen Öls löst man anschließend in einer minimalen Menge Methylenchlorid. Sodann gibt man hierzu

709882/0808

3n

300 g Silicagel, vermischt das Ganze gründlich und engt das so erhaltene Gemisch hierauf unter Vakuum zur Trockne ein. Das dabei erhaltene getrocknete Gemisch wird auf die Säule aufgegeben, wobei man das obere Ende der Säule mit einer bestimmten Menge Seesand versieht, um so eine Durchmischung des Betts während der Elution zu unterbinden- Die Kunststoffsäule stellt man in eine Glasschale als Träger und Unterlage. Die Säule wird mit 12 Liter 10-prozentigem Äthylacetat in Benzol eluiert. Man läßt die Säule trockenlaufen, worauf man sie mit 7,6 Liter 20-prozentigem Äthylacetat in Benzol eluiert. Nach Auffangen entsprechender Fraktionen läßt man die Säule trockenlaufen. Die Säule wird dann mit Stickstoff gespült. Die Ermittlung der antibiotischen Aktivität erfolgt durch Untersuchung entsprechender Fraktionen unter Verwendung von Streptococcus pyogeries NY5. Die Säule wird in 10 gleiche Teile (unter Einschluß der Säulenbeschickung) unterteilt. Über die Länge der gesamten Säule werden Kernproben bei Rf-Werten von 0,05, 0,15, 0,25, O,35 ... etc. entnommen. An denjenigen Stellen, an denen sich die antibiotischen Banden überlappen, werden Proben bei jedem 1/8 einer Rf-Einheit gesammelt. Jede Kernprobe verdünnt man mit 10 ml eines Gemischs aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) und untersucht die Proben dünnschichtchromatographisch unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat und Chloroform (1:1), wobei man jeweils Proben mit 30 ml verwendet und die Detektion unter Verkohlung mit Schwefelsäure durchführt« Die Sektion der Säule mit Rf-Werten von O,11 bis 0,35 wird entfernt und in einem Gemisch aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) aufgeschlämmt. Das Gemisch wird filtriert und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gewaschen, worauf man das erhaltene Material unter Vakuum zur Trockne eindampft. Der Rückstand wird in tert.-Butanol gelöst, und durch anschließendes Filtrieren und Lyophilisieren des dabei erhaltenen Materials gelangt man zu 26,7 g Produkt. Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:75:37, auf Volumen bezogen) stellt man ein Zweiphasensystem her. Mit 600 ml der

709882/080«

- atf -

unteren Phase dieses Lösunsmittelsystems vermischt man hierauf 8OO g säuregewaschene Diatomeenerde und bepackt mit diesem Gemisch anschließend in Teilmengen eine 125 cm³ Glassäule. Die Beschickung, die 40 g Diatomeenerde, 30 ml untere Phase und 13,8 g des obigen lyophilisierten Materials enthält, wird in Form eines Gemisches aufgegeben. Die beschickte Säule entwickelt man mit der oberen Phase des Lösungsmittelsystems, und es werden 25 ml Fraktionen gesammelt. Die Ermittlung der Lage der gewünschten Verbindung erfolgt durch Untersuchung entsprechender Fraktionsproben in der oben beschriebenen Weise durch Dünnschichtchromatographie. Die Fraktionen 90 bis 150 werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man als Produkt 2,75 g Antibiotikum BL58O/^ erhält, das vorwiegend als Natriumsalz vorliegt.

Beispiel 4

Herstellung und Isolierung des Antibiotikums BL58O^ in Form der freien Säure

Nach den in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren wird das Natriumteilsalζ des Antibiotikums BL58O/\ hergestellt und isoliert. Durch Vermischen von Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:80:40 Volumenteile) stellt man dann ein Zweiphasensystem her. Anschließend bepackt man eine Glassäule mit einem Gemisch aus 8OO g Diatomeenerde und 600 ml der unteren Phase des obigen Systems. Die Aufgabe der Beschickung erfolgt in Form eines Gemisches aus 28 g Diatomeenerde, 21 ml unterer Phase und 10,9 g Natriumteilsalz des Antibiotikums BL58O^. Die Säule wird unter Verwendung der oberen Phase entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 90 ml gesammelt. Ausgewählte Fraktionen werden über Silplate F-22 chromatographiert, wobei man als Entwicklungsmittel ein Gemisch aus Xthylacetat und Chloroform verwendet und die eigentliche Detektion des Antibiotikums BL58O/^ durch Verkohlung durchführt. Die Fraktionen 29 bis 39, die das Antibiotikum BL58O^ enthalten,

709882/0808

*S

3%

werden vereinigt und zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Durch Lösen des dabei erhaltenen Rückstands in tert.-Butanol und nachfolgendes Lyophilisieren der auf diese Weise gewonnenen Lösung gelangt man zu 4,79 g Material.

8OO mg dieses lyophilisierten Materials rührt man in 300 ml eines Zweiphasensystems aus Wasser, Äther und Petroläther (2:1:1). Der pH-Wert der Lösung wird unter Rühren unter Verwendung von 1normaler Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 eingestellt. Die organische· Phase wird abgetrennt und dreimal mit einem gleichen Volumen Wasser gewaschen. Der Lösungsmittelextrakt wird dann unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt. Durch anschließendes Lösen des Rückstnads in tert.-Butanol und nachfolgendes Lyophilisieren der dabei erhaltenen Lösung gelangt man zu 657 mg Antibiotikum in Form der freien Säure.

Die freie Säure des Antibiotikums BL58O/v^ ergibt in einer mikroanalytischen Untersuchung folgende Analysenwerte: C = 61,10, E = 8,9, Asche = 0. Die freie Säure hat einen spezifischen Drehwert /alpha/^⁵ = +21° +1° (c = 0,9 in Methanol).

Die freie Säure des Antibiotikums BLSeo/N^ zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen: 2,95; 5,88; 8,35; 8,60; 9,00; 9,12; 9,43; 9,62; 10,05 und 10,47 μ.

Ein Infrarotabsorptionsspektrum der freien Säure des Antibiotikums BL58O^ in Form eines KBr-Preßlings geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor.

Ein PMR-Spektrum der freien Säure des Antibiotikums BL58O/\ wird in Figur 5 der Zeichnung gezeigt.

Ein C-NMR-Spektrum der freien Säure des Antibiotikums BL58O/\ ist in Figur 6 der Zeichnung angegeben.

709882/0801

Beispiel 5 Herstellung des Natriumsalzes des Antibiotikums BL58O/\

Die freie Säure von BL58O/\ (1 g) löst man in 3OO ml eines Gemisches aus Äther und Petroläther (1:1). Diese Lösung gibt man dann zur Bildung eines Zweiphasensystems zu 200 ml Wasser. Anschließend stellt man den pH-Wert der Lösung unter Rühren durch Zusatz von 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf 10,0 ein, worauf man die organische Phase abtrennt und unter Vakuum zu einem Rückstand eindampft. Der Rückstand wird in 10 ml Äther gelöst, und die Lösung versetzt man mit 20 ml Petroläther (Siedebereich 3O bis 70 ⁰C). Sodann impft man die erhaltene Lösung mit einem Kristall des Natriumsalzes von BL58O/^ an und läßt sie hierauf langsam bei einer Temperatur von 4 ⁰C verdampfen, bis sich ein kristalliner Feststoff bildet. Die Kristalle werden auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet, wodurch man zu 323 mg Natriumsalz von BLSeOA₁ gelangt.

Dieses Natriumsalz des Antibiotikums BL58O/j_ schmilzt bei 157 bis 161 ⁰C und hat folgende Elementaranalyse: C = 60,99; H = 8,47; Na = 1,95: /alpha/^⁵ = +6° +1° (c = 1,153 in Methanol) . Das Natriumsalz von BL58O/\_ zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen: 6,27, 7,28, 9,0, 9,13, 9,23, 9,48 und 10,60 μ.

Ein Infrarotabsorptionsspektrum des Natriumsalzes von BL58O/\ in Form eines KBr-Preßlings geht aus Figur 1 der Zeichnung hervor.

Ein C-NMR-Spektrum des Natriumsalzes von BL58O/\ ist in Figur 2 der Zeichnung angegeben.

Ein PMR-Spektrum des Natriumsalzes von BL58O/\ ist in Figur 3 der Zeichnung gezeigt.

709882/0801

-y-

Beispiel 6 Herstellung und Isolierung des p-Bromphenacylesters von BL58O/\

Das Natriumteilsalz des Antibiotikums BL58O/\^ wird nach dem Verfahren der Beispiele 1 bis 3 hergestellt und isoliert. 1 g dieses Natriumsalzes von BL58O/X,, 834 mg p-Bromphenacylbromid, 600 mg Lithiumcarbonat und 20 ml trockenes Dimethylformamid gibt man in einen Kolben und läßt das Ganze darin 16 Stunden bei einer Temperatur von 37 ⁰C reagieren. Sodann gibt man 4 Volumina Chloroform zu und filtriert die hierdurch entstandene Suspension. Das Filtrat wird zur Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu einem sirupartigen Rückstand gelangt. Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Heptan, Äthylacetat, Methanol und Wasser (2000:25:1000:17) stellt man hierauf eine Verteilungssäule mit Diatomeenerde her. Es wird mit 120 g Diatomeenerde und 90 ml unterer Phase des obigen Lösungsmittelsystems für die Säule gearbeitet. Auf die Säule gibt man dann ein Gemisch aus dem obigen sirupartigen Rückstand, 12 g Diatomeenerde und 9 ml unterer Phase. Die Säule wird mit der oberen Phase entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml gesammelt. Die Ermittlung der Lage der Aktivität in den Fraktionen erfolgt durch Dünnschichtchromatographie. Die Fraktionen 22 bis 41 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Methanol gelöst, worauf man die Lösung filtriert. Das Filtrat wird auf einem Dampfbad erwärmt und mit 10 ml Wasser versetzt, worauf man das Gemisch langsam auf 4 ⁰C abkühlen läßt. Die dabei anfallenden Kristalle werden gesammelt, wodurch man zu 566 mg p-Bromphenacylester von BL58O/\ gelangt.

Eine mikroanalytische Untersuchung des p-Bromphenacylesters von

BL58O/\ ergibt folgende Analysenwerte: C = 58,30; H = 7,80;

25 Br = 8,64. Der Ester hat einen spezifischen Drehwert /alpha/

= +63° + 2° (CHCl₃ bei 0,51 %).

709882/0801

Der p-Bromphenacylester von BLSeo^ zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen: 2,95; 5,88; 6,30; 8,20; 8,45; 8,60; 9,00; 9,15 (breit); 9,37 (breit); 9,62; 10,06 und 10,37.

Der p-Bromphenacylester von BLSeo^-Monohydrat hat einer Bestimmung durch Röntgenbeugung zufolge ein Molekulargewicht von 1114 + 0,3 %.

Ein Infrarotabsorptionsspektrum des p-Bromphenacylesters von BL85O/^ in Form eines KBr-Preßlings geht aus Figur 7 der Zeichnung hervor.

Ein Ultraviolettabsorptionsspektrum des p-Bromphenacylesters von BL58O^ in Form einer Lösung in Methanol mit einer Konzentration von 33,84 Mikrogramm pro Milliliter Lösungsmittel ist in Figur 8 der Zeichnung gezeigt.

Ein PMR-Spektrum des p-Bromphenacylesters von BL58O^ ist in Figur 9 der Zeichnung angegeben.

709882/0801

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. / Antibiotikum BL58OA^

der |"prmel

OC--

d*

709882/080·

und die pharmazeutisch unbedenklichen kationischen Salze hiervon.

ORIGINAL INSPECTED

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BL58O/\_r dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität in diesem Medium züchtet und anschließend aus diesem Medium das Antibiotikum ΒΙι580/\ gewinnt.

3. Verfahren zur Behandlung und Verhinderung von Coccidiosis bei Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß man Geflügel oral eine anticoccidial wirksame Menge einer Verbindung aus der Gruppe des Antibiotikums ΒΣ,δδΟ/ν^ oder eines pharmakologisch unbedenklichen kationischen Salzes hiervon verabreicht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man das Antibiotikum Geflügel oral in einer Konzentration von etwa 125 bis 250 ppm Wirkstoff im Futter verabreicht.·

5. Mittel zur Behandlung und Verhinderung von Coccidiosis bei Geflügel aus einem üblichen Geflügelfutter und einer anticoccidial wirksamen Menge eines Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet , daß es als Antibiotikum das Antibiotikum ΒΙ,δδΟΑ^ und/oder ein pharmazeutisch unbedenkliches kationisches Salz hiervon enthält.

6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet , daß es das Antibiotikum in dem Futter in einer Konzentration von 125 bis 25Ο ppm enthält.

709882/060*