Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku, oznaczonego BL 580 A metoda fermentacyjna, wyodrebniana z surowych roztworów, zatezania i oczyszczania.Dzialanie nowego antybiotyku, jako czynnika an- tyokcydiozowego, lacznie z jego wlasciwosciami chemicznymi i fizycznymi odróznia go od antybio¬ tyków dotychczas opisanych.Antybiotyk BL 580 A przedstawia wzór struk¬ turalny, zalaczony na rysunku. Wzór ten, zgod¬ nie z przyjeta konwencja wskazuje, ze podstaw¬ nik w polozeniu cc znajduje sie pod plaszczyzna papieru i odpowiednie wiazanie przedstawione jest linia , natomiast podstawnik w polo¬ zeniu (3 znajduje sie nad plaszczyna papieru i odpowiednie wiazanie przedstawione jest za po¬ moca wypelnionego trójkata.Nowy antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku, jest organicznym kwasem kaTboksylo-; wym i wskutek tego posiada zdolnosc tworzenia' soli z nietoksycznymi, farmaceutycznie dozwolo¬ nymi kationami. I tak, za pomoca zmieszania an¬ tybiotyku w postaci wolnego kwasu z kationami, uzytymi w ilosci stechiometrycznej, korzystnie w srodowisku rozpuszczalnika obojetnego, mozna wy¬ tworzyc sole tak przy uzyciu kationów takich, jak jon sodowy, potasowy, wapniowy, magnezowy i amonowy, jak i kationów amin aromatycznych, takich jak kationy trój/niskoalkilo/amin, /np. trój- etyloaminy, trójetanoloaminy/, prokainy i temu podobne. Sole antybiotyku BL 580 A z kationami sa to na ogól ciala stale krystaliczne, wzglednie nierozpuszczalne w wodzie i rozpuszczalne w wiek¬ szosci zwyklych rozpuszczalników organicznych, takich jak metanol, octan etylu, aceton, chloro¬ form, heptan, eter i benzen.Nowy antybiotyk, który zostal oznaczony sym¬ bolem BL 580 A, tworzy sie w trakcie prowadzo¬ nej w warunkach kontrolowanych hodowli nowego szczepu Streptomyces hygroscopicus, gatunku pro¬ dukujacego takze znane antybiotyki BL 580 a i BL 580 |3 /patrz opis patentowy Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr 3 812 249/. Ten nowy szczep jest mutantem, uzyskanym w wyniku. dzialania na S. hygroscopicus NRRL 5647 N^metylo-N'-nitro- -N"-nitrozoguanidyna. Zywa hodowla nowego drob¬ noustroju zostala zdeponowana w Culture Collec- tion Laboratory, Nothern Utilization Research and Development Division, United States Departament of Agriculture, Peoria, Hlirioiis i stanowi czesc tam¬ tejszej stalej kolekcji. Jest ona ogólnie dostepna pod numerem rejestracyjnym NRRL 81i80.Wlasciwosci hodowlane, fizjologiczne i morfolo¬ giczne szczepu NRRL 8180 sa w zasadzie takie same, jak szczepu NRRL 5647, ustalone przez Dr H. D. Tresnera z Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York. Opis ogólny drobnoustroju, oparty na zaob¬ serwowanych cechach diagnostycznych jest taki sam, jak opis szczepu NRRL 5647, opublikowany 105 378105 378 w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 3 812 249. Ponizej powtórzono go dla udo¬ godnienia.Obserwacji wlasciwosci hodowlanych, fizjologicz¬ nych i morfologicznych szczepu NRRL 81&0 doko¬ nano zgodnie z metodyka podana przez Shirlinga i Gottlieba w Internat. Journal of Syst. Bacteriol. 16, 3H3i-^340, /1986/. Opisowe nazwy barw pod¬ kreslone zaczerpnieto z podrecznika Jacobsona i in. „Color Harmony Manual", Container Corp. of America, Chicago, Illinois, wyd. III, 1948. Szcze¬ gólowe dane zamieszczono w tablicach 1—4.Intensywnosc wzrostu: dobry wzrost: na agarze z ekstraktem drozdzowym, agarze Kustera z plat¬ kami owsianymi, agarze owsianym z pasta pomi¬ dorowa i agarze ziemniaczanym z glukoza; umiar¬ kowany wzrost: na agarze z asparagina i glukoza, agarze Hickeya i Tresnera, agarze skrobiowym z solami nieorganicznymi i agarze Bennetta; slaby wzrost: na agarze z roztworem Czapka.Grzybnia powietrzna: bialawa do zóltawej, prze¬ chodzaca w szarawa, w strefach zarodnikowania od plowej /4 ig/ do bobrowej /4 li/ i do popie¬ latej /S fe/. W starszych hodowlach strefy zarod¬ nikowania staja sie czarne i higroskopijne. Pig¬ menty rozpuszczalne: brak na wiekszosci podlozy.Zóltawe na agarze z ekstraktem drozdzowym, aga¬ rze Bennetta i agarze ziemniaczanym z glukoza i to tylko w nieznacznych ilosciach.Barwa grzybni, ogladanej od dolu: na ogcfl odcieniach zóltawych na wiekszosci podlozy.Wlasciwosci fizjologiczne: azotany redukowane do azotynów.Calkowite uplynnianie zelatyny. Na agarze z pep¬ tonem i zelazem brak tworzenia barwników mela- noidowych. W ciagu 7 dni calkowita peptoniza- cja mleka z purpura. Tolerancja na NaCl na pod¬ lozu wzrostowym Wo, ale <10°/o. Wykorzystanie zródla wegla wedlug metody Pridhama i Gottlieba, podanej w J. Bacteriol., 56, 107—114 /1948/, dobre wykorzystanie adonitu, D — galaktozy, D — fruk¬ tozy, D — rafinozy, salicyny, D — ksylozy i glu¬ kozy. Slabe wykorzystanie az do braku wykorzy¬ stania D — melezytozy, D — melibiozy, L — io arabinozy, inozytu, laktozy, D — mannitu, L — ramnozy, sacharozy i D — trehalozy.Morfologia mikroskopowa: grzybnia powietrzna wytwarza odgalezienia zarodnikonosne, konczace sie ciasno zwinietymi spiralami o kilku zwojach.Zarodniki przewaznie o równej srednicy, cylin¬ dryczne, w ksztalcie paliczka, p wymiarach 0,6—0,7 |xmX0,7—0,8 firn. Powierzchnia zarodników, obser¬ wowana w mikroskopie elektronowym, jest glad¬ ka. Oslonki zarodników delikatnie zmarszczone.Na podstawie stwierdzonych ogólnych wlasciwosci drobnoustrój NRRL 8180 zalicza sie do grupy pro¬ mieniowców, odznaczajacych sie tworzeniem zarod¬ ników o barwie szarej, spiralnych lancuchów za¬ rodników, zarodników o powierzchni gladkiej oraz brakiem pigmentów melaninowych. Higroskopijny charakter hodowli wraz z kompletnym zestawem wlasciwosci morfologicznych i fizjologicznych czy¬ ni go reprezentatywnym szczepem gatunku Strep¬ tomyces higroscopicus wedlug definicji H. D Tre¬ snera i E. J. Backusa, podanej w: „A Broadened Concept of the Characteristics of Streptomyces hygroscopicus" Appl. Microbiol., 4, 243—25(0 /1956/ i H. D. Tresnera, E. J. Backusa i J. A. Hayesa w „Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicus-like Complex", Appl. Microbiol., 15, 6371—«39 ,/19«7/.Tablica 1 Wlasciwosci hodowlane Streptomyces hygroscopicus Czas inkubacji: 14 dni Temperatura inkubacji: 28°C NRRL 8180 1 Podloze 1 1 Agar z roz¬ tworem Czapka Agar z ekstrak¬ tem drozdzo¬ wym Agar Kustera z platkami owsianymi Intensyw¬ nosc wzrostu ,2 Slaby Dobry Dobry Grzybnia powietrzna i/lub zarodniki 3 Siady bialawej grzybni powietrznej Brak zarodnikowania Grzybnia powietrzna bia¬ lawa, przechodzaca w plowa /4 ig/ do bobro¬ wej /4 li/ w strefach za- i rodnikowania Grzybnia powietrzna bia¬ lawa, przechodzaca w strefach zarodnikowania w plowa JA ig/ do bo¬ browej J4 li/. Zarodniko¬ wanie obfite Pigment rozpusz¬ czalny 4 Brak Zóltawy, slaby Brak Barwa grzybni ogladanej od dolu Bezbarw¬ na do bialawej Bambuso¬ wy /2 fb/ Jasno- -musztar- dowo- -brazowy /2 ie/ Uwagi 6 | Czarniawe hygro- skopijne obszary w srodkowych strefach hodowli Czarniawe hygro- skopijne obszary w srodkowych | strefach hodowli.W strefach brze¬ gowych zóltawa i wydzielina105 378 6 Tablica 1 c.d. 1 1 Agar z aspara- gina i glukoza 1 Agar Hickeya i Tresnera Agar skrobio¬ wy z solami nieorganicz¬ nymi Agar owsiany z pasta pomi¬ dorowa Agar Bennetta Agar ziemnia¬ czany z glu¬ koza 2 ' Umiarko¬ wany Umiarko-;- wany Umiarko¬ wany Dobry Umiarko¬ wany Dobry I 3 Grzybnia powietrzna bia¬ lawa, przechodzaca w strefach zarodnikowania w popielata /5 fe/ do pio- wej /4 ig|/. Zarodnikowa¬ nie umiarkowane.Grzybnia powietrzna bia¬ lawa do zóltawej, prze¬ chodzaca w strefach za¬ rodnikowania w plowa /4 ig/ do bobrowej /4 li/.Zarodnikowanie obfite.Grzybnia powietrzna bia¬ lawa do 'zóltawej, prze¬ chodzaca w strefach za¬ rodnikowania w plowa /4 ig/ do bobrowej /4 li/.Zarodnikowanie obfite.Grzybnia powietrzna bia¬ lawa do zóltawej, prze¬ chodzaca w strefach za¬ rodnikowania w plowa /4 ig/ do bobrowej /4 li/.Zarodnikowanie obfite.Grzybnia powietrzna bia¬ lawa, przechodzaca w strefach zarodnikowania w bobrowa /4 li/. Zarod¬ nikowanie obfite.Grzybnia powietrzna bia¬ lawa do zóltawej, prze¬ chodzaca w strefach za¬ rodnikowania w popielata /5 fe/ do plowej /4 ig/. 4 Brak Brak Brak Brak Zóltawy, slaby" Zóltawy, slaby 6 Bambuso¬ wy /2 fb/ Bambuso¬ wy /2 fby Pastelo¬ wo zólty /l db/ Zólto- klonowy /3 ng/ Bambuso¬ wy /2 fb/ Zólto- klonowy /3 ng/ 6 Czarniawe hygro- skopijne obszary w srodkowych strefach hodowli Rozlegle obszary 1 hygroskopijne w srodkowycyh stre¬ fach hodowli Czarniawo hygro- 1 skopijne obszary w srodkowych strefach kolonii Rozlegle obszary hygroskopijne w srodkowych stre¬ fach hodowli. Zól¬ tawa wydzielina w strefach brzego¬ wych Czarniawe obszary 1 hygroskopijne w I srodkowych stre¬ fach hodowli.Czarniawe obszary hygroskopijne w srodkowych stre¬ fach hodowli Tablica 2 Morfologia mikroskopowa Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 Podloze Agar Kustera z platkami owsianymi Grzybnia powietrzna i/lub struktury zarodnikonosne Grzybnia powietrzna wytwarza odgalezienia zarodnikonosne, konczace sie ciasno zwiniety¬ mi spiralami o kilku zwojach Ksztalt zarodników Zarodniki przewaznie o równej srednicy, cylindryczne, w ksztalcie paliczka Wielkosc zarodników 0,6 nm— —0,7 \nm X 0,7 nm— —0,8 [im Powierzchnia zarodników Obserwowana w mikroskopie elektronowym gladka.Oslonki zarod¬ ników delikat¬ nie zmarsz¬ czone. |105 378 7 8 f Tablica 3 Wlasciwosci fizjologiczne Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 Podloze Bulion z azotanami Bulion z azotanami Zelatyna Agar z peptonem i zelazem Mleko z purpura Agar z ekstraktem droz- dzowym+4, 7, 10 i lSP/o Nad Inkubacja /28°C/ 7 dni 14 dni 7 dni 24—48 godzin 7 dni dni Intensyw¬ nosc wzrostu Dobry Dobry Dobry Dobry Dobry Dobry Wlasciwosci fizjologiczne ! Azotany redukowane do azotynów Azotany redukowane do azotynów Calkowite uplynnienie Brak tworzenia barwników melanoido- wych Calkowita peptonizacja Tolerancja na NaCl 7°/e ale <10ty# Tablica 4 Wykorzystanie zródla wegla przez Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 Inkubacja: 10 dni Temperatura: 28°C | Zródlo wegla Adonit 1 L — arabinoza Dekstran jD — fruktoza I Inozyt i Laktoza 1 D — mannit D — melezytoza D — melibioza D — rafinoza L — raihnoza Salicyna Sacharoza D — trehaloza D — ksyloza Glukoza Kontrola ujemna Wykorzystanie */ 3 0 3 3 0 0- 0 1 1 3 0 3 0 0 3 3 0 W tablicy 4 uzyto nastepujacych oznaczen: V 3=wykorzystanie dobre 2=wykorzystanie dosc dobre 1'=wykorzystanie slabe 0=brak wykorzystania Antybiotyk BL 580 A, wykazuje wysoka efektyw¬ nosc hamowania zakazen kokcydiozowych u zy¬ wicieli cieplokrwisftych. Poza tym antybiotyk BL 580 A jest znacznie mniej toksyczny od antybio¬ tyku BL 580 a, którego budowe podano w holen¬ derskim opisie patentowym nr 7 402 938. Aktywnosc antybiotyku BL 580 A jako czynnika antykokcydio- zowego wykazano za pomoca nastepujacych testów in vivo, w których stosowano nastepujaca diete dla drobiu.Premiks witaminowo-aminokwasowy 0,5Vt Pierwiastki sladowe 0,l*/o Chlorek sodowy 0,3V« 45 55 Jednowodorofosforan wapniowy l&h Kreda mielona 0,5^/t Tluszcz stabilizowany 4,0f/» Susz lucerny /zawartosc bialka 176/o/ 2,0°/© Kukurydziana maka glutenowa /zawartosc bialka 4110/*/ 5,0f/§ Macka rybna /Menhaden Fish Meal/ /zawartosc bialka 60Vt/ 5,0°/« Maka z wytloków sojowych /zawartosc bialka 44V»/ 30,0% Zólta sruta kukurydziana, drobna do 100,0°/o Wystepujacy w powyzszej diecie dla drobiu pre¬ miks witaminowo-aminokwasowy wytworzono z nastepujacych skladników, przy czym ilosci poda¬ no w odpowiednich jednostkach na kilogram kar¬ my.Butylowana pochodna hydroksytoluenu 125 mg DL — metiomina 500 mg WitaminaA 3300 j.m.Witamina D1 1100 j.m.Ryboflawina 4,4 mg WitaminaE 2^2 jjn.Kwas nikotynowy 27,5 mg Kwas pantotenowy 8,8 mg Chlorek choliny 500 mg Kwas foliowy 1,43 mg Wodorosiarczan sodowy menadionu 1,1 mg WitaminaBu 11 \ng Zólta sruta kukurydziana, drobna do 5 g Mieszane zakazenia kokcydiozowe organizmami Eimeria tenella i Eimeria acervulina.Siedmiodniowe kurczeta, podzielone na grupy, zainfekowano, przez bezposrednie wprowadzenie wszystkim kurczetom do wola mieszanego inoku- lum, skladajacego sie z 5000 oocyst po sporulacji Eimeria acervulina oraz wystarczajacej ilosci oocyst Eimeria tenella, które powoduja 85—lOOty smier¬ telnosci kurczat w grupie kontrolnej, nie poddanej dzialaniu antybiotyku. Kurczetom przez caly czas trwania testu udostepniono swobodny dostep do karmy i wody. W dwa dni po zainfekowaniu po¬ szczególnym .grupom kurczat, poddawanych próbie, podano pozywienie z lekiem, zlozone z diety dla drobiu i róznych ilosci antybiotyku BL 580 A. Test zakonczono w 10 dni po zainfekowaniu. Kurczeta /105 378 9 zwazono, poddano sekcji i szukano w jelitach u- szkodzen. Wyniki tego testu zamieszczono w ta¬ blicy 5. Z danych tych wynika, ze lOO^/o przezy¬ cia u kurczat zainfekowanych uzyskano w przy¬ padku podania im w diecie 125 ppm lub 250 ppm antybiotyku BL 580 A. Wyniki te wskazuja rów¬ niez na wybitne zmniejszenie uszkodzen, powo¬ dowanych przez Eimeria tenella i EimeTia acer- vulina w przypadku podania zainfekowanym kur¬ czetom w ich karmie 30 ppm lub 60 ppm anty¬ biotyku BL 5(80 A.Tablica 5 Stezenie antybiotyku BL 580 A w diecie ppm 0 ' 250 125 60 Wyjs¬ ciowa ilosc ptaków 60 24 prze¬ zycia 17 100 100 91,6 60 % ptaków ze zmniejszeniem uszkodzen Eimeria tenella 0 100 100 46 0 Eimeria acer- vulina 0 100 100 100 . 64 Mieszane zakazenia kokcydiozowe organizmami Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria neca- trix, Eimeria brunetti i Eimeria maxima.Handlowa szczepionke /CocoivacRD, produkcji Stervin Laboratories, Opalika, Alabama/, zawiera¬ jaca mieszanine co najmniej pieciu gatunków z rodzaju Eimeria, podawano kurczetom w ilosci 70X wiekszej od normalnej dawki uodparniaja- cej. Szczepionke podawano grupom siedmiodnio¬ wych kurczat przez bezposrednie wprowadzenie jej wszystkim kurczetom do wola. Kurczetom przez caly czas trwania testu udostepniono swobodny dostep do karmy i wody. W dwa dni po zainfeko¬ waniu poszczególnym grupom kurczat, poddawa¬ nych próbie, podano pozywienie z lekiem, zlozo¬ ne z diety dla drobiu i róznych ilosci antybioty¬ ku BL 580 A. Test zakonczono w 10 dni po zain¬ fekowaniu. Kurczeta zwazono, poddano sekcji i szukano w ich jelitach uszkodzen. Wyniki tego testu zamieszczono w tablicy 6. Z danych tych wynika, ze L00°/o przezycia u kurczat zainfeko¬ wanych uzyskano w przypadku podania im w die¬ cie 120 ppm antybiotyku BL 580 A. Przy tym po¬ ziomie dawkowania wykazano równiez wybitne zmniejszenie uszkodzen, powodowanych przez Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria neca- trix, Eimeria branetti i Eimeria maxima.Proces fermentacyjny: hodowle drobnoustroju Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 mozna, pro¬ wadzic na bardzo rozmaitych podlozach plynnych.Podloza, uzyteczne przy wytwarzaniu antybiotyku BL 580 A, zawieraja przyswajalne zródlo wegla, takie jak skrobia, cukier, imelas, gliceryna itd., lt przyswajalne zródlo azotu, takie jak bialko, hydro¬ lizat bialka, polipeptydy, aminokwasy, namok ku¬ kurydziany itd. oraz nieorganiczne aniony i katio¬ ny, takie jak jon potasowy, sodowy, wapniowy, siarczanowy, fosforanowy, chlorkowy itd. Pierwia- stki sladowe, takie jak bor, molibden, miedz itd. wprowadzane sa jako zanieczyszczenia innych skladników podloza. Napowietrzanie zawartosci tanków i kolb zapewnione jest przez przepuszcza¬ nie jalowego powietrza odpowiednio poprzez brzeczke fermentacyjna lub ponadpowierzchniowo.Poza tym zawartosc tanków miesza sie przy uzy¬ ciu mieszadla mechanicznego. Jesli jest to koniecz¬ ne, do brzeczki wprowadza sie substancje prze- ciwpienna, taka jak l*/o roztwór oktadekanolu w oleju smakowym.Przygotowanie inokulum: inokulum szczepu Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 w kol¬ bach trzesawkowych 500 ml przygotowuje sie, za¬ szczepiajac 100 ml jalowego podloza plynnego za- rodnikami zdrapanymi lub zmytymi z hodowli na skosie agarowym. Zazwyczaj stosuje sie pod¬ loze o nastepujacym skladzie: Maka sojowa l,0°/o Glukoza 2,0*/t Namok kukurydziany 0,5P/t CaOOa 0,3«/o Woda do 100 •/• Hodowle w kolbach inkubuje sie w temperatu¬ rze od 25 do 29°C, korzystnie 28°C, wstrzasajac 40 energicznie na trzesawce obrotowej przez 48 do &6 godzin.Dwóch 100 ml porcji tak przygotowanego inoku¬ lum uzywa sie do zaszczepienia 12 1 jadowego pod¬ loza o powyzszym skladzie w kolbie 20 1. Hodowle 45 te inkubuje sie, przy mieszaniu i napowietrzaniu jalowymi powietrzem, przez 36 do 64 godzin, w temperaturze 25 do 29°C, korzystnie 28°C.Tak otrzymanym inokulum zaszczepia sie 300 1 jalowego podloza o powyzszym skladzie w tanku w fermentacyjnym. Hodowle te inkuibuje sie, przy mieszaniu i napowietrzaniu jalowym powietrzem, Tablica 6 1 Stezenie antybiotyku BL 580 A w diecie ppm 0 120 60 | 30 Wyjsciowa ilosc ptaków «/o przezycia 0 100 100 100 •/o ptaków ze zmniejszeniem uszkodzen Gatunek z rodzaju Eimeria tenella 0 1O0 40 7 acervulina 0 100 93 7 necatrix 60 100 100 86 brunetti 0 HOO 48 0 maxima ' 1O0 80 21105 378 li przez 36 do 64 godzin w temperaturze 25 do 29°C, korzystnie 28°C.Tak przygotowanego inokulum uzywa sie do za¬ szczepienia 3000 1 jalowego podloza, umieszczonego w 4000 1 tanku fermentacyjnym, o nastepujacym skladzie: Namok kukurydziany 0,5P/o Maka sojowa 1,0% Skrobia kukurydziana 4,0°/o CaOO, 0,1% Woda do 100 % Fermentacje prowadzi sie w ciagu 100 do 200 godzin w temperaturze 27 do 32°C przy miesza¬ niu za pomoca mieszadla i napowietrzaniu z szyb¬ koscia 0,4—0,8 1 powietrza/litr podloza/minute.Zazwyczaj dodaje sie substancje przeciwpienna, taka jak Hodaig FD 82 w ilosci okolo 5,9 1/4545 1 podloza.Sposób oczyszczania. Po zakonczeniu fermen¬ tacji do brzeczki fermentacyjnej, zawierajacej an¬ tybiotyk BL 580 A, dodaje sie octan etylu, uzyty w ilosci równej okolo 1/2 objetosci brzeczki i ca¬ losc miesza sie w ciagu 2—3 godzin. Nastepnie dodaje sie okolo 8% ziemi okrzemkowej i mie¬ szanine saczy na plytowej ramowej prasie filtra¬ cyjnej. Osad na prasie przemywa sie octanem ety¬ lu, ekstrakty octanowe laczy sie i zateza w wypar¬ ce do konsystencji syropu.Syrop, otrzymany w sposób jak wyzej opisano, miesza sie z heptanem, uzytym w ilosci równej dwukrotnej objetosci syropu i pozostawia sie przez noc w temperaturze 4°C. Nastepnie supernatant oddziela sie za pomoca dekantacji i zateza, otrzy¬ mujac pozostalosc o konsystencji gumy.Gumowaty 'koncentrat zadaje sie 10 1 metanolu i oziebia przy uzyciu suchego lodu przez kilka godzin. Mieszanine saczy sie przez saczek ze spie¬ kanego szkla, pokryty warstwa ziemi okrzemko¬ wej i osad przemywa sie zimnym metanolem.Nastepnie roztwór metanolowy zateza sie do su¬ cha pod zmniejszonym cisnieniem.Kolumne chromatograficzna zaladowuje sie weglem aktywowanym, uzytym w stosunku 1 1 wegla na 50 g wsadu. Sucha pozostalosc rozpusz¬ cza sie w chlorku metylenu w stosunku 40 g po¬ zostalosci na 1 1 chlorku metylenu i nanosi na kolumne. Eluat zbiera sie jako jedna frakcje i za¬ teza .do sucha. Otrzymana pozostalosc miesza sie z metanolem i pozostawia w pokoju — chlodni z suchym lodem, aby uzyskac na 15 minut obnize¬ nie temperatury do —10°C. Po uplywie 15. minut zestalona pozostalosc odsacza sie, a roztwór sub¬ stancji rozpuszczonych w metanolu zateza sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac pozostalosc w postaci oleju.Pozostalosc, te rozpuszcza sie w mozliwie naj¬ mniejszej ilosci chlorku metylenu, po czym dodaje sie zel krzemionkowy i calosc zateza do sucha, po czym nanosi na kolumne, wypelniona suchym ze¬ lem, krzemionkowym. Kolumne rozwija sie 10% roztworem octanu etylu w benzenie, a nastepnie % roztworem octanu etylu w benzenie.- Nastep* nie kolumne pozostawia sie do wyschniecia, po czym dzieli sie ja na 10 równych czesci, uwzgledi- niajac w tym wsad. Pobiera sie próbki rdzenia 12 przy Rf 0,05, 0,15, 0,25, 0,55 itd. z calej dlugosci kolumny i poddaje elucji odpowiednia objetoscia mieszaniny 2:2:1 octan etylu, chlorku metylenu i metanolu. Z miejsc, na które zachodzi antybio- tyk, pobiera sie próbki rdzenia przy kazdej 1/8 jednostki Rf. Antybiotyk lokalizuje sie, poddajac eluaty z rdzenia chromatografii cienkowarstwo¬ wej na handlowo dostepnych plytkach do chro¬ matografii cienkowarstwowej /Silplate — 22, roz- io prowadzane przez Brinkmann Instrument Co., Westbury, New York 11590/. Poszczególne strefy wykrywa sie przez zweglanie w obecnosci kwasu siarkowego Odcinek kolumny w obrebie wartosci Rf 0,11 do 0,35 wycina sie i zawiesza w mieszaninie 2:2:1 obj./obj. octanu etylu, chlorku metylenu i meta¬ nolu. Mieszanine saczy sie, przemywa dodatko¬ wa iloscia mieszaniny rozpuszczalników i zateza pod zmniejszonym cisnieniem do sucha. Pozosta- losc rozpuszcza sie w Ill-rzed.butanolu, saczy i liofilizuje, otrzymujac puszysty produkt.Przygotowuje sie uklad dwufazowy za pomoca zmieszania n-heptanu, metanolu, octanu etylu i wody w stosunku objetosciowym, odpowiednio, 23 3000:1500:75:37. Ziemie okrzemkowa gatunku Cela- tom /Eagle-Picher Industries, Cincinnati, Ohio/ miesza sie z faza dolna otrzymanego ukladu w sto¬ sunku 800 g ziemi na 600 ml fazy i otrzymana mie¬ szanine wprowadza sie stopniowo do kolumny o srednicy 7,5 cm. Na kolumne nanosi sie wsad w postaci mieszaniny ziemi okrzemkowej, fazy dol¬ nej i zliofilizowanego produktu w stosunku od¬ powiednio 40 g:30 ml: 13,8 g. Kolumne po zala¬ dowaniu rozwija sie górna faza ukladu, odbiera- jac 25 ml frakcje. Substancje czynna wykrywa sie w wybranych fralkcjach metoda chromatografii cienkowarstwowej przy uzyciu plytek pokrytych zelem, stosujac do rozwijania chromatogramu mie¬ szanine 1:1 chloroformu i octanu etyiu, a do wy- 40 krycia zweglanie. Frakcje 90—150 laczy sie i za¬ teza, otrzymujac antybiotyk BL 580 A.Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady: Przyklad I. Przygotowanie inokulum: w ce¬ lu otrzymania inokulum I-ego stopnia przygoto- 45 wuje sie typowe podloze o nastepujacym skladzie: Maka sojowa 1,0 g Glukoza 2,0 g Namok kukurydziany 0,5 g CaCOa 0,3 g 50 Woda do 100 ml Do dwóch kolb 500 ml, zawierajacych po 100 ml jalowego podloza o powyzszym skladzie, wprowa¬ dza sie zarodniki Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 zmyte lub zdrapane z hodowli na sko- 55 sie agarowym. Obie kolby umieszcza sie na trze- sawce obrotowej i energicznie wytrzasa przez 7(2 godziny w temperaturze 28°C.Otrzymane w kolbach inokulum przenosi sie do 22,7 1 szklanej butli, zawierajacej 12 1 jalowego oo podloza o wyzej podanym skladzie. Przez hodowle, stanowiaca, inokulum 11-ego stopnia, przepuszcza* sie jalowe powietrze, prowadzac inkubacje przez 48 godzin w temperaturze 28°C.Otrzymane-inokulum II-ego stopnia przenosi sie 05 do 454 1 fenmentora, zawierajacego 300 1 podloza'105 378 13 o powyzszym skladzie. Przez hodowle, stanowiaca inokulum III-ego stopnia, przepuszcza sie jalowe powietrze z szybkoscia 1 1 powietrza/1 1 podlo¬ za/l minute, mieszajac mieszadlem przy 17;3 obr,/ /min. Inkubacje prowadzi sie przez 48 godzin w 5 temperaturze 28°C, przy pH=6,9—7,0.Przyklad II. Fermentacja* przygotowuje sie podloze fermentacyjne o nastepujacym skladzie: Namok kukurydziany 0,5 g Makasojowa 1,0 g 10 Skrobia kukurydziana 4,0 g CaC03 0,1 g Woda do 100 ml 3000 1 podloza fermentacyjnego o powyzszym skladzie umieszcza sie w 4000 -1 tanku i steryli- 15 zuje w temperaturze 120°C przez 60 minut. Po steryliyzacji pH podloza wynosi 6,4—6,5. Podloze to zaszczepia sie 300 1 inokulum III-ego stopnia, otrzymanego w sposób jak wyzej, opisano w przy¬ kladzie I. Fermentacje prowadzi sie w tempera- 20 turze 28—30oC przy uzyciu 4,0 1 Hodag FD 82 jako substancji przeciwpiennej. Brzeczke napowietrza¬ no z szybkoscia 0,6 1 jalowego powietrza/l 1 brzeczki/l minute, mieszajac mieszadlem przy 150 obr./min. Pb uplywie 138 1/2 godziny fermentacji 25 oddziela sie biomase.Przyklad III. Izolacja i oczyszczanie: do 2250 1 brzeczki pofermentacyjnej o pH=7,4, otrzy¬ manej w sposób jak wyzej opisano w przykla¬ dzie II, dodaje sie 127^ 1 octanu etylu i calosc 30 miesza przez 2 1/2 godziny. Nastepnie dodaje sie 8% wag./wag. ziemi okrzemkowej. Otrzymana mie¬ szanine saczy sie w kilku porcjach, przy miesza¬ niu, przez dwie ramowe prasy filtracyjne. Wod- no-octanowe przesacze laczy sie, otrzymujac ogó- 35 lem 3250 1 przesaczu, który pozostawia sie w celu rozdzielenia sie warstw i otrzymuje sie 1000 1 ekstraktu octanowego. Osad na filtrze, pozostaly po przesaczeniu kazdej porcji mieszaniny brzecz¬ ki z octanem etylu i ziemia okrzemkowa, przemy- 40 wa sie na prasie octanem etylu. Otrzymane prze- mywki octanowe laczy sie i po odstaniu otrzy¬ muje sie 535 1 roztworu octanowego. 1000 1 ekstrak¬ tu octanowego laczy sie z 335 1 przemywek octa¬ nowych i zateza w 1816 1 wyparce do objetosci 45 225 1. Otrzymany koncentrat zateza sie dalej w 227 1 wyparce do objetosci 20 1. Otrzymany kon¬ centrat zateza sie nastepnie w wyparce szklanej do konsystencji syropu. Otrzymany syrop pozosta¬ wia sie w temperaturze 4°C przez 48 godzin, a w nastepnie miesza z heptanem, uzytym w ilosci równej podwójnej objetosci syropu. Otrzymana mieszanine pozostawia sie w temperaturze 4°C przez noc. Supernatant odziela sie za pomoca zde- kantowania i zateza, otrzymujac pozostalosc o 55 konsystencji gumy.Do gumowatej pozostalosci dodaje sie 10 1 me¬ tanolu i otrzymana mieszanine oziebia sie za po¬ moca suchego lodu w ciagu kilku godzin. Miesza¬ nine saczy sie przez saczek ze spiekanego szkla, m pokryty warstwa ziemi okrzemkowej, po czym osad przemywa sie zimnym metanolem. Przesacz i przemywki laczy sie i zateza do sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac 1353,5 g pozosta¬ losci. 05 14 Pozostalosc te rozpuszcza sie w chlorku me¬ tylenu, uzytym w ilosci 1 1 na 40 g pozostalosci.Kolumne chromatograficzna zaladowuje sie 27,071 wegla aktywowanego o ziarnie 20X40 mesh. Po¬ wyzsza pozostalosc w chlorku metylenu przepusz¬ cza sie przez ikolumne z szybkoscia 375—400 ml/ /min. Eluat zbiera sie jako jedna frakcje i za¬ teza do sucha, otrzymujac 1053 g pozostalosci, któ¬ ra starannie miesza sie z 8—'9 1 metanolu. Na¬ stepnie mieszanine oziebia sie do temperatury —10°C w pokóju-chlodni przy uzyciu suchego lo¬ du i pozostawia w tej temperaturze przez 15 mi¬ nut. Zestalony oleisty produkt usuwa sie za po¬ moca odsaczenia, a przesacz metanolowy zateza do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzy¬ mujac 781,4 g pozostalosci w postaci oleju.Plastykowa kolumne chromatograficzna o ob¬ wodzie wynoszacym 25,4 om, zaladowuje sie 4 kg suchego zelu .krzemionkowego. 200 g powyzszego oleistego produktu rozpuszcza sie w mozliwie naj¬ mniejszej ilosci chlorku metylenu, dodaje 300 g zelu krzemionkowego i calosc starannie miesza, po czym otrzymana mieszanine zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do sucha. Sucha mie¬ szanine nanosi sie na kolumne, na szczycie której umieszcza sie niewielka ilosc piasku morskiego w celu uchronienia zloza od zaburzen podczas elucji.Plastykowa kolumne umieszcza sie w szklanej oslonie, stanowiacej statyw kolumny. Do elucji uzywa sie 12 1 10% roztworu octanu etylu w benzenie. Po splynieciu eluatu, sucha kolumne poddaje sie elucji 7,6 1 °/o roztworu octanu etylu w benzenie. Odbiera sie frakcje, po czym kolumne suszy sie, a na¬ stepnie przedmuchuje azotem. Aktywnosc anty- biotyczna poszczególnych frakcji oznacza sie wobec Streptomyces pyogenes NY 5. Kolumne -dzieli sie na 10 równych czesci, uwzgledniajac w tym wsad.Pobiera sie próbki rdzenia przy Rf 0,05, 0,15, 0,25, 0,35 itd. z calej dlugosci kolumny. Z .miejsc, na które zachodzi antybiotyk pobiera sie próbki rdzenia przy kazdej 1/8 jednostki Rf. Kazda prób¬ ke rdzenia poddaje sie elucji 10 ml mieszaniny 2:2:1 octanu etylu, chlorku metylenu i naetanolu i bada metoda chromatografii cienkowafptwowej przy uzyciu ukladu octan etylu — chloroform 1:1, nakrapiajac 30 próbki i zweglajac kwasem siar¬ kowym. Odcinek kolumny w obrebie wartosci Rf 6,11 do 0,35 wycina sie i zawiesza w mieszaninie 2:2:1 octanu etylu, chlorku metylenu i metanolu.Mieszanine saczy sie, przemywa taka sama mie¬ szanina rozpuszczalników, po czym zateza do su¬ cha 'pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w Ill-rzed.butanolu, saczy i liofilizuje, otrzymujac '26,7 g produktu.Przygotowuje sie uklad dwufazowy za pomoca zmieszania n-heptanu, metanolu, octanu etylu i wody w stosunku objetosciowym odpowiednio 3000:1500:75:37. 800 g przemytej woda ziemi okrzem¬ kowej miesza sie z 600 ml fazy dolnej otrzyma¬ nego ukladu i mieszanine te wprowadza sie stop¬ niowo do tojumny szklanej o objetosci 123 cml» Na kolumne nanosi sie wsad w postaci miesza¬ niny, zlozonej z 40 g ziemi okrzemkowej, 30 ml15 105 378 16 fazy dolnej ukladu i 13,8 g zliofilizowanego pro¬ duktu. Kolumne po zaladowaniu rozwija sie górna faza ukladu, odbierajac 25 ml frakcje. Zadany zwiazek lokalizuje sie, poddajac badaniu próbki, pobrane z frakcji metoda chromatografii cien¬ kowarstwowej w sposób jak wyzej opisano. Frak¬ cje 90—H50 laczy sie i liofilizuje, otrzymujac 2,75 g antybiotyku BL 580 A, glównie w postaci soli sodowej.Przyklad IV. Sposób wytwarzania i izolacji antybiotyku BL 580 w postaci wolnego kwasu: w sposób jak wyzej opisano w przykladach I—III wytwarza sie i wyodrebnia antybiotyk BL 580 A, czesciowo w postaci soli sodowej. Przygotowuje sie uklad dwufazowy za pomoca zmieszania hep- tanu, metanolu, octanu etylu i wody w stosunku objetosciowym, odpowiednio, 3000:1500:80:40.Szklana kolumne zaladowuje sie mieszanina 800 g ziemi okrzemkowej i 600 ml fazy dolnej powyz¬ szego ukladu. Na kolumne nanosi sie wsad w po¬ staci mieszaniny 28 g ziemi okrzemkowej, 21 ml fazy dolnej i 10,9 g antybiotyku BL 580 A, czes¬ ciowo w postaci soli sodowej. Kolumne rozwija sie faza górna. Zbiera sie 90 ml frakcje. Wybra¬ ne frakcje poddaje sie chromatografii na plyt¬ kach Silplate1* F—22, stosujac do rozwijania mie¬ szanine octanu etylu i chloroformu, a do wykry¬ cia zweglanie, w celu zlokalizowania antybiotyku BL 580 A. Laczy sie frakcje 29—30, zawierajace antybiotyk BL 580 A i usuwa rozpuszczalnik. Po¬ zostalosc w postaci ciala stalego rozpuszcza sie w III-rzed.butanolu i liofilizuje, otrzymujac 4,79 g produktu. 800 g, zliofilizowanego produktu, otrzymanego w sposób jak wyzej opisano, miesza sie w 300 ml" ukladu dwufazowego, zlozonego z wody, eteru i . eteru naftowego w stosunku 2:1:1. Nastepnie, przy mieszaniu, doprowadza sie pH do 2,5 za pomoca 1 N kwasu solnego. Faze organiczna oddziela sie i przemywa 3 Tazy woda, uzyta za kazdym razem w ilosci równej objetosci fazy organicznej. Ek¬ strakt organiczny zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac pozostalosc, która rozpusz¬ cza sie w III-rzed.butanolu, a nastepnie liofili¬ zuje, otrzymujac 657 mg antybiotyku BL 580 A w postaci wolnego kwasu.Analiza elementarna antybiotyku BL 580 A w postaci wolnego kwasu: C 61,10, H 8,9, popiól 0.Skrecalnosc wlasciwa £a]D»=+210±l° /C=0,9 w metanolu/.Antybiotyk BL 580 A w postaci wolnego kwasu wykazuje charakterystyczna absorpcje w podczer¬ wieni przr nastepujacych dlugosciach fali: 2,95, ,88, 8,35, *P, 9,00, 9,12, 9,43, 9,62, 10,05 i 10,47 ja.Typowe widmo w podczerwieni antybiotyku BL 580 A w postaci wolnego kwasu, z którego spo¬ rzadzono tabletke z KBr, przedstawia fig. 4.Typowe widmo antybiotyku BL 580 A w posta¬ ci wolnego kwasu przedstawia fig. 5.Typowe widmo "C-NMR antybiotyku BL 580 A w postaci /wolnego kwasu przedstawia fig. 6.Pr z y kia d V. Sposób wytwarzania antybio¬ tyku BL 580 A w postaci soli sodowej: 1 g an¬ tybiotyku BL 580 A w postaci wolnego kwasu rozpuszcza sie w 900 ml mieszaniny 1:1 eteru i eteru naftowego. Otrzymany roztwór dodaje sie do 200 ml wody, otrzymujac uklad dwufazowy.Nastepnie, przy mieszaniu, doprowadza sie pH do ,0 za pomoca dodania 0,1 N NaOH, po czym faze organiczna oddziela sie i zateza pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac pozostalosc. Pozo¬ stalosc te rozpuszcza sie w 10 ml eteru i dodaje ml eteru naftowego /30—70°C/. Otrzymany roz¬ twór zaszczepia sie krysztalkiem soli sodowej an- io tybiotyku BL 580 A i pozostawia do powolnego odparowania w temperaturze 4°C, az do wykry¬ stalizowania. Utworzone krysztaly odsacza sie, przemywa zimnym eterem naftowym i suszy na powietrzu, otrzymujac 323 mg antybiotyku BL 580 A w postaci soli sodowej.Antybiotyk BL 580 A w postaci soli sodowej ma temperature topnienia 157-—161°C.Analiza elementarna: C 60,99, H 8,47, Na 1,95. {a]DM=+6°±l° /C=1,153 w metanolu/.Antybiotyk BL 580 A w postaci soli sodowej wykazuje charakterystyczna absorpcje w podczer¬ wieni przy nastepujacych dlugosciach fali: 6,27, 7,28, 9,0, 9,13, 9,23, 9,48 i 10,60 [i.Typowe widmo w podczerwieni antybiotyku BL 580 A w postaci soli sodowej, z którego sporza¬ dzono tabletke z KBr, przedstawia fig. 1.Typowe widmo "C-NMR antybiotyku BL 580 A w postaci soli sodowej przedstawia fig. 2.Typowe widmo PMR antybiotyku BL 580 A w postaci soli sodowej przedstawia fig. 3.Przyklad VI. Sposób wytwarzania i izolacji antybiotyku BL 580 A w postaci estru p-bromo- fenacylowego: w sposób jak wyzej opisano w przykladach I—III wytwarza sie i wyodrebnia an- tybiotyk BL 580 A czesciowo w postaci soli so¬ dowej. V g tej soli, 834 mg bromku p-bromofena- cylu, 600 mg weglanu litowego i 20 ml suchego dwumetyloformamidu umieszcza sie w kolbie i poddaje reakcji w temperaturze 37°C przez 16 ,go- 40 dzin. Nastepnie dodaje sie chloroform w ilosci równej czterokrotnej objetosci mieszaniny i otrzy¬ mana zawiesine saczy sie. Przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia roz¬ puszczalnika, otrzymujac pozostalosc o konsysten- 45 cji syropu. Przygotowuje sie uklad dwufazowy za pomoca zmieszania heptanu, octanu etylu, meta¬ nolu i wody w stosunku odpowiednio 2000:25:1000: :17. 120 g ziemi okrzemkowej miesza sie z 90 ml dolnej fazy otrzymanego ukladu i mieszanine te cc wprowadza sie do kolumny do chromatografii rozdzielczej. Nastepnie na szczyt kolumny nanosi sie mieszanine, zlozona z syropowatej pozostalos¬ ci, 12 g ziemi okrzemkowej i 9 ml fazy dolnej.Kolumne rozwija sie górna faza ukladu. Odbiera w sie 10 ml frakcje. Antybiotyk w poszczególnych frakcjach lokalizuje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje 22—41 laczy sie i za¬ teza pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac po¬ zostalosc, która rozpuszcza sie w 50 ml metanolu 00 i otrzymany roztwór saczy sie. Przesacz ogrzewa sie na lazni parowej, dodaje 10 ml wody, po czym mieszanine pozostawia w celu powolnego oziebie¬ nia do temperatury 4°C. Utworzone krysztaly wy¬ odrebnia sie, otrzymujac 566 mg antybiotyku BL je 580 A w postaci estru p^bromofenacylowego.105 378 17 18 Analiza elementarna antybiotyku BL 580 A w postaci estru p-bromofenacylowego: C 58,80, H 7,80, Br 8,64. Skrecalnosc wlasciwa [a]DM= +63°±2° /CHC18, 0,51%/.Antybiotyk BL 580 A w postaci estru p-bromo¬ fenacylowego wykazuje charakterystyczna absorp¬ cje w podczerwieni przy nastepujacych dlugos¬ ciach fali: 2,95, 5,88, 6,30, 8,20, 8,45, 8,60, 9,00, 9,15, /poszerzony/, 9,37 /poszerzony/, 9,62, 10,06 i ,37.Ciezar czasteczkowy jednowodzianu estru p-bro- mofenacylowego antybiotyku BL 580 A, oznaczo¬ ny za pomoca dyfrakcji promieni rentgenowskich, wynosi 1114±0,tfVo.Typowe widmo w podczerwieni antybiotyku BL 580 A w postaci estru p-bromofenacylowego, z którego sporzadzono tabletke z KBr, przedstawia fig. 7.Typowe widmo w ultrafiolecie antybiotyku BL 580 A w postaci estru p-bromofenacylowego, z którego przygotowano roztwór -metanolowy o ste¬ zeniu 33,84 ng/ml, przedstawia fig. 8.Typowe widmo PMR antybiotyku BL 580 A w postaci estru p-bromofenacylowego przedstawia fig. 9. PL PL PL PL