JPH107557A

JPH107557A - 抗腫瘍性物質スピロラキシン

Info

Publication number: JPH107557A
Application number: JP8177033A
Authority: JP
Inventors: Masahisa Tsukamoto; 匡央塚本; Hideki Sano; 秀樹佐野; Yoshiaki Kadota; 芳明門田; Katsuhisa Ojiri; 勝久小尻; Hiroyuki Suda; 寛之須田
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1996-06-17
Publication date: 1998-01-13

Abstract

(57)【要約】【課題】新規抗腫瘍剤の創製。【解決手段】有効成分として構造式［Ｉ］【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬の分野で有用で
あり、より具体的には腫瘍細胞の増殖を阻害して抗腫瘍
作用を示す化合物の製造法及びその用途に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】癌化学療法の分野においては、既に多く
の化合物が医薬品として実用化されている。しかしなが
らさまざまな種類の腫瘍に対してその効果は必ずしも充
分ではなく、また臨床上これらの薬剤に対する腫瘍細胞
の耐性現象が明らかにされるにつれ、その臨床的応用性
は複雑化している［第４７回日本癌学会総会記事、１２
頁〜１５頁（１９８８年）等参照］。このような状況
下、癌治療の分野においては常に新規抗腫瘍性物質の開
発が求められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の希求に
応えることのできる新規な抗腫瘍性物質を提供すること
を目的とするものである。即ち、既存の抗腫瘍性物質が
充分に効果を発揮できない種々の腫瘍に対しても抗腫瘍
効果を発揮する化合物を提供することが本発明が解決し
ようとする課題である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、抗腫瘍活性を有する物質について微生
物二次代謝産物を広くスクリーニングした結果、後記構
造式［Ｉ］で表される化合物が優れた抗腫瘍作用を示す
ことを見いだして本発明を完成した。即ち、本発明は構
造式［Ｉ］

【０００５】

【化３】で表される化合物の用途及び製造法に関するものであ
る。尚、構造式［Ｉ］で表される化合物は、ファイトケ
ミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻
６１３頁〜６１６頁（１９９０年）に真菌スポロトリ
クム・ラクサム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍｌａｘｕ
ｍ）の代謝産物、スピロラキシン（ｓｐｉｒｏｌａｘｉ
ｎｅ）として記載されているが、この物質が抗腫瘍性を
有するという報告は未だされてない。以下に本発明にか
かわる抗腫瘍性物質スピロラキシンの物理化学的な性状
を示す。下記にＮＭＲ測定における略号の意味を示す。ｓ：シングレットｄ：ダブレットｔ：トリプレットｑ：カルテットｍ：マルチプレットｂｒ：ブロードＪ：カップリング定数Ｈｚ：ヘルツスピロラキシンの物理化学的性状性状；白色アモルファス状固体又は結晶分子式；Ｃ₂₃Ｈ₃₂Ｏ₆ 質量分析；［高分解能ＦＡＢ−ＭＳ］（Ｍ＋Ｈ）⁺ と
して：実測値：４０５．２２６９計算値：４０５．２２７７比旋光度；［α］²⁰ _D ＝＋６２．２°（ｃ１．
０，ＣＨＣｌ₃）紫外部吸収スペクトル；λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ｎｍ）
２１６，２５８，２９１赤外部吸収スペクトル；（ＫＢｒ，ｃｍ^-1）３４１
７，２９３７，１７１８，１６１４，１６０６，１３
５８，１２１９，１１６３，１０９２，６１１¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ
ｐｐｍ）：６．８１（１Ｈ，ｂｒｓ），６．４１（１
Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），６．３９（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝１．５，０．６Ｈｚ），５．２８（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝７．３，４．３Ｈｚ），４．１７（１Ｈ，
ｍ），３．９２（３Ｈ，ｓ），３．７１（１Ｈ，ｍ），
２．１４（１Ｈ，ｍ），１．５２−１．９８（９Ｈ，
ｍ），１．２２−１．５０（９Ｈ，ｍ），１．２４
（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．１６（１Ｈ，
ｍ）¹³ Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，
δｐｐｍ）：１６８．７（ｓ），１６３．５（ｓ），
１５９．９（ｓ），１５５．１（ｓ），１０６．４
（ｓ），１０６．２（ｓ），１００．３（ｄ），９９．
１（ｄ），７９．７（ｄ），７３．８（ｄ），７０．
１（ｄ），５５．８（ｑ），３７．９（ｔ），３５．９
（ｔ），３４．３（ｔ），３３．５（ｔ），３１．３
（ｔ），３０．８（ｔ），２９．１（ｔ），２５．２
（ｔ），２４．１（ｔ），２１．１（ｑ），２０．３
（ｔ）溶解性；ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け易
く、水に溶けにくい。酸性、中性、塩基性物質の区別；中性物質呈色反応；硫酸反応陽性スピロラキシンの生物学的活性（抗腫瘍作用）抗腫瘍性物質スピロラキシンのマウス実験腫瘍細胞に
対する増殖阻止作用を決定するため、試験管内で試験を
行なった。マウス白血病細胞Ｐ３８８に対する抗腫瘍
作用試験は、スピロラキシンをジメチルスルホキシドに
溶解した後、ジメチルスルホキシドで逐次希釈してか
ら、牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２
０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む）に加え検液
とした。１ｘ１０³個の腫瘍細胞を含む細胞培養培地
（牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地、２０
ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む）５０ μｌを
９６穴マイクロプレートに分注し、３７℃で２４時間、
５％ＣＯ ₂下で培養した後に上記の検液５０μｌを加
え、３７℃で７２時間、５％ＣＯ₂下で培養後、ＭＴＴ
測定法により対照群と比較した。マウス大腸癌細胞ｃｏ
ｌｏｎ２６に対する抗腫瘍試験は、スピロラキシンをジ
メチルスルホキシドに溶解した後ジメチルスルホキシド
で逐次希釈してから、牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１
６４０培地に加え検液とした。１ｘ１０³個の腫瘍細胞
を含む細胞培養培地（牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１
６４０培地）１００μｌを９６穴マイクロプレートに
分注し、３７℃で２４時間、５％ＣＯ₂下で培養した
後に上記の検液１００μｌを加え、３７℃で７２時間、
５％ＣＯ₂下で培養後、５０％トリクロロ酢酸で固定
し、０．４％スルホローダミンＢで染色後、１０ｍＭト
リス液を用いて細胞から色素を抽出した。４５０ｎｍを
対照波長として５５０ｎｍに於ける吸光度を測定して対
照群と比較した。その結果、スピロラキシンは両腫瘍細
胞に対し、強い増殖阻止活性を示し、５０％増殖阻害濃
度は第１表の通りであった。更に、スピロラキシンのヒ
ト腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を試験管内で試験した。
細胞は、ヒト大腸癌細胞ＤＬＤ−１を使用し、細胞培養
用培地は、牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地
を用い、上記のマウス大腸癌細胞ｃｏｌｏｎ２６と同
様の方法を用いて測定した。その結果、スピロラキシン
はヒト腫瘍細胞であるヒト大腸癌細胞ＤＬＤ−１に対し
ても増殖阻害活性を示し、その５０％増殖阻止濃度は第
１表の通りであった。

【０００６】

【表１】上述したようにスピロラキシンはマウス及びヒトの腫
瘍細胞に対し顕著な増殖阻止作用を示す。従って、本発
明はヒトをはじめとする哺乳動物の抗腫瘍剤として有用
である。つぎに、スピロラキシンの製造法について説明
する。本発明の抗腫瘍性物質スピロラキシンの製造に使
用する微生物またはその変異株は、抗腫瘍性物質スピロ
ラキシンを生産するものならばいずれでも良いが、例え
ば以下の菌学的性状を有する微生物が挙げられる。１．形態スピロラキシン生産株Ｆ４４７２７株の気中菌糸は無色
で、幅が２〜６μｍ位であり、滑面からわずかに粗面
で、しばしば無色の結晶様粒子が覆っている。隔壁には
クランプコネクションを欠き、気中菌糸はところどころ
分岐し分生子柄となり、先端部に出芽型分生子または分
裂型分生子を形成している。出芽型分生子は無色で、大
きさが６〜１２ｘ４〜８μｍ位の卵型、洋梨型または亜
球形状である。分裂型分生子は無色で、大きさが８〜４
４ｘ５〜１２μｍ位の不規則な円筒形または楕円形状で
ある。また、菌糸先端部あるいは中間部に無色で、直径
１０〜３４μｍ位の球形または亜球形状の厚膜胞子を形
成している。２．培養性状種々の寒天培地を用い、２５℃で２日間培養した場合の
生育的特徴を表に示す。色名はメツエン・ハンドブック
・オブ・カラー［（ＭｅｔｈｕｅｎＨａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆＣｏｌｏｕｒ）第３版、１９８４年］を基準
にした。

【０００７】

【表２】いずれの培地でも分生子の形成は良好で、分泌液、可溶
性色素の産生は認められなかった。また、いずれの培地
でも３７℃での生育は極めて速く、麦芽寒天培地で２４
時間培養した場合、集落の直径は４１ｍｍに達した。な
お本菌株は１５〜４４℃の範囲で生育可能であり、至適
生育温度は３８℃である。また、ｐＨ３〜１０．５の範
囲で生育可能であり、至適ｐＨ７．５付近である。以上
の結果より、Ｆ４４７２７株をスポロトリクム・プルイ
ノスム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍｐｒｕｉｎｏｓ
ｕｍ）と同定し、スポロトリクム・プルイノスムＦ
４４７２７（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍｐｒｕｉｎｏ
ｓｕｍＦ４４７２７）と命名した。

【０００８】なお、本菌株は通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は
ＦＥＲＭＰ−１５６２５である。本発明で使用する抗
腫瘍性物質スピロラキシンを生産する微生物の変異株
は、例えばＸ線若しくは紫外線などの照射処理、例え
ばナイトロジェンマスタード、アザセリン、亜硝酸、２
−アミノプリン若しくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤
による処理、ファージ接触、形質転換、形質導入又は接
合などの通常用いられる菌種変換処理方法によりスピロ
ラキシン生産菌を変異させた微生物である。本発明のス
ピロラキシンを製造するにあたり、スピロラキシンの生
産菌株を栄養源含有培地に接種して好気的に発育させる
ことにより、スピロラキシンを含む培養物が得られる。
栄養源としては、真菌の栄養源として公知のものが使用
できる。例えば、炭素源としては、市販されているブド
ウ糖、麦芽糖、デンプン、庶糖、糖蜜又はデキストリン
などが単独又は混合物として用いられる。窒素源として
は、市販されている大豆粉、コーンステイープリカー、
グルテンミール、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、綿
実粉、ペプトン、小麦胚芽、魚粉、ミートミール、脱脂
米ヌカ、脱脂肉骨粉、無機アンモニウム塩又は硝酸ナト
リウムなどが単独又は混合物として用いられる。無機塩
としては、市販されている炭酸カルシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、臭化ナトリウ
ム、ホウ酸ナトリウム又は各種リン酸塩などを使用する
ことができる。その他必要に応じて、鉄、マンガン、亜
鉛、コバルト、モリブデン酸などの重金属塩を微量添加
することもできる。また、発泡の激しい場合には消泡剤
として、例えば大豆油又は亜麻仁油などの植物油、オク
タデカノールなどの高級アルコール類、各種シリコン化
合物などを適宜添加してもよい。これらのもの以外で
も、該生産菌が利用し、スピロラキシンの生産に役立つ
もの例えば３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸又はホウ酸ナトリウムなど、いずれも使用することが
できる。培養方法としては、一般の微生物代謝産物の生
産方法と同様に行なえばよく、固体培養でも液体培養で
もよい。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、振と
う培養又は通気培養などのいずれを実施してもよいが、
特に振盪培養又は深部通気攪拌培養が望ましい。培養温
度は１５〜４４℃が適当であるが、好ましくは３８℃
である。好ましい培地のｐＨは３〜１０．５の範囲で、
培養時間は１９２時間〜３３６時間、好ましくは２４
０時間〜２８８時間である。培養物から目的とするス
ピロラキシンを採取するには、微生物の生産する代謝物
から採取するのに通常使用される分離手段を適宜利用す
ることができる。

【０００９】スピロラキシンは菌体中に存在するので、
菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交
換樹脂法又は吸着もしくは分配クロマトグラフィー法及
びゲル濾過法などを単独又は組み合わせて行なうことに
より精製できる。好ましい分離精製の例として次の方法
が挙げられる。まず培養液を濾過し、菌体を得る。得ら
れた菌体をメタノールまたはアセトンなどの有機溶媒を
用いて抽出する。得られた粗抽出物について、水ー酢酸
エチル系で分配を行ない、酢酸エチルを留去後得られる
残留物についてシリカゲルクロマトグラフィー（クロロ
ホルム／メタノールで溶出）などを行なうことにより、
スピロラキシンを粉末もしくは固体として得ることがで
きる。本発明の化合物スピロラキシンは腫瘍細胞の増殖
を阻害し、抗腫瘍効果を発揮するが、本発明化合物を抗
腫瘍剤として使用する際の投与形態としては各種の形態
を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤も
しくは液剤などの経口剤、又は例えば溶液もしくは懸濁
液などの殺菌した液状の非経口剤が挙げられる。

【００１０】固体の製剤は、そのまま錠剤、カプセル
剤、顆粒剤又は粉末の形態として製造することもできる
が、適当な添加物を使用して製造することもできる。そ
のような添加物としては、例えば乳糖もしくはブドウ糖
などの糖類、例えばトウモロコシ、小麦もしくは米など
のデンプン類、例えばステアリン酸などの脂肪酸、例え
ばメタケイ酸アルミン酸マグネシウムもしくは無水リン
酸カルシウムなどの無機塩、例えばポリビニルピロリド
ンもしくはポリアルキレングリコールなどの合成高分
子、例えばステアリン酸カルシウムもしくはステアリン
酸マグネシウムなどの脂肪酸塩、例えばステアリルアル
コールもしくはベンジルアルコールなどのアルコール
類、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、エチルセルロースもしくはヒドロキシプロピルメ
チルセルロースなどの合成セルロース誘導体、その他、
水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴムなど通常
用いられる添加物が挙げられる。

【００１１】これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び粉
末などの固形製剤は一般的には０．１〜１００重量
％、好ましくは５〜１００重量％の有効成分を含
む。液状製剤は、水、アルコール類又は例えば大豆油、
ピーナッツ油もしくはゴマ油などの植物由来の油など液
状製剤において通常用いられる適当な添加剤を使用し、
懸濁液、シロップ剤又は注射剤などの形態として製造さ
れる。

【００１２】特に、非経口的に筋肉内注射、静脈注射又
は皮下注射で投与する場合の適当な溶剤としては、例え
ば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉注射
用）、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈
内注射用液体（例えばクエン酸及びクエン酸ナトリウム
などの水溶液）もしくは電解質溶液（点滴静注及び静脈
内注射用）など、又はこれらの混合溶液が挙げられる。

【００１３】これらの注射剤はあらかじめ溶解したもの
のほか、粉末のままあるいは適当な添加剤を加えたもの
を用時溶解する形態もとり得る。これらの注射液は通
常、０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量
％の有効成分を含む。又、経口投与の懸濁剤又はシロッ
プ剤などの液剤は、０．５〜１０重量％の有効成分を
含む。

【００１４】本発明の化合物の実際に好ましい投与量
は、使用される化合物の種類、配合された組成物の種
類、適用頻度及び治療すべき特定部位、宿主及び腫瘍に
よって変化することに注意すべきである。例えば、１日
あたりの成人の投与量は、経口投与の場合、１０〜５０
０ｍｇであり、非経口投与、好ましくは静脈注射の場
合、１日あたり、１０〜１００ｍｇである。なお、投
与回数は投与方法及び症状によって異なるが、１回ない
し５回である。以下に、実施例を挙げて本発明を具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定される
ものではない。

【００１５】

【発明の実施の形態】

【００１６】

【実施例】

実施例１：スピロラキシンの製造法斜面寒天培地に接種した真菌Ｆ４４７２７株をポリペプ
トン０．３％、グルコース１．０％、小麦胚芽１．０
％、グルテンミール０．５％、麦芽エキス０．３％、マ
ルトース３．０％、塩化ナトリウム０．２％、硝酸ナト
リウム０．１％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム０．０５％、硫酸第一鉄０．０００２％、塩化
第二銅０．００００４％、塩化マンガン０．００００４
％、塩化コバルト０．００００４％、硫酸亜鉛０．００
００８％、ホウ酸ナトリウム０．００００８％及びモリ
ブデン酸アンモニウム０．０００２４％からなる培地
（ｐＨ６．０）１１０ｍｌをふくむ５００ｍｌ容の
三角フラスコ２本に接種し、２８℃で４８時間、回転振
盪機（毎分１８０回転）上で培養した。この培養液を１
ｍｌずつ、上記の培地を１１０ｍｌ含む５００ｍｌ溶の
三角フラスコ２５本に接種し、２８℃で２６４時間、回
転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。この培養液
より菌体を分離し、メタノール（１．０Ｌｘ２）を
加え抽出した。このメタノール抽出液を濃縮し、次いで
酢酸エチル（１．０Ｌｘ２）で抽出した。さらにこ
の酢酸エチル抽出液を濃縮乾固させた後、クロロホルム
１００ｍｌに溶解し、シリカゲルカラム（メルク社製、
３．０ｘ７０ｃｍ）を用いて、クロロホルム−メタノー
ル（４０：１）で溶出し活性画分を得た。この画分を濃
縮乾固後、メタノールを加え、可溶部をトヨパールＨＷ
−４０Ｓカラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｓ、
東ソー社製、３．０ｘ４６ｃｍ）を用いてメタノール
で溶出し、得られた活性画分を濃縮乾固させた。これに
酢酸エチル０．５ｍｌ、ｎ−ヘキサン３ｍｌを加え、
室温で数時間攪拌した後、析出してきた活性物質を含む
沈殿をろ過し白色粉末３０．５ｍｇを得た。この白色
粉末をメタノールに溶解し、分取用高速液体クロマトグ
ラフィー用カラム（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ−ＯＤ
Ｓ、富士シリシア社製、２０ｘ２５０ｍｍ、溶出液７
５％メタノール）を用いて精製した。得られた活性画
分を濃縮乾固後、７５％メタノール３００μｌ、水２０
０μｌを加え室温で攪拌し、活性物質を析出させスピロ
ラキシンの白色粉末２７．２ｍｇを得た。以下に本発明
の化合物の製剤例を示すが、本発明の化合物の製剤は本
製剤例に限定されるものではない。製剤例１本物質（スピロラキシン）１０（部）重質酸化マグネシウム１５乳糖７５を均一に混合して、３５０μｍ以下の粉末状又は細粒状
の散剤とする。この散剤をカプセル容器に入れカプセル
剤とした。製剤例２本物質（スピロラキシン）４５（部）澱粉１５乳糖１６結晶性セルロース２１ポリビニルアルコール３蒸留水３０を均一に混合した後、破砕造粒して乾燥し、次いで篩別
して直径１４１０〜１７７μｍの大きさの顆粒剤とし
た。製剤例３製剤例２と同様の方法で顆粒剤を作製した後、この顆粒
剤９６部に対してステアリン酸カルシウム３部を加えて
圧縮成形し直径１０ｍｍの錠剤を作製した。製剤例４製剤例２の方法で得られた顆粒剤９０部に対して結晶性
セルロース１０部及びステアリン酸カルシウム３部を加
えて圧縮成形し、直径８ｍｍの錠剤とした後、これにシ
ロップゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸濁液を加
えて糖衣錠を作製した。製剤例５本物質（スピロラキシン）０．６（部）非イオン系界面活性剤２．４生理的食塩水９７を加温混合してからアンプルに入れ、滅菌を行なって注
射剤を作成した。

【００１７】

【発明の効果】本発明に記載するスピロラキシンは、マ
ウス及びヒトの腫瘍細胞に対して強い増殖抑制効果を示
すことから、医薬の分野で癌の治療剤として有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小尻勝久茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者須田寛之茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効成分として構造式［Ｉ］【化１】で表される化合物を含有する抗腫瘍剤。
【請求項２】構造式［Ｉ］【化２】で表される化合物を産生する能力を有する微生物又はそ
の変異株を培養し、構造式［Ｉ］で表される化合物を採
取することを特徴とする、構造式［Ｉ］で表される化合
物の製造法。