JPH1171379A

JPH1171379A - 抗腫瘍性物質ｂｅ−５５０５１及びその製造法

Info

Publication number: JPH1171379A
Application number: JP24947897A
Authority: JP
Inventors: Koichiro Torigoe; 浩一郎鳥越; Tadayuki Yamauchi; 忠幸山内; Shigeru Nakajima; 中島　　茂; Masatake Kamiya; 正剛神谷; Masao Nagashima; 正生長嶋; Katsuhisa Ojiri; 勝久小尻; Hiroyuki Suda; 寛之須田
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1997-08-28
Filing date: 1997-08-28
Publication date: 1999-03-16

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は新規な構造式［Ｉ］【化１】で表される化合物に関する。【効果】本発明の化合物は、マウス及びヒトの腫瘍細胞
に対して強い増殖抑制効果を示すことから、医薬の分野
で癌の治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬の分野で有用で
あり、より具体的には腫瘍細胞の増殖を阻害して抗腫瘍
作用を示す新規化合物、その製造法及びその用途並びに
該化合物を産生する微生物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】癌化学療法の分野においては、既に多く
の化合物が医薬品として実用化されている。しかしなが
らさまざまな種類の腫瘍に対してその効果は必ずしも充
分ではなく、また臨床上これらの薬剤に対する腫瘍細胞
の耐性現象が明らかにされるにつれ、その臨床的応用性
は複雑化している［第４７回日本癌学会総会記事、１２
頁〜１５頁（１９８８年）等参照］。

【０００３】このような状況下、癌治療の分野において
は常に新規抗腫瘍性物質の開発が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の希求に
応えることのできる新規な抗腫瘍性物質を提供すること
を目的とするものである。即ち、既存の抗腫瘍性物質が
充分に効果を発揮できない種々の腫瘍に対しても抗腫瘍
効果を発揮する化合物を提供することが本発明が解決し
ようとする課題である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、抗腫瘍活性を有する物質について微生
物二次代謝産物を広くスクリーニングした結果、後記構
造式［Ｉ］で表される化合物が優れた抗腫瘍作用を示す
ことを見いだして本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明は新規な構造式［Ｉ］

【０００７】

【化６】で表される化合物、その製造法及びその用途並びに該化
合物を産生する能力を有することを特徴とするストレプ
トミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生
物に関するものである。

【０００８】なお、抗腫瘍効果及び産生菌株ストレプト
ミセスエスピーＡ５５０５１株に因んで、構造式
［Ｉ］で表わされる化合物を、以下、抗腫瘍性物質ＢＥ
−５５０５１と称する。

【０００９】以下に本発明にかかわる新規な抗腫瘍性物
質ＢＥ−５５０５１の物理化学的な性状を示す。

【００１０】下記にＮＭＲ測定における略号の意味を示
す。ｓ：シングレットｄ：ダブレットｔ：トリプレットｑ：カルテットｍ：マルチプレットｂｒ：ブロードＪ：カップリング定数Ｈｚ：ヘルツＢＥ−５５０５１の物理化学的性状性状；黄色アモルファス状固体若しくは結晶分子式；Ｃ₂₂Ｈ₉Ｎ₂Ｏ₄Ｃｌ₅ 質量分析；［高分解能ＦＡＢ−ＭＳ］（Ｍ＋Ｈ）⁺とし
て：実測値５４０．９０５５、計算値５４０．９０８５紫外部吸収スペクトル； λ_max（ＭｅＯＨ，ｎｍ（ε））２１８（３７１５
０），２５５（ｓｈ），３２０（１５５５０），３５２
（１３４８０） λ_max（０．１ＮＨＣｌ−ＭｅＯＨ（１：９），ｎｍ
（ε））２１８（３６２９０），２５８（１２１０
０），３１０（１５７２０） λ_max（０．１ＮＮａＯＨ−ＭｅＯＨ（１：９），ｎ
ｍ（ε））３２２（１６５９０），３５２（１３４８
０）赤外部吸収スペクトル；（ＫＢｒ，ｃｍ^-1）３１４９，
１６２２，１５８７，１５２９，１４６６，１４３５，
１２５０，１１９２¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−
ｄ₆）δｐｐｍ：５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ），６．９７（１Ｈ，ｓ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝８．８Ｈｚ），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈ
ｚ），７．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．８Ｈ
ｚ），７．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．８Ｈ
ｚ），７．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），１０．
４（１Ｈ，ｂｒｓ），１３．６（１Ｈ，ｓ）¹³ Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ
₆）δｐｐｍ：１１１．７（ｓ），１１１．９（ｓ），
１１５．８（ｄ），１１６．７（ｓ），１１７．４
（ｓ），１１８．６（ｄ），１１９．８（ｓ），１２
２．７（ｓ），１２３．９（ｄ），１２７．３（ｓ），
１２９．２（ｄ），１２９．３（ｓ），１２９．９
（ｓ），１３１．９（ｄ），１３２．５（ｄ），１３
２．９（ｓ），１３４．３（ｄ），１４３．１（ｓ），
１５５．３（ｓ），１５７．３（ｓ），１７８．９
（ｓ），１８０．４（ｓ）溶解性；ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け易
く、水に溶けにくい。

【００１１】酸性、中性、塩基性物質の区別；ほぼ中性
の物質ＢＥ−５５０５１の生物学的活性（抗腫瘍作用）抗腫瘍性物質ＢＥ−５５０５１のマウス実験腫瘍細胞に
対する増殖阻止作用を決定するため、試験管内で試験を
行なった。マウス白血病細胞Ｐ３８８に対する抗腫瘍試
験は、ＢＥ−５５０５１をジメチルスルホキシドに溶解
した後、ジメチルスルホキシドで逐次希釈してから、牛
胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２０ｍＭ
の２−メルカプトエタノールを含む）に加え検液とし
た。１ｘ１０³個の腫瘍細胞を含む細胞培養培地（牛胎
児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地、２０ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む）５０μｌを９６穴マ
イクロプレートに分注し、３７℃で２４時間、５％ＣＯ
₂下で培養した後に上記の検液を５０μｌを加え、３７
℃で７２時間、５％ＣＯ₂下で培養後、ＭＴＴ測定法に
より対照群と比較した。

【００１２】マウス大腸癌細胞ｃｏｌｏｎ２６に対する
抗腫瘍試験は、ＢＥ−５５０５１をジメチルスルホキシ
ドに溶解した後ジメチルスルホキシドで逐次希釈してか
ら、牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地に加
え検液とした。１ｘ１０³個の腫瘍細胞を含む細胞培養
培地（牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地）
１００μｌを９６穴マイクロプレートに分注し、３７℃
で２４時間、５％ＣＯ₂下で培養した後に上記の検液１
００μｌを加え、３７℃で７２時間、５％ＣＯ₂下で培
養後、５０％トリクロロ酢酸で固定し、０．４％スルホ
ローダミンＢで染色後、１０ｍＭトリス液を用いて細胞
から色素を抽出した。４５０ｎｍを対照波長として５５
０ｎｍにおける吸光度を測定して対照群と比較した。そ
の結果、ＢＥ−５５０５１は両腫瘍細胞に対し、強い増
殖阻止活性を示し、５０％増殖阻害濃度は第１表の通り
であった。

【００１３】更に、ＢＥ−５５０５１のヒト腫瘍細胞に
対する抗腫瘍活性を試験管内で試験した。細胞は、ヒト
大腸癌細胞ＤＬＤ−１、ヒト肺癌細胞ＰＣ−１３及びヒ
ト胃癌細胞ＭＫＮ−４５を使用し、細胞培養用培地は、
全ての腫瘍細胞とともに牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ
１６４０培地を用い、上記のマウス大腸癌細胞ｃｏｌ
ｏｎ２６と同様の方法を用いて測定した。その結果、Ｂ
Ｅ−５５０５１はヒト腫瘍細胞に対しても強い増殖阻害
活性を示し、その５０％増殖阻止濃度は第１表の通りで
あった。

【００１４】

【表１】上述したようにＢＥ−５５０５１はマウス及びヒトの腫
瘍細胞に対し顕著な増殖阻止作用を示す。したがって、
本発明はヒトをはじめとする哺乳動物の抗腫瘍剤として
有用である。

【００１５】つぎに、ＢＥ−５５０５１の製造法につい
て説明する。

【００１６】本発明の抗腫瘍性物質ＢＥ−５５０５１の
製造に使用する微生物は、抗腫瘍性物質ＢＥ−５５０５
１を生産するものならばいずれでも良いが、例えば以下
の菌学的性状を有する微生物、即ち、Ａ５５０５１株
を用いることができる。１．形態Ａ５５０５１株はよく伸長し分岐する基生菌糸と気菌
糸を形成し輪生岐及び菌糸の分断は認められない。気菌
糸上には胞子の長い連鎖（３０個以上）を作り、その形
態は、らせん状である。胞子は表面がしわ状、大きさが
１．０〜１．２×０．８〜０．９μｍ、円筒、あるいは
卵型である。胞子嚢、鞭毛胞子及び菌核等の特殊な器官
は観察されない。コロニーはイースト・麦芽寒天培地等
で気菌糸の成熟とともに次第に湿潤化することが観察さ
れる。

【００１７】

【表２】

【００１８】

【表３】

【００１９】

【表４】

【００２０】

【表５】６．細胞壁組成ＬＬ−ジアミノピメリン酸とグリシンが検出された。

【００２１】以上の菌学的諸性質よりＡ５５０５１株
は放線菌ストレプトミセス属に属すると考えられる。し
たがって、Ａ５５０５１株をストレプトミセスエス
ピーＡ５５０５１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ
ｐ．Ａ５５０５１）と称することとした。

【００２２】なお、本菌株は通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は
ＦＥＲＭＰ−１６０２８である。

【００２３】本発明のストレプトミセスエスピーＡ
５５０５１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ａ
５５０５１）の変異株は、例えばＸ線若しくは紫外線
などの照射処理、例えばナイトロジェンマスタード、ア
ザセリン、亜硝酸、２−アミノプリン若しくはＮ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）
等の変異誘起剤による処理、ファージ接触、形質転換、
形質導入又は接合などの通常用いられる菌種変換処理方
法によりストレプトミセスエスピーＡ５５０５１
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ａ５５０５
１）を変異させることにより得ることができる。

【００２４】

【発明の実施の形態】本発明のＢＥ−５５０５１を製造
するにあたり、ＢＥ−５５０５１の生産菌株を栄養源含
有培地に接種して好気的に発育させることにより、ＢＥ
−５５０５１を含む培養物が得られる。栄養源として
は、放線菌の栄養源として公知のものが使用できる。例
えば、炭素源としては、市販されているブドウ糖、麦芽
糖、デンプン、庶糖、糖蜜又はデキストリンなどが単独
又は混合物として用いられる。窒素源としては、市販さ
れている大豆粉、コーンステイープリカー、グルテンミ
ール、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、綿実粉、ペプ
トン、小麦胚芽、魚粉、ミートミール、脱脂米ヌカ、脱
脂肉骨粉、無機アンモニウム塩又は硝酸ナトリウムなど
が単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、
市販されている炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、臭化ナトリウム、ホウ酸
ナトリウム又は各種リン酸塩などを使用することができ
る。その他必要に応じて、鉄、マンガン、亜鉛、コバル
ト、モリブデン酸などの重金属塩を微量添加することも
できる。また、発泡の激しい場合には消泡剤として、例
えば大豆油又は亜麻仁油などの植物油、オクタデカノー
ルなどの高級アルコール類、各種シリコン化合物などを
適宜添加してもよい。これらのもの以外でも、該生産菌
が利用し、ＢＥ−５５０５１の生産に役立つもの例えば
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸又はホウ酸
ナトリウムなどであれば、いずれも使用することができ
る。

【００２５】培養方法としては、一般の微生物代謝産物
の生産方法と同様に行なえばよく、固体培養でも液体培
養でもよい。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、
振とう培養又は通気培養などのいずれを実施してもよい
が、特に振盪培養又は深部通気攪拌培養が望ましい。培
養温度は１２〜３９℃が適当であるが、好ましくは２１
〜３６℃である。好ましい培地のｐＨは４〜８の範囲
で、培養時間は９６時間〜２８８時間、好ましくは１２
０時間〜２１６時間である。培養物から目的とするＢＥ
−５５０５１を採取するには、微生物の生産する代謝物
から採取するのに通常使用される分離手段を適宜利用す
ることができる。

【００２６】ＢＥ−５５０５１は菌体中に存在するの
で、菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオ
ン交換樹脂法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィー
法及びゲル濾過法などを単独又は組み合わせて行なうこ
とにより精製できる。

【００２７】好ましい分離精製の例として次の方法が挙
げられる。まず培養液を濾過し、菌体を得る。得られた
菌体をメタノール又はアセトンなどの有機溶媒を用いて
抽出する。得られた粗抽出物について、水−酢酸エチル
分配を行ない、酢酸エチルを留去後得られる残留物につ
いてシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルムで溶
出）を行なう。ＢＥ−５５０５１を含む画分を減圧下で
濃縮し、更にゲル濾過（メタノールで溶出）を行うこと
により、ＢＥ−５５０５１を粉末若しくは固体として得
ることができる。

【００２８】本発明の化合物ＢＥ−５５０５１は腫瘍細
胞の増殖を阻害し、抗腫瘍効果を発揮するが、本発明化
合物を抗腫瘍剤として使用する際の投与形態としては各
種の形態を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、
顆粒剤若しくは液剤などの経口剤、又は例えば溶液若し
くは懸濁液などの殺菌した液状の非経口剤が挙げられ
る。

【００２９】固体の製剤は、そのまま錠剤、カプセル
剤、顆粒剤又は粉末の形態として製造することもできる
が、適当な添加物を使用して製造することもできる。そ
のような添加物としては、例えば乳糖若しくはブドウ糖
などの糖類、例えばトウモロコシ、小麦若しくは米など
のデンプン類、例えばステアリン酸などの脂肪酸、例え
ばメタケイ酸アルミン酸マグネシウム若しくは無水リン
酸カルシウムなどの無機塩、例えばポリビニルピロリド
ン若しくはポリアルキレングリコールなどの合成高分
子、例えばステアリン酸カルシウム若しくはステアリン
酸マグネシウムなどの脂肪酸塩、例えばステアリルアル
コール若しくはベンジルアルコールなどのアルコール
類、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、エチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルメ
チルセルロースなどの合成セルロース誘導体、その他、
水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴムなど通常
用いられる添加物が挙げられる。

【００３０】これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び粉
末などの固形製剤は一般的には０．１〜１００重量％、
好ましくは５〜１００重量％の有効成分を含む。

【００３１】液状製剤は、水、アルコール類又は例えば
大豆油、ピーナッツ油若しくはゴマ油などの植物由来の
油など液状製剤において通常用いられる適当な添加剤を
使用し、懸濁液、シロップ剤又は注射剤などの形態とし
て製造される。

【００３２】特に、非経口的に筋肉内注射、静脈注射又
は皮下注射で投与する場合の適当な溶剤としては、例え
ば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉注射
用）、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈
内注射用液体（例えばクエン酸及びクエン酸ナトリウム
などの水溶液）若しくは電解質溶液（点滴静注及び静脈
内注射用）など、又はこれらの混合溶液が挙げられる。

【００３３】これらの注射剤はあらかじめ溶解したもの
のほか、粉末のままあるいは適当な添加剤を加えたもの
を用時溶解する形態もとり得る。これらの注射液は通
常、０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の有
効成分を含む。

【００３４】また、経口投与の懸濁剤又はシロップ剤な
どの液剤は、０．５〜１０重量％の有効成分を含む。

【００３５】本発明の化合物の実際に好ましい投与量
は、使用される化合物の種類、配合された組成物の種
類、適用頻度及び治療すべき特定部位、宿主及び腫瘍に
よって変化することに注意すべきである。例えば、１日
あたりの成人の投与量は、経口投与の場合、１０〜５０
０ｍｇであり、非経口投与、好ましくは静脈注射の場
合、１日あたり、１０〜１００ｍｇである。なお、投与
回数は投与方法及び症状によって異なるが、１回ないし
５回である。

【００３６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。実施例ＢＥ−５５０５１の製造法斜面軟寒天培地に接種した放線菌Ａ５５０５１株をグ
ルコース０．１％、デキストリン２％、魚粉０．５％、
コーングルテンミール１％、酵母エキス０．１％、硫酸
マグネシウム０．０５％、塩化ナトリウム０．１％、塩
化カルシウム０．０５％、硫酸第一鉄０．０００２％、
塩化第二銅０．００００４％、塩化マンガン０．０００
０４％、塩化コバルト０．００００４％、硫酸亜鉛０．
００００８％、ホウ酸ナトリウム０．００００８％、及
びモリブデン酸ナトリウム０．０００２４％からなる培
地（ｐＨ７．０）１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の三角
フラスコ２本に接種し、２８℃で４８時間、回転振盪機
（毎分１８０回転）上で培養した。この培養液を２ｍｌ
ずつ上記の培地を１１０ｍｌ含む５００ｍｌ容の三角フ
ラスコ５０本に接種し、２８℃で１６８時間回転振盪機
（毎分１８０回転）上で培養した。

【００３７】このようにして得られた培養液（約５Ｌ）
から濾過により菌体を分離後、菌体に２Ｌのメタノール
を加えて２回抽出した。この抽出液を減圧下２５０ｍｌ
まで濃縮した後、蒸留水２５０ｍｌを加え、５００ｍｌ
の酢酸エチルで２回抽出した。得られた酢酸エチル抽出
液を減圧下に濃縮し、粗抽出物を得た。この粗抽出物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メルク社製キー
ゼルゲル６０、７０〜２３０メッシュ、３．０ｘ３５ｃ
ｍ）に供し、クロロホルムで溶出することによりＢＥ−
５５０５１を含む画分を得た。この画分を減圧下に濃縮
した後、セファデックスＬＨ−２０カラム（ファルマシ
ア社、２．５ｘ４０ｃｍ）に供し、メタノールで溶出
後、ＢＥ−５５０５１を含む画分を濃縮乾固することに
より純粋なＢＥ−５５０５１２００．７ｍｇを黄色の
固体として得た。

【００３８】以下に本発明の化合物の製剤例を示すが、
本発明の化合物の製剤は本製剤例に限定されるものでは
ない。製剤例１本物質（ＢＥ−５５０５１）１０部、重質酸化マグネ
シウム１５部及び乳糖７５部を均一に混合して、３５０
μｍ以下の粉末状又は細粒状の散剤とする。この散剤を
カプセル容器に入れカプセル剤とした。製剤例２本物質（ＢＥ−５５０５１）４５部、澱粉１５部、乳
糖１６部、結晶性セルロース２１部、ポリビニルアルコ
ール３部及び蒸留水３０部を均一に混合した後、破砕造
粒して乾燥し、次いで篩別して直径１４１０〜１７７μ
ｍの大きさの顆粒剤とした。製剤例３製剤例２と同様の方法で顆粒剤を作製した後、この顆粒
剤９６部に対してステアリン酸カルシウム３部を加えて
圧縮成形し直径１０ｍｍの錠剤を作製した。製剤例４製剤例２の方法で得られた顆粒剤９０部に対して結晶性
セルロース１０部及びステアリン酸カルシウム３部を加
えて圧縮成形し、直径８ｍｍの錠剤とした後、これにシ
ロップゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸濁液を加
えて糖衣錠を作製した。

【００３９】

【発明の効果】本発明に記載するＢＥ−５５０５１は、
マウス及びヒトの腫瘍細胞に対して強い増殖抑制効果を
示すことから、医薬の分野で癌の治療剤として有用であ
る。

【００４０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者神谷正剛茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者長嶋正生東京都目黒区下目黒２丁目９番３号萬有製薬株式会社目黒工場内 (72)発明者小尻勝久茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者須田寛之茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】構造式［Ｉ］【化１】で表される化合物。
【請求項２】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属し、構造式［Ｉ］【化２】で表される化合物を産生する能力を有する微生物を培養
し、その培養物から構造式［Ｉ］で表される化合物を採
取することを特徴とする、構造式［Ｉ］で表される化合
物の製造法。
【請求項３】構造式［Ｉ］【化３】で表される化合物を産生する能力を有する微生物が、ス
トレプトミセスエスピーＡ５５０５１（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ａ５５０５１）又はその
変異株である請求項２記載の製造法。
【請求項４】構造式［Ｉ］【化４】で表される化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項５】構造式［Ｉ］【化５】で表される化合物を産生する能力を有することを特徴と
するストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
に属する微生物。
【請求項６】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属する微生物が、ストレプトミセスエスピ
ーＡ５５０５１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ
ｐ．Ａ５５０５１）又はその変異株である請求項５
記載の微生物。