PT80793B

PT80793B - Processo para a producao de novos antibioticos de eter policiclico

Info

Publication number: PT80793B
Application number: PT80793A
Authority: PT
Inventors: Hiroshi Maeda; Junsuke Tone; John Cornish Ruddock; Walter P Cullen
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1984-07-12
Filing date: 1985-07-10
Publication date: 1987-10-20
Also published as: FI852692A0; PT80793A; GR851720B; ATE36860T1; HU194312B; DK317085A; IL75773A; IE57818B1; AU554477B2; HUT39778A; US4992423A; EP0169011A2; FI852692L; US5100785A; FI78732B; GB8417785D0; DE3564689D1; CA1236414A; DK159451C; FI78732C

Description

Descrição pormenorizada do Invento

0 microorganismo aqui designado como Actinomadura roseorupa Huang sp. nov. ATCC 39697 e que é útil para a preparação dos antibióticos UK-58-852, UK-58-852 CP-70.228 e CP-70-828, foi isolado a partir de uma amostra de solo em Izumo City, Shimane Prefecture, Japão. Reconheceu-se tratar-se de uma espécie de Actinomadura, por causa das dimensões estreitas dos "hyphae", produção do micélio aéreo, nascendo espórios em cadeias e da presença da madurose nos hidrolisatos de células interna.

A sua cultura aqui designada como N596-33, foi plantada em plano inclinado no caldo de ATCC nS. 172 e desenvolveu-se durante quatro dias a 28°C num misturador. Em seguida, foi centrifugada durante 20 minutos, la vada três vezes com água destilada estéril e foi plantada em meios normalmente utilizados para a identificação de membros dos "Actinomycetales", conforme será aqui descrito a seguir.

A cultura foi incubada a 28°C e os resultados foram lidos a alturas variadas mas o mais comum foram vistos aos 14 dias. As cores são descritas na terminolo gia comum, mas as cores exactas foram determinadas por comparações com fragmentos coloridos do Colour Harmony Manual, quarta edição. Os métodos das análises de amino ácido de célula única e de açúcar são os descritos em Becker et al., Appl. Microbiol. 12, 421-423; e em Lechevalier J. Lab.

Clin. Med. 71, 934-944, 1968.

Os meios de identificação empregues para a caracterização da cultura e as referências para a sua composição ou abastecimento são como se segue:

1. Agar de extracto de levedura extracto de malte (meio ISP ηθ. 2, Difco).

2. Agar com farinha de azeia (meio ISP, ηθ. 3, Difco).

3. Sais inorgânicos amido (meio ISP n2. 4 Difco).

4. Agar em glicerol-arparagina (Meio ISP n2. 5, Difco)

5. Agar em czapek-açucar - S.A. Waksman, "The Actinomycetes", vol. 2, meio ηθ. 1, p. 328, 1961.

6. Agar com glicose - Asparagina - Ibid. meio ηθ 2

p. 328.

7. Agar Bennett, - Ibid. meio nQ 30, p. 331.

8. Agar Emerson - Ibid. meio ηθ. 28, p. 331.

9. Agar com nutriente - Ibid. meio ηθ. 14, p. 330

10. Agar com tirosina de Gordon e Smith - R.F. Gordon M.M. Smith, J. Bact. 69, 147-150, 1955.

11. Agar com caseina - Ibid.

12. Agar com malato de cálcio - S.A. waksman, Bact Rev. 21, 1-29, 1957.

13. Agar com gelatina - R.F. Gordon e J.M. Mihm, J. Bact. 73, 15-27, 1957.

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14. Agar com amido - Ibid.

15. Agar com batata e cenoura - M.P. .1 ech^val⁴,

J.Lab and Clinicai Med., 71 934-944, 1968, mas utilize-se apenas 30 g de batatas, 2,5 g de cenouras e 20 g de agar.

16. Agar a 2% com água corrente.

17. Meio mineral de Gauze, ηθ. 1 - G.F. Gauze et al Probleus in the Classification of Antagonistic Actinomycetes Esição Inglesa, p. 13, 1957.

18. Agar com dextrose de batata - Descasca-se, corta -se e coze-se em vapor 100 g de batatas em 500 ml de água, filtra-se através de uma gaze grosseira de algodão adiciona· -se 10 g de glicose, 50 ml de leite de coco 20 g de agar e água suficiente para fazer um litro.

20ξ.. - Triptona - Caldo de octracto de levedura (meio ISP n2. 1 Difco).

21S. - Agar com Peptona - ferro extracto de levedura (meio ISP ηθ. 6, Difco).

22â. - Caldo de nitrato orgânico - R.F. Gordon e J.M. Mihm, J. Bact. 73, 15-27, 1957.

23. Caldo de nitrato de dextrose - S.A.Waksman,

"the Actinomycetes", vol. 2, meio n2. 1, p.328, 196), com 30 g de sacarose substituída por 3 g de dextrose sem agar.

24. Leite desnatado - Difco

25. Utilização da celulose

a) H.L. Jensen, Proc. Linn Soc. N.Í3.W. , 55, 231-248, 1930.

b) M. Levine e H.W. Schoenlein," A Compilation of Culture Media", meio nS. 2511, 1930.

26. Carbohidratos - Meio ISP ns 9, Difco; meio C-2, H. Nonomura e J. Ohara, J. Ferment. Technol., 49 (11) 887-894, 1971.

27. Média de temperatura - Meio ATCC 172 em "ATCC Culture Colection Catalogue", 15§. edição, p. 608, 1982.

As observações de desenvolvimento e aparência do organismo foram como se segue:

Agar com extracto de levedura Estracto de malte - Desenvolvimento bom, branco, com matiz rosa a rosa - vermelho (6ga, 6V2ia, 6¹/² ia) em relevo, acidentado, micélio aéreo branco; o reverso amarelado pálido para rosa (2ea, 6ga); ausência de pigmentos solúveis..

Agar de farinha de aveia Desenvolvimento moderado creme (lV²ca), ligeiramente em relevo regular; nenhum micélio aéreo e escassos, brancos; reverso incolor para creme (lV²ca); ausência de pigmentos solúveis.

Agar com sais inorgânicos amido - Desenvolvimento pobre, incolor a creme pálido (perto delV²ca), fino regular nenhum micélio aéreo e escassos, brancos; o reverso incolor para creme pálido (perto de l¹/² ca ausência de pigmentos solúveis.

Agar com glicerol - asparagina - Desenvolvimento pobre a moderado, incolor mas rosa pálido (5ca) perto da extremidade, fino mas moderadamente em relevo perto da extremidade regular, nenhum micélio aéreo a escassos, brancos; o reverso incolor para o rosa pálido (5ca); ausência de pigmentos solúveis.

Agar com Czapek" - sacarose Desenvolvimento moderado, rosa pálido, amarelo acizentado para \ermelho (5ca, 2gc, 63/² ia) ligeiramente em relevo, macio; nenhum micélio aéreo a escassos, visiveis apenas ao microscópio; o reverso como a superficie; ausência de pigmentos solúveis.

Agar com Glicose - asparagina Desenvolvimento moderadao a bom, amarelo acinzentado, castanho amarelado a vermelho (2ie 3nc, 7¹/² ia, 7¹/² la) moderadamente em relevo, regular, com poucos inchaços pequenos; nenhum micélio aéreo a escassos, brancos; o reverso como a superficie; pigmentos solúveis cremes (2ca).

Agar de Bennett - Desenvolvimento bom, amarelo acinzentado (2gc, 2ie) com uma extremidade rosa pálido (5ca) em relevo, acidentado, com fendas em algumas aéreas; nenhum micélio aéreo a escassos, brancos; o reverso como a superficie; pigmentos solúveis amarelos acinzen tados (2ie).

Agar Emerson - Desenvolvimento bom, amarelado pálido, cinzento a castanho escuro (2gc, perto das séries cinzentas 3fe, 31i, 3ni), em relevo, acidentado; micélio aéreo pequeno, branco ; o reverso castanho escuro para amarelado (31i, 41i, 2gc). pigmento solúvel amarelado (21c).

Agar com nutriente - Desenvolvimer. to moderado, laranja (5ea, 5ga), fino a ligeiramente em relevo, regular nenhum micélio aéreo a escassos, brancos, o rever so, laranja (5ga); ausência de pigmentos solúveis.

Agar com tirosina de Gorden e

Smith - Desenvolvimento moderado a bom, castanho a castanho escuro (31e, 31g, 3ni), moderadamente em relevo, regular a ligeiramente granuloso, com uma fenda numa faixa-nenhum micélio aéreo a escassos, brancos; o reverso como a superficie, pigmentos solúveis castanhos amarelados (31c).

Agar com caseína - Desenvolvimento moderado a bom, rosa pálido (5ca, 5ea), ligeiramente em relevo, regular a acidentado; nenhum micélio aéreo ou escassos perto da extremidade, brancos; o reverso amarelado pálido a rosa pálido (2ca, 2ea, 5ca); pigmentos solúveis castanho amarelados.

Agar com maltose de cálcio Desenvolvimento moderado, creme (2ca) a branco, aparecendo como colónias isoladas, em relevo regular, micélio aéreo branco; o reverso creme (2ea, 2ca); ausência de pigmentos solúveis.

Agar com gelatina - DesenvolvjÍ

mento moderado, creme a amarelado escuro (2ea, 2ie) ligeiramente em relevo, regular a ligeiramente granuloso, nenhum micélio aéreo a escassos, brancos; o reverso amarelado pálido (2ea), ausência de pigmentos solúveis.

Agar de amido - Desenvolvimento moderado a bom, creme (2ca, 2ea), moderadamente em relevo, regular a ligeiramente granuloso, nenhum micélio aéreo a escassos brancos; o reverso creme (2ca, 2ea); ausência de pigmentos solúveis.

Agar de batata e cenoura - Desenvolvimento moderado, creme (2ca), ligeiramente em relevo, regu lar; nenhum micélio aéreo a escassos, brancos e reverso creme (2ca); ausência de pigmentos solúveis.

Agar com água - Desenvolvimento pobre, incolor a creme pálido ( lV2ca), fino regular, ausência de micélios aéreos; 2 reverso incolor; ausência de pigmentos solúveis.

Meio mineral Gauze 1 - Desenvolvimen to moderado, creme, verde amarelado a rosa - vermelho (2ca,

1V2 gc, l^x/2 ic, 5 ca, 6ia, 6ga, 61a), fino, regular, com poucas manchas do micélio aéreo branco; o reverso como a super ficie; ausência de pigmentos solúveis.

Meio orgânico de Gauze 2 - Desenvolvimento moderado a bom, rosa - laranja (4ca), moderadamente em relevo, regular mas ligeiramente acidentado perto da extremidade, micélio aéreo pequeno, branco; o reverso como a superficie; ausência de pigmentos solúveis.

Agar com dextrose de batata Desenvolvimento bom, amarelado escuro, rosa a vermelho (2ic, 6ea, 6V2nc), em relevo, acidentado, micélio aéreo branco a rosa (6ea), o reverso amarelado escuro vermelho a vermelho escuro (2ic, 6V2 nc, 6V2ni); pigmento solúvel amarelado pálido (2ca).

Propriedades morfológicas - As propriedades morfológicas gue se seguem foram observadas no agar com amido de sais inorgânicos depois de 21 dias de incubação: massa de espórios em séries de cor branca; esporoforos monopodialmente ramificados; cadeias de espórios simosas ou ondulantes, ocasionalmente em forma de gancho, irregularmente curvos ou enrolados muito livremente em 3 voltas, 10 a 30 espórios por cadeia de espório, espórios ovais a elipticos, raramente esféricos, 1,1-1,6 x 0,7 - 1,0 um ou 0,7-1,0 um em diâmetro; verrugosos conforme foi revelado pelo microscópico de exploração de electrões.

Propriedades bioquimicas - Melamina não produzida no caldo de triptona - extracto de levedura sulfito de hidrogénio não produzido sobre o agar com feno peptc na - extracto de levedura; gelatina liquefeita, amido não-hidrolisado; nitrato reduzido em nitrito em ambos os caldos de nitrato orgânico e de nitrato de dextrose; não houve desenvolvimento nem decomposição em ambos meios de celulose; clarificarão é não houve coagulação sobre o leite; digestão positiva da caseina; digestão positiva do malato de cálcio; digestão da tirosina fracamente positiva. A utilização do carbohidrato foi a mesma no meio ISP n°. 9 e no meio de Nonomut, e de Ohara C-2: Glucose e ramnose utilizados; sacarose fracamente utilizada; frutose duvidosamente utilizada; arabinose, inositol, manitol, rafinose e xitose não foram utilizados.

Análise de célula inteira - Os hidrolisatos de célula inteira contêm ácido mero-diaminopimélico, madurose, galactose, glicose, ramnose e ribose.

Relações de Temperatura - A conexão da temperatura com a taxa de desenvolvimento foi observada ser como se segue:

21°C

28°C

37°C

Bom

Moderado a

. _ fi _

45 C

Não houve

desenvolvimento desenvolvimento bom desenvolvimento desenvolvimento

0 microorganismo e caracterizado pela sua incapacidade em produzir melanina, cadeias de espórios vacilantes a ondulantes com espórios verrugosos e pela presença de ácido, meso-diaminopimélico, e da madurose como componentes de célula inteira. 0 micélio aéreo, se for produ

) zido é rudimentar e em alguns meios é visivel apenas com o

microscópio. A cor do micélio aéreo é branco mas pode ser rosa sobre o agar com dextrose de .batata. 0 micélio vegetativo é distinto, apresentando algumas sombras de vermelho sobre o agar com dextrose de levedura - extracto de malte, agar com "Czapek" - sacarose, agar com glicose - asparagina, agarose, meio orgânico de Gauze nQ. 1 e sobre o agar com dextrose de batata. A cultura ao produzir espórios na maior par te dos meios utilizados. Sobre o agar com sais inorgânicos amido, agar com farinha de aveia e no meio mineral de Gauze n°. 1, são produzidos na forma de alguns pedacinhos pequenos, em relevo brancos.

As propriedades morfológicas e bioquímicas colocam o microorganismo no género Actinomadura . Contudo, o organismo é diferente de quaisquer espécies relacionadas e representa uma nova espécie do género. É aqui desi gnada como "Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. 0 apelido especifico refere-se ao micélio de substrato rosa, rosa-vermelho ou vermelho da cultura. A sua cultura N596-33, foi depositada com a "American Type Culture Collection; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., sob as condições do tratado de Budapeste de 24 de Maio de 1984, sob o número ATCC 39697.

0 cultivo do Actinomadura

Rqseorufa Huang sp. nov. ATCC 39697 e o isolamento des antibióticos UK-58.852, CP-70.228 e CP-70.828. podem ser conduzidos sob condições semelhantes àquelas empregues em fermen| tações prévias para a produção de antibióticos de poliéter.

Ver, por exemplo, a Patente Americana ηθ. 4.361.649. 0 desenvolvimento toma lugar, de preferência, num meio nutriente aquoso sob condições aeróbicas submersas com agitação a uma temperatura de 24° a 36°C. Os meios nutrientes úteis por o cultivo incluem uma fonte de carbono assimilável,

| tais como, açucares, amidos e glicerol; uma fonte de azoto

orgânico, tal como, a caseina, digesto enzimático de caseina farinha de soja, farinha de caroço de algodão farinha de amendoim, glúten de trigo, farinha fina de soja, farinha de carne e farinha de peixe. Também pode ser utilizada com resultados vantajosos uma fonte de substâncias de desenvolvimento, tais como, grãos solúveis, farinha de peixe, farinha de caroço de algodão e extracto de fermento, assim como sais minerais tais como, cloreto de sódio e carborato de cálcio e elementos determinados, tais como, o ferro, magnésio, cobre, zinco, cobalto e manganês. Se se observar espuma em excesso durante a fermentação, podem ser adicionados ao meio de fermentação, agentes anti-espumantes, tais como, óleos

) vegetais ou silicones. 0 arejamento do meio em tanques

para o desenvolvimento submerso é de preferência, mantido à taxa de cerca de V² a 2 volumes de ar livre estéril por volume do caldo de fermentação e por minuto forçado a entrar no caldo através de um pulverizador. A agitação pode

) ser mantida por meio de agitadores geralmente familiares para

os peritis na técnica de fermentação. A taxa de agitação depende do tipo de agitador empregue. Um frasco misturador é, em geral, feito girar de 150 a 200 ciclos por minuto enquan to que um fermentador é, em geral, feito girar de 300 a 1700 rotações por minuto. Devem ser mantidas certamente, condições assépticas durante a transferência do organismo e durante o seu desenvolvimento.

A inoculação para a preparação dos antibióticos de acordo com este invento pode ser obtida pelo emprego de desenvolvimento a partir de uma cultura em plano inclinado ou garrafas "Roux" inoculados com a cultura.

Um meio sólido adequado para o desenvolvimento inicial do organismo sobre plano inclinado e em garrafas "Roux" é o meio ATCC n°. 172. 0 desenvolvimento pode ser utilizado para

inocular quer frascos misturadores quer tanques de inoculação ou os tanques de inoculação podem ficar com sementes a partir de frascos misturadores. 0 desenvolvimento em frascos misturadores terá, em geral, atingido o seu máximo em 4 a 5 dias considerando que a inoculação em tanques de inoculação submersa estará em geral, no periodo mais favorável em 5 a 6 dias.

0 progresso da produção de antibióticos durante a fermentação e a bioactividade do caldo de fermentação podem ser controlados por ensaio biológico do caldo empregando uma estirpe sensitiva de Staphylococcus aureus ou Bacillis subtilis. B. subtilis ATCC 6633 é uma estir pe adequada para este fim. É empregue uma técnica estandardizada de ensaio de lâmina em que a zona de inibição que circunda um disco de papel de filtro saturado coms o caldo é utilizada como uma medida de potência de antibiótico. Também a cromatografia de camada fina empregando silica gel é um instrumento útil para a detecção de antibiótico puduzidos nos meios de fermentação, e para a análise da composição do produto em bruto e de materiais purificados extraídos a partir dos caldos de fermentação. Os cromatogramas são desenvolvidos com acetato de etilo e os compostos de antibióticos são visuaalizados por pulverização com o reagente vanilina eaquecendo a lâmina de CCF a 80°C. A lâmina desenvolvida também pode ser revestida com agar espalhado quer com

S.aureus ou B. subtilis e é incubada a 37°C durante 16 horas a fim de se visualizar os antibióticos.

0 antibiótico UK-58.852 produzido por fermentação do Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC 39697 pode ser separado e recuperado por extracção do caldo de fermentação irieiro, não-filtrado, com um solvente orgânico, tal como, clorofórmio, acetato de etilo, metilisobutil cetona ou butanol ao pH naturalmente eficiente. Alternativamente, o micélio pode ser pode ser separado depois do desenvolvimento estar completo e o micélio pode ser extraido com um solvente orgânico. 0 extracto de solvente pode, então ser concentrado até se obter um xarope fino e o antibiótico puro é obtido por cromatografia.

Os componentes menores CP-70.228 e CP-70.828 são recuperados por mais cromatografia dos licores-mãe.

Um método tipico de separação e recuperação do composto de antibiótico deste invento é como se segue:

Foi extraido o caldo inteiro a partir da fermentação de Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC 39697, com metilisobutilo cetona. O extracto de solvente produziu um óleo escuro na evaporação do solvente sob vácuo. O óleo foi dissolvido em hexano e foi vazado numa ca mada de silica gel. A camada de silica gel foi lavada repetidamente com hexano e, em seguida, foi eluida com clorofórmio, clorofórmio acetato de etilo e acetato de etilo.

Os eluatos foram examinados por cromatografia de camada fina. As fraeções contendo c antibiótico UK-58.852 foram combinadas e evaporadas até ficarem secas. A fraeção do produto pode ser ainda purificada por cristalização ou por cromatografia de coluna,se for desejado. A cicloserina é co-produzida com o antibiótico UK-58.852, mas por causa da sua pobre solubili dade no solvente não interfere na recuperação do Antibiótico UK-58.852.

Os componentes menores CP-70.228 e CP-70.828 são recuperados por posterior eluição da coluna utilizando-se um sistema de solvente mais polar. Os produtos em bruto podem ser purificados, por cromatografia posterior, conforme for necessário.

Em adição, o antibiótico CP-70.228 é produzido quando a forma de ácido livre de UK-58.852 é deixada a repousar numa solução de metanol.

Os compostos de antibiótico deste invento são ácidos e formação sais cationicos por reacção com agentes básicos. Todos os tais sais estão dentro do âmbito deste invento. Estes sais são preparados por métodos convencionais, para os antibióticos de poliéter (ionofora).

Num método, uma solução do antibiótico é lavada num solvente volátil, miscível em água e orgânico com uma solução aquosa contendo, pelo menos, um equivalentes estequiométrico de pre ferência, uma grande parte em excesso de agente básico exceden te. Depois de se secar a solução de solvente orgânico, é evaporada in vacuo de modo a dar o sal catiónico desejado. Agentes tipicos básicos, que podem ser usados para este fim, incluem hidróxidos de metal alcalino, tais como, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio, hidróxidos de metal alcalino terroso, tais como, hidróxido de cálcio e hidróxido de bário e hidróxido de amónio.

A análise ao raio-X do sal de

prata do Antibiótico UK-58.852 e os dados analiticos e espectrais para o CP-70.228 e CP-79.828 indicam que os compostos tem a seguinte estrutura:

(JK-58,852: R = h, R¹ = H

Cft-70,228: R = K, R^ = CH

CP-70,828: R » CH_3> R¹ = CH₃.

0 antibiótico UK-58.852 exibe acção inibidora contra .o desenvolvimento de um número de microorganismo Gram-positivos. No Quadro I que se segue estão sumarizados os resultados dos testes in vitro. Para este teste, cada organismo é inoculado numa série de tubos de teste contendo meio nutriente e concentrações várias do antibiótico UK-58.852, a fim de se determinar a concentração minima do composto em mcg/ml, que inibe o desenvolvimento do organismo durante um periodo de 24 horas (CMI).

TABELA I

ACTIVIDADE ANTI-BACTERIANA

Organismo

Estirpe

NQ.

CMI,mcg/ml Antibiótico UK-58.852/sal de sódio

Staphylococcus aureus	01A005		3,12
··	01A052		3,12
	01A110		3.12
	01A400		6.25
Streptococcus. faecalis	02A006	>	50
Streptococcus pyogenes	020303		0,05
Actinotnyces pyogenes	14D011	<	0,08
Accinobacillus
pleuropneumoniae	44B004	>	25
Pasteurella multocida	59A006	>2	:oo
Clostridium perfringens	10A009		0,79
Bacteroides fragilis	78C024		0,10
Fusobacterium
necrophorum	84C004	>	25
Treponema hyodysenteriae	94Α007		0,39

Contra as bactérias gram-negativas, tais como, Escherischia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, senatia marcescens e Enterobacteria ceae aerogenes, os valores de CMI foram >5, em cada um

dos casos.

-22-

0 antibiótico UK-58.852 e os seus sais catiónicos exibem actividade excelente contra as infecções coccidiais em aves. Quando incorporados na dieta dos frangos a níveis de 25 a 150 ppm, estes compostos são eficien tes no controle de infecções devidas ao Eimeria tenella E. acervulina, E.maxima, E. brunetti e E. necatrix.

Os dados de eficácia para o composto de Antibiótico UK-58.852 e para os seus sais contra as infecções coccidiais em frangos foram obtidos do seguinte modo. Grupos de 3-5 pintainhos de raça "leghorn brancos isentos de patogénios de dez dias de idade foram alimentados com uma dieta de farelos contendo o Antibiótico UK-58.852 ou o seu sal de sódio e/ou de potássio que é aí disperso de um modo uniforme. Depois de terem estado com esta ração durante 24 horas, cada pintainho foi inoculado per 0£ com oocistos da espécie particular do Eimeria ao serem testados. Outros grupos de 3-5 pintainhos de dez dias de de idade foram alinientados com uma dieta de farelos semelhante sem o Antibiótico UK-58.852 ou os seus sais. Também foram infectados depois de 24 horas e serviram como controlos infectados. Ainda foi alimentado um outro grupo de 3-5 pintainhos de dez dias de idade com a mesma dieta de farelos sem o Antibiótico UK-58.852 e não foram infectados com os coccideos. Estes serviram como controles normais.

Os resultados do tratamento foram avaliados depois de cinco dias no caso do E. acervulina e seis dias para todas outr s casos.

Os critérios utilizados para medir a actividade anticoccidial consistiu na contagem das lesões de 0 a 4 para o caso da E.tenella segundo J.E.Lynch" A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity" Am J. Vet. Res., 22, 324-326, 1961; e de 0 a 3 para o caso das outras espécies com base na modificação do sistema de contagem inventada por J.Johnson and W.H.

Reid "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in

BaHery and Floor Pen Experiments in Chicks¹¹ Exp. Parasit.

28, 30-36, 1970. Foi estabelecido uma proporção constante

por divisão da contagem de lesão de cada um dos grupos tratados pela contagem de lesão do grupo de controle infectado.

0 Quadro II Sumariza os resultados

obtidos.

QUADRO II

ACTIVIDADE ANTICOCCIDIAL IN VIVO

ESPÉCIES DE INFECÇÕES

DOSE (PPM GRAU MÉDIO PESO GANHO

EM ALIMENTOS) DE . INFECÇÃO (PERCENTAGEM)

Eimeria tenella ' 150

125 100

75

50

25

Eimeria acervulina 150

125 100

75

^: 50

25

0,0	0
0,0	4
o,'o ' .	8
0,0	28
0,0	45
0,0	93
0,0	0
0,0	0
0,0	23
0,0	0
0,0	62
0,0	98

0 valor dos alimentos animais tem sido em geral, determinado directamente pela alimentação do animal. A Memória Descritiva da Patente Britânica N2.

1.197.826 descreve permenorizadamente uma técnica de rumo in vitro pela qual as transformações que ocorrem nos alimentos realizados por microorganismos são medidas mais facilmente e com grande precisão na avaliação dos alimentos animais. Esta técnica envolve a utilização de um aparelho no qual os processos digestivos dos animais são conduzidos e estudados in vitro. Os alimentos dos animais, a inoculação no rumen e os vários promotores de desenvolvimento são introduzidos numa e retirados de uma unidade laboratorial sob condições cuidadosamente controladas e as alterações que tiveram lugar são estudadas criticamente e progressivamente durante o consumo dos alimentos pelos microorganismos. Um aumento no teor do ácido propiónico do fluido do rumen indica que foi conseguida uma resposta favorável na realização de todos os ruminantes pelo promotor de desenvolvimento na composição alimentar. A transformação em teor de ácido propionico e expressa como percentagem do teor do ácido propiónico encontrado no controle do fluido do rumen. São utilizados estudos alimentares in vivo por longos periodos de tempo com o fim de mostrarem uma correlação segura entre o aumento do ácido propiónico no fluido do rumen e o comportamento animal melhorado.

0 fluido do rumen é colectado de uma vaca fistulada que é alimentada com uma racção de engorda comercial mais feno. 0 fluido do rumen é imediatamente filtrado através de uma gaze grosseira de algodão, são adicionados 10 ml a um frasco de 50 ml que contém 400 mg de substrato normalizado (68% de amido de milho + 17% de celulose + 15% de farinha de feijão de soja extraida) 10 ml de um tampão de pH 6,8 e do composto a testar. Os frascos são expostos à custa do gás azoto isento de oxigénio durante cerca de dois minutos e são incubados num banho de água sob agitação a 39°C durante cerca de 16 horas.

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Todos os testes são lavados a cabo em triplicado.

Depois da incubação, 5 ml da

amostra é misturada com 1 ml de ácido metafosfonico a 25%. Passados 10 minutos, é adicionado 0,25 ml de ácido fórmico e a mistura é centrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos. Em seguida, são analisadas amostras por cromatografia de gás liquido segundo o método de D.W.Kellog, J.Dairy Science, 52 1690, 1969. As alturas dos picos para os ácidos acético, propiónico e butírico são determinadas por amostras a partir de frascos de incubação não-tratados e tratados.

Quando testado por este processo in vitro, o Antibiótico UK-58.852 ao nível de 10 microgramas por mililitro deu origem a um aumento de cerca de 93% na produção de ácido propiónico em relação ao produzido na solução de controle sem o Antibiótico UK-58.852 adicionado.

Por comparação o composto salinomicina comercialmente disponível (um outro antibiótico de éter policiclico a 10 mcg/ml produziu um aumento de cerca de 88% de ácido propiónico em relação ao do controle. De um modo semelhante, uma experiência separada, o antibiótico CP-70.228 a um nível de 10 mcg/ml deu origem a um aumento de cerca de 30% na produção de ácido propiónico, tendo sido comparada com um aumento de cerca de 40% ao utilizar-se salinomicina a 10 mcg/ml.

Estes dados mostram que os Antibióticos UK-58.852 e CP-70.228 vão melhorar a utilização dos alimentos pelos ruminantes, tais como, gado e carneiros.

Os compostos também terão um efeito semelhante em animais monogástricos, como porcos e coelhos. Os Antibióticos UK-58.852 e CP-70.228 podem ser incorporados em composições alimentares como o ácido livre, sal de sódio, sal de potássio ou suas misturas. As formas em bruto do Antibiótico UK-58.852 ou CP-70.228 ou o caldo de fermentação seco contendo os antibióticos também podem ser incorporados em composições

alimentares às concentrações de potência desejada.

A actividade antibacteriana in vitro dos componentes de antibiótico menores CP-70.228 e CP-70.828 esta sumarizada no Quadro III:

QUADRO III

ACTIVIDADE ANTIBACTERIANA MIC, mcg/ml

Organismo

Estirpe Sal de sódio · Salde sódio

NS. CP-70.228 CP-70.828

Staphylococcus aureus	01A005 01A052 01Α11Θ 01A400	3,12 3,12 3,12 6(25	25 25 25 25
Streptococcus faecalis	02A006	50'	>50
Streptococcus pyogenes	020203	0,10	3
Actinomyces pyogenes	14D011	0,34
Actinobacillus
pleuropneumoniae	54B004	>100
Pasteurella multocida	59A006	>100
Clostridium perfringens	10A009	1,58
Bacteroides fragilis	78C024	12,5
Fusobacterium
necrophorum	84CQ04	>100
Treponema hyodysenteriae	94A007	1,58

!7'.ra?’?,·'·'__- ·

Contra as bactérias gram-negativas

tais como Escherischia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens e Enterobacteriaceae

aerogenes, os valores de CMI foram 50 em cada um dos casos.'

Os dados de eficácia para o composto de Antibiótico CP-70.228 contra as infecções provocadas por coccideos em frangos, de acordo com os processos numericamente descritos, estão sumarizados no Quadro IV:

QUADRO IV

ACTIVIDADE ANTICOCCIDIAL IN VIVO CP-70.228

Espécies de infecções

Dose (PPM Grau médio Peso ganho

em alimentos). de infecção (Percentagem)

Eimeria tenella	100	0,0 0,3 1,3	95
	75	63
	50	103
	25	• ²,7 0,0	80
Eimeria acervulina	100	100
	75	0.0	100
	50	ο,'ο i)²	70
	25	40

Evemplos que se seguem.

Ingrediente

Glicose

Farinha fina de soja

NZ Amina YTT *

Sulfato de sódio

Cloreto de cobalto

Carbonato de cálcio

0 invento é

EXEMPLO 1

ainda ilustrado pelos

Gramas/litro

20

10

5

0,5

0,002

2

Cem ml de meio é distribuído em frascos misturadores de 300 ml e é esterilizado a 120°C e a 15 p.s.i. durante 30 minutos. Depois de se ter arrefeci do o meio é inoculado com uma suspensão de célula vegetativa proveniente de uma cultura de plano inclinado Actinomadura sp. ATCC 39697 (N596-33).

Os frascos são agitados a 28°C num misturador rotativo tendo um deslocamento de 1-1/2 até 2-1/2 polegadas e 150 a 200 ciclos por minuto durante três a cinco dias.

O meio que se segue também foi

empregue com resultados semelhantes

Ingrediente

Gramas/litro

Cerelose 10

Amido de milho 5

Licor de milho em infusão 5

NZ Amina YTT # 5

Cloreto de cobalto 0,002

Carbonato de cálcio 3

# Marca registada para o digesto enzimático de caseina, Hunko Sheffield Chemical Co.Inc.

2. Fermentação e isolamento de UK-58.852

Um frasco misturador contendo a cultura desenvolvida foi utilizado para inocular um recipien te de fermentação de cinco litros contendo três litros de meio estéril da composição que se segue à qual foi adicionado 1 ml de agente antiespumante de silicone.

Ingrediente

Gramas/litro

Cerelose 10,0

Amido de milho 20,0

NZ Amina YTT 5,0

Germen de trigo 5,0

Carbonato de cálcio 4,0

Água para 1 litro

de pH 6,9-7,0

A fermentação foi lavada a cabo a 30°C sob agitação a 1700 rotação por minuto e o arejamento a um volume de ar por volume de caldo por minuto até que foi observado uma actividade substancial (com base no ensaio de disco de antibiótico versus B. subtilis ATCC 6633), normalmente 4-6 dias. A bioactividade do caldo, e as correntes subsequentes de recuperação foram seguidas do emprego de uma estirpe sensitiva de Bacillus subtilis ATCC 6633 or Staphylococcus aureus ATCC 6538. O componente antibiótico no caldo e as correntes de recuperação foram visualizadas ao empregar-se placas de silica gel desenvolvidas com acetato de etilo.

As placas foram pulverizadas com o reageçte vanilina (3 g de vanilina em 75 ml de etanol e 25 ml de ácido fosfórico a 85% e aquecidas a 80°C. O Antibiótico IK-58.852 aparece sob a forma de uma mancha la' ranja a vermelho. Como alternativa, a placa foi revestida com agar, semeada que com jS. aureus ou com B. subtilis a que foi adicionado, 1,0 ml de uma solução a 1% de cloreto

.'ORTUGAI

2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio e foi incubada a 37°C durante

16 horas de modo a visualizar o antibiótico sob a forma de

uma área branca em contraste com um fundo rosa.

Ao fim deste tempo, o caldo inteiro foi extraido com metilisobutil cetona, o solvente foi separado e concentrado a fim de produzir um residuo de 35 g. 0 re siduo foi suspenso em hexano e o lote foi tratado com silica gel num funil - filtro. 0 absorvente foi lavado com hexano em seguida',' foi eluido com clorofórmio acetato de etilo, e acetona. A actividade estava na fraeção de acetato de etilo (20 g). Esta foi concentrada, o residuo foi eromatografado de novo sobre silica e o produto foi cristalizado a partir do heptano de modo a dar o Antibiótico UK-58.852, sob a forma de um sólido branco (rendimento 80 mgs).

EXEMPLO 2

Foi seguido o processo do

Exemplo 1, mas empregando-se o seguinte meio para a fermentação.

Ingrediente Gramas/litro

Cerelose 10

Amido de milho em infusão 5

Licor de cobalto 5

Cloreto de cobalto 0__;002

NZ Amina YTT 0,002

Carbonato de cálcio

0 caldo inteiro de um vaso de fermentação 10 de uma cultura de Actinomadura sp. ATCC 39697 (volume total aproximadamente 25 litros) foi extraido com um terceiro volume de metilisobutil cetona. O extracto foi concentrado sob vácuo a fim de obter-se um óleo castanho (35 g). Este material foi cromatografado numa coluna de 5 x 100 em acondicionada com uma coluna graduada de silica gel G (malha de 70-230, Woelm) em cloroformacetona (3 : 1).

A coluna foi desenvolvida com cloroformacetona (3:1) a uma taxa de fluxo de 10 ml/min. Foram tomadas fraeções de 10 ml cada uma.

As fraeções foram examinadas por cromatografia de camada fina sobre placas. "Analtech" de silica gel GF desenvolvidas em acetato de etilo. As placas foram pulverizadas com vanilina a 3% em etanol-ácido fosfónico a 85% (3:1) e foram aquecidas até 80°C. O antibiótico UK-58.852 desejado aparece sob a forma de uma mancha vermelha sob estas condições.

As fraeções que contêm o Antibiótico UK-58.852 foram combinadas (volume total aproximadamente 350 ml) e agitadas com 2 gramas de carbono "Darco G60 durante 5 minutos. A mistura foi filtrada e evaporada sob vácuo.

0 óleo amarelo que ficou depois da evaporação foi dissolvido em 100 ml de clorofórmio e foi agitado com um volume igual de água e o pH foi ajustado até 4,0 com ácido fosfórico. As fases foram separadas e a fase de clorofórmio foi agitada com um volume igual de tampão dibásico de fosfato de sódio a 5% e o pH foi ajustado até 9,0 com IN de uma solução de hidróxido de sódio.

As fases foram separadas e o clorofórmio foi seco sobre sulfato de sódio anidro e, em seguida foi evaporado sob vácuo. 0 óleo amarelo viscoso que ficou depois da evaporação foi dissolvido num pequeno volume de hep tano em que ocorreu a cristalização. Os cristais foram colectado por filtração e secos sob vácuo tendo produzido 3,5 g do antibiótico UK-58.852 assim como o sal de sódio, p.f. 182-183°C Encontrado: C,60,90; H, 8,32; C₅₂ ^H87⁰i8^Narequer C, 61,06; H, 8,51. 0 espectro de ultravioletas

mostrou apenas a absorção final. Rotação óptica /7^7 D

= +10° (c = 0,5, metanol). Espectro de infravermelhos (KBr) cm"¹; 3423, 2966, 2928, 2869, 2821, 1613, 1453,

1407, 1377, 1361, 1312, 1257, 1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1093, 1064, 1030, 983, 969, 938, 919, 886.

A forma de ácido livre do Antibiótico UK-58.852 foi preparado por agitação de uma solução de clorofórmio do sal de sódio de UK-58.852 com um volume igual de água e diminuindo o pH para 3,0 com ácido fosfórico. As fases foram em seguida, separadas e o clorofórmio foi evaporado sob vácuo de modo a dar o Antibiótico UK-58.852 assim como o ácido livre; p.f. 123-126°C. O espectro de ultravioletas mostrou apenas a absorção fi^-nal. Rotação óptica /\7_d = +40° (c=0,5; clorofórmio).

EXEMPLO 3

Um fermentador de 1700 galões,

contendo 1.000 galões de meio estéril da seguinte composição foi inoculado com um litro de um inoculum de Actinomadura sp. ATCC 39697, preparado conforme se descreveu no Exemplo 1

Ingrediente

Meio de fermentação

Gramas/litro

Cerelose , 10

Amido de milho 5

Licor de milho em infusão 5

Cloreto de cobalto 0,002

NZ Amina YTT 5

Carbonato de cálcio 3

0 -fermentador foi mantido a

28°C com arejamento e agitação a 1700 rotações por minuto. Depois de 296 horas o caldo inteiro foi extraido com 300 galões, seguido-: de 200 galões de metilisobutil cetona.

Os extractos de solvente foram separados, combinados, e concentrados sob vácuo até se obter 10 litros de um óleo castanho. 0 extracto foi triturado por agitação com metanol durante cinco minutos. A fase de metanol foi separada e o óleo foi agitado com 6 litros de metanol adicional.

As fracções de metanol foram combinadas e evaporadas sob vácuo (4 litros). Um litro deste concentardo de metanol foi posto em 2 litros de hexano e foi

vazado numa camada de 3 kg de silica gel de coluna graduada

num filtro de Lapp.

A silica gel foi lavada sucessivamente com hexano (11 litros), clorofórmio (7,5 litros) e por fim com acetato de etilo (7,5 litros). As fracções foram examinadas por cromatografia de camada fina. O produto foi descoberto estar nas fracções de clorofórmio e de acetato de etilo. As fracções de clorofórmio e de acetato de etilo foram ambas lavadas com água contendo ácido fosfórico até pH4 e, em seguido, com tampão dibásico de fosfato de sódio a 5% (ajustado até ao pH 9,5 com IN de hidróxido de sódio).

As fracções de solvente foram, em seguida secas sobre sulfato d sódio anidro e foram evaporadas sob vácuo. 0 residuo oleoso que ficou depois de evaporação foi posto numa pequena quantidade de hexano, em que ocorreu a cristalização. Os cristais foram colectados por filtração. Os 3 litros restantes de metanol concentrado foram tratados como foi descrito anteriormente e os cristais obtidos das quatro fracções foram combinados, produzindo 300 g de Antibiótico UK-58.852 assim como o sal de sódio.

EXEMPLO 4

Isolamento de CP-70.228 a partir do licor-mãe de fermentação

25 mg de licor-mãe fde uma cristã lização de UK-58.852 foram cromato grafadas numa coluan coluna de 50 mm χ 1 m acondicionada com silica gel em coluna graduada numa mistura de clorofórmio e acetona (4 : 1).

A coluna foi eluida a 10 ml/min. com o mesmo solvente, obtendo-se fracçoes de 10 ml. A evolução de cromatografia foi controlada por cromatografia de camada fina. 0 UK-58.852 estava contido nas fracçoes 95-230. Depois das 300 fracçoes foi adicionado metanol a 25% ao sistema e a eluição foi continuada durante um adicional de dois litros.

O CP-70.228 estava contido nestas fracçoes, as quais foram evaporadas de modo a dar 4,5 g de um óleo amarelo. Este material foi ainda cromatografado numa coluna de 25 mm x 50cm de "Sephadex LH-20" em metanol. A taxa de fluxo foi de 1 ml/ min. e as fracçoes foram obtidas em cada 5 minutos.

As fracçoes mostradas por cromatografia de camada fina no sentido de conter o CP-70.228 de um óleo amarelo. Este concentrado foi cromatografado de novo numa coluna de 25 mm x 50 cm acondicionada com silica gel em coluna graduada em clorofórmio contendo metanol a 2,5%.

A coluna eluida a 5 ml/min. e as fracçoes foram obtidas em cada 2 minutos. As fracçoes mostradas por cromatografia de camada fina no sentido de conter CP-70.228 foram combinadas e evapora das de modo a produzir 100 mg do sólido branco CP-70.228, p.f. 113-123°C. Encontrado: C, 62,63; H, 8,82. ^C53^H90⁰18 requer C,62,70; H, 8,94%. Espectro de ultravioleta: ausência de absorção. Rotação optica: /õ( = + 21,8° (C = 0,5,

metanol). Espectro de infravermelho (KBr) cnf^ : 3439,,

2970, 2933, 2877, 1716, 1636, 1457, 1380, 1318, 1293, 1240, 1218, 1165, 1117, 1097, 1069, 1032, 989, 975, 940, 912, 897,

859.

I

EXEMPLO 5

Conversão de UK-58.852 no sal de sódio CP-70.228

Foram dissolvidas 11 mg do ácido livre UK-58.852 em 200 ml de metanol e deixar a repousar à temperatura ambiente. A cromatografia de camada fina da solução depois de 1 hora mostrou uma conversão completa do UK-58.852 em CP-70.228. O metanol foi evaporado sob vácuo e o concentrado foi dissolvido em 200 ml de clorofórmio.

0 clorofórmio foi agitado com 200 ml de tampão dibásico de fosfato de sódio a 5% e o pH foi ajustado até 10,5 com 6N de hidróxido de sódio. As fases foram separadas e o clorofórmio foi seco sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e evaporadas sob vácuo até se obter um óleo. Foram adicionados 200 ml de heptano e a solução foi evaporada de novo sob vácuo, após o que o CP-70.228 cristalizou assim como o sal de sódio. O sal foi seco sob vácuo elevado a 60°C durante 5 horas, rendimento 11 g. Os dados do espectro e de cromatografia indicam que este material é idêntico ao CP-70.228 derivado de fermen tação. p.f. 150-155°C. Encontrado: C, 60,49; H, 8,75. ^C53^H89®i8^{Na erc}3^{uer C}' θΐ.37; H, 8,65%. Espectro de ultravioletas: ausência de absorção. Rotação óptica /όζ = +

13,6° (c = 0,5, (C=0,5 metanol). Espectro de infravermelhos (KBr)cnT¹. 3429, 2973, 2935, 2878, 1594, 1455, 1399,

1379, 1319, 1291, 1268, 1242, 1215, 1189, 1165, 1117,

1096, 1068, 990, 975, 943, 891, 860, 833.

»-38-

EXEMPLO 6

Isolamento do CP-70.828 a partir do licor-mãe de fermentação

0 componente menor CP-70.828 foi isolado por cromatografia de coluna repetida de licores-mãe de fermentação. 0 CP-70.828 foi detectado por pulverização de vanilina do mesmo modo como o CP-70.228.

0 material de mancho única CP-70.828 (por ccf) foi cristaliz do a partir de heptano rendimento 20 mg. p.f. 133-136°C. Encontrado: C, 62,66; H, 8,85. ^<-^:54^Η92θ18 ^rec3^uer C, 63,01;

H, 9,01%. Espectro de ultravioletas: ausência de absorção. Espectro de infravermelho (KBr) cm^- : 3416, 3259 (br),

2968, 2926, 2871, 1614, 1455, 1377, 1363, 1315, 1260,

1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1092, 1063, 1030, 986, 970, 939, 921, 887, 857, 827, 799, 661.

II

-39lã. - Processo para a produção

Claims

REIVINDICAÇÕES

de um antibiótico de fórmula

e de seus sais catiónicos farmaceuticamente aceitáveis, em que R e R^ são cada um deles hidrogénio; R é hidrogénio e R é metilo ou R e R são ambos metilo; caracterizado por compreender a cultura do microorganismo Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC /39697 ou de uma sua forma mutante ou recombinante tendo a capacidade de produzir um antibiótico de fórmula (I), em meio de cultura aquoso que contem uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos sob condições de fermentação aeróbicasubmersa até se obter uma quantidade recuperável do antibiótico referido.

-402ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido antibiótico ser separado a partir do meio de fermentação.

35. - Processo de acordo com

a reivindicação 1, caracterizado por o referido antibiótico ser recuperado sob a forma de uma preparação micelial ou por secagem por pulverização do meio de fermentação completo.

4§. - Processo de acordo com

a reivindicação 2, caracetrizado por o referido antibiótico ser convertido no seu sal de sódio ou potássio.

55. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por R e r! serem ambos hidrogénio.

65. - Processo de acordo com qual, quer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o referido antibiótico ser misturado com um alimento nutriente para animais.