DK159451B - Poly(cyclisk ether)-forbindelser, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmaaden samt foderblandinger indeholdende forbindelserne og fremgangsmaade til fremme af vaekst og/eller foderudnyttelse hos svin og kvaeg - Google Patents

Description

DK 159451B

Opfindelsen angår poly(cyclisk ether)-forbindeiser og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, samt en biologisk ren kultur af en mikroorganisme tilhørende slægten Actinomadura til anvendelse ved fremgangsmåden.

5 Endvidere angår opfindelsen foderblandinger til kvæg eller svin, og til fjerkræ samt en fremgangsmåde til at fremme væksten og/eller forøge foderudnyttelsen hos svin eller kvæg.

Poly(cyclisk ether)-forbindelserne ifølge opfindelsen 10 er hidtil ukendte medlemmer af gruppen af sure poly- cycliske ethere med antibiotisk aktivitet, en klasse af forbindelser, som biologisk er karakteristiske ved deres virkning på kationtrarrsporten i mitochondrier.

Denne familie af antibiotika inkluderer sådanne velkendte 15 midler som monensin, nigericin, grisorixin, dianemycin, salinomycin, mutalomycin, ionomycin og leuseramycin.

Emnet er blevet omtalt i en oversigtsartikel af Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. Microbiol., 22:177 (1977).

20 De ovennævnte kendte poly(cyclisk ether)-antibiotika er aktive overfor Gram-positive bakterier, svampe og protozoer. Specielt udviser disse antibiotika kraftig anti-coccicidal virkning. De har derfor været anvendt med varierende held til behandling af forskellige in-25 fektioner hos dyr.

Den velkendte protozoiske sygdom coccidiosis er stadig et alvorligt problem, og bekæmpelsen af denne sygdom er af økonomisk vigtighed inden for veterinærvidenskaben, specielt inden for fjerkræindustrien. Coccidiosis skyldes 30 infektion med en eller flere arter af Eimeria eller

Isospora (med hensyn til en samlet oversigt, se Lund og Farr i "Diseases of Poultry", 5th ed., Biester og Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, la.,

DK 159451B

2 1965 side 1056-1096). Der er seks arter af coccidier, som frembringer let skelnelig morbiditet hos følsomme kyllinger. Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima og E. mivati frembringer skade 5 enten direkte ved ødelæggelse af epithelceller i for døjelseskanalen eller direkte via produktionen af toxi-ner. Tre andre arter af protozoer tilhørende den samme slægt antages at være forholdsvis uskadelige; imidlertid er E. mitis, E. hagano og E. praecox i stand til 10 at reducere vægtforøgelsen, sænke foderudnyttelsen og have uheldig indvirkning på ægproduktionen.

På grund af de store økonomiske tab, der skyldes cocci-diosis, og de velkendte ulemper ved eksisterende anti-coccidiale midler, er man interesseret i at finde bedre 15 midler.

Enteritis er en anden sygdom, som kan forårsage alvorlige økonomiske tab ved husdyrproduktion. Enteritis forekommer hos kyllinger, svin, kvæg og får og skyldes især anaerobe bakterier, specielt Clostridium perfringens 20 og vira. Enterotoxæmia hos drøvtyggere, hvor et eksempel er "pulpy kidney disease" hos får, er en tilstand forårsaget af C. perfringens infektion.

Svinedysenteri er en af- de mest almindelige svinesygdom-me diagnosticeret i USA. Herudover forekommer sygdom-25 men i mange andre lande, og den forårsager betydelige tab hos svineavlere rundt omkring i verden. Man har for nylig opdaget, at en stor spirochæte er den organisme, der forårsager sygdommen. Denne organisme, Treponema hyodysenteriae, er nu blevet isoleret, og viser sig 30 at være i stand til at frembringe sygdommen [Harris, D.L. et al. "Swine Dysentery-1, Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med/SAC, 67:61-64 (1972)].

DK 159451 B

3

De i det følgende angivne forsøgsresultater omhandler forsøg, der er udført med denne organisme. Det skal bemærkes, at det ikke er kendt, om T. hyodysenteriae er den eneste kausative organisme for svinedysenteri.

5 Ud fra de tilgængelige data kan det imidlertid sluttes, at den er en primær infektionskilde. Stigning i udbyttet (forøget væksthastighed og/eller forøget udnyttelseseffektivitet) hos drøvtyggere som f.eks. kvæg og hos enmavede dyr som f.eks. svin er en anden opgave, der 10 af hensyn til økonomien ønskes løst inden for veterinærvidenskaben. Af særlig interesse er forøget udbytte opnået ved at forøge foderudnyttelseseffektiviteten. Foderudnyttelsen er hovedspørgsmålet i forbindelse med fodring af drøvtyggere. Mikroorganismer i dyrets vom 15 nedbryder kulhydrater til frembringelse af monosaccha- rider, og herefter omdannes disse monosaccharider til pyruvatforbindelser. Pyruvater metaboliseres ved mikrobiologiske processer til dannelse af acetater, buty-rater eller propionater, der fælles betegnes som flygtige 20 fede syrer. En mere detaljeret diskussion kan findes hos Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., udg., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, (1970), side 408-410.

Den relative effektivitet af udnyttelsen af flygtige 25 fede syrer er omtalt af McCullogh i "Feedstuffs", 19.

juni 1971, p. 19, Eskeland et al. i J. An. Sci., 33:282 (1971) og af Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", vol. 2, p. 622 og 625 (1971).

Selv om acetater og butyrater udnyttes, udnyttes propio-30 nater med større effektivitet. Yderligere kan dyrene, når der er for lidt propionat til rådighed, udvikle ketose. En gavnlig forbindelse stimulerer derfor dyrene til at producere en højere andel af propionater ud fra carbonhydrater, hvorved carbonhydratudnytteisen 35 forøges, og forekomsten af ketose reduceres.

DK 159451 B

4

En anden sygdom, der forårsager økonomiske tab hos husdyrproducenter, er forårsaget af den protozoiske parasit Theileria parva. Denne sygdom, theileriosis, betegnes også som "East Coast fever", "Coastal fever" eller 5 "Rhodesian tick fever". Theileria-parasitten invaderer, men ødelægger ikke de røde blodlegemer, hvilket forårsager akute eller kroniske febrile infektioner. Hos kvæg er sygdommen karakteriseret ved høj feber, opsvulmning af lymfeknuder, kraftig afmagring og høj dødelighed, ig Sygdommen er særdeles alvorlig i Øst- og Centralafrika.

Se yderligere "The Merck Veterinary Manual", Siegmund et al., Ed., Merck & Co., Rahway, N.J., 5th ed., side 431-433 (1979).

Opfindelsen angår som nævnt hidtil ukendte poly(cyc-15 lisk ether)-forbindelser med den i krav 1 angivne formel og farmaceutisk acceptable kationsalte deraf, som produceres ved neddykket aerob formering i vandige næringsmedier af mikroorganismen Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697, eller en mutant eller rekombinant 2o form deraf med væsentligt samme egenskaber. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 3's kendetegnende del angivne. Hovedkomponenten (R = R^ = H) af det producerede antibiotiske materiale, betegnet (JK-58852, og kationsaltene deraf er aktive overfor en 25 række forskellige mikroorganismer og er effektive til bekæmpelse af coccidiosis, enteritis, svinedysenteri og theileriosis samt effektive til at fremme væksten og forbedre foderudnyttelsen hos svin og drøvtyggere. Opfindelsen omfatter også to beslægtede komponenter,

30 betegnet CP-70228 (R = H, R1 = CH,), og CP-70828 (R

1 ^ = R = CH^), som produceres i mindre mængder ved forgæringen, og som også er antibiotika, der er effektive til bekæmpelse af coccidiosis. CP-70228 er også anvendelig til fremme af væksten og- forøgelse af foderudnyttelsen 35 hos svin og drøvtyggere.

DK 159451B

5

Foderblandingen ifølge opfindelsen til kvæg eller svin er ejendommelig ved det i krav 7's kendetegnende del angivne, og en fremgangsmåde ifølge opfindelsen til at fremme væksten og/eller forøge foderudnyttelsen hos 5 svin eller kvæg er ejendommelig ved det i krav 8's kendetegnende del angivne.

Foderblandingen ifølge opfindelsen til fjerkræ er ejendommelig ved det i krav 10's kendetegnende del angivne.

Den biologisk rene kultur ifølge opfindelsen er mikro-20 organismen, som i denne beskrivelse med krav betegnes Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697, og som anvendes til fremstilling af de antibiotiske forbindelser UK-58852, CP-70228 og CP-70828. Denne mikroorganisme blev isoleret fra en jordprøve indsamlet i Izumo 25 City, Shimane Prefecture, Japan. Man fandt, at det var en Actinomadura-art, på grund af de tynde hyfer, produktionen af lyftmycelium, at sporerne blev båret i kæder og forekomsten af madurose i hydrolysater af hele celler.

En kultur heraf, betegnet N596-33, blev overført fra 20 skåragar til ATCC nr. 172 bouillon og dyrket fire dage ved 28 °C på et rystebord. Herefter blev den centrifugeret i 20 minutter, vasket tre gange med sterilt destilleret vand og udsået på substrater, der sædvanligvis anvendes til identifikation af medlemmer af ac-25 tinomycetales som beskrevet nedenfor.

Kulturen blev inkuberet ved 28 °C, og resultaterne aflæst til forskellige tidspunkter, sædvanligvis efter 14 dage. Farverne er beskrevet i almindelig terminologi, med de nøjagtige farver bestemtes ved sammenlig-30 ning med farvestrimler fra Colour Harmony Manual, 4.

udgave. Metoderne til analyse af helcelle aminosyre og sukker er beskrevet i Becker et al., App. Microbiol., 12:421-423 (1964) og i Lechevalier, J. Lab.· Clin. Med., 71:934-944 (1968).

i DK 159451B

Identifikationssubstraterne anvendt til karakterisering af kulturen og omtale af deres sammensætning eller leverandør er følgende: 1. Gærekstrakt-maltekstrakt agar - (ISP substrat nr.

5 2, Difco).

2. Havremelsagar - (ISP substrat nr. 3, Difco).

3. Uorganiske salte-stivelsesagar - (ISP substrat nr.

4, Difco).

4. Glycerol-asparagin agar - (ISP substrat nr. 5, Difco) 10 5. Czapek-Sucrose agar - S.A. Waksman, The Actinomyce- t e s, vol. 2, substrat nr. 1, p. 32-8, 1961.

6. - Glucose-asparagin agar - Ibid, substra nr. 2, p.

328.

7. Bennett's agar - Ibid, substrat nr. 30, p. 331.

15 8. Emerson's agar - Ibid, substrat nr. 28, p. 331.

9. Næringsagar -Ibid, substrat nr. 14, p. 330.

10. Gordon & Smith's Tyrosin agar - R.E. Gordon og M.M. Smith, J. Bact., 69:147-150, 1955.

11. Kasein agar - Ibid.

20 12. Calciummalat agar - S.A. Waksman, Bact. Rev. 21: 1-29, 1957.

13. Gelatine agar - R.E. Gordon & J.M. Mihm, J. Bact., 73:15-27, 1957.

14. Stivelsesagar -Ibid.

25 15. Kartoffel-gulerodsagar - M.P. Lechevalier, J. Lab.

and Chinical Med., 71:934-944, 1968, men der anvendes kun 30 g kartofler, 2,5 g gulerødder og-20 g agar.

16. 2%'s Postevandsagar.

17. Gauze's Mineralsubstrat nr. 1 - G.F. Gauze et al., 30 Problems in the Classification of Antagonistic

Actinomycetes. English Ed., p. 13, 1957.

18. Gauze's Organiske substrat nr. 2 -Ibid.

19. Kartoffel-dextrose agar - skræl, snit og damp 100 g kartofler i 500 ml vand, filtrer gennem ostelærred, 33 tilsæt 10 g glucose, 50 ml kokosnøddemælk, 20 g agar _o.g..jiok vand indtil 1 liter.

20. Trypton-gærekstrakt boullion - (ISP substrat nr. 1,

Difco).

7 DK 159451B

21. Pepton-gærekstrakt jernagar - (ISP substrat nr. 6,

Di fco).

22. Organisk nitratboullion - R.E. Gordon & J.M. Mihm, J. Bact., 73:15-27, 1957.

5 23. Dextrose-nitrat boullion - S.A. Waksman, The Actino- mycetes, vol. 2, substrat nr. 1, p. 328, 1961, med 3 g dextrose i stedet for 30 g sucrose og uden agar.

24. Skummetmælk - Difco.

10 25. Celluloseudnyttelse - a) H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W., 55:231-248, 1930.

b) M. Levine & H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, substrat nr. 2511, 1030.

15 26. Kulhydrater - ISP substrat nr. 9, Difco: C-2 sub strat, H. Nonomura & Y. Ohara, J. Ferment. Technol-, 49 (11), 887-894, 1971.

27. Temperaturområde - ATCC substrat 172 i ATCC Culture Collection Catalogue, 15. udg., p. 608, 1982.

20 Undersøgelsen for vækst og organismens udseende var følgende: Gærekstrakt-maltekstrakt agar - god vækst, hvid, med lyserød til lyserød-rød farve (6ga, 6 l/2ea, 6 l/2ia), hævet, rynket, luftmycelium hvidt; bagside svag gullig til lyserød (2ea, 6ga): intet opløseligt pigment.

25 Havremelsaqar - moderat vækst, flødefarvet (1 l/2ca), let hævet, glat; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagsiden farveløs til flødefarvet (1 1/2 ca); intet opløseligt pigment.

Uorganiske salte-stivelsesaqar - dårlig vækst, farveløs 50 til svagt cremefarvet (nær 1 1/2 ca), tynd, glat; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagside farveløs til svagt flødefarvet (nær 1 l/2ca); intet opløseligt pigment.

Glycerol-asparaqin agar - væksten dårlig til moderat, farveløs, men svagt lyserød (5ca) nær kanten, tynd,

DK 159451 B

8 men svagt hævet nær kanten, glat; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagside farveløs til svag lyserød (5ca); intet opløseligt pigment. .

Czapek-sucrose agar - moderat vækst, svagt lyserød, 5 gråliggul til rød (5ca, 2gc, 6 l/2ia), svagt hævet, glat; intet til lidt luftmycelium, kun synligt under mikroskop; bagside som forside; intet opløseligt pigment.

Glucose-asparaqin agar - moderat vækst, grågul, gullig-brun til rød (2ic, 3nc, 7 l/2ia, 7 l/21a), moderat hæ-10 vet, glat, med nogle få klumper; intet til ringe luftmy celium, hvidt; bagside som forside; opløseligt pigment flødefarvet (2ca).

Bennett's agar - god vækst, gråliggul (2gc, 2ie) med svagt lyserød kant (5ca), hævet, rynket, med revner i visse områder; intet til ringe luftmycelium, hvidt; bagside som forside; opløseligt pigment gråliggult (2ic).

Emerson's agar - god vækst, svagt gullig, grå til mørkebrun (2gc, nær grå rækker 3fe, 31i, 3ni), hævet, rynket; kort luftmycelium, hvidt; bagside mørkebrun til gullig 20 (31i, 41i, 2g.c); gulligt... opløseligt pigment (21c)..

Næringsaqar - moderat vækst, orange (5ea, 5ga)~7 tynd til svagt hævet, glat; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagside orange (5ga); intet opløseligt pigment.

Gordon & Smith's tyrosin agar - vækst moderat til god, 25 brun til mørkebrun (31e, 31g, 3ni), moderat hævet, glat til lidt granulært, med revner i et enkelt strøg; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagside som forside; opløseligt pigment gulligbrunt (31c).

Casein agar - vækst moderat til god, svagt lyserød (5ca, 30 5ea), let hævet, glat til rynket; intet luftmycelium eller lidt nær kanten, hvidt; bagside svagt gullig til svagt lyserød (2ca, 2ea, 5ca); opløseligt pigment

DK 159451 B

9 gulligbrunt (31c).

Calciummalat agar - vækst moderat, flødefarvet (2ca) til hvid, forekommer som isolerede kolonier, hævet, 5 glat, hvidt luftmycelium; bagside flødefarvet (2ea, 2ca); intet opløseligt pigment.

Gelatine agar - moderat vækst, flødefarvet til mørk gullig (2ea, 2ic), let hævet, glat til lidt granulær; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagside svagt gullig (2ea); intet opløseligt pigment.

10

Stivelsesaqar - vækst moderat til god, flødefarvet (2ca, 2ea), moderat hævet, glat til lidt granulært; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagsiden flødefarvet (2ca, 2ea); intet opløseligt pigment.

13 Kartoffel-qulerodsaqar - moderat vækst, flødefarvet (2ca), let hævet, glat; intet til kun lidt luftmycelium, hvidt; bagside flødefarvet (2ca); intet opløseligt pigment .

Postevandsaqar - dårlig vækst, farveløs til svagt fløde-20 farvet (1 l/2ca), tynd, glat, intet luftmycelium; bag side farveløs; intet opløseligt pigment.

Gauze's mineralsubstrat 1 - moderat vækst, flødefarvet, gulgrøn til lyserød-rød (2ca, 1 l/2gc, 1 l/2ic, 5ca, 6ia, 6ga, 61a), tynd, glat med nogle få pletter af luft-25 mycelium; bagside som forside; intet opløseligt pigment.

Gauze's organiske substrat 2 - moderat vækst til god, lyserød-orange (4ea), moderat hævet, glat til lidt

DK 159451 B

10 rynket nær kanten; kort luftmycelium, hvidt; bagside som forside; intet opløseligt pigment.

Kartoffel-dextrose agar - god vækst, mørk gullig, lyserød 5 til rød (2ic, 6ea, 6 1/2 nc), hævet, rynket, luftmyceli um hvidt til lyserødt (6ea); bagside mørk gullig, rød til mørkerød (2ic, 6 l/2nc, 6 l/2ni); svagt gulligt opløseligt pigment (2ea).

Morfologiske egenskaber - de følgende morfologiske egen-10 skaber blev iagttaget på^’uorganiske salte-stivelse-agar efter 21 dages inkubation: sporemassen i hvidfarvede rækker; sporoforer monopodialt forgrenet; sporekæder bøjede eller bølgede, af og til knyttet sammen, irregulært kurvede eller meget løst snoet op i indtil 3 snoninger, 15 10 til 30 sporer pr. sporekæde; sporer ovale til ellipse formede, sjældent runde, 1,1-1,6 x 0,7-1,0 ^um eller 0,7-1,0 yum i diameter; vortede, når man undersøger i elektronmikroskop.

Biokemiske egenskaber - melanin produceres ikke i tryp-20 ton-gærekstrakt-væske; hydrogensulfid produceres ikke på pepton-gærekstrakt-jern-agar; gelatine bliver flydende; stivelse hydrolyseres ikke; nitrat reduceres til nitrit — - båd_e i organisk-nitrat-væske og dextrosenitrat-væske; ..ja ingen vækst og ingen dekomponering på begge cellulose-25 medier; klaring og ingen koagulation på mælk; casein- nedbrydning positiv; nedbrydning af calciummalat positiv; tyrosinnedbrydning svagt positiv. Carbonhydratudnytteisen var den samme på ISP substrat nr. 9 og Nonomura og Ohara's C-2 substrat: glucose og rhamnose forbrugtes; sucrose 30 svagt forbrugt; tvivl om forbrug af fructose; arabinose, s inositol, mannitol, raffinose og xylose ikke forbrugt.

DK 159451B

11

Analyse af hele celler - hel-celle-lysaterne indeholdt meso-diaminopimelinsyre, madurose, galactose, glucose, rhamnose og ribose.

Temperaturforhold - afhængigheden mellem temperatur 5 og væksthastighed blev iagttaget at være som følger:

210 C 28°C 37°C 45°C

God God Moderat Ingen vækst vækst vækst til god vækst 10 Mikroorganismen er karakteriseret ved dens evne til at frembringe melanin, bøjelige til bølgeformede spore-kæder med vortede sporer og tilstedeværelsen af meso-diaminopimelinsyre og madurose som helcellekomponenter.

Dersom der produceres luftmycelium, er det rudimentært 15 og på visse substrater kun synligt under mikroskop.

Farven på luftmyceliet er hvid, men kan være lyserød på kartoffel-dextrose agar. Det vegetative mycelium er distinkt og viser en vis afskygning af rødt på gær-ekstrakt-maltekstrakt agar, Czapek-sucrose agar, glucose-20 asparagin agar, Gauze's organiske substrat nr. 1 og kartoffel-destrose agar. Kulturer frembringer ikke sporer på de fleste anvendte substrater. På uorganiske saltestivelsesagar, havremelsagar og Gauze's mineralsubstrat nr. 1 frembringer de sporer i form af nogle få, små, 25 ophævede hvide pletter.

De morfologiske og biokemiske egenskaber placerer mikroorganismen inden for slægten Actinomadura. Imidlertid er organismen forskellig fra alle mulige andre beslægtede arter, og er derfor en ny art af denne slægt. I den 30 foreliggende beskrivelse med krav betegnes den som Actino madura roseorufa Huang sp. nov. Det specifikke adjektiv

DK 159451 B

12 henfører til det lyserøde, lyserøde-røde eller røde substratmycelium fra kulturen. Kulturen deraf, N596-33, blev deponeret i American Type Culture Collection; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA under 5 Budapesttraktatens bestemmelser den 24. maj 1984 under registreringsnummeret ATCC 39697.

Dyrkning af Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697 og isolering af antibiotika UK-58852, CP-70228 og CP-70828 kan udføres under betingelser mage til dem, 10 der blev anvendt ved tidligere gæringer- til opnåelse af polyether-antibiotika; se f.eks. US Patentskrift nr. 4 361 649. Dyrkningen foretages sædvanligvis i vandige næringsmedier under neddykkede aerobe betingelser under omrøring ved en temperatur på 24° til 36°C. Nærings-15 medier, der er anvendelige til dyrkningen, omfatter en kilde til assimilerbart carbon, såsom sukkerarter, stivelsesarter og glycerol; en kilde til organisk nitrogen, såsom casein, enzymatisk nedbrudt casein, soya-bønnemel, bomuldsfrømel, jordnøddemel, hvedegluten, 20 soyamel, kødmel og fiskemel. En kilde til vækststoffer såsom "grain solubles", fiskemel, bomuldsfrømel og gær-ekstrakt, såvel som mineralsalte, såsom natriumchlorid og calciumcarbonat, og sporstoffer, såsom jern, magnesium, kobber, zink, cobalt og mangan, kan også anvendes med 25 fordelagtige resultater. Dersom der sker for "megen - skumning under gæringen, kan antiskummidler, såsom vegetabilske olier eller siliconer sættes til gærings-mediet. Beluftning af mediet i tanke til neddykket vækst opretholdes fortrinsvis med en hastighed på ca. 1/2 30 til 2 rumfang steril almindelig luft pr. rumfang gæ ringsvæske pr. minut tvunget ind i væsken gennem en spreder. Omrøring kan opretholdes ved hjælp af omrørere, der er almindeligt kendt af fagfolk. Omrøringshastigheden afhænger af den anvendte type omrører. En ryste-35 kolbe behandles sædvanligvis med 150-200 slag pr. minut,

DK 159451 B

13 medens en fermenter sædvanligvis roteres med 300-1700 omdrejninger pr. minut. Aseptiske betingelser skal naturligvis opretholdes under overførslen af organismen og under dennes vækst.

5 Inokulum til fremstilling af de omhandlede antibiotika kan fås ved at anvende vækst fra en skråagar af kulturen eller Roux-flasker inokuleret med kulturen. Et fast medium, der er velegnet til organismens første vækst på skråagar og i Roux-flasker, er ATCC-medium nr. 172.

10 Væksten kan anvendes til at inokulere enten rystekolber eller inokulumtanke, eller inokulumtanke kan tilsås fra rystekolberne. Væksten i rystekolberne vil generelt have nået sit maksimum i løbet af 4-5 dage, medens inokulum i neddykkede inokulumtanke sædvanligvis vil være 15 i den mest fordelagtige periode efter 5-6 dage.

Fremadskriden af antibiotikumproduktionen under gæringen og gæringsvæskens bioaktivitet kan kontrolleres ved biologisk undersøgelse af væsken, idet der anvendes en følsom stamme af Staphylococcus aureus eller Bacillus 20 subtilis. B. subtilis ATCC 6633 er en velegnet stamme til dette formål. Der anvendes en standard-pladeunder-søgelsesmetode, hvorved hæmningszonen rundt om en filtrerpapirskive mættet med gæringsvæske anvendes som et mål for den antibiotiske aktivitet. Også tyndtlags-25 chromatografi under anvendelse af silica gel, er et nyttigt redskab til detektering af antibiotika produceret i gæringsmedier og til analyse af sammensætningen af rå og rensede materialer ekstraheret fra gærings-væskerne. Chromatogrammerne fremkaldes med ethylacetat, 30 og de antibiotiske forbindelser synliggøres ved påsprøjt- ning af vanillinreagens og opvarmning af TLC-pladen til 80 °C. Den fremkaldte plade kan også overdækkes med agar podet med enten S. aureus eller B. subtilis og inkuberes ved 37 °C i 16 timer for at synliggøre

DK 159451B

14 de antibiotiske forbindelser.

Antibiotikum UK-58852, der frembringes ved gæringen af Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697, kan fraskilles og udvindes ved ekstraktion af den hele, 5 ufiltrerede gæringsvæske med et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, ethylacetat, methylisobutylketon eller butanol, ved den naturligt forekommende pH-værdi. Alternativt kan myceliet fraskilles, efter at væksten er fuldendt, og myceliet kan ekstraheres med-et organisk 10 oplysningsmiddel. Opløsningsmiddelekstrakten-kan herefter koncentreres til en tynd sirup, og den rene antibiotiske forbindelse fås ved chromatografi.

De mindre betydelige komponenter, CP-70228 og CP-70828, udvindes ved yderligere chromatografi af modervæskerne.

15 En typisk metode til fraskillelse og udvinding af de antibiotiske forbindelser ifølge opfindelsen er følgende:

Hele gæringsvæsken fra gæringen af Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697 ekstraheres med methylisobutylketon. Opløsningsmiddelekstrakten giver en mørk 20 olie ved afdampning af opløsningsmidlet under vakuum.

Olien opløses i hexan, og der udhældes på et leje af silica gel. Silicagel-kuglerne vaskes gentagne gange med hexan, hvorefter der elueres med chloroform, chlo-roform/ethylacetat og ethylacetat. Eluaterne undersøges 25 ved tyndtlagschromatografi. Fraktioner, der indeholder antibiotikum UK-58852 slås sammen og inddampes til tørhed. Produktfraktionen kan om ønsket renses yderligere ved krystallisation eller ved søjlechromatografi. Cyc-loserin produceres sammen med antibiotikum UK-58852, 30 men på grund af deres ringe opløselighed i opløsnings midlet, forstyrrer det -ikke udvindelsen af antibiotikum UK-58852.

DK 159451 B

15

De to komponenter, CP-70228 og CP-70828, udvindes ved yderligere eluering af søjlen, idet der anvendes et mere polært opløsningsmiddelsystem. De rå produkter kan om nødvendigt renses ved yderligere chromatografi.

5 Desuden produceres antibiotikum CP-70228, når den frie syreform af UK-58852 får lov at stå i methanolisk opløsning .

De antibiotiske forbindelser ifølge opfindelsen er sure, og vil danne kationsalte ved omsætning med basiske midler.

10 Opfindelsen angår også sådanne farmaceutisk acceptable kationsalte. Disse salte fremstilles ved konventionelle metoder for (ionophore)-polyether antibiotika. Ved én metode vaskes en opløsning af den antibiotiske forbindelse i et flygtigt, med vand ublandbart, organisk opløsnings-15 middel med en vandig opløsning indeholdende mindst et støkiometrisk ækvivalent og fortrinsvis et overskud af det passende basiske middel. Efter tørring af den organiske opløsning inddampes denne i vakuum, hvorved man opnår det ønskede kationsalt. Typiske basiske midler, 20 der kan anvendes til dette formål, omfatter alkalimetal- hydroxider, såsom natriumhydroxid og kaliumhydroxid, jordalkalimetalhydroxider, såsom calciumhydroxid og bariumhydroxid, og ammoniumhydroxid.

Røntgenanalyse af sølvsaltet af antibiotikum UK-58852 25 og analytiske og spektrale data for CP-70228 og CP-70828 angiver, at forbindelserne har følgende opbygning:

DK 159451B

- 16 ΛΑ«, jCCCH3 _0 T aR 3 / '°"X^CK3 fi 0 aYl > j / \ / —L Jm.n ca^ ' j oh h 1 a 0 ΓΊΝ'Ι I <r A a a χ

COOH CH3 CH3 H CH3 κ H ^ ” 0R

UK-58852: R = H, R1 = H

CP-70228: R = H R1 = CH3 CP-70828: R = CH3 R1 = CHr

Antibiotikum UK-58852 udviser hæmmende virkning over for væksten af en hel række Gram-positive mikroorganismer. I tabel I neden for er opgivet resultaterne af in vitro afprøvninger. Til denne afprøvning inokuleres 5 hver organisme i en række reagensglas, der indeholder næringsmedium og varierende koncentrationer af__anti-biotikum UK-58852 for at bestemme den minimale koncentration af forbindelsen i pg/ml, der hæmmer væksten af organismen over en periode på 24 timer (MIC).

DK 159451 B

17

TABEL I

ANTIBAKTERIEL VIRKNING

Organisme Stamme MIC, pg/ml antibiotikum nr. UK-58852 (natriumsalt)

Staphylococcus aureus 01A005 3,12 01A052 3,12 01A110 3,12 01A400 6,25 10 Streptococcus faecalis 02A006 >50

Streptococcus pyogenes 020303 0,05

Actinomyces pyogenes 14D011 ,£0,08

Actinobacillus pleuropneumoniae 44B004 } 25 15 Pasteurella multocida 59A006 >200

Clostridium perfringens 10A009 0,79

Bacteroides fragilis 78C024 0,10 F usobacterium necrophorum 84C004 >25 ^ Treponema hyodysenteriae 94A007 0,39

Overfor de Gram-negative bakterier som f.eks. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,

Serratia marcescens og Enterobacteriaceae aerogenes, var MIC-værdierne >50 i hvert tilfælde.

25

Antibiotikum UK-58852 og dets kationsalte udviser glimrende virkning overfor coccidiale infektioner hos fjerkræ. Dersom forbindelserne inkorporeres i kyllingefoderet i niveauer på 25-150 ppm, kan disse forbindelser effektivt 30 bekæmpe infektioner, der skyldes Eimeria tenella, E.

acervulina, E. maxima, E. brunetti og E.necatrix.

DK 159451B

18

Effektivitetsresultater for antibiotikum UK-58852 og salte heraf overfor coccidiale infektioner hos kyllinger blev opnået på følgende måde. Grupper på 3-5 ti dage gamle patogenfri hvide italiener hankyllinger blev fodret 5 med en formalet diæt indeholdende antibiotikum UK-58852 eller dens natrium- og/eller kaliumsalt ensartet dis-pergeret heri. Efter at være holdt på dette foder i 24 timer inokuleredes hver kylling per os med oocyster af den pågældende art af Eimeria, der skulle undersøges.

10 Andre grupper på 3-5 ti dage gamle kyllinger blev fodret på samme måde uden antibiotikum UK-58852 eller dens salte. Disse inficeredes også 24 timer efter og tjente som inficerede kontroller. Endnu en gruppe på 3-5 ti dage gamle kyllinger blev fodret med samme foder uden 15 antibiotikum UK-58852 og blev ikke inficeret med cocci-dier. Disse tjente som normale kontroller. Resultaterne af behandlingen blev bedømt efter 5 dage, når det drejede sig om E. acervulina, og efter 6 dage for de andre belastninger.

20 De kriterier, der anvendtes til at måle den anticoccidiale virkning, bestod af læsionskarakterer fra 0 til 4 for E. tenella efter J.E. Lynch "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res., 22:324-326, 1961, og fra 0 til 3 for de andre arter 25 baseret på en modifikation af karaktersystemet, der er angivet af J. Johnson og W.H. Reid "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit., 28:30-36, 1970. Et konstant forhold blev opnået ved at dividere 30 læsionskaraktererne for hver behandlet gruppe med læ sionskaraktererne for den inficerede kontrolgruppe.

Tabel II opsummerer de opnåede resultater.

19

DK 1S9451B

TABEL II

IN VIVO ANTICOCCIDIAL VIRKNING

Dosis Gennemsnits- Vægtfor-

Infektionsart (ppm i foder) grad af øgelse _ __infektion_(%_)_

Eimeria tenella 150 0,0 0 125 0,0 4 100 0,0 8 75 0,0 28 50 0,0 45 25 0,0 93

Eimeria acervulina 150 0,0 0 125 0,0 0 100 0,0 23 75 0,0 0 50 0,0 62 25 0,0 98 Værdien af dyrefodere er almindeligvis blevet bestemt direkte ved fodring af dyrene. GB patentskrift nr. 1 197 826 beskriver i detaljer en in vitro rumenmetode, hvorved de forandringer i fodere, der frembringes af 5 mikroorganismer, måles lettere og med større nøjagtighed ved bedømmelsen af dyrefodere. Denne teknik indebærer anvendelsen af et apparat, hvori dyrenes fordøjelsesprocesser gennemføres og undersøges in vitro. Dyrefo-derne, rumeninokulum og forskellige vækstfremmende stof-10 fer indføres i og udtages fra en laboratorieenhed under omhyggeligt kontrollerede betingelser, og de forandringer, der har fundet sted, studeres kritisk og fremadskridende under mikroorganismernes forbrug af foderet. En forøgelse i rumenvæskens propionsyreindhold angiver, at der

DK 159451 B

20 er blevet frembragt et ønskeligt respons i den totale drøvtyggeropførsel ved hjælp af de vækstfremmende stoffer i foderblandingen. Ændringen i propionsyreindhold udtrykkes som procent af det propionsyreindhold, der findes 5 i kontrolrumenvæsken. Langtids in vivo fodringsunder søgelser anvendes til at påvise en pålidelig korrelation mellem stigning i propionsyre i rumenvæsken og forbedret dyreydelse.

Rumenvæske opsamles fra en fistuleret ko, der fodres 10 på kommercielt opfedningsfoder plus hø. Rumenvæsken filtreres straks gennem ostelærred, og 10 ml sættes til en konisk kolbe indeholdende 400 mg standardsubstrat (68¾ majsstivelse + 17¾ cellulose + 15¾ ekstraheret soyabønnemel), 10 ml af en pH 6,8 puffer og prøvefor-15 bindeisen. Kolberne gennemskylles med oxygenfrit nitrogen i ca. 2 minutter og inkuberes i rystevandbad ved 39 °C i ca. 16 timer. Alle forsøgene udføres som tredobbelte forsøg.

Efter inkubationen blandes 5 ml af prøven med 1 ml 25¾ 20 metaphosphorsyre. Efter 10 minutters forløb tilsættes 0,25 ml myresyre, og blandingen centrifugeres i 10 minutter ved 1500 omdrejninger/minut. Herefter analyseres prøver ved gas-væskechromatografi ved den metode, der er beskrevet af D.W. Kellog, J. Dairy Science, 52:1690, 25 1969. Tophøjder for eddikesyre, propionsyre og smørsyre bestemmes for prøver fra ubehandlede og behandlede inkubationskolber .

Afprøvet ved denne in vitro metode gav antibiotikum UK-58852 i en mængde på 10 mg pr. ml anledning til en 30 forøgelse på ca. 93¾ i produktionen af propionsyre i forhold til den mængde, der produceres i kontrolopløsningen uden tilsat antibiotikum UK-58852. Til sammenligning frembragte den kommercielt tilgængelige forbin-

DK 159451 B

21 delse salinomycin [et andet poly(cyclisk ether)-anti-biotikum] ved 10 pg/ml ca. 88% forøgelse af propionsyre i forhold til kontrollen. I et separat forsøg bevirker antibiotikum CP-70228 i en mængde på 10 yjg/ml en forøgelse 5 på ca. 30% i propionsyreproduktionen sammenlignet med en forøgelse på ca. 40% ved anvendelse af salinomycin i en mængde på 10 jjg/ml.

Disse resultater viser, at antibiotika UK-58852 og CP-70228 vil forbedre foderudnyttelsen hos drøvtyggere 10 som f.eks. kvæg og får. Forbindelserne vil også have en lignende virkning på en-mavede dyr som f.eks. svin og kaniner. Antibiotika UK-58852 og CP-70228 kan inkorporeres i foderblander i form af den frie syre, som natriumsaltet, som kaliumsaltet eller som blandinger 15 heraf. Urensede former af antibiotikum UK-58852 eller CP-70228 eller tørret gæringsvæske indeholdende de antibiotiske forbindelser kan også inkorporeres i foder-præparater i de ønskede koncentrationer.

Den antibakterielle virkning in vitro af de to anti-20 biotiske forbindelser CP-70228 og CP-70828 er sammen fattet i tabel III.

DK 159451B

22

TABEL III

ANTIBAKTERIEL VIRKNING MIC, jjq/ml

Stamme CP-70228 CP-70828 5 Organisme nr. Natriumsalt Natriumsalt

Staphylococcus aureus 01A005 3,12 25 01A052 3,12 25 01A110 3,12 25 01A400 6,25 25 10 Streptococcus faecalis 02A006 50 ^50

Streptococcus pyogenes 020203 0,10 3,12

Actinomyces pyogenes 14D011 0,34

Actinobacillus pleuropneumoniae 54B004 >100 15 Pasteurella multocida 59A006 >100

Clostridium perfringens 10A009 1,58

Bacteroides fragilis 78C024 12,5

Fusobacterium necrophorum 84C004 >100 20 Treponema hyodysenteriae 94A007 1,58

Overfor Gram-negative bakterier som f.eks. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,

Serratia marcescens og Enterobacteriaceae aerogenes, er MIC værdierne i hvert tilfælde 50.

25 Effektivitetsdata for antibiotikum CP-70228 overfor coccidiale infektioner hos kyllinger efter de tidligere beskrevne procedurer er sammenfattet i tabel IV.

DK 159451 B

23

TABEL IV

IN VIVO ANTICOCCIDIAL VIRKNING CP-70228

Dosis Gennemsnits- Vægtfor- 5 Infektionsart (ppm i foder) grad af in- øgelse fektion (%)

Eimeria tenella 100 0,0 93 75 0,3 63 50 1,3 103 10 25 2,7 80

Eimeria acervulina 100 0,0 100 75 0,0 100 50 0,0 70 25 1,2 40 15 Opfindelsen illustreres yderligere i de følgende eksemp ler .

^1

DK 159451 B

24 EKSEMPEL 1 1. Fremstilling af inokulum

Der blev fremstillet et sterilt vandigt medium med følgende sammensætning 5 Ingrediens Gram/liter

Glucose 20

Soyamel 10 "NZ Amine YTT"* 5

Natriumsulfat 0,5 10 Cobaltchlorid 0,002

Calciumcarbonat 2 100 ml medium blev fordelt i 300 ml rystekolber og steriliseret ved 120 °C og 1 atm. i 30 minutter. Efter afkøling blev mediet inokuleret med en vegetativ cellesuspension 15 fra en skråkultur af Actinomadura sp. ATCC 39697 (N596-33).

Kolberne blev rystet ved 28 °C på en roterende ryster med en vandring på 3,8-6,4 cm og 150-200 omdrejninger pr. minut i 3-5 dage.

20 Det fremstillede inokulum blev anvendt til at inokulere produktionsgæringsmediet.

Følgende medium blev også anvendt til fremstilling af inokulum, som gav de samme resultater ved produktions-gæringen .

25 Ingrediens Gram/liter

Cerelose 10

Majsstivelse 5

Majsstøbevæske 5 "NZ Amine YTT"* 5 30 Cobaltchlorid 0,002

Calciumcarbonat 3

DK 159451B

25 *Varemærke for enzymatisk nedbrydningsprodukt af casein,

Humko Sheffield Chemical Co. Inc.

2. Gæring og isolering af UK-58852

En rystekolbe indeholdende det dyrkede inokulum anvendes 5 til at inkubere en 5 liters gæringsbeholder indeholdende 3 liter sterilt medium med følgende sammensætning, hvortil 1 ml silicone antiskummiddel var tilsat:

Ingrediens Gram/liter

Cerelose 10,0 10 Majsstivelse 20,0 "NZ Amine YTT" 5,0

Hvedekim 5,0

Calciumcarbonat 4,0

Vand til 1 liter 15 pH 6,9-7,0 Gæring udførtes ved 30°C under omrøring med 1700 omdrejninger pr. minut og beluftning med et rumfang luft pr. rumfang væske pr. minut, indtil der blev observeret væsentlig aktivitet (baseret på prøvning med antibiotisk 20 skive overfor B. subtilis ATCC 6633), sædvanligvis 4-6 dage. Bioaktiviteten af gæringsvæsken og af efterfølgende udvindingsstrømme blev fulgt ved at anvende en følsom stamme af Bacillus subtilis ATCC 6633 eller Staphylococcus aureus ATCC 6538. Den antibiotiske komponent i gærings-25 væsken og udvindingsstrømmene blev synliggjort under anvendelse af silicagel-plader, der blev fremkaldt med ethylacetat. Pladerne blev sprøjtet med vanillinrea-gens (3 g vanillin i 75 ml ethanol og 25 ml 85¾ phos-phorsyre) og opvarmet til 80 °C. Antibiotikum UK-58852 30 viser sig som en orange til rød plet.

Alternativt kan pladen dækkes med agar, der er podet med enten S. aureus eller B. subtilis, hvortil er sat

DK 159451B

26 1,0 ml af en 1 % opløsning af 2,3,5-triphenyl-2H-tetra-zoliumchlorid, og der inkuberes ved 37 °C i 16 timer for at synliggøre den antibiotiske forbindelse som et hvidt område en lyserød baggrund.

5 Efter afslutning af denne periode blev hele gæringsvæs ken ekstraheret med methylisobutylketon, og den organiske opløsning blev fra og koncentreret til opnåelse af 35 g remanens. Remanensen blev opslæmmet i hexan og behandlet batchvis med silicagel på en filtertragt.

10 Absorbanten blev vasket med hexan og derpå elueret med chloroform, ethylacetat og acetone. Aktiviteten var i ethylacetatfraktionen (20 g). Denne blev koncentreret, remanensen blev chromatograferet igen på siliciumdioxid, og produktet krystalliseret fra heptan, hvilket gav 15 antibiotikum UK-58852 som et hvidt fast stof (udbytte 80 mg), der var identisk med produktet fra eksempel 2.

EKSEMPEL 2

Fremgangsmåden fra eksempel 1 anvendes, men der anvendes 20 følgende medium til gæringen:

Ingrediens Gram/liter

Cerelose 10

Majsstivelse 5

Majsstøbevæske 5 25 cobaltchlorid 0,002 "NZ Amine YTT" 5

Calciumcarbonat 3

Al gæringsvæsken fra 10 ganges gæring af en kultur af Actinomadura sp. ATCC 39697 (et totalrumfang på omtrent 30 25 liter) blev ekstraheret med en trediedel rumfang methylisobutylketon. Ekstrakten blev under vakuum koncentreret til en brun olie (35 g). Dette materiale blev

DK 159451 B

27 chromatograferet på en 5 x 100 cm søjle pakket med søjlekvalitet af silicagel G (maskevidde 63-212 un, Woelm) i chloroformacetone (3:1). Søjlen blev udviklet med chloroform/acetone (3:1) med en strømningshastighed 5 på 10 ml/minut. Der udtoges fraktioner på 10 ml hver.

Fraktionerne blev undersøgt ved hjælp af tyndtlagschroma-tografi på "Analtech silica gel GF" plader, der blev udviklet i ethylacetat. Pladerne blev sprøjtet med 3% vanillin i ethanol-85% phosphorsyre (3:1) og opvarmet 10 til 80°C. Den ønskede antibiotiske forbindelse UK-58852 fremkommer som en rød plet under disse betingelser.

De fraktioner, der indeholdt antibiotikum UK-58852, blev slået sammen (totalrumfang omtrent 350 ml) og omrørt med 2 g "Darco G60" carbon i 5 minutter. Blandingen 15 blev filtreret og inddampet i vakuum. Den gule olie, der blev tilbage efter inddampning, blev opløst i 100 ml chloroform og omrørt med samme rumfang vand, og pH indstillet til 4,0 med phosphorsyre. Faserne adskiltes, og chloroformfasen omrørtes med samme rumfang 5% di-20 basisk natriumphosphat puffer, og pH blev indstillet til 9,0 med 1 N natriumhydroxidopløsning. Faserne blev adskilt, og chloroformfasen tørret over vandfrit natriumsulfat, hvorefter den blev inddampet i vakuum.

Den gule viskøse olie, der blev tilbage efter inddampning, 25 opløstes i et lille rumfang heptan, hvorefter der skete krystallisation. Krystallerne lev frafiltreret og tørret i vakuum, hvorved der blev opnået 3,5 g af den antibiotiske forbindelse UK-58852 i form af natriumsaltet med smeltepunkt 182-183°C. Fundet: 30 C,60,90; H, 8,32; c52H87°18Na kræver C 61,06; H 8,51. Ultraviolet spektrum viste kun uspecifik absorption ved enden af spektret. Optisk drejning [a]n = +10° (c = 0,5, methanol). Infrarødt spektrum (KBr) cm : 3423, 2966, 2928, 2869, 2821, 1613, 1453, 1407, 1377, 1361,

DK 159451 B

28 1312, 1257, 1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1093, 1064, 1030, 983, 969, 938, 919, 886.

Den frie syreform af antibiotikum UK-58852 blev fremstillet ved at omrøre en chloroformopløsning af natrium-5 saltet af UK-58852 med samme rumfang vand og sænke pH til 3,0 med phosphorsyre. Herefter adskiltes faserne, og chloroformfasen blev inddampet i vakuum, hvorved der blev opnået antibiotikum UK-58852 som den frie syre med smeltepunkt 123-126°C. Det ultraviolette spektrum 10 viste kun endeabsorption. Optisk drejning [a]p = +40° (c = 0/5, chloroform).

EKSEMPEL 3

En 6435 liters gæringsbeholder indeholdende 3785 liters sterilt medium med følgende sammensætning blev inoku-15 leret med 1 liter af et inokulum af Actinomadura sp.

ATCC 39697 fremstillet som beskrevet i eksempel 1.

Gærinqsmedium

Ingrediens Gram/liter

Cerelose 10 20 Majsstivelse 5

Majsstøbevand 5

Cobaltchlorid 0,002 "NZ Amine YTT" 5

Calciumcarbonat 3 25 Gæringsbeholderen blev holdt ved 28 °C under beluftning og omrøring med 1700 omdrejninger pr. minut. Efter 296 timer blev hele gæringsvæsken ekstraheret med 1136 liter og derefter 757 liter methylisobutylketon. Opløsningsmiddelekstrakterne blev skilt fra, kombineret og 30 koncentreret i vakuum til 10 liter af en brun olie.

Ekstrakten blev tritureret ved omrøring med methanol i 5 minutter. Methanolfasen blev skilt fra og olien

DK 159451 B

29 omrørt med yderligere 6 liter methanol. Methanolfrektionerne blev kombineret og inddampet i vakuum (4 liter).

En liter af methanolkoncentratet blev opløst i 2 liter hexan og udhældt på et leje bestående af 3 kg silicagel 5 af søjlekvalitet i et Lapp filter. Silicagelen blev vasket først med hexan (11 liter), derefter med chloroform (7,5 liter) og endelig med ethylacetat (7,5 liter). Fraktionerne blev undersøgt ved hjælp af tyndtlagschro-matografi. Forbindelsen viste sig at være i chloroform-10 og ethylacetatfraktionerne. Chloroform- og ethylace- tatfraktionerne blev begge vasket med vand indeholdende phosphorsyre til pH 4 og herefter med 5 % dibasisk-na-triumphosphat-puffer (indstillet til pH 9,5 med 1 N natriumhydroxid). Herefter blev opløsningsmiddelfrak-15 tionerne tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet i vakuum. Den olieagtige remanens, der blev tilbage efter inddampningen, blev optaget i en lille mængde hexan, hvorefter der skete krystallisation. Krytallerne blev opsamlet ved filtrering. De resterende 3 liter 20 methanolkoncentrat blev behandlets som beskrevet oven for, og krystallernr fra alle fire behandlinger blev kombinrtry, hvilket gav 300 g antibiotikum UK-58852 som natriumsaltet.

EKSEMPEL 4 25 Isolering af CP-70228 fra gærinqsmodervæsken 25 g modervæske fra en UK-58852 udkrystallisation blev chromatograferet på en 50 mm x 1 m søjle pakket med silicagel af søjlekvalitet i en blanding af chloroform og acetone (4:1). Søjlen blev elueret med 10 ml/minut 30 af det samme opløsningsmiddel, idet man udtog 10 ml fraktioner. Chromatografiens fremadskriden blev kontrolleret ved hjælp af tyndtlagschromatografi. UK-58852 fandtes i fraktionerne 95-230. Efter 300 fraktioner

DK 159451 B

30 tilsattes 25% methanol til systemet, og elueringen fortsattes gennem yderligere 2 liter. CP-70228 fandtes i disse fraktioner, der blev inddampet, hvorved der blev opnået 4,5 g af en gul olie. Dette materiale blev yder-5 ligere chromatograferet på en 25 mm x 50 cm søjle af "Sephadei^LH-20" i methanol. Strømningshastigheden var 1 ml/minut, og fraktioner blev udtaget hvert femte minut. Fraktioner, der ved tyndtlagschromatografi viste sig at indeholde CP-70228, blev inddampet til opnåelse 10 af 1,3 g af en gul olie. Dette koncentrat blev atter chromatograferet på en 25 mm x 50 cm søjle, der var pakket med silicagel af søjlekvalitet i chloroform indeholdende 2,5¾ methanol. Søjlen blev kørt med 5 ml/minut, og fraktioner blev udtaget hvert andet minut. Fraktioner, 15 der ved tyndtlagschromatografi viste sig at indeholde CP-70228, blev kombineret og inddampet, hvilket gav 100 mg fast hvidt CP-70228 med smeltepunkt 113-123°C.

Fundet: C 62,63; H 8,82. dræver ^ 62,70; H

8,94¾. Ultraviolet spektrum: ingen absorption. Optisk 20 drejning : [ ce ] ^ = +21,8° (c = 0,5, methanol). Infrarødt spektrum (KBr) cm-1: 3439, 2970, 2933, 2877, 1716, 1636, 1457, 1380, 1318, 1293, 1240, 1218, 1165, 1117, 1097, 1069, 1032, 989, 975, 940, 912, 897, 859.

EKSEMPEL 5 25 Omdannelse af UK-58852 til CP-70228 natriumsalt 11 g UK-58852 fri syre blev opløst i 200 ml methanol og fik lov at stå ved stuetemperatur. Tyndtlagschromatografi af opløsningen efter 1 times forløb viste fuldstændig omdannelse af UK-58852 til CP-70228. Metha-30 nolet blev afdampet i vakuum, og koncentratet opløst i 200 ml chloroform. Chloroformopløsningen blev omrørt med 200 ml 5 % dibasisk-natriumphosphat, puffer, og pH indstillet til 10,5 med 6 N natriumhydroxidopløsning.

DK 159451 B

31

Faserne blev adskilt, og chloroformfasen tørret over vandfrit natriumsulfat, filtreret og inddampet i vakuum til en olie. Der tilsattes 200 ml heptan, og opløsningen blev atter inddampet i vakuum, hvorved CP-70228 udkry-5 stalliserede som natriumsaltet. Saltet blev tørret i højvakuum ved 60°C i 5 timer, hvorved der blev opnået 11 g. Spektraldata og chromatografi viser, at dette materiale er identisk med CP-70228, der stammer fra gæring, idet forbindelsen har smeltepunkt 150-155°C.

10 Fundet: C 60,49; H 8,75. c53H89°18Na kræver C 61,37; H 8,65%. Ultraviolet spektrum: ingen absorption. Optisk drejning [a]p = 13,6° (c = 0,5, methanol). Infrarødt spektrum (KBr) cm-1: 3429, 2973, 2935, 2878, 1594, 1455, 1399, 1379, 1319, 1291, 1268, 1242, 1215, 1189, 1165, 15 1117, 1096, 1068, 1030, 990, 975, 943, 891, 860, 833.

EKSEMPEL 6

Isolering af CP-70828 fra qærinqsmodervæsken

Komponenten CP-70828 blev isoleret ved gentagen søjle-chromatografi af gæringsmodervæsken. CP-70828 blev detek-20 teret ved vanillinpåsprøjtning på samme måde som CP-70228. Enkeltpletmateriale (ved tic) af CP-70828 blev krystalliseret med heptan, hvorved der blev opnået 20 mg med smeltepunkt 133-136°C. Fundet: C 62,66; H 8,85. Ct./HQO0-lo j4 7 Δ lo kræver C 63,01; H 9,01%. Ultraviolet spektrum: ingen 25 absorption. Infrarødt spektrum (KBr) cm- : 3416, 5259 (br), 2968, 2926, 2871, 1614, 1455, 1377, 1363, 1315, 1260, 1238, 1206, 1175, 1160, 1116, 1092, 1063, 1030, 986, 970, 939, 921, 887, 857, 827, 799, 661.

Claims (10)

1. Poly(cyclisk ether)-forbindelser med formlen: (//^NvvW'' OCH /oXch θΓ"0“3 x0 OR 3 ( "YT3 CH3 • I OH H i Η 1 iN)Xi £ O^A k k ! COOH CH3 CH3 H CH3 H HH OR hvori R og begge betyder hydrogen, eller R betyder hydrogen, og R^ betyder methyl, eller R og R^ begge bety-5 der methyl, og farmaceutisk acceptable kationsalte deraf.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har form af natrium- eller kaliumsaltet.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af poly(cyclisk ether)-forbindelser ifølge krav 1 eller 2, kendete g- 10 net ved, at mikroorganismen Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697, eller en mutant eller re-kombinant form deraf med væsentligt samme egenskaber dyrkes i et vandigt dyrkningsmedium indeholdende en assimilerbar kilde til carbon, nitrogen og uorganiske salte under 15 neddykkede, aerobe gæringsbetingelser, indtil der er opnået en udvindelig mængde af en eller flere af poly-(cyclisk ether) -forbindelserne .

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at poly(cyclisk ether)-forbindelserne separeres 20 fra gæringsmediet ved ekstration med et organisk opløs ningsmiddel og, om ønsket, underkastes søjlechromato-grafi til adskillelse og isolering af de enkelte bestanddele . DK 159451 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at poly(cyclisk ether)-forbindelserne udvindes som en rå blanding ved isolering af myceliet eller ved spraytørring af hele gæringsmediet.

6. Biologisk ren kultur af en stamme af slægten Actino- madura, til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den er Actinomadura roseofura Huang sp. nov., ATCC 39697.

7. Foderblanding til kvæg eller svin, kendete g-10 net ved, at foderet indeholder en poly(cyclisk ether)- forbindelse ifølge krav 1 eller 2, hvori R og begge er hydrogen, eller R er hydrogen, og R^ er methyl, i en mængde, som er effektiv til at fremme væksten og/-eller forbedre foderudnyttelsen hos kvæget eller svinene.

8. Fremgangsmåde til at fremme væksten og/eller forøge foderudnyttelsen hos svin eller kvæg, kendetegnet ved, at man indgiver svinene eller kvæget en vækstfremmende eller foderudnyttelseseffektivitetsfremmende mængde af en poly(cyclisk ether)-forbindelse ifølge 20 krav 1 eller 2, hvori R og R^ begge er hydrogen, eller R er hydrogen, og R"*- er methyl.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at forbindelsen indgives svinene eller kvæget ved tilsætning af forbindelsen til foder, som indtages af 25 disse.

10. Foderblanding til fjerkræ, kendetegnet ved, at den indeholder en poly(cyclisk ether)-forbindelse ifølge krav 1 eller 2 eller en blanding af sådanne forbindelser i en mængde, som er effektiv til at bekæmpe 30 coccidiale infektioner hos fjerkræet.