DE2340005A1 - Beta-lactamaseinhibitoren und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Beta-lactamaseinhibitoren und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
ß-Lactamaseinhibitoren und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft zwei neue Enzyminhibitoren, die mit MC696-SY2-A und MC696-SY2-B bezeichnet sind und ein Verfahren
zu ihrer Herstellung durch Kultivieren einer Spezies von Streptomyces, die als Streptomyces fluvovirens klassifiziert
ist.
Mit der in der Beschreibung verwendeten Bezeichnung "MC696-SY2"
ist freibleibend entweder der Stoff MC696-SY2-A oder der Stoff MC696-SY2-B oder ihr Gemisch gemeint* solange
nicht ausdrücklich anderes ausgeführt ist.
Es ist bekannt, dass eine Zahl von Mikroorganismen, unter ihnen insbesondere auch die pathogenen Bakterien, ß-Lactamase
erzeugen, die den sowohl in dan Penicillinen als auch
in den Cephalosporinen in der Regel auftretenden* :.:--»Ls.r?tamring
spaltet. Diese Reaktion ist die Grundlage der Resistenz solcher Bakterien gegen Penicilline und Cephalosporine
(vgl. N. Citri, "Penicillinase and other ß-Lactamases" sowie
"The Enzymes", herausgegeben von P.D. Boyer, Bd. IV, S. 23-46, 3. Aufl., Academic Press, 1971). Da die ß-Lactamaseinhibitoren
die Aktivität der ß-Lactamase einschliesslich der Penicillinase und der Cephalosporinase unterdrücken, führt
eine gemeinsame Verabreichung von ß-Lactamaseinhibitoren mit Penicillinen und bzw. oder Cephalosporinen zu einer
erfolgreichen Chemotherapie von Krankheiten, die durch Bakterienstämme verursacht werden, die gegen Penicilline
und bzw. oder Cephalosporine resistent sind. Auch wenn Aminobenzyl-Penicillin, das im Handel unter der Bezeichnung
"Ampicillin" erhältlich ist, weithin auf dem Markt als wirkungsvollstes synthetisches Penicillin gegen grampositive
und gramnegative Bakterien gilt, so sind dennoch in den letzten Jahren zunehmend Bakterien aufgetreten, die
auch gegen die verbreitet verwendeten synthetischen Penicilline, insbesondere auch gegen das Aminobenzylpenicillxn,
resistent sind. Eine gemeinsame Verabreichung von ß-Lactamaseinhibitoren mit den synthetischen Penicillinen ist
eine wirkungsvolle Massnahme zur Aktivierung der synthetischen Penicilline auch gegenüber solchen Bakterien, die
sonst gegen diese Penicilline resistent sind.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue ß-Lactamaseinhibitoren
zu schaffen, die in Verbindung insbesondere mit synthetischen Penicillinen verabreicht werden
können, um auch sonst gegen Medikamente, insbesondere gegen die synthetischen Penicilline,resistente Bakterien abtöten
zu können. Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Herstellen solcher ß-Lactamaseinhibitoren
zu schaffen.
Diese Aufgabe wirü erfiTidungsgemäss durc^ nit MC696-SY2-A
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und MC696-SY2-B bezeichnete Stoffe massiger Stabilität und
saurer Natur gelöst, die die Aktivität von ß-Lactamase inhibiren, in Wasser löslich sind und in Butanol, Essigsäureäthylester,
Äthyläther,Chloroform und Benzol unlöslich sind und zu Aminosäuren hydrolysierbar sind; MC696-SY2-A inhibiert
weiterhin das Wachstum von Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Proteus-Arten, Staphylococcus aureus,
Micrococcus flavus, Micrococcus lysodeikticus, Klebsiella
pneumoniae, Shigella-Arten und Salmonella typhosa, liefert
bei der Elementaranalyse Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel und eine Natrium enthaltende Asche und bei der
Hydrolyse mit 6n Salzsäure nach 16 h bei 100 C im geschlossenen Gefäss Ammoniak, Glycin, Tyrosin, Asparaginsäure und
Glutaminsäure und nach dem Verpressen in Kaliumbromid zu Tabletten das in Fig. 1 gezeigte IR-Absorptionsspektrumj
MC696-SY2-B zeigt bei der Ninhydrinreaktion eine Purpurfärbung,
eine auf eine Amidbindung zurückgeführte schwach positive Rydon-Smith-Reaktion, eine bräunlich-purpurne
Färbung bei der Anthron-Reaktion und eine negative Eisen(III)-chloridreaktion,
liefert bei der Elementaranalyse Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Asche und
bei der Hydrolyse mit 6n Salzsäure nach 16 h bei 105 C im verschlossenen Gefäss Ammoniak, Asparaginsäure, Glutaminsäure
und Glycin, jedoch keine Aminoadipinsäure, und zeigt nach dem Tablettieren in Kaliumbromid das in Fig. 2
gezeigte IR-Absorptionsspektrum.
Zur Herstellung der vorgenannten mit MC696-SY2-A und MC696-SY2-B
bezeichneten Stoffe wird erfindungsgemäss ein Verfahren vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass
man einen Stamm von Streptomyces fulvoviridis unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium kultiviert, das assimilierbaren
Kohlenstoff und Stickstoff enthält, dass man die beiden Stoffe in der Kultur ansammelt und im Gemisch aus
dieser isoliert.
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Bei den Versuchen, neue ß-Lactamaseinhibitoren zu erhalten,
wurden verschiedene Bodenproben gesammelt und aus ihnen Mikroorganismen isoliert, deren StoffWechselprodukte untersucht
wurden. Im Rahmen dieser Versuche wurde aus einer Bodenprobe, die im Gebiet von Okazaki-City in der Aichi-Präfektur
in Japan im Mai 197O genommen wurde, ein neuer Mikroorganismus isoliert. Die weiteren Untersuchungen haben
dann bestätigt, dass dieser jetzt als Stamm MC696-SY2 bezeichnete Mikroorganismus ein neuer Stamm der bekannten
Spezies Streptomyces fulvoviridis ist.
Die aus den Kulturen dieser Stämme gewonnenen Stoffe MC696-SY2-A
und MC696-SY2-B können sowohl allein als auch im Gemisch miteinander als wirkungsvolle ß-Lactamaseinhibitoren
pharmazeutisch verwendet werden. Die Erfindung umfasst sowohl die beiden Stoffe einzeln als auch ihr Gemisch sowie
diese Stoffe in Form verdünnter Lösungen, in Form von Rohkonzentraten, von ungereinigten Feststoffen, von gereinigten
Feststoffen, als freie Säure und in Form der Salze mit Metallen oder organischen Basen.
Wenn das gewonnene Gemisch der Stoffe MC696-SY2 in die
Komponenten A und B getrennt werden soll, so wird eine solche Trennung vorzugsweise chromatographisch durchgeführt.
Die Ausbeuten der beiden neuen Stoffe in den Streptomyces fulvovirides-Kulturen können durch Zugabe eines oder mehrerer
wasserlöslicher Kobaltsalze, wie beispielsweise Kobaltchlorid, Kobaltsulfat, Kobaltnitrat, Kobaltphosphat
oder Kobaltacetat, deutlich verbessert werden.
Die Erfindung ist nachstehend anhand von Beispielen in Verbindung mit den Zeichnungen näher beschrieben. Es' zeigen:
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Fig. 1 das IR-Äbsorptionsspektrum von
MC696-SY2-A in KBr im Bereich von 4000 - 400 cm" und
Fig. 2 das IR-Absorptionsspektrum von
MC696-SY2-B in KBr im Bereich von 4000 - 400 cm" .
Zur Herstellung des Stoffes MC696-SY2 kann ein Stamm von
Streptomyces fulvovirides genommen werden, solange dieser den Stoff MC696-SY2 erzeugt. Als Beispiel für einen solchen
Stamm sei der oben erwähnte Streptomyces fulvovirides-Stamm MC696-SY2 genannt. Dieser Stamm MC696-SY2 wurde am 8. Juli
1972 in Japan hinterlegt, und zwar bei dem "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology",
Inage, Chiba-City, Japan, unter der Hinterlegungsnummer
FERM-P 1504. Ausserdem wurde der Stamm MC696-SY2 in der American Type Culture Collection, Washington D.C.,
USA, unter der ATCC-Kennziffer 21954 hinterlegt.
Nachstehend sind die Kulturcharakteristiken und die Klassifizierungscharakteristiken
des Stammes MC696-SY 2 näher beschrieben.
(a) Mikroskopische Morphologie
Der Stamm MC696-SY2 weist ein wohlverzweigtes Substratmyces
auf und entwickelt gerade bis mehr oder weniger schwach gekrümmte Lufthyphae, ohne jedoch Spiralstrukturen oder
QuirlVerzweigungen auszubilden. Die Spitzen der Lufthyphae
tragen Ketten von mehr als 10 konischen Sporen, deren Oberfläche glatt ist oder auf einem Sucrosenitratagar gelegentlich
warzig erscheint. Die Abmessungen der einzelnen Sporen betragen etwa 0,5 - 0,7 zu O,7 - 1,1 Mikrometer.
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(b) Charakteristisches Verhalten auf verschiedenen Medien
Die nachstehend in Klammern angegebenen Bezeichnungen entsprechen dem in dem "Color Harmony Manual", herausgegeben
von der Container Corporation of America, verwendeten Standard.
(1) Auf Sucrosenitratagar bei 27 C inkubiert: Farbloser
b-is blass gelblichbraun oder gelblichbraun gefärbter Wuchs entwickelt Luftmycel mit hellbraungrauer bis braungrauer Färbung (3 fe, Silver gray). Kein lösliches Pigment.
(2) Auf Glucoseasparaginagar bei 27 C inkubiert: Farbloses bis blass gelbliches Wachstum ohne Lufthyphae. Kein lösliches
Pigment.
(3) Auf Glycerinasparaginagar (ISP-Medium Nr. 5) bei 27 C inkubiert: Farbloses oder blass gelblichbraun bis gelblichbraun gefärbtes Wachstum mit Lufthyphae von hellgrauer
bis hellbraungrauer Färbung. (3 fe, Silver gray) Kein lösliches Pigment.
(4) Auf einem Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP-Medium Nr. 4) bei 27 0C inkubiert: Blass gelbes bis
blass gelblichbraunes Wachstum mit Lufthyphae von bräunlichweisser bis hellbraungrauer Färbung (3 fe, Silver gray).
Kein lösliches Pigment.
(5) Auf Tyrosinagar (ISP-Medium Nr. 7) bei 27 0C inkubiert:
Farbloses bis blass gelblichbraunes Wachstum mit Lufthyphae von hellbraungrauer bis hellolivgrauer Färbung. Kein lösliches
Pigment.
(6) Auf Nähragar bei 27 0C inkubiert: Farbloses bis
blassgelbes Wachstum mit dünnen Lufthyphae von grauweisser Färbung. Kein lösliches Pigment.
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(7) Auf Hefe-Malz-Agar (ISP-Medium Nr. 2) bei 27 °C inkubiert:
Blassgelbes bis blassgelblichbraunes Wachstum mit Lufthyphae von grauweisser bis hellbraungrauer Färbung.
Kein lösliches Pigment.
(8) Hafermehlagar (ISP-Medium Nr. 3) bei 27 °C inkubiert:
Blassgelbes bis gelblichbraunes Wachstum mit Lufthyphae
von weisser bis hellbraungrauer Färbung. Lösliches Pigment von gelblicher Tönung.
(9) Auf Calciummalatagar bei 27 0C inkubiert: Farbloses
bis blassgelbes Wachstum mit Lufthyphae von bräunlxchweisser
.bis hellbraungrauer Färbung. Kein lösliches Pigment.
(10) Auf einem Glucose-Pepton-Gelatinemedium, bei 24 0C
durch Einstechen inkubiert: Farbloses bis blassgelbes Wachstum mit Lufthyphae von grauweisser bis hellgrauer
oder hellbraungrauer Färbung. Kein lösliches Pigment.
(11) Auf Gelatine, bei 20 0C durch Einstechen inkubiert:
Farbloses bis blassgelbes Wachstum mit Lufthyphae von grauweisser bis hellgrauer Färbung. Kein lösliches Pigment,
(12) Auf entrahmter Milch bei 37 0C inkubiert: Farbloses
Wachstum ohne Lufthyphae. Lösliches Pigment von blasser gelboranger Färbung.
(13) Auf Glycerinnitratagar bei 27 C inkubiert: Farbloses bis gelbbraunes Wachstum mit Lufthyphae von grauweisser
bis hellbraungrauer Färbung. Kein lösliches Pigment.
(14) Auf Cellulose bei 27 0C inkubiert: Recht gutes
Wachstum ohne Zersetzung der Cellulose.
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(c) Physiologische Eigenschaften
(1) Wachstumstemperatur: Das Wachstum auf Glucoseasparaginagar wurde bei 20, 24, 27, 30, 37 und 50 0C untersucht.
Der Stamm MC696-SY2 wuchs bei allen Temperaturen bis auf
die Temperatur von 50 0C gut. Die optimale Wachstumstempera
tür liegt zwischen 20 und 27 C.
(2) Verflüssigung von Gelatine: Einfache Gelatine (15 %) begann sich vom 5. Tag an zu verflüssigen, wenn bei 20 C
inkubiert wurde. 15 %ige Gelatine in einem Glucose-Pepton-Gelatine-Medium
begann sich bei einer Inkubation bei 27 C vom 19. Tag an zu verflüssigen. Der Grad der Verflüssigung
war mittelmässig.
(3) Hydrolyse von Stärke: Stärkekleister in Starkeagar
und ein Agar aus Stärke und anorganischen Salzen wurde bei einer Inkubationstemperatur von 27 C vom 5. Tag an hydrolisiert.
Der Hydrolysegrad war mittelmässig.
(4) Koagulation und Peptonisierung in entrahmter Milch: Bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C war die Koagulation
am 5. Tag vollständig beendet. Eine Peptonisierung wurde erst später beobachtet. Nach 7 bis 10 Tagen war
auch die Peptonisierung beendet. Der Reaktionsgrad war mittel bis stark.
(5) Bildung eines melaminartigen Pigments: Bei einer Inkubationstemperatur
von 27 0C wurde weder auf einer Trypton-Hefe-Brühe
(ISP-Medium Nr. 1) noch auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP-Medium Nr. 6), noch auf Tyrosinagar (ISP-Medium
Nr. 7) eine Pigmentierung beobachtet.
(6) Verflüssigung von Calciummalat: Calciummalat in Calciummalatagar
wurde bei einer Inkubationstemperatur von 27 C
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rund um den Wachstumsbereich herum verflüssigt.
(7) Verwendung von Kohlehydraten für das Wachstum: Bei einer
Inkubation bei 27 C wurden in einem Pridham-Gottlieb-Grundmediura
die folgenden Kohlehydrate verwendet: L-Arabinose, D-Xylose, L-Rhamnose, Glucose, D-Fructose und D-Mannitol.
Sucrose, Raffinose und Inositol wurden nicht verwendet.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass der Stamm MC696-SY2 zum Genus Streptomyces gehört und weder
Spiralen noch Quirle bildet. Die Sporenoberfläche ist glatt. Die Wachstumsfärbung auf den verschiedenen Medien
ist blassgelb bis gelblichbraun. Die Färbung der Lufthyphae ist grauweiss bis hellbraungrau. Es wird praktisch
kein lösliches Pigment erzeugt. Die Proteolyse und die Stärkehydrolyse ist dem Grad nach mittel bis stark. Es
wird kein melaminartiges Pigment erzeugt. L-Arabinose, D-Xylose, L-Rhamnose, Glucose, D-Fructose und D-Mannitol
können zur Züchtung verwendet werden, jedoch sind Sucrose, Raffinose und Inositol als Kohlenstoffquelle nicht brauchbar.
Auf dieser Grundlage wurde der Stamm MC696-SY2 mit den
bekannten Spezies von Streptomyces verglichen, wobei eine Ähnlichkeit mit den folgenden Spezies festgestellt wurde:
Streptomyces flavovirens (Waksman), Waksman und Henrici
(J. of Systematic Bacteriology, Bd. 18, S. 114, 1968, und S.A. Waksman "The Actinomycetes", Bd. 2, S. 210, 1961, The
Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA), Streptomyces
nigrifaciens Waksman (J. of Systematic Bacteriology, Bd. 18, S. 150, 1968, und S.A. Waksman "The Actinomycetes", Bd. 2,
S. 247, 1961, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA), Actinomyces fulvoviridis Kuchaeva et al. (J. of Systematic
Bacteriology, Bd. 18, S. 321, 1968, und N.A. Krasilnikov
et al. "Biology of Antibiotic-producing Actinomycetes" in
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? 3 4 0 Π Π
Transaction of the Institute of Microbiology, Acedemy of Sciences of the USSR, No. 8, S. 222 - 251, 1966, Englische
Übersetzung in IPST Cat. Nr. 1292), Streptomyces scabies (Thaxter) Waksman & Henrici (J. of Systematic Bacteriology,
Bd. 18, S. 374, 1968, und S.A. Waksman "The Actinomycetes",
Bd. 2, S. 274, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA) und Streptomyces flavogriseus (Duehe),Waksman & Henrici
(J. of Systematic Bacteriology, Bd. 19, S. 429, 1969, und S.A. Waksman "The Actinomycetes", Bd. 2, S. 209, 1961,
Baltimore, USA). Die Arten der Kulturen der fünf vorstehend genannten Spezies wurden bei 27 C auf einem Sucrosenitratagar
mit dem Stamm MC696-SY2 und weiterhin bei 27 C auf Glucoseasparaginagar, bei 27 C auf einem Agar aus Stärke
und anorganischem Salz (ISP-Medium Nr. 4) hinsichtlich ihrer Kulturcharakteristika auf dem Medium verglichen. Unter anderem
wurden die melaminartige Pigmentierung, die Koagulation und die Peptonisierung entrahmter Milch und die Kohlehydrat-Verwertung
auf Pridham-Gottlieb-Grundmedium untersucht. Die Ergebnisse dieser Vergleichsversuche zei-gten, dass der
Stamm MC696-SY2 mit den vorgenannten Spezies grosse Ähnlichkeit aufwies, von diesen jedoch durch die in der
nachstehenden Tabelle 1 zusammengestellten Unterschiede deutlich verschieden war.
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Stamm Streptomyces Streptomyces Actinomyces Streptomyces Streptomyces
MC696-SY2 flavovirens nigrifaciens fulvovirxdxs scabies flavogriseus (ISP 5062) (ISP 5071) (ISP 5210) (ISP 5078) (ISP 5323)
Ό
H
H
Koagulation + schnell +schnell + schnell
Peptonisation (10 Tage beobachtet) + schnell +schnell + schnell
co
α>
ο
ca
α>
ο
ca
tra
Farbe der Lufthyphae
V; Wuchsfar-
ρ be
l\ g, Lösliches
w ro Pigment
hell gelbgrau braungrau getönt
blass gelbbraun graugelb- farblos braun
- blass gelb
grauwexss getönt
farblos
hell
braungrau
braungrau
hell braungrau
braunweiss
getönt
farblos bis farblos bis farblos braungrau; graugelbbraun blass
braungrau gelbbraun
•Η (β
Farbe der Lufthyphae
Wuchsfarbe
Lösliches
υ +>
£ 2 Pigment
hell gelbgrau braungrau getönt
blass farblos gelbbraun
schwach gelb
grauwexss getönt
farblos
blass
braungrau
braungrau
gelbbraun
blass braungrau
farblos bis gelbbraun
schwach gelb getönt
schwach weiss
farblos
CD O O
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Streptomyces flayovirens ISP 5062 und Streptomyces nigrifaciens
ISP 5071 unterscheiden sich vom Stamm MC696-SY2 hinsichtlich ihrer Eigenschaften sowohl auf Sucrosenitratagar
als auch auf Glycerinnitratagar. Streptomyces scabies ISP 5078 und Streptomyces flavogrJseus ISP 5323 unterscheiden sich
vom Stamm MV696-SY2 hinsichtlich der Koagulation und Peptonisierung
entrahmter Milch. Actinomyces fulvoviridis ISP 5210 wies die grösste Ähnlichkeit mit dem Stamm MC696-SY2 auf.
Actinomyces wird jedoch von der russischen Forschungsgruppe um Kuchaeva dem Genus Streptomyces zugeordnet, während der
Stamm MC696-SY2 sicher als zur' Spezies Streptomyces fulvoviridis
gehörend identifiziert ist.
Sowohl unter künstlichen als auch unter spontanen Bedingungen tritt häufig eine Mutation von Actinomycetes auf.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher nicht nur die Verwendung des Stammes MC696-SY2, sondern auch die seiner Mutanten.
Mit anderen Worten umfasst die Erfindung die Verwendung aller zur Spezies Streptomyces gehörenden Stämme,
die den Stoff MC696-SY2 erzeugen.
Der Stoff MC696-SY 2 kann durch aerobes Kultivieren von Sporen oder Mycel eines diesen Stoff MC696-SY2 erzeugenden
Stammes erhalten werden, beispielsweise durch anaerobes Kultivieren von Streptomyces fulvoviridis. Dabei können
als Kulturmedium Komponenten verwendet werden, die in an sich bekannter Weise zur Kultivierung von Actinomycetes
verwendet werden. Zu solchen Stoffen gehören beispielsweise Glycerin, Glucose, Lactose, Sucrose, Stärke, Maltosemelassen,
Fett, Öl oder andere Kohlenstoff liefernde Quellen. Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Baumwollsamenpulver,
Erdnusspulver, Sojabohnenpulver, Hefeextrakte, NZ-Amin, Casein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat oder andere Stoffe
können als Stickstoffquelle verwendet werden. Zusätzlich können Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcar-bonat, Magnesium-
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sulfat und andere anorganische Salze dem Medium zugesetzt werden. Verschiedene Schwermetallsalze können gegebenenfalls
ebenfalls zugesetzt werden. Da alle diese Futterstoffe von den den MC696-SY2-Stoff erzeugenden Stämmen zur Erzeugung
des Stoffes MC696-SY2 verwendet werden können, können in der Regel auch praktisch alle für die Actinomycetes bekannten
Futterstoffe verwendet werden. Für die Züchtung im grossen Massstab sind flüssige Kulturen vorzuziehen. Generell kann
die Züchtung der entsprechenden Stämme bei allen Temperaturen erfolgen/ bei denen noch der Stoff MC696-SY2 erzeugt
wird, jedoch ist ein Temperaturbereich von 25 - 35 °C bei weitem bevorzugt. Die Kultivierung wird so lange fortgesetzt
bis ausreichende Mengen des Stoffes MC696-SY2 erzeugt und in der Kulturbrühe angesammelt sind. So wird beispielsweise
ein Medium aus 2 % Glycerin, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,1 % MgSO4*7H2O und 0,1 % K-HPO4 in Leitungswasser mit 0,02 %
Siliconöl versetzt und bei einem pH von 6,8 sterilisiert. Dieses Medium wird mit Sporen oder Mycel des Stammes MC696-SY2
geimpft, die von Schrägkulturen dieses Stammes geerntet worden sind. Bei einer anschliessenden aeroben Schüttelkultivierung
bei 27 0C ist eine ausreichende Menge des Stoffes MC696-SY2 nach einer Inkubationszeit von 3-5 Tagen in der
Kulturbrühe angesammelt.
Der Stoff MC696-SY2 kann durch seine Hemmung der Penicillinase
(ß-Lactamase) mit Hilfe der jodometrischen Titration und der Agarplattenprobe in der nachstehend beschriebenen
Weise nachgewiesen werden:
1) Jodometrische Titration
Eine Lösung von 0,1 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers (pH 7,0), die den Inhibitor enthält, 0,25 ml Penicillinase im selben
Puffer (3OOO Einheiten/ml), hergestellt aus Penicillinase
(300 Einheiten/mg) oder aus ß-Lactamase_5, erhalten durch
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E. coli K-12 W366O R+ 75 (H. Ogawara, K. Maeda & H. Umezawa,
Biochem. Biophys. Acta 289, 203-211, 1972) und 0,4 ml des Puffers wurden in ein Reagenzglas gegeben und 5 min bei
37 C vorsichtig geschüttelt. Dann wurden zu dem Gemisch 0,25 ml KalxumbenzylpeniciHin (8000 Einheiten/ml) im gleichen Puffer
gegeben. Das Gemisch wurde dann weitere 35 min geschüttelt und anschliessend genau 1 min lang im siedenden Wasserbad
auf 100 C erhitzt, um die Reaktion abzubrechen. In der gleichen Weise wie diese Probelösung wurden Kört rollversuche
ohne Inhibitor, ohne Penicillinase sowie ohne Inhibitor und ohne Penicillinase hergestellt. Alle Reagenzgläser mit den
Kontroll- und Leerproben wurden mit 5 ml 0,01 η Jod versetzt. Nach 15 min wurde das überschüssige Jod mit 0,01 η Natriumthiosulfat
titriert, wobei eine 1 %ige Stärkelösung als Indikator diente. Der T -Wert wurde aus dem Titer der Leer-
probe (ohne Penicillinase und ohne Inhibitor) abzüglich des Titers der Kontrollprobe (ohne Inhibitor) berechnet.
Der T -Wert wurde aus dem Titer der anderen Leerprobe (ohne
Penicillinase) abzüglich des Titers der Probe mit dem
Penicillin, mit der Penicillinase und dem Inhibitor bestimmt. Die prozentuale Hemmung wurde nach der folgenden
Gleichung berechnet:
Ts prozentuale Inhibition = 1OO - — χ lOO %
Im Rahmen der weiteren Beschreibung ist die Menge des Stoffes
MC696-SY2, die eine 50 %ige Hemmung (ID5 ) hervorruft, als
Einheit verwendet.
Eine Probe des Stoffes MC696-SY2-A (88 OOO Einheiten/mg) und
des Stoffes MC696-SY2-B (6670 Einheiten/mg) wurden in einem pH 7,O-Phosphatpuwer (100 - 0,1 mcg/ml) gelöst. Ein Cephalosporinase
erzeugender Stamm (Escherichia freundii GN346) wurde
16 h lang bei 37 0C inkubiert, mit Fleischbrühe auf das
10-fache verdünnt und weitere 2 h lang inkubiert, wobei eine
Cephalosporinase-Lösung erhalten wurde. Bei der Bestimmung
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der Hemmungsaktivität gegenüber der Cephalosporinase durch jodometrische Titration in der vorstehend beschriebenen
Weise, wobei 0,10 ml der Inhibitorlösung, 0,25 ml der verdünnten
Cephalosporinase-Lösung und 0,5 ml Cephazoiin-Lösung (5 mg/ml) verwendet wurden, zeigten 1,1 Einheiten des Inhibitors
MC696-SY2-A und 0,84 Einheiten des Inhibitors MC696-SY2-B eine 50 %ige Hemmung der Cephalosporinase.
2) Die Agarplattenmethode
Es wurde zu diesem Versuch eine im Handel erhältliche Penicillinase (500 000 Einheiten/ml) verwendet. Staphylococcus
aureus FDA 2O9P auf einer schrägen Agarplatte wurde in IO ml Salzlösung suspendiert und als Testorganismus verwendet.
Weiterhin wurde das für die Penicillinprobe verwendete Agarmedium benutzt. Es wurden bei 48 C 10 ml geschmolzenes
Agarmedium, das 500 Einheiten Penicillinase enthielt, lOO Einheiten Kaliumbenzylpenicillin und die
Suspension des Testorganismus (1 %) auf Platten gebracht. 15 min bis 2 h nach der Präparation der Platten wurde auf
den Agar eine geeignete Mengen des Inhibitors enthaltende Scheibe gelegt. Nach der über Nacht währenden Inkubation
bei 37 C trat eine deutlich abgegrenzte Inhibitionszone auf. Zwischen dem Durchmesser (d) der Inhibitionszone und
der Konzentration (C) des Inhibitors konnte im Bereich von 3 - 150 Einheiten/ml folgende Beziehung festgestellt
werden:
d = alog C + B , wobei α und ß Konstanten sind.
Bei der fermentativen Herstellung des Stoffes MC696-SY2
wurden auch eine Reihe von Tests zur Untersuchung der Beziehung zwischen der Zusammensetzung des Kulturmediums.
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der Dauer der Fermentation in Tagen und der ß-Lactamasehemmung der Kulturbrühe durchgeführt. Dazu wurde der Stamm
MC696-SY2 in je 1OO ml verschiedener Medien inokuliert.
Die geimpften Medien wurden in eine 500 ml-Schüttelflasche
gegeben und bei 27 - 29 0C schüttelkultiviert. Dazu wurde
eine ümkehrschüttelmaschine mit einer Amplitude von 8 cm
und 130 Takten/min verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt.
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| Tabelle | 2 | Zusammen | pH | 8 | 3 Taqe | Fermentationsdauer | pH | Taqe | 5 | pH | Taqe | I |
| Medium | setzung | 6. | 6 | % Hemmunq | 4 | 7.6 | % Hemmung | 8.0 | % Hemmunq | H -J |
||
| Nr. | 5. | 2 | 65.4 | 7.4 | 60.6 | 8.0 | 38.8 | I | ||||
| 2 % Stärke | 6. | 4 | 79.2 | 6.2 | 78.6 | 6.6 | 58.8 | |||||
| 1 | 2 % Glucose | 5. | .0 | 82.7 | 6.6 | 89.2 | 6.8 | 71.0 | ||||
| 2 | 2 % Glycerin | 8. | .0 | 69.0 | 8.0 | 25.0 | 5.2 | 32.2 | ||||
| 3 | 2 % Maltose | 8. | .2 | 41.6 | 8.0 | 35.6 | 8.0 | 61.2 | ||||
| 4 | 2 % Lactose | 5 | .0 | 20.4 | 5.2 | 19.8 | 5.2 | 12.8 | ||||
| 5, | 2 % Sucrose | 8 | .0 | 3.6 | 8.0 | 0 | 8.0 | 3 4 | ||||
| 6 | 2 % Sojaboh- | 8 | .8 | 20.4 | 8.0 | 14.2 | 8.0 | \ 16.0 | ||||
| 7 | nenöl (E) Medium *1 |
7 | 69.0 | 8.0 | 50.0 | 8.0 | 38,8 | |||||
| 8 | (F) Medium *2 | 86.0 | 50.0 | 29,0 | ||||||||
| 9 | (B) Medium *3 | |||||||||||
| 10 | ||||||||||||
*1 I1O % Polypepton, O,2 % Hefeextrakt, 2,5 % Glycerin, 0,6 % CaCO3, Leitungswasser,
pH 6,8
*2 1,5 % Sojabohnenmehl, 2,0 % Stärke, 0,2 % MgSO4'7H2O, Leitungswasser, pH 6,8
*3 1,5 % Prorich (Ajinomoto Products), 1,O % Stärke (Kartoffelstärke), 1,0 % Glucose,
0,1 % K2HPO4, 0,1 % MgSO4*7H2O, O,3 % NaCl, Leitungswasser, pH 6,8
0,1 % K2HPO4, 0,1 % MgSO4*7H2O, O,3 % NaCl, Leitungswasser, pH 6,8
OO
O
OE>
| Tabelle 3 | 1,5 % Sojabohnen | PH | 3 Taqe | Fermentationsdauer | pH | % Hemmung | 5 Tage | Hemmung | 1 |
| Medium Zusammensetzung | mehl O,3 % Hefeextrakt |
6.8 | % Hemmung | 4 Tage | 8.0 | 61.3 | pH % | 25.8 | CD |
| Nr. | 7.4 | 76.5 | 8.0 | 45.2 | 8.0 | 22.5 | I | ||
| 1,5 % Prorich | 44.0 | 7 8 | 29.0 | 8.0 | * 32.2 | ||||
| 1,5 % Pharma Media | 7.4 | / · M | 7.8 | ||||||
| 1,0 % Polypepton | 6.0 | 29.3 | 7.2 | 42.0 | 42.0 | ||||
| 0,5 % Fleischextrakt | 7.0 | 26.5 | 8.0 | 4.5 | 8.0 | 3.0 | |||
| 1,5 % Fleischextrakt | 7.4 | 8.6 | 8.0 | 6.5 | 8.0 | 22.5 | |||
| 1,0 % Hefeextrakt | 7.4 | 32.3 | 7.8 | 40.0 | 8.0 | 29.0 | |||
| 2,0 % Maisquellflüs sigkeit |
B 0 | 76.5 | 5.0 | 8.0 | 7 .8 | 9.7 | |||
| (F) Medium * | 6.8 | - 5.8 | 8.0 | 47.0 | 5.0 | 4^5.2 | |||
| 7.4' | 44.0 | 8.0 | 30.3 | 8.0 | 22.5 | ||||
| 58.8 | 8.0 | ||||||||
* wie Medium Nr. 9 in Tabelle 2
O O O LH
Das in Tabelle 2 aufgeführte Medium, das Sojabohnenmehl in der Menge von 1,5 X1 O1I % MgSO4*7H2O und 0,1 % K2HPO4
enthielt, wurde mit 0,2 % eines Schaumunterdrückungsmittels
(einem Silicon in IO %iger wässriger Lösung) nach der Einstellung
des pH auf 6,8 versetzt und als Grundmedium verwendet. In der Tabelle 3 wurde in dem vorstehenden Medium
statt des Sojabohnenmehls 2 % Glucose verwendet.
Jede der Fermentationsbrühen wurde auf das 4-fache verdünnt« Je 0,1 ml der so bereiteten Proben wurden durch jodometrische
Titration avf ihre Hemmungsaktivität untersucht.
Die Produktion des Stoffes MC696-SY-2 wurde am zweiten
Tag der Fermentation untersucht und erreichte ihr Maximum am Ende des zweiten bis fünften Tages der Fermentation
bei einem pH von 6,8 bis 8,0. Es wurden 250 - 300 Einheiten/ml des Stoffes MC696-SY2 in der Fermentationsbrühe
festgestellt, wobei die Bestimmung nach der Agarplattenmethode vorgenommen wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen
zeigten, dass Glycerin, Glucose und Stärke die günstigsten Kohlenstoffquellen sind und dass das Sojabohnenmehl,
der Fleischextrakt, die Maisquellflüssigkeit und der Baumwollsamen des Pharma-Mediums die besten Stickstoffquellen
waren.
In einer anderen Versuchsreihe wurde festgestellt, dass ein Zusatz eines Kobaltsalzes die Produktion des Stoffes
MC696-SY2 merklich erhöhte, worauf weiter unten noch eingegangen wird. Das zugesetzte Kobaltsalz kann dem Kulturmedium
in Form eines wasserlöslichen Salzes zugesetzt werden, beispielsweise in Form eines Kobaltsalzes einer anorganischen
Säure oder einer organischen Säure, beispielsweise einer niederen aliphatischen Carbonsäure. Als
Beispiele für geeignete und leicht verfügbare Kobaltsalze seien die folgenden genannt: Kobaltchlorid, Kobaltbromid,
AO 9.808/1 176
7340005
Kobaltsulfat, Kobaltnitrat, Kobaltphosphat, Kobaltacetat,
Kobaltcitrat und andere. Die Konzentration des Kobaltsalzes
kann im Bereich von O,0001 - Ο,ΟΟΙ Gew.-%, bezogen auf das
Kulturmedium, liegen.
Der Stoff MC696-SY2 kann sowohl in einer Tankkultur als auch
in einer Schüttelflaschenkultür hergestellt werden. Beispielsweise
werden 15 1 eines Kulturmediums in einem 30 1-Permentor hergestellt und 30 min lang bei 120 C sterilisiert.
Das sterilisierte Medium wird mit 200 ml einer Kulturbrühe geimpft, die zuvor 2 Tage lang schüttelkultiviert
worden war. Die Fermentation im Tank verläuft unter Belüftung mit 15 1 steriler Luft/min unter Rühren mit einer
Rührergeschwindigkeit von 200 U/min. Das Maximum der Erzeugung des Stoffes MC696-SY2 wird in der Tankkultur nach
45-5Oh der Fermentation erreicht.
Die Verbindung MC696-SY2 ist nur massig stabil. Die Aktivität
im Filtrat der Kulturbrühe nahm auf 60,5, 34,5 bzw. 15,1 % nach 3, 8 bzw. 10 Tagen Lagerung im Kühlschrank
bei 5 0C ab. Sogar in Form eines getrockneten Pulvers nahm
die Aktivität der Stoffe bei Zimmertemperatur im Exsiccator rasch ab. Der Stoff erwies sich jedoch mit seinen beiden
Komponenten bei einer Temperatur von -20 C als durchaus stabil. Die Stabilität des Kulturbrühenfiltrats (18Ο Einheiten/ml
), einer wässrigen Lösung des ungereinigten Pulvers des Wirkstoffgemisches (13,3 Einheiten/mg; 8 mg/ml) und
einer wässrigen Lösung eines besonders gereinigten Pulvers des Stoffes MC696-SY2-A (184 Einheiten/mg; 500 mcg/ml) und
des Stoffes MC696-SY2-B (363 Einheiten/mg; 5OO mcg/ml) wurde
bei verschiedenen pH-Werten untersucht. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 4 und 5 zusammengefasst.
409808/1 1 76
Stabilität des Kulturbrühenfiltrats bei verschiedenen pH-Werten
| pH | Restalctivität (%) | 500C, 30 min. |
| 2.0 5.0 7.0 7.8 9.0 |
600C, 30 min. | 65 80 3ü |
| O 43 38 |
Stabilität der wässrigen Lösung, des ungereinigten bzw. gereinigten Pulvers bei 50 C
rohes Pulver
MC696-SY2-A
MC696-SY2-B
| ^crnriir | 4U min | • | 100 | 2 h | 3O min | 2 h | |
| 2.3 | _ | 0 | , — | - | 0 | - | |
| 3.0 | 25 | 0 | 61 | - | 0 . | — | |
| 4.0 | 61 | 8 | - | 15 | 10 | ||
| 5.0 | 84 | — | - | — | |||
| 5.2 | _ | 65 | 11 | 62 | 28 | ||
| 6.0 | 85 | 82 | 66 | 100 | 69 | ||
| 6.8 | — | 100 | 76 | 100 | 64 | ||
| 7.0 | 99 | - | — | — | |||
| 8.0 | 49 | 70 | 100 | 71 | |||
| 9.0 | 20 | - | — | ||||
| 10.5 | — | 39 | 84 | 28 |
409803/117S
Weiterhin wurde der Einfluss auf die Aktivität des Kalbserums mit einer Lösung untersucht, die 10 mg/ml des umgereinigten
Pulvers (6,7 Einheiten/mg) enthielt. Die Untersuchung wurde nach der Scheibenmethode durchgeführt. In
Kalbsserum-Bouillonlösungen mit einer Konzentration von 6,25, 12,5, 25 und 50 % nahm die Aktivität auf lOO, 88,5,
69,6 und 51,5 % ab.
Das ungereinigte Pulver (28,3 Einheiten/mg) wurde in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) in einer Konzentration von 2O mg/ml
gelöst. 2 Teile dieser Lösung, 0,01 ra 2-Mercaptoäthanol,
Dithiothreitol oder Glutathion wurden miteinander vermischt und über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die Aktivität
aller Lösungen war in allen Proben vollständig verschwunden, während Kontroilösungen ohne Reduktionsmittel eine Restaktivität
von 57,5% aufwiesen.
Da der Stoff MC696-SY2 in Wasser leicht löslich ist, liegt
er im wesentlichen in der flüssigen Komponente der fermentierten Kulturbrühe des den Stoff MC696-SY2 erzeugenden
Stammes von Streptomyces fulvovirides vor. Eine Extraktion mit Butanol, Äthyläther, Chloroform, Benzol oder ähnlichen
Lösungsmitteln ist nicht besonders praktisch. Die Extraktion mit solchen Lösungsmitteln dient gegebenenfalls der Entfernung
von Verunreinigungen im Aufbereitungsverfahren des Stoffes MC696-SY2. Zur Aufbereitung des Stoffes MC696-SY2
kann empfehlenswerterweise zunächst mit einer Filtration
oder Zentrifugierung der Kulturbrühe zur Entfernung der festen Bestandteile zusammen mit dem Mycel gearbeitet werden.
Der Stoff MC696-SY2 wird dann aus dem Kulturbrühenfiltrat oder aus anderen wässrigen Lösungen vorzugsweise durch Adsorptionsmittel
gewonnen. Als bevorzugtes Adsorptionsmittel wird Aktivkohle verwendet. Der an der Aktivkohle adsorbierte
Stoff MC696-SY2 kann beispielsweise mit wässrigem Aceton
oder wässrigem Propanol eluiert werden. Insbesondere werden
409808/1176
hohe Ausbeuten bei Verwendung einer Lösung voh 50 % Aceton
oder 30 % Propanol in Wasser von einem pH von 7,0 bis 7,5 erhalten. Aufgrund des sauren Charakters des Stoffes MC696-SY2
können auch Anionenaustauscherharze oder Anionenaustauschercellulosen
zur Aufbereitung und Abtrennung verwendet werden. Dabei sind stark basische Anionenaustauscherharze, wie
beispielsweise das quaternäre Ammoniumhydroxidderivat von
Polystyrol mit -N(CH-)3OH-Gruppen als funktioneilen Gruppen
(Amberlite IRA-400), schwach basische Anionenaustauscherharze, wie beispielsweise ein polyaminiertes Polystyrol
(Amberlite IR-4B),oder DEAE-Cellulose besonders geeignet.
Eines der wirksamsten Verfahren besteht darin, dass der Stoff MC696-SY2 in neutraler wässriger Lösung an DEAE-Cellulose
in der OH~- oder Cl"~-Form adsorbiert und mit einer Pufferlösung
eluiert wird, die Natriumchlorid enthält. Während des Eluierens wird die Natriumchloridkonzentration im
Puffer ständig erhöht. Dieses Verfahren ist die wirksamste Methode zur Trennung des Stoffes MC696-SY2 in die Einzelkomponenten
MC696-SY2-A und MC696-SY2-B. Ausserdem können nach diesem Verfahren aktivere Stoffe aus dem Eluat des
vorstehend beschriebenen Äktivkohle-Adsorptionsverfahrens aufbereitet werden. Wenngleich durch das Aktivkohleverfahren
auch insbesondere anorganische Salze vom Stoff MC696-SY2
abgetrennt werden können, so sind doch auch Molekularsiebverfahren zu diesem Zweck recht geeignet. Dabei kann
als Molekularsieb vor allem ein Dextrangel dienen, das mit Epichlorhydrin raumvernetzt ist (Sephadex G-25 oder G-IO).
Auch haben sich Copolymerisate mit grosser spezifischer Oberfläche für die Aufbereitung sehr bewährt. (Amberlite
XAD-2 oder Amberlite XAD-4)
Celit, Bentonit und aktivierte Tone, die als Filtrierhilfen
bekannt sind, wurden dem Kulturbrühenfiltrat in einer Menge
von 10 % (Gewicht pro Volumen) zugesetzt und 30 min lang bei
U09808/1176
Zimmertemperatur geschüttelt. Anschliessend wurde filtriert
und die Aktivität in den Filtraten bestimmt. Die Restaktivität
für die einzelnen Filtrierhilfen betrug 84, 84 bzw. 90 %. Alle verwendeten Filtrierhilfen erwiesen sich damit
als durchaus geeignet.
Aufgrund ihrer nur massigen Stabilität konnten die Stoffe
MC696-SY2-A und -B bisher nicht vollständig rein erhalten
werden. Die Eigenschaften der Inhibitoren gemäss der Erfindung werden daher bei unterschiedlichen Reinheitsgraden
nachstehend beschrieben.
Der Stoff MC696-SY2-B mit einer Potenz von 667O Einheiten/mg
zeigt in der Ninhydrinreaktion eine purpurne Färbung, eine schwach positive Rydon-Smith-Reaktion aufgrund einer Amidbindung,
eine bräunlich-purpurfarbene Anthronreaktion und eine negative Eisen(III)-Chloridreaktion. Weiterhin wurde
der Stoff MC696-SY2-B (66/0 Einheiten/mg) sauer hydrolisiert. Dabei wurden 3,1 mg der Substanz in 0,31 ml 6 η
HCl 16 h lang im verschlossenen Gefäss bei 105 C der Reaktion unterworfen. Als Hydrolysate wurden Ammoniak (1,59 0A),
Asparaginsäure (5,12 %), Glutaminsäure (5,86 %), Glycerin (l,O5 %) und Tyrosin (O,4O %) mit Hilfe eines Aminosäurenanalysators
nachgewiesen. Im Hydrolysat wurde keine Aminoadipinsäure gefunden. Eine Probe des Stoffes MC696-SY2-A
mit einer Potenz von 60400 Einheiten/mg zeigte im UV-Spek-
1% trum ein Maximum bei 270 - 272 nm (E^ 58), während der
ίση
Stoff MC696-SY2-B mit einer Potenz von 6670 Einheiten/mg ein Maximum bei 288 nm (EJ^m 115) zeigte. Die IR-Absorptionsspektren
des Stoffes MC696-SY2-A (60400 Einheiten/mg) und des Stoffes MC696-SY2-B (6670 Einheiten/mg) in Kaliumbromidtabletten
sind in den Figuren 1 bzw. 2 wiedergegeben. Die analytische Ultrazentrifugierung einer 0,5 %igen
Lösung einer Probe des Stoffes MC696-SY2-B (707 Einheiten/mg)
in O,01 m Phosphatpuffer (pH 7,O) ergaben ein Molekular-
409808/117 B
gewicht im Bereich von 113 - 565, entsprechend 0,7 - 0,9
des spezifischen Partialvolumens. Die Elementaranalyse
des Stoffes MC696-SY2-B (6670 Einheiten/mg) führte zu
folgenden Daten: C 38,29; H 5,22r N_3,96; 0 37,50; S 1,12
und Asche 180 mcg/mg.
Die Dünnschichtchromatographie auf Silicagel GF 54 (E. Merck
AG) auf Glasplatten (5 cm χ 20 cm) mit n-Propanol-0,1 m
(pH 7) Phosphatpuffer (7 ; 3) als Laufmittel ergab Rf-Werte
von 0,32 - 0,37 für MC696-SY2-A und von 0,41 - 0,46
für MC696-SY2-B. Mit n-Butanol-Methanol-Wasser (4:1:2)
betrugen die entsprechenden Rf-Werte 0,20 - 0,23 bzw. 0,23 0,25. Die aktiven Stoffe sind bioautographisch. Nach der
Dünnschichtchromatographie auf DEAE-Cellulose (Punktfilm;
5 cm χ 20 cm) wurden mit 0,2 m NaCl in 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7) Rf-Werte von 0,54 - 0,60 für MC696-SY2-A und von
0,42 - 0,53 für MC696-SY2-B erhalten.
Die Kinetik der Wirkung von MC696-SY2-A (2,23 Einheiten/ml) und von MC696-SY2-B (1,47 Einheiten/ml) auf die Hydrolyse
von Benzylpenicillin durch ß-Lactamase-,. von E. coli K-12
W363O R^5 wurde untersucht. Die Hemmung durch MC696-SY2-A
war konkurrierend, während diejenige von MC696-SY2-B nicht
vollständig konkurrierend war.
Durch 3 h langes Einwirken von Penicillinase bei 37 C wurden weder der Stoff MC696-SY2-A noch der Stoff MC696-SY2-B
zerstört, während unter den gleichen Bedingungen benzylpenicillin bereits nach 1 h vollständig hydrolysiert war.
Bei der Injektion von 10 mg einer Probe MC696-SY2-A (17000
Einheiten /mg) in 20 g schwere Mäuse (i.v.) zeigten sich nach 10 Tagen keine Anzeichen einer Toxizität*
£09808/1176
" 26 " 7340005
Weiterhin wurde der Einfluss eines Gemisches der Stoffe
MC696-SY2-A und -B auf die Aktivität von Penicillin gegenüber 2 penicillinresistenten Stämmen von Staphylococcus
aureus untersucht. S. aureus Nr. 154 (resistent gegen Penicillin,
Streptomycin und Tetracyclin) und Nr. B337 (resistent gegen Erythromycin, Oleandomycin,. Leucomycin und Penicillin)
wurden als Testorganismen verwendet. Es wurden Platten hergestellt, die mit je 10 ml geschmolzenem Nähragar beschichtet
waren, der 13OO, 65O, 325, 163 oder O Einheiten des Inhibitors
und 1 % einer 16 h-Testorganismenkultur enthielt. Auf die Agarplatten wurden Scheiben gelegt, die mit Standardbenzylpenicillinlösungen
der Konzentration 8OO, 400, lOO, 25 und 6,5 Einheiten pro ml getr-änkt waren. Nach 16 h Inkubation
bei 37 0C wurde der Durchmesser der Hemmungszone gemessen. Die in der nachstehenden Tabelle 6 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die Inhibitoren die Aktivität
des Penicillins gegenüber den penicillinresistenten S. aureus-Stämmen verstärkten. Auch wurde die Aktivität gegenüb-er
dem empfindlichen S. aureus-Stamm FDA 2O9P verstärkt.
409808/1178
Einfluss von MC696-SY2 auf die Aktivität von Penicillin
G gegen S. aureus
| S. aureus Nr. |
MC696-SY2 in Agar (Einh./ml) |
.3 | 8OC | Durchmesser der Inhibitions zone (mm) und Penicillin G- Konzentration (Einh./ml) der Scheiben |
5) | 400 | 25) | 100 | 25 | .5 | 6.25 | 0 |
| .5 | (10. | ) | 25 | (9. | .25 | 0 | 0 | .75 | 0 | |||
| O | .0 | 12. | 0 | 10 | .5 | 0 | 0 | 0 | ||||
| B154 | 16 | 13. | 5 | 12 | .5 | 10 | 0 | 25 | 0 | |||
| 32 | 16. | 5 | 14 | .5 | 12 | 10 | 25 | 0 | 0 | |||
| 65 | 3 | 24. | 0 | 22 | .5 | 20 | 17 | 25 | 15. | 5 | ||
| 130 | 5 | 13. | 5 | 11 | .75 | 9 | 0 | 5 | 0 | 25 | ||
| 0 | 0 | 14. | 75 | 12 | .5 | 11 | 9 | 25 | 0 |
0
0 0 |
||
| B337 | 16 | 17. | 25 | 15 | .0 | 12 | 10 |
25
5 5 |
0 | 0 | ||
| 32 | 19. | 5 | 18 | .5 | 15 | 13. | 0 | 11. | ||||
| - | 65 |
3
5 0 |
24. | 22 | .0 | 19. | 17. | 14. | ||||
| 130 | - | 34 | im | 30. | 27. | 22. | ||||||
| 209P [empfindli cher Stamm) |
0 | - | 33. 36. 36. |
30. 32. 32. |
to to to
CO CO UI ... |
|||||||
|
16.
32. 65. |
- | 34. | 30. | |||||||||
| 130 | ||||||||||||
| .0 | ||||||||||||
| .5 | ||||||||||||
| .5 | ||||||||||||
| 5 | ||||||||||||
| 0 | ||||||||||||
| 25 | ||||||||||||
| 5 | ||||||||||||
| 5 | ||||||||||||
| 75 | ||||||||||||
| 5 0 0 |
||||||||||||
409808/ 1 1 7 B
no
7340005
In jüngerer Zeit wurden von Streptomyces-Spezies isoliert:
Cephalosporinanaloge A16886A, A16886B und A16884 (R. Nagarajan
u.a.: J. Atner. Chem. Soc. j?3, 23O8-231O (1971); D.R. Brannon
et al.: Origin of glycine from acid hydrolysis of the ß-lactam antibiotic A16886B, Antimicrob. Agents and Chemoth.
1, 242-246 (1972)) und Cephamycin A, B und C (E.O. Stapley
et al.: Cephamycine: Production by Actinomycetes, biological
characteristics and chemical characterization. Abstract, XI. Interscience Conference on Antimicrobial Agents an
Chemotherapy, Atlantic City, N.J., 1971, S. 8; L.D. Cama
et al.: Substituted penicillin and cephalosporin derivatives, I., Stereospecific introduction of the C-6(7)-methoxy
group; J. Amer. Chem. Soc. 94, 1408-1410 (1972)). Die genannten Materialien wurden mit Genehmigung ihrer jeweiligen
Entdecker erhalten und mit den Stoffen MC696-SY2-A bzw. -B gemäss der Erfindung verglichen. Die Ergebnisse dieses
Vergleichs sind in der Tabelle 7 zusammengefasst. Die Stoffe gemäss der Erfindung waren stärkere Penicillinaseinhibitoren
als die Cephalosporxnanalogen, jedoch sehr viel schwächer hinsichtlich ihrer Hemmung des Wachstums von Bakterien als
diese.
4098 0.8/ 1 1 7b
23A0005
Vergleich der Inhibitoraktivität gegen Penicillinase und Bakterien
Substanz
Hemmungsaktivität gegen Penicillinase
M.I.C. (mcg/ml)*
Hemmung MC696-SY2 S.aureus E. coli
(%/mcg Gen (E./mg) d. FDÄ.2O9P NIHJ
(jodometr.)l Aoarplattef
8 4
31.3
16
16
25.0 23.4
A16886A
A16886B
A16884
A16886B
A16884
Cephamycin A
Cephamycin B
Cephamycin C
Cephamycin B
Cephamycin C
MC696-SY2-A
MC696-SY2-B
MC696-SY2-B
8/200 50/220 50/280
13.5/200 18/200 50/215
50/2.6 50/0.78
17.9 13.3 10.7
6.0
10.0
2.0
161 867
500 250
125 125
> 500
1,000 93.5
* Bouillonverdünnungsmethode
** E./mg, d.h. Einheiten/mg, bezeichnet den als Potenz
von MC696-SY2 berechneten Wert
409808/1176
"30" 7340005
In der unter Zusatz des Kobaltsalzes fermentierten Kulturbrühe
wurde der Stoff MC696-SY2 in hoher Konzentration erhalten und wurde eine ausserordentlich aktive Probe des Stoffes
MC696-SY2-A mit einer Potenz von 60400 E./mg isoliert. Diese Probe ist 60 mal aktiver hinsichtlich der Hemmung der
ß-Lactamase als die zuvor erhaltene Substanz und ist einige hundert mal reiner als die Substanz MC696-SY2, deren Eigenschaften
zuvor beschrieben wurden. Die Reinigung dieser Probe des Stoffes MC696-SY2-A mit einer Potenz" von 60400 E./mg
ist zwar bis jetzt noch nicht vollständig abgeschlossen, jedoch seien einige ihrer Eigenschaften hier bereits wiedergegeben
.
Die Probe MC696-SY2-A (mit 604OO E./mg) zeigte einen ID50
(50 % Hemmung) gegen ß-Lactamase bei einer Konzentration von nur 0,0175 meg bei jodometrischer Titration. Die Probe
zeigte die zur Hemmung des Wachstums verschiedener Mikroorganismen geringste erforderliche Wirkkonzentration (bestimmt
durch das Verfahren der Agarverdünnung), und zwar 1OO mcg/ml gegen Bacillus subtilis. Bacillus anthracis
und Proteus species, und 200 mcg/mg gegenüber Staphylococcus species, Micrococcus flavus, Micrococcus lysodeikticus,
Klebsiella pneumoniae, Shigella species und Salmonella typhosa. Penicillinresistente Mikroorganismen wurden
gegen Aminobenzylpenicillin ebenso empfindlich wie andere
gegenüber Penicillin empfindliche Stämme, wenn der Stoff MC696-SY2-A dem Aminobenzylpenicillin (Ampicillin) zugegeben
wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle 8 zusammengefasst.
409808/1176
7340005
Wirkung von MC696-SY2-A auf MIC (mcg/ml) von Aminobenzylpenicillin
gegen verschiedene Mikroorganismen, auch resistente Stämme
Aininobenzylpenicillin (869/ug/mg)
Stoff MC696-SY2-A *
O 0,2
O 0,2
2O (mcg/ml)
12. coli K-12 W363U
K. coli K-12 W 3 G 30 H7r>
K. coli K-12 + WibiO RGN2
i:. iroundii
GN34(>
Protous rottqerii
G'A L 2 4
Proteäs nornani i
ΠΝ921.
Proteus vuKiari s
GN 70
Providence GN 3 27
PsoLidunionas
Serratia GN6 3
Klebsiella pneumoniae ■
GN G 9
Staphylococcus -us S-G42
1.56
->ino
100
>100
100**
>100
>100 12.5
100
>100 1.56
•-JÜO
>100
>100
•-JÜO
>100
>100
100**
100
100
50
12.5
12.5
>100
100
>100
0.7
10 0
100
■■100
100
100
G.25
3.12
>100 100
>100
0.1 0.1
409808/1176
0.0'
0.39
100
>100
100
12.5
| 1. | ,56 |
| 0. | .78 |
| >100 | |
| 50 | |
| 100-25** | |
| •t 0. ι | |
| 0125 |
* Eine Probe des Stoffes MC696-SY2-A mit 604OO E./mg wurde
verwendet.
Par t i al hemmung
Die geeigneten Mengen des Stoffes MC696-SY2, die dem synthetischen
Penicillin zur Durchbrechung der Resistenz der entsprechenden Mikroorganismen geeigneterweise zugesetzt werden
sollen, können in einfacher Weise schnell durch einige Vorversuche geklärt werden, in denen unterschiedliche Dosierungen
des Stoffes MC696-SY2 in Kombination mit einer vorgegebenen Penicillindosis auf einen -speziellen Mikroorganismus
angesetzt werden. Die inhibitorische Mindestkonzentration des Penicillins gegen den jeweiligen Mikroorganismus
kann nach der vorstehend angegebenen Tabelle bei gemeinsamer Applizierung des Penicillins mit dem Stoff MC696-SY2
bestimmt werden.
Bei der Hydrolyse der Probe des MC696-SY-2-A mit dem Wirkungsgrad von 60400 E./mg 16 h lang bei 100 0C in 6 η HCl im
verschlossenen Gefäss wurden folgende Hydrolyseprodukte erhalten: 3,73 ,um (1,26 % pro Mol) Ammoniak, 4,O6 ,um (6,IO %)
Glycin, 4,41 ,um (16,O %) Tyrosin, 1,56 ,um (4,14 %) Asparaginsäure
und 0,75 ,um (2,20 %) Glutaminsäure. Die Analyse der Hydrolysate wurde mit einem Aminosäureanalysator
durchgeführt. Das UV-Absorptionsspektrum dieser Probe zeigte
1%
ein Maximum bei 270 - 272 nm (Ej^ 57,8). Das IR-Absorptionsspektrum dieser Probe in Kaliumbromidtabletten ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die Elementaranalyse dieser Probe ergab die folgenden Werte: 41,46 % C, 4,83 % H, 6,58 % N, 2,07 % S und 27 % Asche. Unter Zugrundelegung der Annahme, dass die Asche aus Na3O2 besteht, sollte der Na-Anteil 15,9 % betragen. Atomabsorptionsspektrophotometrische Messungen zeigten jedoch, dass der tatsächliche Natriumgehalt nur bei 9,3 % lag.
ein Maximum bei 270 - 272 nm (Ej^ 57,8). Das IR-Absorptionsspektrum dieser Probe in Kaliumbromidtabletten ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die Elementaranalyse dieser Probe ergab die folgenden Werte: 41,46 % C, 4,83 % H, 6,58 % N, 2,07 % S und 27 % Asche. Unter Zugrundelegung der Annahme, dass die Asche aus Na3O2 besteht, sollte der Na-Anteil 15,9 % betragen. Atomabsorptionsspektrophotometrische Messungen zeigten jedoch, dass der tatsächliche Natriumgehalt nur bei 9,3 % lag.
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Die Erfindung ist nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen im Detail näher beschrieben.
Streptomyces fulvoviridis MC696-SY2 (registriert unter ATCC 21954), ein Stamm der den Penicillinaseinhibitor erzeugt,
wurde auf 100 ml eines Kulturmediums geimpft, das aus 2 % Glycerin, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,1 % K3HPO4, 0,1 % MgSO4*
7H-O und O,2 % Siliconöl (auf das zehnfache Volumen mit
Wasser verdünnt) bestand und einen pH von 7,0 aufwies. Das Medium war 20 min lang bei 120 C sterilisiert worden. Das
geimpfte Medium wurde 4 Tage lang bei 27 0C schüttelkulüviert.
Die Fermentationsbrühe wurde gesammelt und durch
Zentrifugieren bei 0 - 5 0C von Feststoffanteilen, die auch
das Mycel enthielten, getrennt. Das Kulturbruhenfiltrat
(2OOO ml) enthielt 280 E./ml des Stoffes MC696-SY2. Zu
diesem Filtrat wurden 40 g Aktivkohle im Eisbad bei einem pH von 6 gegeben. Das Gemisch wurde 20 min lang gerührt.
Die Aktivkohle wurde durch Zentrifugieren bei 0-5 C abgetrennt und mit 300 ml Wasser nachgewaschen. Der an
der Aktivkohle adsorbierte Stoff MC696-SY2 wurde mit 30 %igem
n-Propanol (4OO ml) im Verlauf von 10 min bei 40-45 C eluiert. Der pH-Wert wurde mit wässrigem Ammoniak auf 8
eingestellt. Der pH-Wert des Eluats wurde auf 7 eingestellt. Das Eluat wurde dann unter vermindertem Druck bei 40 C
a uf 1/10 seines Volumens eingeengt. Die so erhaltene Ausbeute betrug 52,5 %. Das Konzentrat wurde mit O,005 m Phosphatpuffer
(pH 7) auf 250 ml verdünnt. Die Verdünnung wurde bei 3 0C auf eine mit DEAE-Cellulose (0H~-Form) beschickte
Säule (2,7 cm χ 60 cm) gegeben. Die Säule wurde mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7; 500 ml) gewaschen und mit 0,01 m
Phosphatpuffer (pH 7) mit zunehmender Konzentration von
NaCl eluiert, wobei die NaCl-Konzentration von 0 - 0,2 m, bezogen auf den Puffer, gesteigert wurde (je 11). Das
Eluat wurde in 15 ml-Fraktionen gesammelt. Die Aktivitäten
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der einzelnen Fraktionen wurde nach der Scheibenmethode bestimmt. Der Stoff MC696-SY2-A wurde aus den Fraktionen
- 79, der Stoff MC696-SY2-A1 aus den Fraktionen 83 - 95
und der Stoff MC696-SY2-B aus den Fraktionen 105 - 125 erhalten. Während die Komponenten A und B stets erhalten
wurden, wurde die Komponente A' unter gewissen Fermentationsbedingungen nicht erhalten. Jede der aktiven Komponenten
wurde an Aktivkohle adsorbiert, mit 3O %igem n-Propanol
in Wasser aus der zuvor mit Wasser gründlich gewaschenen Aktivkohle eluiert, unterhalb von 4O C eingeengt,
in Methanol suspendiert, durch Zusatz von Äther ausgefällt und anschliessend unter vermindertem Druck zu einem
Pulver getrocknet. Es wurden 55,8 mg (187 E./mg) und 7,8 mg (1127 E./mg) des Stoffes MC696-SY2-A, 29,O mg (84,7 E./mg)
und 9,6 mg (68,0 E./mg) des Stoffes MC696-SY2-A' und 41,4 mg (592 E./mg) und 3,5 mg (14,0 E./mg) des Stoffes MC696-SY2-B
erhalten. Die Ausbeute der Gradientenchromatographie betrug 26,6 %.
Das Kulturbrühenfiltrat (2250 ml, 323 E./ml), das nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten worden war,
wurde bei einem pH von 5 an Aktivkohle adsorbiert, mit 30 %igem n-Propanol eluiert und auf 100 ml eingeengt (31,2 %
Ausbeute). Das Konzentrat wurde mit O,Ol m Phosphatpuffer
(pH 7) auf 400 ml verdünnt und in einer mit DEAE-Cellulose
beschickten Säule (3 cm χ 75 cm) in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise fraktioniert. Bei einer Sammlung des
Eluats in 50 ral-Fraktionen trat eine schwache Aktivität
in den Fraktionen 43 - 67, eine Aktivität von 693OO Einheiten in 660 ml für den Stoff MC696-SY2-A in den Fraktionen
1Ol - 144 und eine Aktivität von 29900 Einheiten in 64S ml für den Stoff MC696-SY2-B in den Fraktionen 145
-187 auf. Nach der Behandlung der vereinigten Fraktionen
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in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden die den Stoff A bzw. den Stoff B enthaltende Konzentrate getrennt
voneinander auf zwei gleiche Säulen gegeben, die Dextran enthielten, das mit Epichlorhydrin quervernetzt war (Sephadex
G-25t fein). Es wurde mit destilliertem Wasser entwickelt,
in IO ml-Fraktionen gesammelt und lyophilisiert. Es wurde ein weisses bis hellbraunes Pulver der folgenden
Spezifizierung erhalten: MC696-SY2-A: 64,7 mg (161 E./mg) in Fraktion 9; 43,3 mg (154 E./mg) in Fraktion 10; 21,0 mg
(113 E./mg)τ MC696-SY2-B: 16,9 mg (107 E./mg) in Fraktion 1O; 8,1 mg (867 E./mg) in Fraktion 11: 4,2 mg (307 E./mg)
in Fraktion 12. Die gesamte Ausbeute betrug 4,58 %. Alle vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte wurden in einem
Raum durchgeführt, der so kühl wie möglich gehalten wurde,
d.h. bei ca. 3 0C. Das aus der Fraktion 9 erhaltene Pulver
des Stoffes MC696-SY2-A (161 E./mg) ergab nach jodometrischer Titration einen ID- von 2,6 meg. Die Inhibitorkonzentration
gegenüber Staphylococcus aureus 2O9P betrug lOOO mcg/ml und gegenüber Escherichia coli NIHJ 250 mcg/ml.
Die aus der Fraktion 11 erhaltene Substanz MC696-SY2-B
(867 E./mg) zeigte einen ID5 von O,76 meg und inhibierte
S. aureus 2O9P und E. coli NIHJ bei 93,7 bzw. 23,4 mcg/ml.
Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden 2250 ml Kulturbrühenfiltrat (135 E./mg) hergestellt und lieferten
550 ml eines Aktivkohleeluats (Ausbeute 65,4 %). Das bei
4 0C auf 198 ml konzentrierte Eluat (695 E./ml) wurde auf
eine mit DEAE-Cellulose in der Cl~-Form beschickte Säule (3 cm χ 39 cm) gegeben, die mit 0,Ol m Phosphatpuffer (pH 7,0)
vorbehandelt worden war. Die Säule wurde nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Gradientenchromatographieverfahren "
eluiert. Das Eluat wurde in 17 ml-Fraktionen gesammelt. Eine schwache Aktivität trat in den Fraktionen 21 - 31
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auf (165 ml, 6,7 E./ml). Der Stoff MC696-SY2-A (525 ml: 125
E./ml) trat in den Fraktionen 71 - 101 und der Stoff MC696-SY2-B (335 ml; 90,7 E./ml) in den Fraktionen 115 - 134 auf.
Die Ausbeute betrug 32 %. Diese Fraktionen wurden lyophilisiert und zur Reinigung mit Hilfe eines Absorbens (Amberlite
XAD-2) entsalzt. Der Stoff MC696-SY2-A wurde in 14,8 ml Wasser auf eine mit Amberlite XYD-2 beschickte Säule (1,5 cm
χ 25 cm) gegeben, die mit destilliertem Wasser entwickelt wurde. Beim Sammeln der Eluate in 10 ml-Fraktionen wurden
die eine Aktivität aufweisenden Fraktionen 8-20 lyophilisiert, wobei die Fraktionen 6-7, die mit Salzen
eine Aktivität aufwiesen, erneut auf einer ähnlichen Säule chromatographiert wurden. Auf diese Weise wurden 73,3 mg
des Stoffes MC696-SY2-A mit einer Wirkkonzentration von 144 E./mg erhalten. In gleicher Weise wurden 15 ml einer
Lösung des. Stoffes MC696-SY2-B in einer Säule (2 cm χ 14 cm) behandelt, wobei die Fraktionen 8-11 lyophilisiert und
die Fraktionen 6-7 erneut chromatographiert wurden. Auf diese Weise wurden 19,2 mg des Stoffes MC696-SY2-B mit
einer Wirkkonzentration von 345 E./mg erhalten. Die Ges amtausbeute betrug 5,7 %.
Von einer Schrägkultur wurde eine Schlaufe voll von Organismen des Stammes MC696-SY2 (FERM-P Nr. 1504; ATCC 21954)
genommen und zum Impfen von 80 ml eines Kulturmediums in einer 500 ml-Schutt elf lasche verwendet. Das Kulturmedium
bestand aus 2 % Glycerin, 1,5 % Maisquellflüssigkeit, 0,1 %
K2HPO4 und 0,05 % MgSO4*7H2O bei einem pH von 6,8. Das
Kulturmedium war 20 min lang bei 120 0C sterilisiert worden.
Das auf diese Weise geimpfte Medium wurde 24 h lang bei 28 C auf einer Schüttelmaschine schüttelkultiviert. Ein
Milliliter dieser Kulturbrühe wurde zum Impfen von 30 ml eines sterilisierten Kulturmediums (pH 6,8) in einem 25Ο ml-
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Erlenmeyerkolben verwendet, das aus 2 % Glycerin und 1,5%
Sojabohnenmehl mit Spuren verschiedener Metallsalze bestand. Die Lösung wurde 2 Tage lang auf der Rotationsschüttelmaschine
schüttelkultiviert. Die Hemmungsaktivität der Kulturbrühe gegen Penicillinase wurde auf der Agarplatte untersucht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 9 zusammengestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Zusatz
von 0,1 % K2HPO4 und 0,0005 % Kobaltchlorid die Produktion
der Inhibitorsubstanz erhöhten. Auch wurde in der gleichen
Weise der Einfluss einer Zugabe verschiedener Mengen von Kobaltchlorid und Kaiiumhydrogenphosphat untersucht. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 9 und 10 zusammengestellt.
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Tabelle 9 Der Einfluss von Metallsalzspuren auf die Produktion der Inhibitor subs tanz
CD CD σ co
| K2HPO4 | MgSO4-7H2O | CoCl | 2'6H2° | ZnSO | 4.7H2O | FcSO4.7H2O | MnSO.-4H0O |
| 0.1% | 0.1% | 0 % | 0 % | 0 % | 0 % | ||
| 0.1 | 0.1 | 0 | 0 | 0.0005 | 0.001 | ||
| 0.1 | 0.1 | 0. | 0005 | 0. | 0005 | 0 | 0 |
| 0.1 | 0.1 | 0. | 0005 | 0. | 0005 | 0.0005 | 0.001 |
| 0.1 | 0 | 0 | 0. | 0005 | 0 | 0.001 | |
| 0.1 | 0 | 0 | 0. | 0005 | 0.0005 | 0 | |
| 0.1 | 0 | Ό | 0005 | 0 | 0 | 0.001 | |
| 0.1 | 0 | 0 | 0005 | 0 | 0.0005 | 0 | |
| 0 | 0.1 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 0.1 | 0 | 0 . | 0.0005 | 0.001 | ||
| 0 | 0.1 | 0 | .0005 | 0 | .0005 | 0 | Ό |
| 0 | 0.1 | 0 | .0005 | 0 | .0005 | 0.0005 | 0.0001 |
| ■ ο | 0 | 0 | 0 | .0005 | 0 | 0.0001 | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | .0005 | 0.0005 | 0 | |
| 0 | 0 | 0 | .0005 | 0 | 0 | O.OOOl | |
| 0 | 0 | 0 | .0005 | 0 | 0.0005 | . 0 |
UJ 00
•ΟΙ}
3
jn
(Tabelle 9 Fortsetzung)
ο cc oo
ο oo
| Na2M0O4.2H2O | CuSO | 4.5H2O |
| 0 % | 0 % | |
| 0.0005 | 0. | 0005 |
| 0.0005 | 0. | 0005 |
| 0 | 0 | |
| ■0 | 0. | 0005 |
| 0.0005 | 0 | |
| 0.0005 | 0 | |
| 0 | 0. | 0005 |
| 0 | 0. | 0005 |
| 0.0005 | 0 | |
| 0.0005 | 0 | |
| 0 | 0. | 0005 |
| 0 | 0 | |
| 0.0005 | 0. | 0005 |
| 0.0005 | 0. | 0005 |
| 0 | 0 |
Inhibitoraktivität der Kulturbrühe (Einh./ml)
| 0 | |
| 0 | |
| 2, | 500 |
| 2' | 900 |
| 3, | 530 |
| 600 | |
| 6, | 300 |
| 5, | 930 |
| 3, | ,300 |
| 0 | |
| 0 | |
| 0 | |
| 900 | |
| 0 | |
| 2 | ,167 |
| 1 | ,630 |
OO
cn
Einfluss von Kobaltchlorid und Kaiiumhydrogenphosphat
auf die Produktion
| COCl2. | 6H2O | Kalium- phosphat |
0.05% | Aktivität der Brühe (E./ml) |
| 0 | .on% | K2HPO4 | 0.1 | 11,200 |
| Il | K2HPO4 | 0.1 | 5,930 | |
| Il | KH2PO4 | 0.05 | 6,867 | |
| 0 | .0005S | K2HPO4 | 0.1 | 8,400 |
| It | K2HPO4 | 0.1 | 6,867 | |
| ti | KH2PO4 | 0.05 | 16,330 | |
| 0 | .00025% | K2HPO4 | 0.1 | 9,130 |
| Il | K2HPO4 | 0.1 | 12,930 | |
| Il | KH PO4 | 16,330 | ||
Ein Medium Nr. 1 mit 1,5 % Sojabohnenmehl, 2 % Glycerin, 0,1 % K2HPO4 und 0,05 % MgSO4'7H2O wurde bei einem pH von
6,5 sterilisiert. Weiterhin wurde ein Medium Nr. 2 hergestellt und bei einem pH von 6,2 sterilisiert, das statt
des Magnesiumsulfats des Mediums Nr. 1 O,OOO5 % CoCl *6H„O
409.808/1
enthielt. Eine Schüttelkultur des Stammes MC696-SY2 (ATCC
21954), der den beiden vorgenannten Medien aufgeimpft worden
war, wurde in der im Beispiel 4 beschriebenen Weise hergestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 11
zusammengestellt. 15 1 jedes der so geimpften Medien wurde in einem 30 1-Fermentationskolben unter Rühren fermentiert.
Die Rührgeschwindigkeit betrug 250 Upm.Die Belüftung betrug 15 l/min. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 12
zusammengestellt.
Einfluss von Kobaltverbindungen in Schüt telkultur en
Aktivität der Kulturbrühe
Exp. Nr. Medium 2 Tage 3 Tage ^_
pH Einh./ml pH Einh./ml
(1) 6,O 433 5,8-6,O 267
(2) 5,8 2667 5,8 733
(1) 5,8 667 5,8 466 2
(2) 6,0 3733 6,0 11333
Einfluss von Kobaltverbindungen im Kolbenfermentor
Aktivität der Kulturbrühe
24 h 45-47 h
| Medium | PH | Einh./ml | pH | Einh./ml |
| (D | 6,6 | 100 | 6,7 | 267 |
| (2) | 6,2 | 867 | 6,1 | 28000 |
| (3) | 6,3 | 1533 | 5,9 | 120OO |
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Das Medium Nr. 2 des Beispiels 5 zeigte nach 47 h Kultivierung und Inkubation in einem Kolbenfermentor einen pH
von 6,8 und enthielt 28OOO Einheiten/ml des Stoffes MC696-SY2. Das KuIturfiltrat enthielt 204,7 χ ΙΟ6 Einheiten des
Stoffes MC696-SY2 und wurde auf einen pH von 6 eingestellt. Anschliessend wurde unter Rühren und Kühlen durch Adsorption
an 140 g Aktivkohle extrahiert. Durch Gefrierzentrifugierung wurde die Aktivkohle abgetrennt und mit 9OO ml kaltem Wasser
nachgewaschen. Die Hälfte der Kohle wurde mit 12OO ml 5O %igem
wässrigen Aceton 10 min lang bei 40 - 45 0C gerührt und
mit wässrigem Ammoniak bei einem pH von 8 gehalten. Nach dem Entfernen der Kohle durch Filtrieren wurden 1090 ml
eines Eluats erhalten, das 71,373 χ 10 Einheiten des Stoffes MC696-SY2 enthielt. Das Eluat wurde auf pH 7 eingestellt
und unterhalb von 40 0C unter vermindertem Druck auf 170 ml eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde
mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) auf 500 ml verdünnt. Die Lösung wurde im Kaltraum (5 0C) auf eine mit DEAE-Cellulose
in der OH~-Form beschickten Säule (4,3 cm χ 73 cm) gegeben.
Nach dem Waschen der Säule mit 2 1 eines 0,01 m Phosphatpuffers (pH 7) wurde eine Gradxenteneluation durchgeführt,
wobei 2 1 eines 0,01 m Phosphatpuffers (pH 7) und 2 1 des gleichen Puffers mit zusätzlich O,2 m NaCl verwendet
wurden. Das Eluat wurde in 17 ml-Fraktionen gesammelt und auf die Inhibitoraktivität gegenüber Penicillinase untersucht.
In den Fraktionen 15 - 49 wurden 8870 Aktivitätseinheiten und in den Fraktionen 77 - 105 1O50O Aktivitäts-
IC .3
einheiten gefunden. 19,4 χ 10 Einheiten des Stoffes MC696-SY2-A
wurden aus den Fraktionen 151 - 251 und 693 χ 10' des Stoffes MC696-SY2-B aus den Fraktionen 271 - 350 erhalten.
Insgesam-71,8 %,, eluiert.
halten. Insgesamt wurden 2,01 χ 10 Einheiten, entsprechend
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73Α0Π05
Der Stoff MC696-SY2-A in den Fraktionen 151 - 250 wurde vereinigt und auf eine Säule gegeben, die 2 % (Gewicht pro
Volumen) Kohlenstoff enthielt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Der Kohlenstoff wurde bei pH 8 mit 5O %igem
wässrigen Aceton eluiert, und zwar einmal mit dem 20fachen Volumen, bezogen auf das Volumen der Aktivkohle, an 50 %igem
wässrigen Aceton und zweimal mit dem lOfachen des Volumens, bezogen auf das Volumen der Aktivkohle, an 50 %igem wässrigen
Aceton. Die Eluate wurden vereinigt und unterhalb von 40 0C
unter vermindertem Druck auf 10 ml eingeengt, die eine Aktivität von 18933 χ 10 Einheiten aufwiesen. Dieses Konzentrat
wurde auf eine mit Sephadex G-IO (fein) beschickte Säule gegeben und mit destilliertem Wasser entwickelt. Das
Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Jede der aktiven
Fraktionen wurde lyophilisiert. Dabei wurden folgende Fraktionen erhalten:
Fraktion 12: 94,5 mg (1840 E./mg), insgesamt 173 χ IO Einheiten;
Fraktion 13: 54,7 mg (28400 E./mg), insgesamt 1553 χ 10 Einheiten; Fraktion 14: 60,8 mg (60400 E./mg), insgesamt
3667 χ IQ3 Einheiten; Fraktion 15: 54,8 mg (43400 E./mg),
insgesamt 2380 χ 10 Einheiten; Fraktion 16: 12,6 mg (14800 E./mg), insgesamt 187 χ 10° Einheiten und Fraktion 17: 5,1 mg
(1690 E./mg), insgesamt 8,7 χ 10 Einheiten. Insgesamt wurden
3
7969 χ 10 Einheiten, entsprechend einer Ausbeute von 41,1 %, erhalten. Die vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte wurden in einem Raum durchgeführt, der so kalt wie möglich gehalten wurde (ca. 3 C). Das aktivste Pulver, das aus der Fraktion 14 erhalten wurde, zeigte einen IDgo von 0,0175 meg nach jodometrischer Bestimmung und inhibierte Staphylococcus aureus FDA 2O9P bei einer Konzentration von 133 mcg/ml und den Stamm NIHJ von Escherichia coli bei einer Konzentration von 5O mcg/ml, wobei die letztgenannten Angaben nach der Verdünnungsmethode bestimmt wurden.
7969 χ 10 Einheiten, entsprechend einer Ausbeute von 41,1 %, erhalten. Die vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte wurden in einem Raum durchgeführt, der so kalt wie möglich gehalten wurde (ca. 3 C). Das aktivste Pulver, das aus der Fraktion 14 erhalten wurde, zeigte einen IDgo von 0,0175 meg nach jodometrischer Bestimmung und inhibierte Staphylococcus aureus FDA 2O9P bei einer Konzentration von 133 mcg/ml und den Stamm NIHJ von Escherichia coli bei einer Konzentration von 5O mcg/ml, wobei die letztgenannten Angaben nach der Verdünnungsmethode bestimmt wurden.
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? 3 A O O O
Der Stoff MC696-SY2-A wurde hinsichtlich seiner antagonistischen Wirkung gegenüber einer ß-Lactamase# die von penicillinresistenten
Staphylococci erzeugt wurde, in vivo getestet. Der Stamm Staphylococcus aureus 193, der gegen PenicdLlin,
Tetracyclin, Streptomycin resistent ist, wurde 18 h lang bei 37 0C in einer 5 %igen Herzinfusionslösung aktiviert.
Die Kulturlösung wurde mit einer sterilen Mucinsuspensxon auf das 5fache verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde in
einer Dosierung von 0,5 ml je Versuchstier Mäusen intraperitoneal eingeimpft. 1,5 h nach der Infektion wurden die
Mäuse ebenfalls intraperitoneal mit einem Gemisch des Stoffes MC696-SY2-A und Penicillin G bzw. mit Penicillin G allein
behandelt. Ein Beispiel der erhaltenen Ergebnisse ist in der Tabelle 13 wiedergegeben, wobei sich die Daten auf einen
Zeitpunkt 48 h nach der Injektion beziehen.
Penicillin G Anzahl der überlebenden Tiere/
_.. -u /„ Anzahl der behandelten Tiere
E mn./Maus
Stoff MC696-SY2-A lOOOO Einh./Maus 0 Einh./Maus
0 0/8 0/16
20 3/8 0/8
78 3/8 O/8
313 3/8 O/8
1250 7/8 0/8
5000 6/8 0/8
409808/1 176
7340005
Dieses Beispiel kann mit gleichem Erfolg wiederholt werden, wenn statt der in dem vorstehenden Beispiel beschriebenen
Bedingungen andere im Rahmen der Beschreibung allgemein oder spezifisch beschriebenen Kulturmedien und bzw. oder
andere Inkubationsbedingungen und bzw. oder andere Aufbereitungsverfahren für die ß-Lactamaseinhibitoren gemäss
der Erfindung verwendet werden. Die speziellen, vorstehend beschriebenen Ausführungsformen können von Fächmann nach
Kenntnisnahme der Erfindung variiert werden.
Λ 09808/1176
Claims (5)
1. Mit MC696-SY2-A und MC696-SY2-B bezeichnete Stoffe mässiger
Stabilität und saurer Natur, die die Aktivität von ß-Lactamase inhibieren, in Wasser löslich sind und in
Butanol, Essigsäureäthylester, Äthyläther, Chloroform und Benzol unlöslich sind und zu Aminosäuren hydrolysierbar
sind; MC696-SY2-A inhibiert weiterhin das Wachstum von Bacillus subtilis. Bacillus anthracis, Proteus-Arten,
Staphylococcus aureaus, Micrococcus flavus, Micrococcus
lysodeikticus, Klebsiella pneumoniae, Shiqella-Arten und
Salmonella typhosa, liefert bei der Elementaranalyse Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Schwefel und eine
Natrium enthaltende Asche und bei der Hydrolyse mit 6n Salzsäure nach 16 h bei 100 0C im geschlossenen Gefäss
Ammoniak, Glycin, Tyrosin, Asparaginsäure und Glutaminsäure und nach dem Verpressen in Kaliumbromid zu Tabletten das
in Fig. 1 gezeigte IR-Absorptionsspektrum; MC696-SY2-B
zeigt bei der Ninhydrinreaktion eine Purpur färbung, eine
auf eine Amidbindung zurückgeführte schwach positive R/don-Smith-Reaktion, eine bräunlich-purpurne Färbung bei
der Anthron-Reaktion und eine negative Eisen(III)-chloridreaktion,
liefert bei der Elementaranalyse Kohlenstoff,
Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Asche und bei der Hydrolyse mit 6n Salzsäure nach 16 h bei 105 0C
im verschlossenen Gefäss Ammoniak,Asparaginsäure, Glutaminsäure
und Glycin, jedoch keine Aminoadipinsäure, und zeigt nach dem Tablettieren in Kaliumbromid das in Fig.
gezeigte IR-Absorptionsspektrum.
2. Verfahren zum Herstellen der mit MC696-SY2-A und MC696-SY2-B
bezeichneten Stoffe nach Anspruch 1, dadurch ge-
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kennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces
fulvoviridis unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium kultiviert, das assimilierbaren Kohlenstoff und
Stickstoff enthält, dass man die beiden Stoffe in der Kultur ansammelt und im Gemisch aus dieser isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit ATCC 21954 bezeichneten Stamm von Streptomyces fulvoviridis
2-5 Tage lang bei 25-35 C kultiviert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit ATCC 21954 bezeichneten
Stamm von Streptomyces fulvoviridis in einem Kulturmedium kultiviert, das zusätzlich mindestens ein
wasserlösliches Kobaltsalz enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das isolierte MC696-SY2A/MC696-SY2-B-Stoffgemisch
chromatographisch trennt.
40 9-8 08/1176
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- 1973-08-08 FR FR7329596A patent/FR2195682B1/fr not_active Expired
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