DE2657599C2

DE2657599C2 - Verfahren zur Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxycephalosporinderivaten

Info

Publication number: DE2657599C2
Application number: DE2657599A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Ageo Saitama Gushima; Toshiaki Tokio/Tokyo Miyoshi; Keisuke Wako Saitama Murakami; Yoshihiko Kawagoe Saitama Oka; Takashi Tokio/Tokyo Osono; Takeshi Tokio/Tokyo Saito; Toshio Tokio/Tokyo Sasaki; Kiyoshi Susaki; Isao Tokio/Tokyo Takahashi; Shuichi Ageo Saitama Takamura; Shunichi Omiya Saitama Watanabe; Hiroshi Omiya Saitama Yamaguchi
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-12-25
Filing date: 1976-12-18
Publication date: 1986-11-20
Also published as: CA1093997A; US4656262A; FR2336136B1; PT65977B; DK146100C; SE7614516L; NO149112B; MX3916E; ES454469A1; AU509288B2; DK146100B; CH631487A5; AU2092576A; NL189767C; SE435288B; DK579776A; NO149112C; GB1573718A; PT65977A; NL189767B

Description

SS XS^ \

CH₂S-R²
COOM

worinR²eine l-Methyl-lH-tetrazol-5-yl-grappe,eine l,3,4-Thiadiazol-2-yl-gruppe,eine5-Methyl-I,3,4-thiadiazol-2-yl-gruppe oder eine 5-Carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasseirstoffatom, Alkalimetall, Erdalkalimetall, Schwermetall oder Basen, die quatemäre Salze oder Aminsalze bilden, darstelit,dadurch gekennzeichnet, daß StreptomycesoganonensisATCCSl 167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heterocyclischen Thiols mit der Formel

worin R² die vorstehend genannte Bedeutung hat, oder dessen Salz oder eine Verbindung mit der Formel R²—S—S—R²

worin R² die gleiche schonsenannte Bedeutung hat, enthält, um 7-Methoxycephalosporindeiivate mit der Formel (II)

HOOC OCH₃

\h-(chaconh-|—Λ

Die Ernndung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxycephalosporinderivaten der allgemeinen Formel (1)

OCH,

S
HOOC—(CH₂)jCONH

COOM

worin R² eine l-Methyl-lH-tetrazol-5-yl-gruppe, eine l,3,4-Thiodiazol-2-yl-gruppe, eine5-Methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl-gruppe oder eine 5-Carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasserstoffatom, Alkali-

O T CH₂S-R²

COOM

herzustellen, worin R² und M die vorstehend genannte Bedeutung haben, und dann aerob auf die Verbindun- |

gen der allgemeinen Formel (II) das Mycel der D-Aminosäure oxidierende Enzyms.bildt-Vien Stämme Trigonopsis variabilis IFO 0671 oder IFO 0755 oder ein diese Enzyme enthaltendes Behandlungsprodukt aus dem Mycel zur Einwirkung gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Behandlungsprodukt des Mycels mit gesteigerter Enzymaktivität der durch Anwendung physikalischer und/oder chemischer Einwirkungen gewonnene zellfreie Extrakt eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Behandlungsprodukt des Mycels teilweise oder vollständig gereinigtes, D-Aminosäure oxydierendes Enzym, das aus dem zellfreien Extrakt durch Anwendung bekannter Enzymabtrennungs- und Reinigungsmethoden gewonnen wurde, eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das partiell oder ganz gereinigte, D-Aminosäure oxydierende Enzym mit einem wasserunlöslichen Polymer oder einem anorganischen Träger, durch physikalische oder chemische Mittel kombiniert, nach einer Aktivationsbehandlung eingesetzt wird.

metall, Erdalkalimetall, Schwermetall oder Basen, die quatemäre Salze oder Aminosalze bilden, darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz einecs heterocyclischen Thiols mit der Formel

R²SH

worin R- die gleiche schon genannte Bedeutung hat, enthält, um T-Methoxycephalosporinderivate mit der Formel (II)

HOOC OCH₃

\ I A

CH-(CHz)₃CONH-

Η,Ν

^NCH₂S— R²

I COOM

§ herzustellen, worin R² und M die vorstehuad genannte Bedeutung haben, und dann aerob auf die Verbindungen

U der allgemeinen Formel (II) das Mycel der D-Aminosäure oxidierende Enzyme bildenden Stämme Trigonopsis

I variabilis IFO 0671 oder IFO 0755 oder ein diese Enzyme enthaltendes Behandlungsprodukt aus dem Mycel zu

1 Einwirkung gebracht wird.

% Die vorstehende erste Stufe des Verfahrens dieser Erfindung ist bereits in dem deutschen Patent 26 60 659 mit

2 dem gleichen Anmeldetag geschützt. Im Rahmen des vorliegenden Patents wird auf einen Elementenschutz für p die erste Umsetzungsstufe hier verzichtet.

I Produkte dieser Erfindung sind:

% 7-(4-C'arboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-

I ^('-cephem-4-carbonsäure,

« 7-{4-Carboxybutyramido)-3-( 1-methyl-l H-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-.4³-cephem-

g 4-carbonsäure,

p 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-2f"'-cephem-

i 4-carbonsäure,

v\ 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-J³-cephem-4-carbonsäure

I sowie die Salze dieser Verbindungen mit den im Hauptanspruch angegebenen Kationen M.

ί Einigt 7-Methoxy-3-heterocyclothiomethylcephalosporine sind in der GB-PS 13 21412 (1970) als durch che-

I mische Synthese erhältliche Verbindungen beschrieben, j-doch sind in dieser britischen Patentschrift keine

II praktischen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen angegeben.

ί Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der vorstehenden Cephdlosporinderivate

ι; durch Fermentation zur Verfugung zu stellen.

Ccphalophorine besitzen ausgezeichnete antirnikrobielle Aktivitäten gegen gram-positive und gram-negative ;;; Bakterien, und unter diesen Verbindungen besitzen die Cephalosporinderivate mit einer Methoxygruppe in der

'A 7-Position und einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der3-Position ganz ausgezeichnete Wirkung bei der

j Behandlung von ernsthaften Erkrankungen, die durch die Infektion mit Bakterien, wie Pseudomonas und Pro-

5 leus hervorgerufen werden, gegen die gewöhnliche Antibiotica nicht wirksam sind, oder die durch die Infektion

;; mit den Bakterien hervorgerufen werden, die nicht empfindlich sind gegen gewöhnliche Cephalosporine,

p welche keine Methoxygruppe in der 7-Position aufweisen.

ί Diese Verbindungen werden gewöhnlich hergestellt, indem zuerst die entsprechenden Verbindungen, die

■ eine Acetoxymethylgruppe oder eine Carbamoyloxymetbvlgrvppe in der 3-Position aufweisen, hergestellt wer-

j den, und zwar durch ein Fermentationsverfahren, und dann werden diese Verbindungen mit einer heterocycli-

'■' sehen Thiolverbindung umgesetzt.

Die Verbindungen der Formel (II) besitzen selbst ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten.
' Die Verbindungen der Formel (II) besitzen die Eigenschaften wie ein amphoteres Material, denn die Verbindungen haben eine Aminogruppe und zwei Carboxygruppen im Molekül, und dadurch ist die Isolierung und . Reinigung der hergestellten Verbindungen mühsam. Die aus den Verbinuungen der allgemeinen Formel (II)

: hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) haben dagegen deutlich saure Eigenschaften,, die die

Isolierung und Reinigung der Verbindungen erleichtert, zumal die Verbindungen in organischen Lö^urigsmitteln löslich sind, wodurch sich Vorteile für eine nachfolgende Reaktion ergeben. Daher sind die Verbindungen ebenfalls als Zwischenprodukte geeignet.

Als Mikroorganismus, der zur Herstellung der 7-Methoxycephlosporin-Antibiotica der Formel (II) in erster Stufe Verwendung findet und der zu den Streptomyceten gehört, wird in dieser Erfindung ein neuer Stamm benutzt, nämlich Streptomyces oganonensis Y-G19Z, der zuvor von den Erfindern aus dem Erdboden bei der Stadt Ogano, Chichitugun, Bezirk Saitama (Japan) isoliert worden ist. Dieser Stamm ist in dem Institut für

Mikrobielle Industrie, Zweigstelle für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, Japan, unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM-P 2725 und auch in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (USA) unter ATCC No. 31 167 hinterlegt worden. Die mythologischen Eigenschaften des Stammes sind die folgenden:

I. Morphologische Charakteristiken von Streptomyces oganonensis ATCC 31167

Der Stamm wachst sowohl auf natürlichen wie auch auf synthetischen Medien unter Bildung eines gut verzweigten Substratmycels, während die Bildung von atmosphärischem Mycel nicht ausreichend ist, da die Sporenbildung zu gering ist. Die Sporenketten sind gerade, gehören zum R- (rectus) oder RF- (Rectiflcxiblcs) Typ und tragen 10 bis 50 Sporen in jeder Kette. Die Sporen sind elliptisch, sphärisch oder zylindrisch geformt und weisen eine Größe von 0,45 bis 0,60 x 0,55 bis 0,90 μ auf. Die Sporenoberfläche ist glatt. Es werden weder Flagellaten-Sporen noch Sporangium beobachtet.

II. Kultur-Charakteristika des Stammes S. oganonensis ATCC 31167

Medium

Wachstum

Atmosphärisches Mycel Lösliches Pigment Czapek's Agar Glukose Czapek's Agar

sehr gering weiß

gut cremegelb

Glukose Asparagin-Agar gut

weiß

Glycerin Asparagin-Agar gut

Anorganischer Salz-Stärke-Agar

Tyrosin-Agar

weiß bis gelblich weiß

gut

gelblich grau bis

schwach gelblich braun

gut schwach gelb

Eisen und Hefeextrakt· gut Tyrosin-Agar schwach gelb bis

gelblich-grau

Nährboden-Agar Bennett's Agar

gut

spärlich weiß

leidlich gelblich-grau

gering weiß

gering

weiß bis gelblich weiß

gering gelblich grau

gut

bräunlich weiß bis

gelblich grau

gut, pulverig

schwach gelblich-braun schwach orange bis

schwach braun

gut

schwach gelblich-braun bräunlich-grau, schwach

orange bis schwach rosa

Calciummalat-Agar Kartoflelstücke

mäßig cremefarbig

gut

kein

gut

schwach gelblich-braun gelblich-grau bis

schwach bräunlich grau

BIut-Agar

gut

olive-grau bis dunkel olive grau

Loeffer's Serum Medium gut

kein

nein

sehr gering

nein nein nein

schwach

schwach gelblich grau

sehr gering

hell bräunlich-grau

schwach gelblich-braun

sehr schwach

kein

bräunlich-grau bis dunkel gelblich-braun

gelblich-grau bis dunkel rötlich-braun

kein

III. Physiologische Eigenschaften von S. oganonensis ATCC 31167 Tyrosin-Formation

Nitrat-Reduktion Magermilch-Koagulation Magermilch-Peptonisation

negativ positiv

positiv, schwach positiv, schwach

Hydrolyse von Stärke positiv

Verflüssigung von Gelatine positiv, schwach

Ccllulose-Abbau negativ

llämolyse positiv

Löslichmachung von Calciummalat positiv s

Ausnutzung von Kohlenstoffverbindungen durch S. oganonensis ATCC 31 167

KohlenstolTquelle Ausnutzung 10

Glukose +

Arabinose +

Sukrose

Xylose +

Inositol

Mannitol +

Fruktose +

Rhamnose - _Vi

Raff! nose -

Charakteristische Merkmale für Streptomyces oganonensis ATCC 31 167-Stamm können wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Es gehört zu dem nicht-chromogenen Streptomyces-Stamm;

2. Sein atmosphärisches Mycel ist gerade ohne Verzweigung (R- oder RF-Typ);

3. Sporen sind sphärisch oder ellyptisch;

4. Sporenoberfläche ist glatt;

5. Hs gibt schwach gelblich graue bis schwach gelblich braune Gewächse auf verschiedenen Medien; 30

6. Die Farbe des sphärischen Mycels ist bräunlich-weiß, gelblich-weiß und gelblich-grau;

7. Die erzeugte antibiotische Substanz ist das Natriumsalz der 7-(5-Amino-5-carboxyvalerylamino)-3-sulfothiomcthyl-7a-methoxy-.d^;'-cephem-4-carbonsäure und gehört zur 7-Methoxycephalosporingruppe.

Bei der Durchforschung bekannter Stämme, die die vorstehenden Eigenschaften aufweisen, können als am 35 nächsten kommende Streptomyceten die folgenden angesehen werden:

Streptomyces globisporus, beschrieben in S. A. Waksman: »The Actinomycetes« 2,218 (1961) und 1 nternational Journal of Systematic Bacteriology, 18» (4) 324-325 (1968).

Wenn man jedoch den bekannten S. globisporus, der in der vorstehenden Literatur beschrieben ist, mit dem Stumm ATCC 31 167 vergleicht, weicht dieser in den folgenden Eigenschaften, die in der Tabelle angegeben 4u sind, ab:

Tabelle

IjtiLnschalkn ATCC 31 167 S. globisporus -IJ

ürötic der Sporen (_:jim) 0,45x0,60x0,55-0,90 1,2-1,4 x 8-2.0 oder

0,9-1,4 kugelförmig

Flüssiges Pigment oder kein gelblich bis grünlich-gelb 50

Glyccrin-Asparagin-Medium

Rhamnose-Verwertung negativ positiv

Stärke-Hydrolyse stark schwach

Magermilch-Koagulation positiv negativ ..

Magermilch-Peptonisation schwach stark

Produktion von Cephalosporin-Antibiotica positiv negativ

Aus den in der vorstehenden Tabelle angegebenen Differenzen ergibt sich, daß der in dieser Erfindung bcnut/tc Stamm ein neuer Stamm ist, der sich von den vorstehend genannten bekannten Stämmen unterschei- 60 dct.

Da der Y-G19Z-Stamm als ein neuer Stamm durch die vorstehenden Beobachtungsergebnisse bestätigt worden ist, ist er als »Streptomyces oganonensis« ATCC 31167 bezeichnet worden.

Die Herstellung der besprochenen Verbindung der Formel (II) wird ausgeführt, indem man den erwähnten 7-Mcthoxycephalosporin-Antibiotika produzierenden Stamm in einem üblichen Kulturmedium kultiviert, dem 65 eine heterocyclische Thiolverbindung gemäß Anspruch 1 zugegeben wurde.

Beispiele für die heterocyclischen Thiole, die dem Kulturmedium in dieser Erfindung hinzugefügt werden,

S-Mercapto-l^-thiadiazol^-thioglykolsäure, l-Methyl-S-mercapto-lH-tetrazol, 2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol, bisiS-Carboxymethylthio-lvM-thiadiazol^-yOdisulfid, bis(l-Methyl-lH-tetrazol-5-yl)disulfid,

bis(5-Methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)disulfid, 2-Mercapto-l ,3,4-thiadiazol.

Diese heterocyclischen Thiole können als ihre Salze verwendet werden. Diese Salze sind anorganische Salze,

ίο wi'5 Alkalimetallsalze, Alkalierdmetallsalze, Ammoniumsalze etc., und die Salze mit organischen Basen, wie Triüthylamin, Triäthanolamin, Dicyclohexylamin, Lysin, Arginin, Histidin, basische wasserlösliche Antibiotika, z. B. Kanamycin, Alkaloide, basische Proteine etc. Die Salze mit hoher Wasserlöslichkeit können selektiv verwendet werden, falls erforderlich, und ferner, wenn die heterocyclischen Thiole eine starke Toxizität zu den Antibiotika erzeugenden Stämmen aufweisen, können die nur spärlich in Wasser löslichen Salze selektiv ver wendet werden.

Die Herstellung der Zwischenprodukte der Formel (II) wird durch Kultivierung des im Patentanspruch ! genannten Stammes Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium unter Zugabe der vorstehend schon beschriebenen heterocyclischen Thiolverbindung oder des Salzes oder ihres Derivates R -SS-R-durchgeführt. Die Kultivierung wird nach den üblichen herkömmlichen Methoden zur Züchtung von Mikroor-

ganismen durchgeführt, jedoch wird die submerse Kultur in einem flüssigen Kulturmedium bevorzugt. Jodes Kulturmedium, welches Nährstoffe für die T-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellenden Stämme der Art Streptomyces enthält, kann verwendet werden. Es können synthetische Kulturmedien, halb-synthetische Kulturmedien und natürliche Kulturmedien, die die vorstehend genannten Nährstoffe enthalten, in dieser lirfindiang Verwendung finden. Für die Zusammenstellung des Kulturmediums können Glukose, Sukrosc, Mannitol,

Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabile Öle etc. als Kohlenstoffquellen Verwendung finden, und Fleischextrakt, Peptone, Klebermehl, Baumwollsaatmehl,Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Kornschlempc, TrockenheTe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische und anorganische Stickstoffquellen können als Stickstoffspender Verwendung finden. Ebenso können, falls erforderlich. Metallsalze, wie Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate etc. von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium,

Zink und Eisen zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Weiterhin können, falls erforderlich. Materialien, die die Bildung der Antibiotika begünstigen, oder Entschäumungsmittel, wie Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Lardöl, Siliconöl, oberflächenaktive Mittel etc., in geeigneter Weise zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden. ...,-. Das vorstehend genannte heterocyclische Thiol, dessen Salz oder dessen Derivat R^-SS-R' wird gewohnlich

in einer Konzentration von 0,1-5 mg/ml, vorzugsweise 0,5-2 mg/ml als heterocyclischesThiol hinzugefügt: Es kann zu dem Kulturmedium als eine sturzartige Zugabe vor der Kultivierung oder auch in verschiedenen unterteilten Portionen in den Eingangsstufen der Kultivierung zugefügt werden. Es ist im allgemeinen günstig, die Kultivierung unier aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Kultivserungstemperatur liegt gewöhnlich /wischen etwa 18°C bis etwa 35°C, vorzugsweise um 30⁰C. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das pi 1 des KuI-

turmediums auf etwa 5-10. vorzugsweise etwa 6-8 gehalten wird. Der Kultivationszeitablauf hängt von der

Zusammensetzung und der Temperatur des verwendeten Kulturmediums ab, aber im allgemeinen werden etwa

3 Tage bis etwa 10 Tage benötigt. Das hergestellte Material wird selektiv in dem Medium angereicher., nachdem die Kultivierung beendet ist.

Das hergestellte Material kann isoliert und aus der Kulturbrühe nach den üblichen Methoden gewonnen wcr-

den, die für das Isolieren von Antibiotika aus dem kultivierten Mycel-Nährboden üblich sind. Das hergestellte Antibiotikum der Formel (II) ist hauptsächlich in der Kulturbrühe anwesend. Nach der Abtrennung des Myccls von der Nährbodenlösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren wird das hergestellte effektive Material aus dem Filtrat extrahiert; das heißt, das hergestellte Material wird abgetrennt, wieder ausgezogen und gereinigt vom Hltrat. Hierbei werden Vorrichtungen und Verfahren verwendet, die ganz allgemein für die Herstellung von Anli-

biotika Verwendung finden, wie Methoden, die die Unterschiede der Löslichkeit in einem geeigneten Lösungsmittel ausnutzen, die die Unterschiede der adsorptiven Affinität zu verschiedenen Adsorbentien ausnutzen oder die auf Unterschieden der Trennmethoden in zwei flüssige Phasen beruhen.

Diese Methoden können, falls erforderlich, in einer geeigneten Kombination oderauch wiederholt angewandt werden.

Einige praktische Beispiele der 7-Methoxycephalosporinverbindungen der allgemeinen Formel (II) - Zwischenprodukte des erfindungsgemäßen Verfahrens - werden nachfolgend genannt:

ZO D/

A) 7-(5-Arnino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-.4^J-cephem-4-carbonsäure

OCH₃

S 110OC-CH-CH₂CH₂Ch₂CONH

Y \ N-N

N J-CH₂-S-H^ J— S—Cl

x_IU /. '■" //—ν-"j—-a—\ /—-a—CH₂COQH

⁰ T ^s

COOH

Additionsverbindung:

5-M ccapto-1,3,4-thiadiazol-2-thiogly kolsäure;

Ν —Ν

HS—^ JLs-CH₂COOH S

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung A mit der allgemeinen Formel (II)

N — N
R- - Il Il M = H

SCH₂COOH
sind die folgenden:

1. weißes Pulver;

2. Schmelzbeginn bei 156- 160°C. Hierbei tritt Braunfärbung ein, und die Zersetzung beginnt ab etwa 17O⁰C;

3. leicht löslich in Wasser, spärlich löslich in Methanol, und sehr spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. amphotcres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion;

5. es besitzt das ultraviolette Absorptionsspektrum gemäß F i g. 1 der beigefügten Zeichnung, wenn es in einer i /' i OO M Phosphat-Pufferlösung mit einem pil von 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaximum bei 287 m_:j. liegt;

6. es besitzt das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß F i g. 2, wenn es in der Kalajmbromicl-Tablette gemessen wird. Es ergeben sich Absorptionen bei 3413 cm"¹,2920 cm"¹,1763 cm"¹,1620 cm"¹,1515 cm"¹ und 1380 cm ';

7. Bei der Bestimmung des kernmagnetischen Resonanzspektrums unter Verwendung von TMS als äußerem Standard in schwerem Wasser werden folgende Signale erhalten:

<5 Wert (ppm): 2,35 (4H, Multiplett), 2,96 (2H, Multiplett), 4,00 (3H, Singlett), 3,73-4,33 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 4,25 (IH, Multiplett), 4,44 (2H, Singlett), 4,42-4,91 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,63 (IH, Singlett);

8. Das im derzeitig reinsten Zustand hergestellte Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte:

C: 35,95%, H: 3,87%, N: 10,85%, S: 18,33%; S-

9. es ergibt cr-Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit 6 η Chlorwasserstoffsäure;

10. das Massenspektrum dieser Verbindung ergibt nach einer N-Chloracetylierung der Verbindung und Überführung des Produktes in den Methylester das folgende Fragment mit m/e 392, das heißt

^s

Il Ii η

H⁺N J-CH₂-S-I^ JI-S-CH₂COOCHj

COOCH₃

Unter Berücksichtigung aller vorstehenden Ergebnisse ist es ersichtlich, daß diese Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt eine Absorption bei 1763 cm"¹ (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum, und die Gegenwart der Signale bei 4,00 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,63 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,73-4,33 (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) und 4,42-4,91 (2H, Quartett, j - i4 Hz, 3-Seitenkette CH₂) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum. Die Verbindung ergibt a-Aminoadipinsäurc bei der Säurehydrolyse, ferner ergibt die Verbindung Absorptionen bei 4,44 ppm (2H, Singlett, CH₂ von -S-CII₂-COOH) im nuklearmagnetischen Resonanzspektrum und außerdem das Fragment von m/e 392

im Massenspektrum des Derivates; aus diesen Gründen ist entschieden worden, daß die Verbindung die vorstehend genannte Struktur hat, in die das heterocyclische Tbiol eingeführt worden ist

B) 7-{5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-{l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-2l³-cephem-4-carbonsäure

20 25 30 35

HOOC —CH- CH₂CH₂CH,CONH

NH₂

N N

Il N /

CH₃

Additionsverbindung:

5-Mercapto-l-methyl-lH-tetrazol;

N N

HS-I! N

CH₃ Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung B der Formel

N N

R¹ = It II

Λ /^N

M = H

N CH,

sind die folgenden:

40 1. weißes Pulver;

2. ergibt braune Verfärbung und Zersetzung bei 160-17O⁰C;

3. leicht löslich in Wasser, gering löslich in Methanol und spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion;

5. es wird das in F i g. 3 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum bei Messung in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 erhalten. Das Absorptionsmaximum liegt bei 273 ηΐμ; 6. es wird das in Fig. 4 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum bei Messung der Kaliumbromidtablctle erhalten. Es wurden Absorptionen bei 3413 cm"¹, 2920 cm"¹, 1765 cm"¹, 1620 cm"¹, 1515 cm ' und 1390 cm"¹ festgestellt;

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externer Standard in schwerem Wasser ergab die folgenden Signale:

δ Wert (ppm): 2,36 (4H, Multiplett), 2,96 (2H, Multiplett), 3,98 (3H, Singlett), 4,38 (IH, Multiplen), 4,50 (3 H, Singlett), 5,59 (IH, Singlett);

8. das bis jetzt in reinstem Zustand erhaltene Material ergab die folgenden elementar-analytischen Werte: C: 37,48%, H: 4,25%, N: 16,74% und S: 10,90%;

9. es wird a-Aminoadipinsäure erhalten, wenn mit 6 η Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wurde. Es wird 5-Mercapto-l-methyl-lH-tetrazol durch Hydrolyse in Methanol durch Dowex* 50 W (Η-Typ) erhalten.

Berücksichtigt man die vorstehenden gesamten Ergebnisse, so ergibt sich, daß die Verbindung eine 7-Metho-

xycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt Signale bei 3,98 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃) und

5.99 ppm (IH, Singlett, 6-CH) bei den kernmagnetischen Resonanzspektren und Absorption bei 1765 cm ' (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum. Ferner wird a-Aminoadipinsäure durch Säurehydrolyse erhalten. Ferner ergibt sich aus der Tatsache der Absorption bei 450 ppm (3H, Singlett, Tetrazol-N-methyl) im kernmagnetischen Resonanzspektrum und auch aus der Tatsache, daß 5-Mercapto-l-methyI-l H-tetrazol durch milde Hydrolyse erhalten wird, daß der Verbindung die vorstehend erläuterte Struktur zuerkannt wurde, in die

das heterocyclische Thiol eingeführt wurde.

C) 7-{5-Amino-5-carboxyvaleramido)-(5-methyI-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-^³-cephem-4^carbonsäure

OCH₃

I ^s

HOOC-CH-CHjCH₂CH₂CONH-^ ( \ N-N

I Li LrH s J! Ι-γη

° T ^s

COOH Additionsverbindung:

2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol:

N-N
HS-I[^ J-CH,

S

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung C) mit der Formel (II)

N —N \

R² - Il Jl M = H

CH₃

sind die folgenden:

1. leicht gelb-weißes Pulver;

2. zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, ergibt braune Verfärbung und Zersetzung bei etwa 17O⁰C;

3. leicht löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, aber unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion;

5. ergibt das in Fig. 5 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wenn in einer 1/100 NJ Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaximum bei 272 nw liegt;

6. es wird das in Fig. 6 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum erhalten, wenn als Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde, mit Absorptionen bei 3420 cm"¹, 2930 cm"¹, 1765 cm"¹, 1610 cm"¹, 1515 cm"¹ und 1385 cm";

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externer Standard in schwerem Wasser ergibt die folgenden Signale:

δ Wert (ppm): 2,34 (4H, Multiplett), 2,95 (2H, Multiplett), 3,19 (3H, Singlett), 3,72-4,31 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,99 (3H, Singlett), 4,26 (IH, Multiplett), 4,40-4,95 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,63 (IH, Singlett);

8. die gegenwärtig am reinsten hergestellte Verbindung weist die folgenden elementaranalytischen Werte auf: C: 37,82%, H: 4,01%, N: 12,90%, S: 14,97%;

9. es wird e-Aminoadipinsäure erhalten, wenn mit 6 η ChlorwasserstofTsäure hydrolysiert wird. Es wird auch 2-Mercapto-5-methyl-13,4-thiadiazol erhalten, wenn in Methanol mit Dowex 50 W® (H-Typf hydrolysiert wird.

Wenn man alle vorstehenden Ergebnisse berücksichtigt, ist es ersichtlich, daß die Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung weist die Absorption bei 1765 cm"' (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum auf. Ferner werden die Signale bei 3,99 ppm (3H, Singlett, 7-OCH,), 5,63 ppm (UI,Singlett,6-CH),3,72-4,31 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂),4,40-4,95(2H, Quartett, J = l'4Hz,3-Seitenkctte Cl I;) erhalten. Es wird a-Aminoadipinsäure bei der Säurehydrolyse erhalten; weiter auf Grund der Tatsache, daß die Absorption bei 3,19 ppm (3H, Singlett, Thiadiazol C-CH₃) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum erhalten wird und auch 2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazoI durch milde Hydrolyse erhalten wird, wird der Verbindung die vorstehend erläuterte Struktur zuerkannt, in die das heterocyclische Thiol eingeführt wurde.

65

D) 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-^l³-cephem-4-carbonsäure

OCH₃

I ^s

HOOC-CH-CH₂Ch₂CH₂CONHH {

NH₂

IO

Additionsverbindung: 15 2-Mercapto-l,3,4-thiadiazol:

N-N

phat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,4, Absorptionsmaximum bei 274 .
6. es wird das in Fig. 8 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum erhalten, wenn mit der Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde, wobei die Absorptionen bei 3400 cm"¹, 2925 cm"¹, 1765 cm"¹, 1610 cm ', 1515 cm"¹ und 1365 cm"¹ liegen;

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externer Standard in schwerem Wasser, ergibt die folgenden Signale:

6 Wert (ppm): 2,30 (4H, Multiplett), 2,93 (2H, Multiplen), 3,69-4,29 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,97 (3H, Singlett), 4,26 (1H, Multiplett), 4,45-4,99 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,56 (IH, Singiett), 9,85 (1H, Singlett);

8. das derzeit im reinsten Zustand erhaltene Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte: C: 37,53%, H: 4,36%, N: 12,77%, S: 16,42%;

9. es wird a-Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit 6 η Chlorwasserstoffsäure erhalten. Es wird auch 2-Mercapto-l,3,4-thiadiazol bei der Hydrolyse in Methanol mit Dowex* 50 W (Η-Typ) erhalten.

Berücksichtigt man alle Ergebnisse, so ergibt sich, daß die Verbindung eine 7-MethoxycephaIosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt im Infrarot-Absorptionsspektrum eine Absorption bei 1765 cm', und es werden die Signale bei 3,97 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,56 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,69-4,29 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂), 4,45-4,99 (2H, Quartett, J = M Hz, 3-Seitenkette CH₂), erhalten. a-Aminoadipinsäure wird durch Säurehydrolyse erhalten. Aus den Tatsachen, daß die Absorption bei 9,85 ppm (IH, Singlett, Thiazol CH) im kemmagnetischen Resonanzspektrum vorhanden ist und 2-Mercapto-l,3,4-thiadiazol bei milder Hydrolyse erhalten wird, ist der Verbindung die zuvor genannte Struktur zugeordnet worden, in die das heterocyclische Thiol eingeführt worden ist.

Nachfolgend werden die Ergebnisse von verschiedenen chromatographischen Analysen und papierelcktrophoretischen Untersuchungen der hergestellten Verbindungen A), B), C) und D) angegeben.

Die srhaltenen Rf-Werte dieser Verbindungen in der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung mikro-(iO kristalliner Cellulose (Avicel* SF) sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Hergestellte Verbindung A)	0,39	0,37	0,32
Hergestellte Verbindung B)	0,39	0,34	0,31
Hergestellte Verbindung C)	0,43	0,43	0,40

20 ^a

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung D) sind die folgenden:

Ν —Ν 25 IR² = Il D M = H

1. leicht gelb-weißes Pulver;

2. sie zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, jedoch erfolgen Braunverfarbung und Zersetzung bei etwa 175-18C°C;

3. leicht löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, jedoch in anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich;

4. amphoteres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion;

5. ergibt das in Fig. 7 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum bei Messung in einer 1:100 M Phos- I

10

	26 57 599	2	3	j CH₂-S-SO₁H COOH
Fortsetzung		0,38 0,36 0,36 0,36 0,26 0,32	0,33 0,31 0,32 0,31 0,22 0,26
	1		) Bei der Verbindung Y-G19Z-D3 handelt es sich um das Natriumsalzder7-<5-Amino-5-carboxyvalerylami- no)-3-suirothiomethyI-7a-methoxy-J³-cephem-4-carbonsäufe der Formel* COOH OCH, I I ' s
Hergestellte Verbindung D) Cephalosporin C 7-MethoxYcephalosporin C Cephamycin C Y-G19Z-D3) Y-G19Z-D2*)	0,39 0,37 0,41 0,37 0,26 0,39		CH-(CII₂)J-CO-NhJ { \ I '
	O

"■ Λ/¹ /~» ini O¹TiV e\ ^r r\ **s~ r\ 'y* '"

**) Die Strukturformel der Vcrbind-ing Y-C49Z-D2 ist noch nicht ermittelt worden.

Physikochemische Eigenschaften: 25

Weißes Pulver,

Bräunung, tritt bei etwa 16O⁰C ein,

Zersetzung erfolgt bei 165-172 ⁰C,

leicht löslich in Wasser, 30

wenig löslich in Methanol und Äthanol,

praktisch unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln.

UV (Η,Ο) X_max 275 ΐτίμ(£{*, 160)

IR (KBr) 3420, 1765, 1625, 1520, 1405, 1225, 1025, 630 cm"¹

NMR (D₂O, δ) 1,87 (4H, m), 2,41 (2H, m), 3,24-3,77 (2H, Q, J = 18 Hz), 3,42 (3H, s), 3,73-4,21 (2H, q, J = 13 Hz), 3,92 (IH, m), 5,06 (IH, s).

Elcmenidranalyse:

Gefunden: C: 32,94% H: 3,85%
N: 7,76% S: 16,53%

Verwendetes Entwicklungslösemittelsystem (Volumenverhältnis): 45

1. Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9).

2. n-Butunol : Essigsäure : Wasser (4:1: 2).

3. n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5).

Die Kontrollprobe, Cephamycin C ist 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-4'-ccphem-4-carbonsäure.

Die Verbindungen Y-G19Z-D3 und Y-G19Z-D2, die in den vorstehenden Vergleichsuntersuchungen verwendet wurden, sind neue 7-Methoxyciphalosporin-VerbindungPii, die zuvor aus der Kulturflüssigkeit des Streptomyecs oganonensis durch die gleichen Erfinder (vergl. Japanische Patentanmeldungen Nr. 109 753/74 und 55 146593/'75) isoliert worden sind.

Die Rf-Werte, die bei der Papierverteilungschromatographie unter Verwendung von Watlman^Nr. 1 Filterpapier und einem Entwicklungslösungsmitielsystem aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) bestimmt wurden, lauten:

Rf-Wert ⁶⁰

I lcrgcstellte Verbindung A) 0,40

Hergestellte Verbindung B) 0,39

Cephalosporin C 0,36

7-Methoxy-cephalosporin C 0,40 65

Ccphamycin C 0,35

Y-GI9Z-D3 0,24

Y-G19Z-D2 0,25

Dann wurden die Verbindungen unter Verwendung einer Hitachi* 635 Hochgeschwindigkeits-Γ lüssigkcitschromatographie-Apparatur analysiert und dadurch folgende Resultate erzielt:

Säule: 3 x 500 mm Säule aus rostfreiem Stahl. Kunstharz: Hitachi⁹ 2610 (kationisches Austauschharz).

Entwicklungslösungsmittelsystem: 0,2 M Citratpufferlösung (pH 3,6). Fließgeschwindigkeit: 0,6 ml/min. Schreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cm/min.

_|0 Retentionszeit

Hergestellte Verbindung A) S min, 33 see Hergestellte Verbindung B) 6 min, 00 see Hergestellte Verbindung C) 9 min, 35 see Cephalosporin C 5 min, 18 see

7-Methoxy-cephalosporin C 5 min, 09 see

Cephamycin C 5 min, 18 see Y-G19Z-D3 3 min, 42 see Y-G19Z-D2 3 min, 42 see

Nachstehend werden weitere Ergebnisse von Analysen unter Verwendung der vorstehend erläuterten Apparatur, die unter folgenden Bedingungen erhalten wurden, in der Tabelle angegeben:

Säule: -ι Bondapa C,₈ (Hersteller: Waters Ltd.) 4 x 300 mm.

Entwicklungslösungsmittel-System: Acetonitril: 0,1% Essigsäurelösung (pH 3,3) (1:9 im Volumenverhältnis).

Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min. Schreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cm/min.

Retentionszeit Hergestellte Verbindung A) 3 min, 14 see Hergestellte Verbindung B) 1 min, 52 see Hergestellte Verbindung C) 2 min, 55 see Hergestellte Verbindung D) 1 min, 56 see Die durch Hochspannungs-Papierelektrophorese erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:

Filterpapier: Wattman* Nr. 1. Entwicklungslösemittel: 10%ige Essigsäure (pH 2,2). Spannung: 42 Volt/cm. Laufzeit: 1 Stunde.

M igrationsentfernung Hergestellte Verbindung A) - 3,6 cm Hergestellte Verbindung B) - 3,3 cm Hergestellte Verbindung C) - 3,6 cm Hergestellte Verbindung D) - 3,9 cm Cephalosporin C - 3,5 cm

7-Methoxy-cephalosporin C - 3,4 cm

Cephamycin C - 3,5 cm

so Y-G19Z-D3 - 6,1 cm

Y-G19Z-D2 -6,1cm

Cysteinsäure - 7,5 cm Glutathion - 1,2 cm

Dann wurde die antibakteriell Aktivität der hergestellten Verbindungen A), B), C) und D) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammen mit jenen von Cephalosporin C als Vergleichssubstanz angegeben.

Herzinfusions-Agar Plattenmethode (verwendete 500 y/ml-Lösung). Die Zahleinwerte in der Tabelle geben den Durchmesser (mm) der Inhibitionszone an.

-

A) B) C) D) Cephalo

sporin C

Sarcina iutea ATCC 9341	0	0	0	0	14,0 *
Staphylococcus aureus 209 P	0	0	0	0	12,8 p
Bacillus subtilis ATCC 6633	0	0	0	0	23,1 \|j I

12

Fortsetzung

	A)	B)	C)	D)	Cephalo
					sporin C
hschurichia coli NIHJ	19,2	18,7	14,2	13,0	10,4
K»'.'bsiclla pneumoniae	21,8	23,5	23,0	23,0	13,0
Salmonella gallinarum	24,0	25,2	23,5	25,1	23,5
Proteus vulgaris OX 19	22,6	20,2	20,0	21,0	17,5
Proteus mirabilis IMF OM-9	22,2	19,8	19,5	23,0	23,0

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) werden in die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) überfuhrt, indem aerob auf die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) das Mycel der D-Aminosäure oxidierende Enzyme bildenden Stämme Trigonopsis variabilis IFO 0671 oder IFO 0755 oder ein diese Enzyme enthaltendes Behandlungsprodukt aus dem Mycel zur Einwirkung gebracht wird. Hierbei kann anstelle der Verbindungen der allgemeinen Formel (II) die fermentierte Gärbrühe Verwendung finden, die die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) enthält. Da die fermentierte Gärbrühe ohne Isolierung der Verbindungen der allgemeinen Formel (II) eingesetzt werden kann und die hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) leicht in organischen Lösungsmitteln aurgelöst werden können, sind bei der Herstellung die Trennungs- und Reinigungssturen in erheblichem Umfange vereinfacht worden.

Die so hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) besitzen ausgezeichnete antimikrobiell Aktivitäten. Sie sind auch zusätzlich als Zwischenprodukte zur hier nicht beanspruchten Herstellung von 7-Meth- oxycephalosporin-Derivaten zu gebrauchen, denen in die 7-Position andere Acylgruppen eingeführt worden sind, denn diese Verbindungen sind in organischen Lösungsmitteln löslich.

In der zweiten Stufe des Verfahrens nach der Erfindung werden die D-Aminosäure oxidierende Enzyme herstellende Stämme Trigonopsis variabilis IFO 0671 oder IFO 0755 passend verwendet.

Sie sind vom Institut fur Fermentation Osaka (Japan) unter der Stamm-Nr. IFO 0755 (= ATCC 10679) und S'amm-Nr. IFO 0671 erhältlich.

Zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) aus einem Zwischenprodukt der allgemeinen Formel (II) wird es bevorzugt, daß der Mikroorganismus erst kultiviert wird und das so erhaltene Mycel oder das so behandelte Mycel zuderCephalosporin-Verbindung der allgemeinen Formel (II) unter geeigneten Bedingungen gebracht wird.

Als Kultivationsmethode zur Herstellung des Myceis wird es jedoch gewöhnlich bevorzugt, die aerobe !Cultivation zu verwenden. In einer bevorzugteren Ausführungsform wird eine flüssige Kultivation unter Rühren und Belüftung verwendet. Herkömmliche Kulturmedien können für dieses Verfahren Verwendung finden.

So können synthetische Kulturmedien, halb-synthetische Kulturmedien oder natürliche Kulturmedien als Zubereitung für das Kulturmedium verwendet werden, wie Glukose, Sukrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabiles Öl als Kohlenstoffquelle und Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Kornschlempe, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnilrat, Harnstoff und andere organische und anorganische Stickstoffverbindungen als Stickstoffquelle.

Ebenso werden, falls erforderlich, Metallsalze, wie Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate etc. von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink, Eisen etc. zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Weiterhin werden falls erforderlich, Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Lardöl, Silikonöl, oberflächenaktive Mittel etc. dem Kulturmedium als ein Bildungs- oder Entschlämmungsmittel zugesetzt. Die gewünschten Resultate werden durch Aufrechterhalten des pH des Kulturmediums bei etwa 4-10, vorzugsweise 5-6, erhalten.

Besonders wenn das Kulturmedium D- (oder DL-) Aminosäure, wie beispielsweise D- (oder DL-) Methionin, D- (oder DL-) Alanin, D- (oder DL-) Valin etc enthält, wird eine ausgezeichnete D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität erhalten. Die Kultivationstemperatur beträgt gewöhnlich 18-37°C, vorzugsweise etwa 30⁰C. Der Zeitraum der Kultivation ist unterschiedlich gemäß de.i Kultivationsbedingungen, insbesondere in Abhängigkeit von der Kulti vationsapparatur, der Zusammensetzung des Kulti vationsmediums, der Temperatur etc. Es wird jedoch bevorzugt, die Kultivation zu vervollständigen, wenn die D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität ein Maximum besitzt Gewöhnlich werden 2—10 Tage für die Kultivation benötigt. Das so erhaltene Mycel oder das behandelte Mycel wird für die D-Aminosäure-Oxydationsreaktion des Zwischenprodukts der allgemeinen Formel (II) verwendet. In diesem Falle wird unter behandeltem Mycel das Mycel verstanden, welches in eine brauchbare Form zur Herstellung des gewünschten Materials der allgemeinen Formel (I) überführt wurde, indem die D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität durch die Anwendung einer geeigneten Behandlung gesteigert wurde. Beispielsweise ist die D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität, die in dem Verfahren dieser Erfindung benutzt wird, gewöhnlich im Mycel vorhanden, und deshalb bedeutet das behandelte Mycel den zellfreien Extrakt, der durch Anwendung physikalischer und/oder chemischer Einwirkungen auf das Mycel gev/onnen wurde, das aus dem Kultivationsprodukt der D-Aminosäure oxydierenden Enzym-Aktivität herstellenden Stäm me gesammelt wurde, gewaschen wurde, oder teilweise oder vollständig gereinigtes D-Aminosäure oxydierendes Enzym, das aus dem zellfreien Extrakt durch Anwendung bekannter Enzymabtrennungs- und Reinigungsmelhoden gewonnen wurde, oder weiterhin kann das aktivierte Mycel, das durch Kombinieren des partiell oder ganz gereinigten D-Aminosäure oxydierenden Enzyms mit einem wasserunlöslichen Polymer oder einem anorganischen Träger durch physikalische oder chemische Mittel erhalten worden ist, einen festen

D-Aminosäure oxydierenden Enzym-Aktivator oder Mycel ergeben, und dann wird der Aktivator oder das Mycel einer Aktivationsbehandlung unterworfen.

In dieser Erfindung ist die Herstellung und die Rückführung des vorstehend erläuterten löslichen Enzyms auf den praktischen Gebrauch beschränkt, aber die Verwendung des unlöslichen Enzyms, wie das aktivierte Mycel, ist besonders wirtschaftlich für den industriellen Gebrauch, wobei sie leicht abgetrennt und wiederverwendet werden können.

Die Aktivierungsbehandlung des Mycels, die vorstehend beschrieben ist, kann dadurch bewirkt werden, daß das Mycel eine gewisse milde Schädigung in einem solchen Ausmaß erleidet, daß keine Zerstörung erfolgt.

Als Beispiel für eine solche Aktivationsbehandlung wird zur Verdeutlichung ein Verfahren genannt, bei dem das Mycel auf eine Temperatur unterhalb -10⁹C bei einem pH von etwa 3-4 eingefroren wird, dann aufgetaut und mit einem Lösungsmittel behandelt wird, wobei das Mycel in einem Bad von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, n-Butanol, 2-Phenyläthanol, Diäthyläther, Cyclohexan, Benzol, Toluol etc., behandelt wird, ein Verfahren, wobei das Mycel mit 0,1-10% oberflächenaktivem Mittel behandelt wird, beispielsweise einem kationischen oberflächenaktiven Mittel, wie Cetyltrimethylammonium, Cetylpyridinium, is Cetyldimethylbenzyl-Ammoniumhalid etc., einem anionischen oberflächenaktiven Mittel, wie Dodecylsulfat, einem Alkalimetallalkylarylsulfonat, Natriumdesoxycholat etc., und einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, wie Sorbitanmonolaurat, Triton X-100 etc., in ihrer wässerigen Lösung, ein Verfahren, bei dem das Mycel mit einer verdünnten wässerigen Lösung von Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid behandelt wird, oder ein Verfahren, bei dem das Mycel in einer Lösungs suspendiert wird bei einem hohen osmotischen Druck, bcispielsweise 2 M Zuckerlösung, worauf die Lösung dann schnell mit Wasser verdünnt wird. Diese Aktivierungsbehandlungen sind durch verschiedene Faktoren beeinflußt, wie Temperatur, Zeitdauer der Bearbeitung, pH-Wert, der Konzentration des Reagenzes etc. Daher ist es erforderlich, die Aktivierungsbedingungen auszuwählen.

Die Überführung der Gruppierung in den Zwischenprodukten

HOOC

CH-(CH₂J₃CONH-H,N

der allgemeinen Formel (H) erfolgt durch aerobe Einwirkung des Mycels der D-Aminosäure oxidierende Enzyme bildenden Stämme Trigonopsis variabilis IFO 0671 oder IFO 0755 oder ein diese Enzyme enthaltendes Behandlungsprodukt aus dem Mycel in die Gruppierung

HOOC—(CH₂)₃CONH —

in den Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Daneben kann die Katalase, die gewöhnlich in einem Mycel vorhanden ist, dazu führen, daß die gewünschte Decarboxylierung nichi ganz vollständig zu der vorstehend gewünschten Gruppierung in den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eintritt. Dies führt dazu, daß durch die Wirkung der Katalase als unerwünschtes Nebenprodukt Verbindungen mit der Gruppierung

HOOC —CO-(CH₂)JCONH-

in den Verbindungen mit der allgemeinen Formel (III)

OCH₃
I S

HOOC —CO-(CH₂)₃CONH-4 / \

O T CH₂SR²

COOH

gebildet werden können.

Die Beispiele 8a und 11 b verdeutlichen die Aktivierung und Verwendung des Mycels, ohne die Katalaseaktivität zu inhibieren.

Um selektiv die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zu erhalten, ist es zweckmäßig, die Katalaseaktivität zu inhibieren.

Beispiele für geeignete Katalase-Inhibitoren sind Ascorbinsäure, 3-Amino-l,2,4-triazol, Alkalimetalloxide etc.. und Natriumazid wird besonders bevorzugt. Der Inhibitor kann zu dem Reaktionsgemisch während der Umwandlung des Ausgangsmaterials der allgemeinen Formel (II) in das herzustellende Material der allgemeinen Formel (I) hinzugefügt werden. Auch das Mycel kann mit dem Inhibitor vorbehandelt werden bevor das Mycel für die vorstehend erläuterte Umwandlung Verwendung findet. Die Menge an Natriumazid, die für den angegebenen Zweck gebraucht wird, beträgt Ϊ-100 mM. Weiterhin kann die Katalase in dem angegebenen Mycel inaktiviert werden, indem das Mycel einer Wärmebehandlung unterworfen wird, bevor es in der vorhin erwähnten Umwandlungsstufe verwendet wird. So kann das vorgenannte Mycel bei 40—60⁰C, vorzugsweise bei 50⁰C, tür mindestens 3 Stunden vorbehandelt werden, wodurch die Katalaseaktivität erheblich abfallt, jedoch

die D-Aminosäureoxidase-Aktivität bleibt unverändert. Die Wärmebehandlung des Mycels kann einfach durchgeführt werden, indem das Mycel in einer wässerigen Lösung oder einer Puffersuspension behandelt wird. Besonders wirksam ist es, das Mycel gleichzeitig der vorstehend erläuterten Wärmebehandlung und der »Aktivierungs«-Rcagenzbehandlung zu unterwerfen. Beispielsweise kann durch Aktivationsbehandlung des Mycels bei 50⁰C für 4 Stunden unter Verwendung eines Lösungsmittels (Toluol) der Inhibitor der Katalaseaktivität und die Aktivierung des Mycels gleichzeitig durchgeführt werden.

Die Reaktion des Enzymsystems auf das vorstehend genannte aktivierte Mycel und das Ausgangsmaterial der allgemeinen Formel II wird gewöhnlich bei einem pH von 6-8 durchgeführt. Es ist wünschenswert, die Reaktion bei 30-40⁰C auszuführen. Der Zeitraum der Reaktion ist vor allem von der Potenz des Enzyms abhängig, gewöhnlich sind 1-5 Stunden erforderlich.

Da die vorstehend genannte Enzymreaktion unter aeroben Bedingungen ausgeführt wird, wird sie vorzugsweise unter Belüftung mit Luft oder Sauerstoff durchgeführt.

Wie schon erläutert, ist es schwierig, das Ausgangsmaterial der allgemeinen Formel (II) aus der fermentierten Brühe aufgrund der amphoteren Struktur zu extrahieren. Jedoch kann gemäß der bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung die Abtrennung des hergestellten Produktes der allgemeinen Formel (I) unter einer geeigne- ι s ten Bedingung aus der fermentierten Gärbrühe des Ausgangsmaterials der allgemeinen Formel (II) nach der Entfernung des Mycels durchgeführt werden. Dies bedeutet, daß das hergestellte Material der allgemeinen Formel (I) leicht durch Lösungsmittelextraktion oder durch Adsorption mittels lonenaustauscherharz abgetrennt wcrd?n kynn

Beispielsweise wird das Reaktionsproduktgemisch angesäuert unterhalb von pH 2,5, und dann wird das her- 2u gestellte Material aus dem Reaktionsgernisch mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, n-Butanol etc., extrahiert. In diesem Falle liefert die Kombination eines Ionenaustauscherharzes und einer Lösungsmittelextraktion die besseren Ergebnisse. Geeignetes lonenaustauscherharz ist ein flüssiges Aminanionisches Austauscherharz. Beispiele für das bevorzugte Lösungsmittel sind Äthylacetat, Butylacetat, n-Butanol etc. Auch kann das hergestellte Produkt unter Verwendung von einem festen lonenaustauscherharz vorgenommen werden. In diesem Falle kann ein geeignetes Lösungsmitel leicht durch eine geeignete Voruntersuchung gefunden werden.

Um das reine Produkt zu erhalten, werden gewöhnlich die üblichen Reinigungsmethoden für Antibiotika verwendet.

Das hergestellte Material der allgemeinen Formel (I) kann nicht nur im freien sauren Zustand abgetrennt werden, aber auch als dessen gewöhnliches Alkalimetallsalz, Erdalkalimetallsalz, organisches Aminsaiz etc.

Einige neue 7-Methoxycephalosporin-Derivate der allgemeinen Formel (I), erhalten nach dem Verfahren dieser Erfindung, werden nachfolgend zusammen mit ihren Eigenschaften beschrieben.

E) 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-7-methoxy-J³-cephern-4-carbonsäure

OCH₃

I s

HOOC-(CH₂J₃CONH-^ ( \ Ν —Ν

-SCH₂COOH S

COOH

Ausgangsmaterial ist die Verbindung A).

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von E) sind die folgenden:

1. weißes Pulver;

2. Schmelzpunkt 75-78°C;

3. leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, jedoch kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. saures Material besitzt negative Ninhydrinreaktion;

5. es /cigt das in Fig. 9 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum, gemessen in einer 1/100 M Phosphat-PulTerlösung mit einem pH von 6,5, und das Absorptionsmaximum liegt bei 278 ma;

6. Fig. IO zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum aus der Messung mit der Kaliumbromid-Tablette und besitzt Absorptionen bei 3250 cm""¹, 2925 cm"¹, 1770 cm"¹, 1715 cm"¹, 1520 cm"¹, 1380 cm"¹;

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum unter Verwendung von TMS als innerer Standard in schwerem Methanol ist in Fig. 11 dargestellt und besitzt die folgenden Signale:

ö Wert (ppm): 1,93 (2H, Multiplen), 2,41 (4H, Multiplen), 3,51 (3H, Singlett), 3,37-3,81 (2H, Quarten, J - 18 Hz), 4,11 (2H, Singlett), 4,15-4,63 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,05 (IH, Singlett);

8. die folgenden elementar-analytischen Werte für C₁₈H₂₀N₄O₉S₄ · 2 H-.0 werden erhalten:

Berechnet: C 35,99% H 4,03% N 9,33% "

gerunden: C 35,77% H 3,81% N 9,42%

9. das Massenspektrum des hergestellten Materials V, gemessen nach der Hydrolyse des Materials in 6 η Chlorwasserstoffsäure für 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extraktion des hydrolysierten Produktes mit Äthyläther,

Trocknen des Produktes durch Abdampfen, und dann Silylieren mit BSA (Bistrimethjlsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/e 276 (CHj^Si-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-COO-Si(CHj)₃.

Wenn man die vollständigen Gesamtergebnisse berücksichtigt, so ist ersichtlich, daß die hergestellte Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist Dies ergibt sich aus der Gegenwart insbesondere der Absorption bei 1770 cm"¹ (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum, und der Signale bei 3,51 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,05 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,37-3,81 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂), 4,15-4,6 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₂), und weiter4,11 ppm (2H, Singlett, CII₂ von -S-CH₂-COOH) und weiter aus den Tatsachen, daß 1,93 ppm (2H, Multiplettj&CH,) und 2,41 ppm (411, MuI-tiplett, a,y-CH₂) anwesend sind, wodurch die Anwesenheit von4-Carboxybutyramido in dem kenunagnetischen Resonanzspektrum angezeigt wird, und das Massenspektrum des Derivates des hergestellten Materials, das mit Chlorwasserstoffhydrolysiert und silyliert wurde, das Fragment von m/e 276 ergibt; die hergestellte Verbindung E) besitzt die vorstehend angegebene Struktur, wobei die 5-Ammo-5-K»rboxyvaleramido-Gnippe in der 7-Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert worden ist zur 4-Carboxybutyramido-Gruppe.

F) 7-{4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-^l³-cephem-4-carbonsäure

I S

¥■ /^ f\ g~· t /~* τι \ y^ ^n ¹KtTT I S N₁ ^* 1 '

O I N

COOH I

CH₃

Ausgangsmaterial ist die Verbindung B). Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung F) sind die folgenden:

1. weißes Pulver;

2. Schmelzpunkt 80-83⁰C;

3. leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, jedoch kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln. Das Natriumsalz ist in Wasser leicht löslich;

4. - saures Material zeigt negative Ninhydrinreaktion;

5. das erhaltene Ultraviolett-Absorptionsspektrum ist in Fig. 12 dargestellt; es wurde in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,5 gemessen; das Absorptionsmaximum liegt bei 269 π»μ;

6. das erhaltene Infrarot-Absorptionsspektrum ist in Fig. 13 dargestellt, gemessen mit der Kaliumbromid-Tablette, und besitzt die Absorptionen bei 3420 cm"¹, 2940 cm"¹, 1765 cm"¹, 1680 cm"¹, 1610 cm ', 1525 cm ', 1390 cm"';

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als innerer Standard in schwerem Methanol gibt die in Fig. 14 dargestellten Signale:

δ Wert (ppm): 1,94 (2H, Multiplett), 2,40 (4H, Multiplett), 3,51 (3H, Singlett), 3,40-3,83 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,99 (3H, Singlett), 4,17-4,50 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,02 (IH, Singlett);

8. es werden die folgenden elementar-analytischen Werte fur C₁₆H₂₀N₆OyS₂ ■ 2H₂O erhalten: Berechnet: C 37,79% H 4,76% N 16,53%

gefunden: C 37,78% H 4,75% N 16,41%

9. das Massenspektrum des Hergestellten Materials VI, gemessen nach der Hydrolyse des Materials in 6 η Chlorwasserstoffsäure für 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extrahieren des hydrolysierten Produktes mit Äthyläther, Trocknen und Abdampfen und Silylierung mit BSA (Bistrimethylsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/2 276 (CHj)₁Si-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-COOSi(CHj)₃.

Berücksichtigt man die vorstehenden Gesamtergebnisse, so ergibt sich, daß die hergestellte Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, insbesondere die Existenz der Absorption bei 1765 cm ' (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum und die Signale bei 3,51 ppm (3H₁ Singlett, 7-0CH₁), 5,02 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,99 ppm (3H, Singlett, N-CH₃ von Tetrazol), 3,40-3,83 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz₁ 2-CH₂), 4,17 -4,50 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₂) und weiter aus den Tatsachen, daß anwesend sind 1,94 ppm (2H, Multiplett,j5-CH₂) und 2,40 ppm (4H, Multiplett, e,y-CH₂) beweist die Existenz von 4-Carboxybutyramido in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum und weiter das Massenspektrum des Deriva tes des hergestellten Materials, hydrolysiert mit Chlorwasserstoffsäure und silyliert, ergibt das Fragment von m/e 276; die hergestellte Verbindung F) dieser Erfindung hat ergeben, daß sie die vorstehend angegebene Struktur besitzt und die 5-Amino-5-carboxyvaleramid-Gruppe in der 7-Position des Ausgangsmatcrials oxydaliv deaminiert wurde in die 4-Carboxybutyramid-Gruppe.

G) 7-{4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l ,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyI-2f³-cephem-4-carbonsäure

OCH₃

S
HOOC—(CH₂),— CONH

COOH

Ausgangsmaterial ist die Verbindung C). Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung G) sind die folgenden:

1. weißes Pulver;

2. Schmelzpunkt 95-99 ⁰C;

3. leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, aber kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. saures Material ergibt negative Ninhydrinreaktion;

5. es wurde das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie in F i g. 15 dargestellt, erhalten, wenn in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 6,5 gemessen wurde. Das Absorptionsmaximum liegt bei 273 ηΐμ;

6. es wird das Infrarot-Absorptionsspektrum gemessen als Kaliumbromid-Tablette erhalten und zeigt die Absorptionen bei 3260 cm"', 2925 cm"', 1773 cm"', 1515 cm"¹ und 1375 cm"¹, wie aus Fig. 16 zu entnehmen ist

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als innerer Standard in schwerem Methanol, ergibt die in Fig. 17 dargestellten Werte und besitzt die folgenden Signale:

δ Wert (ppm): 1,92 (2H, Multiple«), 2,40 (4H, Multiplett), 2,71 (3H, Singlett), 3,38-3,80 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,51 (3H, Singlett), 4,17-4,64 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,03 (IH, Singlett);

8. es werden die folgenden elementar-analytischen Werte für Ci₇H₂ON₄O₇S₁ erhalten: Berechnet: C 41,79% H 4,13% N 11,47%

gefunden: C 41,89% H 4,27% N 11,17%

9. Das Massenspektrum des hergestellten Materials VII, gemessen nach der Hydrojyse des Materials in 6 η Chlorwasserstoffsäure in 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extrahieren des Produktes mit Äthyläther, Trocknen des Extraktes durch Abdampfen, Silylieren mit BSA (Bistrimethylsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/e 276 (CH₃)JSi-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-CO-OSi(CHO₃.

Berücksichtigt man die vorstehend genannten Ergebnisse, so ist ersichtlich, daß die hergestellte Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, insbesondere durch die Existenz der Absorption bei 1773 cm"¹ (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum und die Signale bei 3,51 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), -to 5,03 ppm (1H, Singlett, 6-CH), 2,71 ppm (3H, Singlett, C-CH₃ von Thiadiazol), 3,38-3,80 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) und 4,17-4,64 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₂) und weiter aus den Tatsachen, daß 1,92 ppm (2H, MuItIpIeU₁JS-CH₂) und 2,40 ppm (4H, Multiplett, ar,y-CH₂) anwesend sind, zeigen die Existenz von 4-Carboxybutyramid im kernmagnetischen Resonanzspektrum, und weiterhin ergibt das Massenspektrum des Derivates, hergestellt durch Hydrolyse der hergestellten Verbindung mit Chlorwasserstoffsäure und Silylieren des Produktes das Fragment von m/e 276. Der hergestellten Verbindung der Formel G) wurde die vorstehend angegebene Struktur zugesprochen, wobei die 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Gruppe in der 7-Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert wurde in die 4-Carboxybutyramido-Gruppe.

H) 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-^-cephem^-carbonsäure

OCH₃

S

HOOC—(CH₂)j—CONH

io COOH

Ausgungsmaterial ist die Verbindung D). Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung H) sind die folgenden:

1. weißes Pulver;

2. Schmelzpunkt 88-92°C;

3. leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, jedoch

kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. Saures Material besitzt negative Ninhydrin-Reaktion;

5. es wird das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie in Fig. 18 dargestellt, erhalten, wenn in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 6,5, gemessen wurde; das Absorptionsmaximum liegt bei 274 rnji;

6. es wird das Infrarot-Absorptionsspektrum, wie in Fig. 19 dargestellt, erhalten, wenn an einer Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde; die Absorptionen liegen bei 3250 cm"¹,2925 cm"¹,1770 cm"¹,1515 cm ' und 1365 cm"¹;

7. das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter TMS als innerer Standard in schwerem Methanol, ergibt, wie in Fig. 20 dargestellt, die folgenden Signale:

δ Wert (ppm): 1,92 (2H, Multiplett), 2,40 (4H, Multiplett). 3,39-3,83 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,f 1 (3H,

Singlett), 4,24-4,73 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,03 (IH, Singlett) und 9,35 (IH, Singlett);

8. es werden die folgenden elementar-analytischen Werte fur C₁₆H₁₈N₄O₇S₃ · 1/2H₂O erhalten: Berechnet: C 39,74% H 3,96% N 11,59%

gefunden: C 39,69% H 3,87% N 11,32%

9. Das Massenspektrum der hergestellten Verbindung H, gemessen durch Hydrolyse der Verbindung in 6 η Chlorwasserstoffsäure für 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extrahieren des Produktes mit Äthyläther, Trocknen des Extraktes durch Abdampfen und Silylieren mit BAS (Bistrimethylsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/e 276 (CHj)₅Si-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-CO-OSi(CHj)₃.

Berücksichtigt man die vorstehenden Gesamtergebnisse, so ergibt sich, daß die Verbindung eine 7-Methoxycephalosp&in-Verbindung ist. Dies wird abgestützt durch die Existenz der Absorption bei 1770 cm"' (cyclisches Lactam) in wem Infrarot-Absorptionsspektrum und den Sienalen bei 3-51 Dpm(3H. Singlett, 7-OCHj). 5.03 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 9,35 ppm (IH, Singlett, CH von Thiadiazol), 3',39¹Mi ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) und 4,24-4,73 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₂) und weiter durch die Tatsachen, daß

die Signale 1,92 ppm (2H, Multiplett, -CH₂) und 2,40 ppm (4H, Multiplett, -CH₂) anwesend sind, die die Existenz von 4-Carboxybutyramido in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum anzeigen, und weiterhin ergibt das Massenspektrum des Derivates, welches durch Hydrolyse der hergestellten Verbindung mit Chlorwasserstoffsäure und Silylierung des Produktes gewonnen wurde, das Fragment von m/e 276. Der hergestellten Verbindung H) wurde die vorstehend angegebene Struktur zuerkannt, wobei die S-Amino-S-carboxyvalerami do-Gruppe in der 7-Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert wurde in die 4-Carboxybutyramido- Gruppe.

Weiterhin 7e:gen die Analysenergebnisse der Dünnschichtchromatographie-Untersuchungen der Verbindungen E)-H) der allgemeinen Formel (I) und der Ausgangsmaterialien A)-D) der allgemeinen Formel (II) unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel®) in der folgenden Tabelle 1 die folgenden Rf-Werte:

Tabelle 1

Rf-Werte im Lösungs- Ninhylrin mittelsystem Anfärbung

, ₂

Ausgangsmaterial A)

Hergestellte Verbindung E)
Ausgangsmaterial B)

Hergestellte Verbindung F)

Ausgangsmaterial C)

Hergestellte Verbindung G)
"° Ausgangsmaterial D)

Hergestellte Verbindung H)

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-[(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxypropenoyOoxyrnethylH-methoxy-.d'-cephem^-carbonsäure

" 7-(4-Carboxybutyramido)-3-[(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxy- 0,67 0,67

propenoyl)oxymethyl]-7-methoxy-^l³-cephem-4-carbonsäure

Entwicklungslösungsmittelsystem:

1. Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser

(21 : 3 : 7 : 9 Volumenverhältnis)
_t2. n-Butanol : Essigsäure : Wasser
(4": 1 : 2 Volumenverhältnis)

Nachweis: Ninhydrinreaktion oder Ultraviolettabsorption (Manasulu Light, 2536 A) oder Bioautogruphic (unter Verwendung von Proteus mirabilis).
Die vollständigen Verbindungen geben positive Ergebnisse in den letzten beiden Testen.

0,44	0,37
0,79	0,72
0,44	0,34
0,81	0,64
0,42	0,44
0,82	0,77
0,42	0,36
0,81	0,65
0,66	0,67

Die Ergebnisse der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie sind in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Retentionszeit

Ausgangsmaterial A) 3 Min. 14 Sek.

Hergestellte Verbindung E) 13 Min. 24 Sek.

Ausgangsmateriai B) 1 Min. S3 Sek.

Mergestelite Verbindung F) 4 Min. 54 Sek. 10

Ausgangsmaterial C) 2 Min. 55 Sek.

Hergesteltte Verbindung G) 11 Min. 18 Sek.

Ausgangsmateriai D) 1 Min. 56 Sek.

Hergestellte Verbindung H) 5 Min. 28 Sek.

Benutzte Säule: Waters LTD α Bondapak Q₈ 15

Lösungsmittelsystem: Acetonitril . 0,1% Essigsäure (pH 3,3) (1 : 9 im Volumenverhältnis)

Die. Retentionszeiten der beiden Cephalosporinverbindungen bei der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie waren die folgenden: 20

Retei^.onszeit

7-(5-Amino-5-rarboxyvaleramido)-3V(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxy- 5 Min. 18 Sek.

propenoyl )-oxymethyl]-7-methoxy-J -cephem^carbonsäure _Ί .

7-(4-Carboxybutyramido)-3-[(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxy- 5 Min. 55 Sek.

propenoyl )-oxymethyI]-7-methoxy-^l³-cephem^-carbonsä! Te

Benutzte Säule: Waters Ltd. u Bondapak C₁₈

Lösungsmittelsystem: Acetonitril: 0,1% Essigsäure (pH 3,3) (2 : 8 Volumenverhältnis) _J(j

Die in vivo Eiffekte der Verbindungen B), C), F) und G) sind nachstehend angegeben: An 5 gesunde, männliche Mäuse des ddY Stamme3 wurden 10⁶ Zellen von E. coli NIHJ intraperitöneal injiziert. Nach 2 Stunden wurde jede Probe subkutan verabreicht. Die Überlebensprozentangaben nach 5 Tagen werden in der Folgenden Tabelle angegeben. Ähnliche Untersuchungen wurden mit 10⁵ Zellen von Proteus 35 mirabilis 1287 ausgeführt.
Die Kontrollgruppe bestand jedesmal aus 10 Mäusen.

Probe E. coli NIHJ Proteus mirabilis 1287 ₄₀

Dosis (mg/Maus)
3 1 0,5 0 3 1 0,5 0

B)	100	100	100	40	20	0
F)	100	100	0	60	20	0
C)	80	80	40	100	20	20
G)	80	60	0	40	20	20

Nachstehend werden die Beispiele dieser Erfindung im einzelnen verdeutlicht.

Beispiel 1

Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-'>-yl)-thiomethyl-7-methoxy-^³-cephem-4-carbonsäure A als Zwischenprodukt der Formel (II)

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid ent hi-It, wurde in eine 500 ml Sakaguchi- 6o (lasche mit je 100 ml eingefüllt und bei 120⁰C für 20 Minuten sterilisiert. Jede Flasche wurde mit Streptomyces oganonensis ATCC 31167 beimpft und 48 Stunden bei 3O⁰C kultiviert.

In weiteren Ansätzen wurde das gleiche Kulturmedium in 2000 ml Sakaguchiflaschen mitje400 rrl gefüllt und bei 120⁰C fur 20 Minuten sterilisiert. Es wurde mit dem gleichen Stamm in einer Konzentration von 2-3% beimpft und 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Kultur zu erhalten. 65

Weiterhin wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% G.'utenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, jeweils in zwei Liter Fermenten- zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel eingefüllt. Es wurde 30 Minuten

bei 12O⁰C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit 800 ml der Züchtungskultur beimpft, und dann wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. In wässeriger Natriumhydroxidlösung wurde S-Mercapto-l^-thiadiazol^-thioglykolsäure aufgelöst, und die gebildete Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu jedem Fermentor bis zu 0,05% des Impfmaterials zugegeben und dann wurde 90 Stunden kultiviert.

s Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Radiolitc (als Filterhilfsmittel) vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden miteinander vereinigt, und es wurden 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Die Filtrate wurden auf pH 3,0 mit wasseriger Natriumhydroxidlösung eingestellt und durch eine 12 Liter Amberlite* XAD-2 Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde

ίο gesammelt und eingeengt auf 5,5 Liter. Nach Entfernung der sich gebildeten Verunreinigungen wurde Wasser zu dem Rückstand hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und dann durch eine 3 Liter Amberlite¹" IRA-68 (Cl-Typi-Säule gegeben. Nach Waschen der Säule mit 6 Liter Wasser wurde mit wässeriger Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung mit antimikrobicl lern aktivem Material erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine ein Liter Amberlite" XAD- 2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit wässerigem 50%igem Aceton gewaschen. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Durch

Lyopholisierung der Lösung wurde etwa 18 g Rohprodukt der hergestellten Verbindung A erhalten. Dann wurde 18 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von etwa 800 ml DEAIi-

Sephadex* A-25 iEssigsäure-Typ) unterworfen. Die Säule war mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung gefüllt. Es wurde in die effektiven Komponenten fraktioniert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite⁰ XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer wässerigen 25%igen Acetonlösung eluiert. Die erhaltenen Eluate wurden zur Trockne eingedampft.

Dann wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7 : 3 Volumenverhältnis) verwendet, um den erhaltenen Rückstand des Produktes einer Säulenchromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel*), präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch der gleichen, vorstehend angegebenen Zusammensetzung, zu unterwerfen. Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel® SF aufgetragen, und mit einem Gemisch aus Isopropanol : n-Butanol: Essig säure: Wasser (21:3:7:9 Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurde Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin auf gesprüht und anschließend erwärmt, um die Färbung zu entwickeln. Dann wurden die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,39 gesammelt, die Fraktion im Vakuum bei etwa 45-50⁰C zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen. Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 Volumenverhältnis) präpariert. Die so erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde dann einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel* SF unter Verwendung des vorstehend genannten Lösungsmittelgemisches unterworfen und unter gleicher Nachbehandlung weiterverarbeitet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Produktrückstand wurde mit mikrokristalliner Cellulosesäulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsaure:

Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) weitergereinigt. Die gereinigte aktive Fraktion wurde zur Trockne eingedampft und dann in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde in einer Säule Sephadex® G-10 unter Verwendung von Wasser entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobiellcr Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie, wie schon vorstehend erläutert, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) untcrwor fen. Die Fraktionen mit Rf-Werten 0,32 wurden gesammelt, eingeengt und dann einer Lyophilisation unterwor fen. Es wurden etwa 80 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-J ^:-cephein-4-carbonsäure erhalten. Das erhaltene Zwischenprodukt wird gemäß den Angaben im Beispiel 10 zum Endprodukt weiter umgesetzt.

Beispiel 2 Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaieramido)-3-( l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-

J'-cephem-4-carbonsäure B) als Zwischenprodukt der allgemeinen Formel (II) 55

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl,0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchi-Flaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit Slreptomyces oganonensis ATCC 31 167 beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde das schon genannte Kulturmedium in zwei Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dem Sterilisieren für 20 Minuten beil 20⁰C wurde jedes Medium mit 2-3% der vorstehend erhaltenen Kulturbrühe beimpft und anschließend weitere 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um einen Impfansatz zu erhalten.

60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenöl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, wurde in zwei Liter Fermentern mit t>5 jeweils 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt. Nach dem Sterilisieren für 30 Minuten bei 120⁰C wurde jedes Medium mit 800 ml des vorstehend hergestellten Impfansatzes versetzt, und anschließend wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde l-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazoI in wässeriger Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Die Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugefügt, um deren

Knn/.cntrulion auf 0,05% einzustellen. Das Gemisch wurde 90 Stunden weiter kultiviert.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die so gebildete Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Radiolitc als Hilfsmittel zum Filtrieren unter Rühren versetzt, das Gemisch unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt, und es wurden etwa 100 Liter Filtratgemisch erhalten.

Das Filtrat »vurdeauf pH 3,0 mit wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt, durch eine 12 Liter Amberlite" XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit 30 Liter Wasser wurde die Säule mit 30 Liter einer wässerigen 50%igen Acetcnicsung eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde aul" pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine Dreiliter /Vr.bcrlitc"° IRA-68 (Cl-Typ)-Säule geleitet. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die I M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, fraktioniert. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die ein antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter Amberlite* XAD-2-Säule gegeben, mit Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 50%igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Durch Lyophilisierung der Lösung wurde etwa 54 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung B erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie mit etwa 800 ml DEAE is Sephade* A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung, unterworfen, um die aktiven Komponenten zu fraktionieren. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 25%igem Aceton eluiert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der gebildete Rückstand wurde der Säulenchromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Aviccl*) unterworfen, gefüllt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7 : 3 Volumenverhältnis) unter Verwendung des Lösungsmittelgemisches mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung. Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde gesammelt, tropfenförmig auf eine DUnnschichtplatte aus AviceP SF aufgetragen, mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 Volumenverhältnis) entwickelt und eine Lösung von 0,25% Ninhydrin in Pyridin wurde aufgesprüht, und anschließend wurde durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 gesammelt. Die Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet. Der gebildete Rückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen. Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21:3:7:9 VoIu- mcnverhältnis) präpariert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchror,.jtographie mit Avicel* SF mit dem Lösungsmittelgemisch mit der zuvor genannten gleichen Zusammensetzung unterworfen, wobei die gleiche Prozedur, wie vorstehend angegeben, angewendet wurde. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der so gebildete Rückstand wurde einer mikrokristallinen Cellulosesäulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6:1,5:2,5 Volumenverhältnis) unterworfen, um die effektive Komponente zu reinigen. Die so gereinigte aktive Fraktion wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Sephedex® G 10-Säule unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus -to n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 Volumenverhältnis), wie vorstehend angegeben, unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 gesammelt, konzentriert und dann lyophilisiert. Es wurde etwa 60 mg weißes 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-J³-cephem-4-carbonsäure erhalten. Das erhaltene Zwischenprodukt wird gemäß den Angaben im Beispiel 8 Abschnitt b) zum Endprodukt weiter umgesetzt.

Beispiel 3 Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)- so

thiomethyl-J³-cephem-4-carbonsäure C) als Zwischenprodukt der Formel (II)

Ein Kulturmedium, welches l%Stärke, l%Glukose, 1,5%Sojabohnenmehl,0,5%Hefeextrakt,0,1%Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Säkaguchiflaschen mit je 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Medium wurde dann mit Streptomyces oganonensis ATCC 31 167 beimpft und 48 Stunden bei 3O⁰C kultiviert. Ein weiteres Kulturmedium, wie vorstehend beschrieben, wurde in Zweiliter-Sakaguchiflaschen mit je 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit der vorstehend kultivierten Brühe mit einer 2—3%igen Konzentration beimpft und dann 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, wodurch eine Animpfkultur erhalten wurde.

Separat wurden je 60 Liter des Kulturmediums, das 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% GIycerin, 0,1% Casaminsäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in zwei 100 Liter Fermentern zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt. Es wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und mit 800 ml der Animpfungskuitur beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde 2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol in wässeriger Natriumhydroxidlösung gelöst und unter hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugegeben, so daß die Konzentration davon 0,05% in der Brühe betrug, worauf 90 Stunden weiter kultiviert wurde.

Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die FiI-

träte wurden vereinigt und ergeben etwa 100 Liter Filtratgemisch.

Das Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt durch Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung und dann durch eine 12 Liter Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 L Her Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wässerigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite" IRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter eines antimikrobiell aktiven Materials erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und durch eine Einliter-Amherlite® XAD-2-Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer

ίο wässerigen LSsung von 50%igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Das Produkt wurde lyophilisiert.

Unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis) wurde dergebildete Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel®), gefüllt mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen gleichen

is Zusammensetzung. Dann wurden die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen fraktioniert und tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte von Avicel® SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 :9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde übergesprüht und unter Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne bei 45-50°C gebracht. Der erhaltene Rückstand wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen. Die Säule war präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril: Wasser (7:3 Volumenverhältnis). Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel* SF, wie bei der vorstehenden Prozedur unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockne eingedampft. Es wurde 0,78 g rohes Pulver erhalten.

Das Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex® G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden fraktioniert und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Rutanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis) wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die Frak- $ tionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 82 mg weiße 7-(5-Ami-

no-S-carboxyvaleramidoj^-methoxy^-fS-methyl-l^^-thiadiazol-i-yO-thiomethyl-^-'-cephem^-carbonsäure erhalten. Das erhaltene Zwischenprodukt wird gemäß den Angaben im Beispiel 9 weiter umgesetzt.

Beispiel 4

Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bis(5-Carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung von 5-Mercapto-l ^-thiadiazoW-thioglykolsäure, hergestellt in Wasser unter Verwendung wässeriger Natriumhydroxidiösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde 23 g Röhpuiver der hergestellten Verbin- dung A erhalten. Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 1 angegeben, wurde etwa 45 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaIeramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-zl³-cephem-4-carbonsäure (hergestellte Verbindung A) als Zwischenprodukt erhalten, welches gemäß den Angaben im Beispiel 10 zum Endprodukt umgesetzt wird.

Beispiel 5

Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 2 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bis(l-Methyl-lH-tetrazol-5-yl)-disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in Wasser enthaltendem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle einer Lösung von l-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazol, hergestellt durch Auflösen des Tetrazols in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde etwa 26 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung B erhalten. Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 2 angegeben, wurde etwa 37 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaIeramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yI)-thiornethyt-7-rnethoxy-J³-cephem-4-carbonsäure (hergestellte Verbindung B) als Zwischenprodukt erhalten, welches gemäß den Anga- ben im Beispiel 8 Abschnitt b) zum Endprodukt weiter umgesetzt wird.

Beispiel 6

Durch Anwenden des gleichen Verfahrens wie im Beispiel 3 angegeben, wurde durch Einsetzen einer Lösung von bis(5-Methyl-l,3,4-thiadiazoI-2-yI)-disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol, und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporfilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung von 2-Mercapto-5-methyl-l ,3,4-thiadiazol, hergestellt in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, etwa 19 g rohes Pulver der hergestellten Verbindung C erhalten. •Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 3 angegeben, wurde etwa 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-2l³-cephem-4-carbonsäure (hergestellte Verbin dung C) als Zwischenprodukt erhalten, welches gemäß den Angaben im Beispiel 9 zum Endprodukt weiter umgesetzt wird.

Beispiel 7

Herstellung von 7-(j-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l ,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-,d^J-cephem-4-carbonsäure D) als Zwischenprodukt der Formel (II)

F.in Kulturmedium, welches l%Stärke, l%Glukose, 1,5%Sojabohnenmehl,0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhyürogcnphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml .»akdguehi-,, Haschen mit je 100 ml gelullt, 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und mit dem Streptomyces oganonensis

ATCC 31 167 beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in Zweiliter-Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, die gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, angeimpft, lis wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

■ Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, das 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100 Liter Fermentern, zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde t mit 800 mi eier Animpfkultur beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von

2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol, hergestellt durch Auflösen des Thiadiazols in Wasser unter Verwendung einer wäs-.. scrigcn Natriumhydroxidlösung und Sterilisation unter hohem Druck, zu der Kulturbrühe hinzugefügt, so daß

die Konzentration des Thiadiazols 0,05% betrug. Der Ansatz wurde dann 90 Stunden weiter kultiviert.
iL Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2.0 eingestellt und unter Rühren mit Radiolite

J- als Fillerhüümittel versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate

■ wurden \ reinigt, wodurch etwa 100 Liier des Filtratgemischs erhalten wurden.

'■, Das Filtrait wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine 12 Liter Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule

wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wässeriger 50%iger Acetonlösung eluiert. Die Eluate wurden bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite" llRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Eluiert wurde mit einer wässerigen Lösung (von pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter-Amberlite* XAD-2-Säule gegeben und mit Wasser gewaschen. Es wurde mit einer wässerigen 50%igen Acetonlösung gewaschen. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert. Unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 :1 :2 Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer

Süulcnchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel®) und mit dem

ι Lüsungsmitlelgemisch der gleichen vorstehenden Zusammensetzung präpariert. Die antimikrobiell aktiven

Fraktionen wurden fraktioniert, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel³ gebracht, entwickelt unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21:3:7:9) im Volumenverhältnis. Dann wurde eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin aufgesprüht und durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Hierauf wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt und im Vakuum bei 45-50⁰C zur Trockne eingedampft. Der Produktrückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel®) unterworfen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril: Wasser (7:3 Volumenverhältnis) präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden ebenfalls einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel® SF wie in dem vorstehenden Verfahren unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rl-Wert 0,39 wurden gesammelt, im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es wurde 0,92 g rohes Pulver erhalten.

Das rohe Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und dann einer Säulenchromalographie unter Verwendung von Amberlite® CG-50 (Η-Typ) mit destilliertem Wasser unterworfen, und άκ. antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephedex^s G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis), wie vorstehend beschrieben, unterzogen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurden weiße 7-(5-Amino-5- '■ carboxyvaIeramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyM³-cephem-4-carbonsäure als Zwischenprodukt erhalten, welches gemäß den Angaben im Beispiel 17 zum Endprodukt weiter umgesetzt wird.

f] Beispiel 8

ij; a) Ein Kulturmedium mit pH 6,0, bestehend aus 20 g Glukose, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magne-

I_I siumsul fat, 2 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Calciumchlorid, 0,1 g Borsäure, 0,04 g Ammoniummolybdat, Ü,04 g Mangansulfat, 0,04 g Zinksulfat, 0,045 g Kupfersulfat, 0,025 g Ferrosulfat, 20 meg Biotin, 2 mg Thiaminhydrochlorid,

■i 1 g DL-Methionin und 1000 ml Wasser wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben gefüllt und mit jeweils 100 ml Abfül-

lung versehen, dann in üblicher Weise sterilisiert. Jedes Medium wurde mit Trigonopsis variabilis IFO 0755-

:: Stamm beimpft mit anschließender Schüttelkultur für 72 Stunden bei 30⁰C.

; Nach Abschluß der Kultivierung wurden etwa 1000 ml der Kulturbrühe gesammelt. Die Brühe wurde bei

ψ 2000 Umdrehungen/Minute für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Mycel wurde gesammelt und in 500 ml

jY einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung mit pH 8,1 suspendiert, um eine Mycelsuspension zu erhalten. Zu der

t§ Myielsuspension wurden 5 ml Triton® X-100 hinzugefügt, und das Gemisch wurde 20-40 Minuten bei 37°C

jf geschüttelt, um das Mycel zu aktivieren. Dann wurde das geschüttelte Gemisch bei 2000 Umdrehungen/Minute

% 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert Das aktivierte Mycel wurde gesammelt, zweimal mit einer Pyrophosphat-

:■■ 23

pufferlösung mit pH 7-8 gewaschen. Dann wurde 100—200 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung mit pH 8,1 suspendiert, um eine Suspension des aktivierten Mycels zu erhalten.

b) In 10 ml einerO,l M Pyrophosphatpufferlösung mit pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, wurde 54,5 mg T-iS-Amino-S-carboxyvaleramidoVT-methoxy-S-il-methyl-lH-tetrazol-S-yl^-thiomethyl-^l^-cepheni^-carbon-S säure aufgelöst Dann wurde 0,5 ml der nach a) erhaltenen aktivierten Mycelsuspension hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüftung in einem Wasserbad bei 33°C durchgerührt Das Reaktionssystem wurde alle 30 Minuten mit einer Hitachi' Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographieapparatur unter Verwendung von uBondapak C₁₈, Herstellen Waters Co-, Lösungsmittelsystem: Acetonitril: Essigsäure (1:9 Volumenverhältnis) geprüft, um das Ende der Reaktion zu bestimmen. Die Retentionszeii des Ausgangsmaterials 7-(5-Ami-

«o no-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-( 1-methyl-l H-tetiazol-5-yI)-thiomethyl-.d^J-cephem-4-a>rbonsäure beträgt 1 Minute 53 Sekunden, während die Retentionszeit von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-niethoxy-3-( 1-methyllH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-/l^:'-cephem-4-carbonsäure die durch die D-Aminosäure-Oxidation erhalten wurde, 4 Minuten 54 Sekunden beträgt Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel durch Zentrifugieren entfernt Das Überstehende wurde abge trennt und wiedergewonnen, auf pH 1,5—2,0 mit verdünnter wässeriger Hydrochlorwasserstoflsäurelösung ein gestellt, und dann wurde viermal mit je einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatextrakte wurden gewonnen und mit Phosphatpufferlösung pH 6,0 reextrahiert Die Phosphatpufferlösung wurde dann auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und weiter viermal mit jeweils dem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatextrakte wurden kombiniert, mit wasser freiem Natriumsulfat entwässert und zur Trockne verdampft Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel·) mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure - Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unterworfen. Entwickelt und fraktioniert wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion gegen Proteus mirabilis wurde geprüft und die Fraktionen mit der antimikrcöiellen Aktivität wurden ausgesucht, tropfenförmig auf eine Dünn schichtplatte aus Avicel⁹ SF gebracht und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essig säure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt Dann wurden die Fraktionen, die die Ultraviolettabsorption mit Manasululicht 2536 Ä (Hersteller: Manasulu/Kagaku Koyo K. K.) zeigten und einen Rf-Wert 0,81 und beziehungsweise Rf-Wert 0,64 besitzen, gesammelt konzentriert und Iyophilisiert. Es wurden 35 mg reine 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-/l³-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis. Salmonella gallinarum und Escheria coli.

Beispiel 9

In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatlösung von pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, wurde 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyI-id³-cephem-4-carbonsäure aufgelöst. Zu der Lösung wurde 04 ml der aktivierten Mycelsuspension von Trigonopsis variabilis IFO 0755, in der gleichen Weise wie im Beispiel 8 beschrieben, zugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüftung in einem Was serbad bei 33°C gehalten, um die D-Aminosäure-Oxydation durchzuführen. Die Beendigung der Reaktion wurde mit der gleichen Hochgeschwindigkeitsfiüssigkeitschromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials, 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyI-/l-cephem-4-carbonsäure betrug 2 Minuten 55 Sekunden und die Retentionszeit der 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiome- thyl-4'-cephem-4-carbonsäure, die durch die D-Aminosäure-Oxidation erhalten wurde, betrug 11 Minuten 18 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel bei 4°C entfernt, und das Überstehende wurde gewonnen, auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter Chlorwasserstofjsäurelösung eingestellt, und es wurde viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und mit einer PhosphatpulTcr- lösung von pH 6 extrahiert. Die Phosphatlösung wurde auf pH 1,5 bis 2,0 eingestellt und erneut viermal mit jeweils gleichem Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden gesammelt, mit entwässertem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde unter Verwendung einer Säule, gefüllt mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Voiumenverhältnis) gereinigt. Der Rückstand wurde unter Verwendung des glei chen, vorstehend angegebenen Lösungsmittelgemisches entwickelt Die Fraktionen mit antimikrubieller Akti vität gegen Proteus mirabilis wurden gesammelt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel* SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure: Wasser (21:3 :7:9 im Voiumenverhältnis und beziehungsweise einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt Dann wurden die Fraktionen, die die Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 Λ (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) aufwiesen und auch einen Rf-Wert 0,82 beziehungsweise RF-Wert 0,77 besaßen, gesammelt, konzentriert und Iyophilisiert. Es wurden 32 mg reines 7-(4-Carboxy-butyramidoJ-T-methoxy-i-iS-methyl-I.S^-thiadiazol^-ylHhiomethyl-.d'-cephem^carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis. Salmonella Gallinarum und Escherichia coli.

Beispiel 10

in 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung von pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, wurde in 50 mg T-iS-Amino-S-carboxyvaleramidoJ-S-iS-carboxymethylthio-l^^-thiadiazoI^-yD-thiomethyl-T-methoxy-j'-cephem-4-carbonsäure aufgelöst Nach Zugabe von 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, hergestellt in der gleichen Weise wie im Beispiel 8a angegeben, wurde das Gemisch unter Rühren und Belüftung auf dem Wasserbad bei 33°C gehalten, um die D-Aminosäure-Oxydation durchzuführen. Das Ende der Reaktion wurde alle 30 Minuten mit der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8 angegeben, geprüft Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials T-iS-Amino-S-carboxyvaleramido^^S-carboxymethyIthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-2l³-cephem-4-carbonsäure, betrug 3 Minuten 14 Sekun- den und die Retentionszeit von 7-(4-(^boxybutyramido)-3-{5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thioraethyl-7-methoxy-/iⁱ-cepheni-4-carbonsäure, gebildet durch die Wirkung des D-Aminosäure oxidierenden Enzyms, betrug 13 Minuten 24 Sekunden.

Nach beendeter Umsetzung wurde das Mycel durch Zentrifugieren bei 4°C entfernt Das Überstehende wurde wiedergewonnen und dann auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt Es wurde viermal mit je gleichem Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden gewonnen und vereinigt Der Extrakt wurde mit einer Phosphatpufferlösung bei pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatpufferlösung wurde auf pH_l,5-2,0 mit verdünnter Chlorwasserstofflösung eingestellt und erneu' viermal mit einem gleichen Volumen Athylacetat extrahiert

Die Äthylacetatextrakte wurden gesammelt und mit entwässertem Natriumsulfat getrocknet und danach im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der Rückstand wurde mil einem Lösungsmitteigemisch entwickelt aus n-Butanoi : Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel") und des Lösungsmittelgemisches mit dergleichen vorstehenden Zusammensetzung. Die antimikrobiclle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität gegen Proteus mira- bilis wurden gesammelt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel* SF aufgetragen und mit einem Lösungsmitteigemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 :3 : 7 :9 im Volumenverhältnis), beziehungsweise einem Lösungsmitteigemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurden die Fraktionen, die die Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 Ä (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) aufweisen und den Rf-Wert 0,79 bzw. 0,72 besitzen, gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es werden 30 mg reine 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazoI-2-yI)-thiomethyl-7-methoxy-J³-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis. Salmonella Gallinarum und Escherichia coli.

Beispiel 11

a) Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke,1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmeh!, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen in einer Menge von je 100 ml gefüllt Jede Flasche wurde 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit Streptomycen oganonensis ATCC 31167 beimpft und 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert.

Das Kulturmedium wurde außerdem in Zweiliter-Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Der Ansatz wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, die wie vorstehend hergestellt wurde, beimpft und 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Es wurde so eine Animpfkultur erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0.8% Glycerin, 0.1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100 Liter Fermentern zusammen mit je 10 ml Adecanol als Antischaummittel versetzt, sterilisiert während 30 Minuten bei 12O⁰C. Es wurde mit 800 ml der Animpfkultur, die gemäß der vorstehenden Vorschrift hergestellt worden war, beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 5-Mercapto-l-methyl-lH-tetrazol, hergestellt aus einer wässerigen Nutriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, zu der Kulturbrühe so hinzugegeben, daß die Konzentration des Tclrazols 0,05% betrug. Die Kultivierung wurde noch 90 Stunden ausgeführt.

Nachdem die Kultivierung vollständig war, wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt Das Gemisch wurde mit einer Filterpresse filtriert und die erhaltenen liltralc wurde vereinigt. Es wurden 100 LiterFiltratgemisch mit einem Gehaltan lOOmcg/ml an 7-(5-Amino-5-carboxyvalcramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyI-^^}-cephem-4-carbonsäure erhalten.

h) Das Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt und durch eine 12 Liter Amberlite" XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50%igen Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 7,5 unter Verwendung wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Nach Entfernen der gebildeten unlöslichen Anteile wurde 320 ml der aktivierten Mycelsuspension des Trigonopsis variabilis IFO 0755-Stammes, präpariert nach den Angaben im Beispiel 8a, zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüften 4 Stunden durchgeführt, auf pH 1,5-2,0 mit wässeriger ChlgrwasserstofFsäurelösung eingestellt, Die Lösung wurde viermal unter Verwendung gleicher Volumenteile Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden gesammelt. 20 Liter des so erhaltenen Äthylacetatcxtraktcs wurde dann mit 2 Liter Phosphatpufferlösung pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatlösung wurde auf pH 1,5-2,0 mit wässeriger ChlorwasserstofTsäurelösung eingestellt und erneut viermal mit dem gleichen Volumen Athylacetat extrahiert. Die Äthylacetatfiltrate wurden vereinigt. 8 Liter des so erhaltenen Extraktes wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es wurden etwa 15 g Rohmaterial erhalten. Dieses Rohmaterial wurde der Säuionchromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver in der gleichen Weise, wie im Beispiel 8b angegeben, unterworfen. Es wurde 6,1 g weiße 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-rnethyl-lH-tetrazol-5-yl)-

zu Ji

thiomethyl-.4³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 12

Ein Kulturmedium, welches 50 g Glukose, 10 g Pepton, 1 gKaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 10 g Malzextrakt, 1 g DL-Methionin und 1000 ml Wasser mit pH 6,0 enthielt, wurde mit dem Tngonopsis variabilis IFO 0755-Stamm beimpft Anschließend wurde kultiviert, wie im Beispiel 8a angegeben. 1000 ml der so gebildeten Kulturbrühe wurden gesammelt. Es wurden 1000 ml der Kulturbrühe bei 2G00 Umdrehungen/ Minute bei 4°C zentrifugiert Das gebildete Mycel wurde gesammelt Das Mycel wurde in 200 ml einer 0,1 M

ίο Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1 suspendiert Die Suspension des Mycels wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben in 50 ml Portionen eingefüllt Dann wurde nach der Zugabe von 5 ml Toluol zu der Suspension die AkUvierung eine Stunde bei 37°C durchgeführt Danach wurde das aktivierte Mycel durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 2000 Umdrehungen/Minuten aktiviert.
Dann wurde unter Zentrifugieren mit 200 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1 gewaschen. Das

is aktivierte Mycel wurde erneut in 200 ml 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1 suspendiert Die Suspension wurde auf dem Wasserbad bei 50⁰C durchgerührt, um die Katalaseaktivität zu inaktivieren. Dann wurden 5 ml der aktivierten Mycelsuspension zu einer Lösung von 100 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-S-yOthiomethyl-^-cephem^-carbonsäure in 20 ml 0,1 M Pyrophosphatpuflerlösung pH 8,1 gegeben, und nach dem Durchfuhren unter Belüftungfür 5 Stunden bei 33°C wurde das Gemisch, wie im Beispiel 8b angegeben, behandelt. Es wurde dadurch 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-{l-mcthyl-IH-tetrazol-S-ylHhiomethyl-.^-cephern-'t-carbonsäure hergestellt

Beispie! 13

Das Mycel, erhalten von Trigonopsis variabilis IFO 0755 durch die gleiche Arbeitsweise, wie im Beispiel 8a beschrieben, wurde bei einer Temperatur unter -20⁰C für mehr als eine Stunde eingefroren. Dann wurde bei Zimmertemperatur zum Auftauen stehen gelassen. Es wurde in 200 ml 0,1 M Pyrophosphatlösung pH 8,1 suspendiert. Danach wurde 5 ml der Suspension zu einer Lösung von 100 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-_J4^:j-cephem-4-carbü-nsäure in 20 ml 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, hinzugefügt Nach dem Durchrühren des Gemisches unter Belüftung während 5 Stunden bei 33°C wurde das Gemisch in dergleichen Weise, wie im Beispiel 8b angegeben, behandelt. Es wurde 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-2f'-cepherr 4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 14

a) Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaIeramido)-3-(l-methy!-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-/l³-cephem-4-carbonsäure

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1% Glucose, 1,5%Sojabohnenmehl,0,5% Hefeextrakt,O,l% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in £X> ml Sakaguchillaschen in jeweils einer Menge von 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das sterile Kulturmedium wurde mit dem Streptomyces oganonensis ATCC 31167 beimpft. Es wurde 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Das vorstehend hergestellte kulturmedium wurde auch in zwei Liter Sakaguchifiaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dem Sterilisieren des Mediums fur 20 Minuten bei 120⁰C wurde das Kulturmedium mit der im vorstehenden Verfahren erhaltenen Kulturbrühe in einer Menge von 2-3% beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermentern zusammen mitje 10 ml Adecanol als Entschäum ungsmittel eingefüllt. Jedes Kulturmedium wurde für 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Es wurde mit 800 ml der nach der vorstehenden Arbeitsweise hergestellten Animpfkultur beimpft. Dann wurde zu jedem Fermenter eine Lösung von l-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazol, hergestellt durch Auflösen in wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren unter hohem Druck, so daß der Gehalt 0,05% betrug, hinzugefügt. Dann wurde die Kulturbrühe 90 Stunden weiter kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde durch eine Filterpresse filtriert, und die Filtrate wurden zu etwa 100 Liter Filtratgemisch vereinigt.

Das Gemisch wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt Dann wurde durch eine 12 Liter-Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen.

Es wurde mit 30 Liter wässerigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoflsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite* IRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit wässeriger Lösung (pH 7,2), die I η Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung, die ein antimicrobiell aktives Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, und sie wurde durch eine 1 Liter Amberlite* XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Ks wurde mit wässerigem 50%igem Aceton eluiert.

Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung mit antimicrobiell aktivem Material erhalten, welches lyophilisierl wurde. Es wurden etwa 54 g rohes Pulver erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie unter-

I worfcn. Hs wurden hierzu 800 ml DEAE Sephadex® A-25 (Essigsäure-Typ) verwendet und mit einer kleinen

i Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepuffer gefüllt. Es wurden die effektiven Fraktionen isoliert. Die so

> gesammelten antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden durch eine 500 ml Amberlike® XAD-2-Säule gegeben.

£ Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wässerigem 25%.'gem Aceton eluiert. Das Eluat wurde dann im

J Vakuum zur Trockne eingedampft Das getrocknete Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem

Jj Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7 :3 im Volumenverhältnis) mittels mikrokristalliner Cellu-

% lose (Avicel") unterworfen. Die Säule war mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen Zusam-

I nicnset/ung gelullt. Die Fraktionen mit antimikrobicllcr Aktivität wurden tropfenförmig auf eine Dünnschicht-

*&. platte aus Aviccl" SI·' aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser

I (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) entwickelt.

|; Eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde aufgesprüht und die Anfärbung wurde durch Erwärmen ent-

1 wickelt. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, im Vakuum bei 45-50⁰C zur Trockne einge-

5 dampft und einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel®) unterworfen. Die Säule ent-I hielt ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 :3 : 7 :9 im Volumenver-

I hältnis). Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden dann ausgewählt und einer Dünnschichtchromatogra-

^ phic mit Avicel® SF unterworfen. Hierbei wurde das gleiche vorstehende Verfahren angewendet. Die Fraktio-

f nen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.

6 Das getrocknete Produkt wurde in eine Chromatographiesäule mit mikrokristalliner CeUulose gegeben.

f Fs wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis)

% verwendet, um eine Reinigung der effektiven Komponente zu erzielen. Die gereinigten aktiven Fraktionen wur-

I, den durch Konzentration getrocknet, in einer kleinen Menge destifliertem Wasser gelöst un^ in einer Säule mit

j Scphadex* G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobitile Aktivität jeder

j Fraktion wurde geprüft, und die effektive η Fraktionen wurden ausgewählt und einer Dünnschiciitchromatogra-

; phic unterworfen, wie dies vorstehend erläutert wurde.

j Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 :2,5 im Volumenverhältnis)

I verwendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurde

\. etwa 60 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-meitiyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-j'-

I cephem-4-carbonsäure erhalten.

1 b) Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-

\ thiomethyl-.<l³-cephem-4-carbonsäure

] In 10mleiner0,l MPyrophosphatpufferlösungpFI8,1,die0,02Natriumazidenthielt,wurde54,5mg7-(5-Ami-

;.; no-5-carboxy-valeramido)-7-methoxy-3-(l -methyl- lH-tetrazoI-S-yO-thioinethyl-.d-'-cephenM-carbonsäure,

\. hergestellt in Stufe a, aufgelöst. Nach Zugabe von 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, die in der gleichen

i Weise, wie im Beispiel 8a angegeben, hergestellt worden war, wurde das Gemisch unter Belüftung auf dem Was-

^ scrbad bei 33°C durchgerührt. Der vollständige Ablauf der Reaktion wurde durch Prüfung des Reaktionsansat-

y zes in 30 Minuten Abständen mit Hilfe einer Hitachi* Hochgeschwindigkeitsflüssigkeits-Chromatographieap-

I parulur bestimmt (unter Verwendung von μ Bandapak C₁₈, Hersteller: Waters Ltd., Lösungsmittelsystem Aceto-

L. nitril : 0,1% Essigsäurelösung 1 : 9 im Volumenverhältnis).

I Die «etentionszeit des Ausgangsmaterials 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-IH-

y tcira/ol-5-ylHhiomethyI-.d¹-cephem-4-carbonsäure betrup 1 Minute 53 Sekunden, und die Retentionszeit der

y 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-( 1-methyl-lH-tetrazoI-5-yl)thiomethyl-zl "-cephenHUcarbonsäure, her-

I gestellt durch D-Aminosäure-Oxidation, betrugt Minuten 54 Sekunden Nach beendeter Umsetzung wurde das

I Mycol durch Abzentrifugieren bei 4°C entfernt. Das Überstehende wurde gesammelt, auf pH 1,5-2,0 mit ver-

Π dünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Dann wurde die Lösung viermal mit je einem gleichen

Volurucn an Äihylacetat extrahiert und dann mit einer Phosphatpufferlösung von pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphalpuffcrlösung wurde dann eingestellt auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäurelösung und j erneut viermal jeweils mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden ver-

i einigt und durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das 5i>

k Trockenprodukt wuite mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 :1:2 im VoIu-

j* menverhäitnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose* (Avicel) ent-

; wickel·, wobei das Löiungsmittelgemisch mit der gleichen vorstehenden Zusammensetzung verwendet wurde.

j Die iintimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde gegen Proteus mirabilis geprüft. Die Fraktionen, die die anti-

I mikrobiellc Aktivität enthielten, wurden ausgewählt uno tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte Avicel* SF

aufgetragen. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanot : Essigsäure : Wasser ; (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser

< (4 . I : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt. Die Fraktionen, die eine Ultraviolett-Absorption im Manasululicht

2536 Λ (Hcrsteller.Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) aufwiesen und den Rf-Wert 0,81 bzw. Rf-Wert 0,64 besaßen, ; wurden gesammelt. Diese Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und "yophilisiert. Es wurden 35 mg reines

■ 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(!-methyl-lH-tetrazoI-5-yl)-thiomethyI-J³-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses so hergestellte Material besaß antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinurum und Escherichia coli.

Zusätzlich wurde die nicht unter die Erfindung fallende Methylesterverbindung, die sich von dem in diesem Beispiel erhaltenen Produkt ableitet, durch das im folgenden Referenzbeispiel A angewendete Verfahren hergestellt. Dieser so erhaltene Methylester stimmte in seiner Struktur vollständig mit der entsprechenden Verbindung überein, die durch das synthetische Verfahren, welches nachstehend im Referenzbeispiel B artgegeben wird, hergestellt wrrde.

Referenz-Beispiel A

In 10 ml Chloroform wurde 100 mg 7-(4-Carboxybutyrarnido)-7-rnethoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-^)'-cephem-4-carbonsäure suspendiert. Nach Zugabe von 4 ml einer l%igen Diazomethan-Ätherlösung zu der Suspension wurde das Gemisch 30 Minuten bei Zimmertemperatur durchgerührt. Das erhuUenc Reaktionsgemisch wurde mit verdünnter Essigsäure und Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Silikagelsäule unterworfen. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol: Äthylacetat (1 :3 im Volumenverhältnis) eluiert. Die die Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt.

Eswurde80mg7-Methoxy-7-(4-methoxycarbonylbutyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yI)-thiomcthyl-/l¹-cephem-4-carbonsäuremethylester erhalten.

Infrarot-Absorptionsspektrum:

^¹: 1780 \Lactam O

1725 (Ester, Carbonyl).

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCi₃):

δ: 2,03 (2H, -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CO-), 2,39 (4H, -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CO-), 3,51 (3H, 7-Position, -OCH₃), 3,64 (3H, CH₃-O —CO-(CH;),,-),

3,87	3H,	N- I	N Η	ν' ι
3,92	3H,	κ	11 N	I CH,
		\

4.23.	4.53	2H

COOCH₃

CH₂-S-

5,04 (IH, 6-Position, —H).

Referenzbeispiel B

a) In ein Gemisch aus 30 ml Äthylacetat und 50 ml Methanol wurden 1,0 g 7jS-(3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzylidenamino)-7ü-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-zl³-cephem-4-carbonsäure-diphcnylmethylester und 1,8 g Gilardreagenz aufgelöst. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur durch- gerührt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt, und der gebildete Rückstand wurde in 50 ml Äthylacetat aufgelöst und dreimal mit je 20 ml Wasser gewaschen. Die gebildete organische Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat. Dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Es wurde etwa 0,6 g rohes 7/?-Amino-7a'-methoxy-3-(1-methyl-l H-tetrazol-5-yl)-thiomethyM³-<ephem-4-carbonsäure-diphenylmethylester erhalten. Das Produkt wurde in 10 ml Chloroform aufgelöst und nach dem Abkühlen der Lösung auf eine Temperatur von -20⁰C bis -30⁰C wurde 0,6 g 4-Chlor-förmyIbuttersäuremethylester tropfenweise zu der Lösung unter Rühren hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann noch eine Stunde bei dergleichen Temperatur durchgerührt Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 20 ml Chloroform gemischt. Das Gemisch wurde mit 10 ml 1 η Chlorwassersioffsäure gewaschen, und dann wurde mit 10 ml Wasser nachgewaschen. Die gebildete organische Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der gebildete Rückstand wurde einer Silikagelsäulenchromatographie unterworfen. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol: Äthylacetat (3 :1 im Volumenverhältnis) und danach mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol: Äthylacetat (1:3 Volumenverhältnis) eluiert. Es wurde 500 mg reiner la Methoxy-7j!-(4-methoxycarbonyIbutyramido)-3-(l-methyl-lH-.tetrazol-5-yl)-thiometh3.-|-/i^!- cephem-4-carbonsäure-diphenylmethylester mit den folgenden Eigenschaften erhalten.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl₃):

δ: 2,00 (2H, -CO-CH₂-CHa-CH₂-CO-), 2,36 (4H, -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CO-), 3,50 (3H, 7-Position, -OCH₃), 3,63 (3H, CH₃-O-CO-(CH₂),-),

N N\

3,78

3H,

4,19, 4,44

2H

CH₃

. -ί

5,04 (IH, 6-Position, H), C₆H₃\

6,91

7,32

IH, -CH

C₆H₅, _ C₆H₅N

1OH, -CH \

C₆HjJ

b) In 4 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Trifluoressigsäure : Anisol (4 : 1 im Volumenverhältnis) wurde 400 mg 7ar-Methoxy-7/H4-methoxycarbonylbutyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-.d³-cephern^-carbonsäure-diphenylrnethylester bei Temperaturen von -!O⁰C bis -2Q°C aufgelöst. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei der gleichen Temperatur gerührt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Dann wurde Äther zu dem Rückstand hinzugegeben, wodurch rohe 7o-Methoxy-7jJ-(4-methoxycarbonyl-butyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-/l³-cephem-4-carbonsäure ausfiel, die durch Filtration abgetrennt und in 10 ml Chloroform suspendiert wurde. Die Suspension wurde mit 0,4 ml einer l%igen Diazomethan-Ätherlösung bei 10-20⁰C vermischt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das gebildete Reaktionsgemisch wurde mit verdünnter Essigsäurelösung gewaschen, mit Wasser nachgewaschen. Es wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der gebildete Rückstand wurde einer Silikagelsäulenchromatographie unterworfen. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol: Äthylacetat (1 : 3 im Volumenverhältnis) eluiert. Die die Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 150 mg 7ar-Methoxy-7jS-(4-methoxycarbonylbutyramido)-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-2l³-cephem-4-carbonsäuremethylester mit den folgenden Eigenschaften erhalten:

Infrarot-Absorptionsspektrum:

ig;cm"': 1780 \Lactam O

1725 (Ester, Carbonyl).

Kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl₃):

(5: 2,03 (2H, —CO — CH₂-CH₂-CH₂—CO-),

2,39 (4H, -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CO-),

3,51 (3H, 7-Position, -OCH₃),

3,64 (3H, CHjOCOiCH^—),

25

35 40 45 50 55 60 65

29

5,04 (IH, 6-Position, H).

Beispiel 15

a) Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvalerarnido)-7-methoxy-3-(5-rnethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-

thiomethyl-,d'-cephem-4-carbonsäure

Ein Kulturmedium, weiches i% Stärke, 1% Glukose, i,5%Sojabohncrirnch^0,5%Mcfecxiraki,0,!% Dikaüurnhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchillaschen in einer Menge von jeweils 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Das Kulturmedium wurde dann mit dem Streptomyces oganonensis ATCC 31167 beimpft. Anschlieüend wurde 48 Stunden bei 3O⁰C kultiviert.

Das vorstehende Kulturmedium wurde in 2 Liter Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert.

Dann wurde mit 2-3% Kulturbrühe, gemäß dem vorstehenden Verfahren erhalten, angeimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermenter zusammen mit 10 ml Adecanol gefüllt und 30 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde mit 800 ml Animpfkultur, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, geimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. In jeden Fermenter wurde eine Lösung von 2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol, hergestellt mit wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, hinzugegeben, so daß ihr Gehalt 0,05% der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden fortgesetzt.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt. Radiolite wurde als Filterhilfsmittel unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse nitriert. Die Filtrate wurden vereinigt und ergaben etwa IQO Liter Filtratgemisch.

Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Die Lösung wurde durch eine 12 Liter Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50%igem Aceton eluieirt. Das Eluat wird konzentriert bis zu 5,5 Liter, auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und in eine 3 Liter /-mberlitc"" IRA-68 (Cl-Typ)-Säuie gefüllt. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, gewonnen. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und in eine 1 Liter Amberlite® XAD-2-Säule eingefüllt. Die Säule wurde mit 50%igem wässerigen Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch

so aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel) und einer Füllung mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 :3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Mit einer Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde besprüht, um durch Erwärmen anzufärben. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockne unter vermindertem Druck bei 45—50⁰C eingedampft. Das erhaltene Produkt wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel®), gefüllt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril: Wasser (7 :3 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie auf Avicel® SF, wie bei der vorstehenden Arbeitsweise, unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurden 0,78 g eines rohen Pulvers erhalten.

Das Produkt wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex* GlO unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie, wie vorstehend angcgeben, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurde 82 mg weiße 7-{5-Amino-5-carboxyvakramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3₎4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-2l³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

►>> Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-tbiomethyl-.d¹-cephem-4-carbonsäure

In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, wurde 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-^l³-cephem-4-carbon- säure aufgelöst. Nach Zugabe von 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, hergestellt unter Verwendung des Trigonopsis variabilis IFO 0755-Stammes, wie im Beispiel 8a angegeben, wurde das Gemisch unter Belüftung auf einem Wasserbad bei 33°C durchgerührt, um die D-Aminosäure-Oxidation durchzuführeti. Der vollständige Ablauf der Reaktion wurde durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeits-Chromatographie, wie im Beispiel 8b beschrieben, festgestellt. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-S-tS-methyl-l^-thiadiazol^-yO-thiomethyl-^-cephem^-carbonsäure betrug 2 Minuten 55 Sekunden und jene von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-J"¹-cephern-4-carbonsäure, hergestellt durch die D-Aminosäure-Oxidation, betrug 11 Minuten 18 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel bei 4°C entfernt, und das Überstehende wurde abgetrennt, auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die ÄthylacCtatextrakte wurden vereinigt, und mit einer PhosphatpulTerlösung pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatlösung wurde dann auf pH 1,5-2,0 eingestellt und dann viermal jeweils mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, mit wasserfreiem Natriumsulfat extrahiert und zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 :1:2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrukrisiaüiner Ceiiuiose (Avicer) unter Verwendung des Lösungsmittelgemisches mit der gleichen vorstehenden Zusammensetzung entwickelt. Dann wurden die Fraktionen, die antimikrobieile Aktivitat gegen Proteus mirabilis besitzen, ausgewählt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel® SF aufgetragen, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Biitanol: Essigsäure: Wasser (21:3 :7:9 im Volumenverhältnis) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser(4:1:2 im Volumenverhältnis) entwickelt, um die Fraktionen auszuwählen, die die Ultraviolett-Absorplion im Manasululicht 2536 Ä (Hersteller Manasulu Kagaku KogyoK. K.) aufweisen-Jnd den Rf-Wert0,82 bzw. Rf-WertO,77 besitzen. Die so ausgewählten Fraktionen wurden konzentriert und dann lyophilisiert. Es wurden 32 mg reine 7-(4-CarboxybutyramidoJ^-methoxy-S-iS-methyl-l^-thiadiazol^-yO-thiomethyM'-cephem^-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobieile Aktivität gegen Proteus mirabilis. Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

Beispiel 16

a) Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-

thiomethyl-7-methoxy-.d^:'-cephem-4-carbonsäure

Ein Kulturmedium, welches l%Stärke, l%Glukose, 1,5%Sojabohnenmehl,0,5%Hefeextrakt,0,1%Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500 ml Sakaguchiflasche mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit dem Streptomyces oganonensis ATCC 31167-Stamm beimpft. Es wurde anschließend 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2000 ml Sakaguchiflaschen jeweils mit 400 ml gefüllt, und jedes Kulturmedium wurde 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, beimpft und anschließend 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermentcr zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt. Jedes Medium wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und mit 800 ml der Animpfkultur, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, geimpft. Anschließend wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert.

Dann wurde in jeden Fermenter eine Lösung von bis(5-Carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol, und Sterilisieren durch Filtration unter Verwendung eines Millipore-Filters, in einer solchen Menge zugefügt, daß der Gehalt 0,05% in der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden durchgeführt. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt. Es wurden etwa 100 Liter eines Filtratgemisches erhalten. Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe einer wässerigen Natriumhydroxidlösung eingestellt. Es wurde die Lösung in eine 12 Liter Amberlite® XAD-2-Säule eingefüllt. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Nach Entfernung der gebildeten unlnslichen Anteile wurde Wasser zu dem Konzentrat hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt, durch eine 3 Liter Amberlite® IRA-68 (CI-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter Lösung erhalten, die antimikrobiell aktives Material enthielt. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, in eine 1 Liter Amberlite® XAD-2-Säule gefüllt. Die Säule wurde mit Wasser gewäsehen und mit wässerigem 50%igen Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Durch Lyophilisieren der wässerigen Lösung wurde etwa 23 g rohes Pulver erhalten. Dann wurde 23 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 800 ml

DEAE-Sephadex* A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung, unterworfen, um die effektiven Komponenten abzutrennen. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in eine 500 ml Amberiite* XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Es wurde mit wässerigem 25%igen Aceton eluiert Das Eluat wurde zur Trockne im Vakuum eingedampft Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen, wobei das Löst xigsmi ttelgemisch verwendet wurde, das die gleiche Zusammensetzung wie bei der vorstehenden Fraktionierung der antimikrobiell aktiven Fraktionen hatte. Die so erhaltenen Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel* SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropano!: n-Butanol: Essigsäure: Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis) entwickelt Dann wurde eine Pyridi nlösung von 0,25% Ninhydrin aufgesprüht und die Anfärbung durch Erhitzen entwickelt Dann wuraen die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie, mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) gefüllt, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure: Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis)

IS verwendet Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie auf einer Avicel* SF-Piatte unterworfen. Das Lösungsmittelgemisch hatte die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehende Gemisch. Es wurde hierbei, wie vorstehend schon beschrieben, verfahren. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft

Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose und eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) gereinigt. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen und mit einer Säule aus Sephadex* G-10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchrom sographie, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6:1,5 :2,5 im Volumenverhältnis) verwendet Die Fraktionen mit einem Rf-Wert 032 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert Es wurden etwa 45 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-13,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-?-methoxy-.d^J-cephem-4-carbonsäure erhalten.

b» Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-

thiomethyl-7-methoxy-^³-cephem-4-carbonsäure

In 5 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufierlösung von pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt wurde 25 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylihio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-4'-cephem-4-carbonsäure, die im vorstehenden Verfahren a) erhalten worden ist aufgelöst. Zu der Lösung wurde 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, hergestellt gemäß den Angaben im Beispiel 8a, hinzugefügt Das Gemisch wurde unter Belüftung und Rühren bei 33°C auf dem Wasserbad gehalten, um die D-Aminosäure-Oxidation auszuführen. Zur Feststellung des Reaktionsendes wurde aus 30 Minuten unter Verwendung der Hitachi* Hochgeschwindigkeitschromatographieapparatur in der gleichen Weise, wie im Beispiel 8a beschrieben, die Prüfung ausgeführt Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-2l³-cephem-4-carbonsäure betrug 3 Minuten 14 Sekunden und jene von 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-J³-cephem-4-carbonsäure, hergestellt durch die D-Aminosäure-Oxidation, betrug 13 Minuten 24 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel durch Zentrifugieren bei 4°C entfernt. Das Überstehende wurde abgetrennt, auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt Dann wurde viermal jeweils mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und mit einer Phosphatpuffertösung bei pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatlösung wurde auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und viermal jeweils mit einem gleichen Volumen

Äthylacetat extrahiert. Die Äthytacetatextraktc wurden gesammelt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie gcreinigt. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die Fraktionen, die die antimikrobielle Aktivität

gegen Proteus mirabilis besitzen, wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel* SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 :3 : 7 :9 im VoIumenverhältnis) bzw. einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) entwickelt. Es wurden die Fraktionen gesammelt, die eine Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 Ä (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) besitzen und den Rf-Wert 0,79 oder Rf-Wert 0,72 aufweisen.

Die Fraktionen wurden konzentriert und lyophilisiert. Es wurde 16 mg reine 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-U^ahiadiazol^-ylHhiomethyl^-methoxy-^-cephem^-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichiu coli,

Beispiel 17

In 10 ml 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung von pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, wurde 50 mg 7-(5-Amino-S-carboxyvaleramidoH-methoxyO-il^^-thiadiazol^-yO-th'omethyM^cephem^-carbonsäure aufgelöst. Dann wurde 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, hergestellt unter Verwendung von Trigonopsis varia-

bilis IFO-0755, wie im Beispiel 8a angegeben, hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüftung auf einem Wasserbad bei 33°C durchgerührt. Es wurde dabei die D-Aminosäure-Oxidation ausgeführt. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch die Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschroraatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8b beschrieben, ausgeführt Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials, 7-(5-Amino-5-carboxyvaIeramido)-7-methoxy-3-{ 1 ^,'t-thiadiazol-I-yO-thiomethyl-^-cephem^-carbonsäure betrug 1 Minute und 56 Sekunden und jene von 7-{4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l^,4-thiadiazol-2-yl)-tbiomethyl-2l³-cephem-4-carbonsäure₎ die durch die D-Aminosäure-Oxidation gebildet wurde, betrug 5 Minuten 28 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel bei 4°C entfernt Das Überstehende wurde abgetrennt und auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und viermal mit jeweils einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und mit einer Phosphatpufferlösung von pH 6,0 reextrahiert Die Phosphatlösung wurde erneut viermal jeweils mit dem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatextrakte wurden gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknei und im Vakuum zur Trockene eingedampft Das erhaltene Produkt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 :1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule, gefüllt mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel·*) und des Lösungsmittelgemisches der gleichen vorstehenden Zusammensetzung, entwickelt Es wurden die Fraktionen, die antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis besitzen, ausgewählt Die so ausgewählten Fraktionen wurden auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel® SF tropfenförmig aufgetragen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure · Wasser (21:3 :7:2 im Volumenverhältnis) bzw. ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wassei (4:1:2 im Volumenverhältnis) zum Entwickeln verwendet Die Fraktionen mit der Ultraviolett-Absorption im Manasululicht 2536 Ä (Hersteller: Manasulu Kogyo K. K.) und mit dem Rf-Wert 0,81 bzw. Rf-Wert 0,65 wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophiiisiert Es wurden 40 mg reines 7-{4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-/l³-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besaß antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

Beispiel 18

a) Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(I,3,4-thiadiazol-2-yl)-

thiomethyl-.4³-cephem-4-carbonsäure

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Dann wurde jedes Kulturmedium mit dom Streptomyces oganonensis ATCC 31167 beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2 Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde mit der Kulturbrühe beimpft die vorstehend hergestellt worden ist. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten. Separat wurden 60 Liter Kulturmedium, die 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Casaminosäurc, 0,01% Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermenter zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit 800 ml der Animpfkultur beimpft und anschließend 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 2-Mercapto-l,3,4-thiadiazol, hergestellt mit wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, zu jedem Fermenter in einer solchen Menge gegeben, daß der Gehalt 0,05% in der Kulturbrühe betrug.

Dann wurde die Kultivierung 90 Stunden fortgesetzt. Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurde vereinigt, und es wurden etwa 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Das Filtrat wurde durch Zugabe einer wässerigen Natriumhydroxidlösung auf pH 3,0 eingestellt und in eine 12-Liter Amberlite* XAD-2-Säule gefüllt. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewc-xhen und mit 30 Liter wässerigem 50%igen Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann in eine 3-Liter Amberlite ^β IRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Eluiert wurde mit e'ner wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. Es wurden 5 Liter Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthält, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, in eine 1-Liter Amberlite* XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 50%igem Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, welches lyophiiisiert wurde, erhalten.

Das erhaltene Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4 :1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel) als Füllung unterworfen, wobei das Lösungsmittelgemisch mit der gleichen vorstehend angegebenen Zusammen-Setzung Anwendung fand, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen.

Die Fraktionen wurden tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel® SF aufgetragen, und es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9) entwickelt. Eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde aufgesprüht, und durch Erwärmen wurde angefärbt. Dann wurden Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockene bei 45-50⁰C eingedampft. Dann wurden die Fraktionen einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel® SF in der vorstehend beschriebenen Weise unterworfen, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 zu sammeln. Die Fraktion wurde zur Trockene eingedampft, wobei 0,92 rohes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde in einer kleinen Menge

zo 3 /

von destilliertem Wasser aufgelöst und einer Säulenchromatographie mit destilliertem Wasser unter Verwendung von Amberlite® CG-50 (Η-Typ) unterworfen, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen. Die Fraktionen wurden dann konzentriert und lyophilisiert. Das Produkt wurde in einer kleinen Menge aus destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex* G-IO unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie in der schon vorstehend erläuterten Weise unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) verwendet, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 zu sammeln. Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert, und dabei wurden 75 mg weiße T-iS-Amino-S-carboxyvaleramidoH-methoxj'-SKl.B.^tbiadiazol-l-ylJ-thiomethyl-^-cephem-^

ίο carbonsäure erhalten.

b; In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphat-Pufferlösung mit pH 8,1, die 0,026% Natriumazid enthielt, würden 50mg7-(5-Arnino-5-carboxyvaieramido)-7-methoxy-3-(l^,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-^³-cephem-4-carbonsäure aufgelöst. Dann wurde zu der Lösung 0,5 ml aktivierte Mycelsuspension, hergestellt unter Verwendung von Trigonopsis variabilis IFO 0755, wie in Beispiel 8a angegeben, hinzugefügt Das Gemisch wurde unter Belüf-

tung in einem Wasserbad bei 33°C gerührt, um die D-Aminosäureoxidation auszuführen. Der vollständige Ablauf der Umsetzung wurde mit dergleichen Hochgesuhwindigkeitsflüssigkeits-Chromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8b beschrieben, überwacht Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7-{5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-{l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-J³-cephem-4-carbonsäure betrug 1 Minute 56 Sekunden und die von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-metnoxy-3-{l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyM'-cephem-4-carbonsäure, gebildet durch die D-Aminosäure-Oxidation, betrug 5 Minuten 28 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel bei 4°C entfernt Das Überstehende wurde abgetrennt und auf pH 1,5-2,8 arit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetat-Fraktionen wurden vereinigt und mit Phosphat-Pufferlösung bei pH 6,0 reextrahiert Die Phosphatlösung wurde dann auf pH 1,5-2,0 eingestellt und erneut viermal mit

jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet

Es wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft Das Produkt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel®), wobei das Lösungsmittelgemisch die gleiche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben hatte, entwickelt, um die Fraktionen, die eine antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis besitzen, auszuwählen. Die Fraktionen wurden tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel® SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) bzw. einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (4:1:2 im yolumenv&shältniü^entwickelt; dabei wurden die Fraktionen mit Ultraviolettabsorption im Manasu-

lulicht 2536 Ä (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) gesammelt. Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 40 mg r-ine 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l^,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-4³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Dieses Material besitzt eine antimikrobieiie Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

-»ο

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxycephalosporinderivaten der allgemeinen Formel (I)

OCH₃

S
HOOC-(Ch₂)JCONH-