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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika lBu-2313A und
Bu-2313B), das darin besteht, dass einer der Stämme von Micropolyspora caesia A. T. C. C. 31295,
31296,31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässerigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, kultiviert wird, bis eine be- trächtliche Menge der antibiotischen Mischung durch diesen Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet ist, und gegebenenfalls die antibiotische Mischung bzw. die einzelnen Antibiotika aus dem Kulturmedium isoliert werden. Die antibiotische Mischung, die mit Bu-2313 bezeichnet werden soll, und deren bioaktive Bestandteile Bu-2313A und Bu-2313B haben eine antibakterielle Wirkung mit Bezug auf verschiedene anaerobe Bakterien und einige aerobe Bakterien.
Bu-2313A und Bu-2313B eignen sich zur Behandlung von Infektionskrankheiten bei Menschen und Tieren, insbesondere bei durch anaerobe Bakterien verursachte Krankheiten.
Die neue antibiotische Verbindung Bu-2313B kann aus der antibiotischen Mischung durch Chromatographie auf einem makrovernetzten Polymerharz abgetrennt werden. Die neue antibiotische Verbindung Bu-2313A kann erhalten werden, indem der Hauptteil des Bu-2313B aus der antibiotischen Mischung durch Chromatographie auf einen makrovernetzten Polymerharz abgetrennt und das Bu-2313A aus dem restlichen Bu-2313B durch Chromatographie auf Siliciumdioxydgel abgetrennt wird.
Diese neuen Verbindungen betreffende Merkmale, auf die nachstehend noch näher eingegangen werden soll, sind aus den Fig. 1 bis 6 ersichtlich.
Fig. 1 zeigt das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Bu-2313A in Äthanol in n/10 NaOH-5% Äthanol in einem 7, 0 Phosphatpuffer und in n/10 HCI-5% Äthanol. Fig. 2 zeigt das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Bu-2313B in Äthanol, in n/10 NaOH-5% Äthanol, in einem Phosphatpuffer PH = 7, 0 und in n/10 HCl-5% Äthanol, Fig. 3 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Bu-2313A in Form von Kugeln in Kaliumbromid. Fig. 4 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Bu-2313B in Kugelform in Kaliumbromid. Fig. 5 zeigt das NMR-Spektrum von Bu-2313A in CDCIa (60 MHz).
Fig. 6 zeigt das NMR-Spektrum von Bu-2313B in CDCl3 (60 MHz).
Bu-2313 und dessen Bestandteile Bu-2313A und Bu-2313B werden, wie vorstehend angegeben, durch Fermentation bestimmter neuer chromogener Subspecien von Mikropolyspora caesia erhalten.
Die Strukturen von Bu-2313A und Bu-2313B sind die folgenden :
EMI1.1
Bu-2313A R = CHs Bu-2313B R = H
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
EMI2.2
<tb>
<tb> Stammnummer <SEP> grünliche <SEP> Luft- <SEP> Pigmentbildung <SEP> Verhältnis <SEP> von
<tb> Sporen- <SEP> Mycel <SEP> violett <SEP> grün <SEP> gebildeten
<tb> masse <SEP> B-2313A/Eu-2313B
<tb> S-2 <SEP> ursprünglicher <SEP> Stamm <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> a <SEP> : <SEP> 2 <SEP>
<tb> S-26
<tb> (Variante) <SEP> + <SEP> +--1 <SEP> : <SEP> 9
<tb> 8-7
<tb> (Variante) <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> -- <SEP> 6 <SEP> ! <SEP> 4
<tb> Y-29
<tb> (Variante) <SEP> + <SEP> 9
<tb>
Variante Y-29, hergestellt aus dem ursprünglichen Stamm S-2 durch Monosporenisolierung, wurde als ein stark produzierender Stamm ausgewählt.
Kulturen von Actinomyces-E864-61 Stämmen 6-2, 5-26, 5-7 und Y-29 wurden bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., hinter- legt bzw. der Kollektion von Mikroorganismen als A. T. C,. C. NI, 31295,31297, 31296 und 31298 einverleibt.
Zellwandzusammensetzung
Der Stamm E864-61 enthält mesQ-DAP, Galactose und Rhamnose als charakteristische Zellwandkomponenten. Die Zusammensetzung der Zellwand ist in Tabelle II gezeigt.
<Desc/Clms Page number 3>
Tabelle II Aminosäuren-und Kohlehydrat-Zusammensetzung der Zellwand
EMI3.1
<tb>
<tb> Aminosäure <SEP> Stamm <SEP> E864-61 <SEP>
<tb> meso-Diaminopimelinsäure <SEP> +++ <SEP>
<tb> CC-Diaminopimelinsäure
<tb> Glycin
<tb> Glutaminsäure <SEP> +++ <SEP>
<tb> Alanin <SEP> +++ <SEP>
<tb> Kohlehydrat
<tb> Ara-binose
<tb> Galactose <SEP> +++
<tb> Rhamnose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> Spuren
<tb>
Merkmale der Kultur
Der Stamm E-864-61 wächst kräftig auf an mehr Mitteln reichen Medien wie Hefe-Extrakt-MalzExtrakt-Agar und Bennett's Agar, wogegen das Wachstum auf chemischen Medien, wie Stärkeanorganisches Salz-Agar, Glucose-Asparagin-Agar, Tyrosin-Agar und Glucose-Ammoniumsalze-Agar gering war. Auf Czapek's Agar wurde kein Wachstum erhalten.
Der ursprüngliche Stamm E864-61 (S-2) bildet zahlreiche Sporen und Luft-Mycelen. Es entstehen zwei Pigmentarten : rötlich-violett bis rötlich-braun auf Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agar, Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar und Glucose-Ammoniumsalze-Agar, und dunkelgrün auf Haferflockenmehl-Agar, Tyrosin-Agar und Bennett's Agar. Die Variante Nu S-26 gibt viele Sporen und bildet ein Luft-Mycel, weist jedoch keine Fähigkeit zur Pigmentbildung auf. Die Variante S-7 bildet ein weisses Luft-Mycel ohne grünlicher Sporenmasse und ergibt in reichlicher Menge ein rötlich-violettes Pigment, jedoch kein grünliches Pigment. Der Variante NO Y-29 fehlt die Fähigkeit zur Sporenmassebildung und zur Bildung eines Luft-Mycels ; sie weist daher ein bakterienähnliches Aussehen auf.
Sie produziert nur ein grünliches Pigment, wobei jedoch diese Eigenschaft bei Übertragung leicht verloren geht. Die Merkmale der Kultur des ursprünglichen Stammes und der Spontanvarianten sind in Tabelle III aufgezeigt.
<Desc/Clms Page number 4>
Tabelle HI Kulturmerkmale des Stammes E 864-61 und Varianten
EMI4.1
<tb>
<tb> Stamm <SEP> E <SEP> 864 <SEP> No. <SEP> S-2 <SEP> Variante <SEP> No.S-28 <SEP> Variante <SEP> No.S-7 <SEP> Variante <SEP> No.Y-29
<tb> 1. <SEP> Sucrose-Nitrat- <SEP> 6. <SEP> VM <SEP> Kein <SEP> Wachstum <SEP> kein <SEP> Wachstum <SEP> Kein <SEP> Wachstum <SEP> Kein <SEP> Wachstum
<tb> Agar <SEP> oder <SEP> Wachstum
<tb> (Czapek <SEP> Agar) <SEP> von <SEP> Kolonien
<tb> dunkel <SEP> roun,
<tb> AM <SEP> mässig, <SEP> weiss, <SEP>
<tb> t
<tb> D <SEP> Keine
<tb> 2. <SEP> Hefe-Extrakt- <SEP> G.
<SEP> VM <SEP> nHssiges <SEP> Wachstum <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mässiges <SEP> Wachstum
<tb> Malz-Extrakt- <SEP> rätlich <SEP> braum <SEP> gelblich <SEP> braum <SEP> tief <SEP> orange <SEP> gold <SEP> oder <SEP> olivegrün
<tb> Agar <SEP> Am <SEP> reichlich, <SEP> matt <SEP> reichlich, <SEP> matt <SEP> keines <SEP> oder <SEP> Keine
<tb> (ISP <SEP> No. <SEP> 2) <SEP> blaugrün <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> spärlich, <SEP> weiss
<tb> graugrün
<tb> D <SEP> leicht <SEP> rotbraun <SEP> leicht <SEP> rötlich <SEP> tief <SEP> rötlich- <SEP> geld- <SEP> oder <SEP> olivebraun <SEP> orange <SEP> farben
<tb> 3. <SEP> Hefe-Mehl- <SEP> G.
<SEP> VM <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> kärgliches <SEP> Wachstum,
<tb> Agar <SEP> dunkelgrün <SEP> leicht <SEP> braun <SEP> ! <SEP> matt <SEP> rötlich- <SEP> mattes <SEP> gelb <SEP>
<tb> (ISP <SEP> No. <SEP> 3) <SEP> purpur
<tb> AM <SEP> reichlich, <SEP> matt <SEP> spärlich, <SEP> weiss <SEP> keine <SEP> oder <SEP> keine
<tb> blaugrün <SEP> I <SEP> und <SEP> leicht <SEP> spärlich <SEP> weiss
<tb> graugrün
<tb> D <SEP> leicht <SEP> rotbraun <SEP> keine <SEP> matt <SEP> rotlich-keine
<tb> purpur
<tb> 4. <SEP> Stärke-Mineral- <SEP> G. <SEP> VM <SEP> spärliches <SEP> Wachs- <SEP> spärliches <SEP> spärliches <SEP> Wachs- <SEP> spärliches <SEP> Wachssalze-Agar <SEP> turn <SEP> Wachstum <SEP> tum, <SEP> leicht <SEP> tum, <SEP> farblos
<tb> (ISP <SEP> No.
<SEP> 4) <SEP> gelblich-braun
<tb> AM <SEP> keines <SEP> oder <SEP> keine
<tb> spärlich <SEP> weiss
<tb> blass <SEP> blasspurpurrosa <SEP> keine
<tb> 5. <SEP> Glucose- <SEP> G. <SEP> VM <SEP> spärliches <SEP> Wachs- <SEP> spärliches <SEP> spärliches <SEP> Wachs- <SEP> geringes <SEP> Wachstum,
<tb> Asparagin-Agar <SEP> tum <SEP> Wachstum <SEP> tum <SEP> orange <SEP> weisslich <SEP>
<tb> AM <SEP> spärlich <SEP> weiss <SEP> keine <SEP> keine
<tb> D <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine
<tb> 6. <SEP> Pepton-Hefe- <SEP> G.
<SEP> VM <SEP> geringes <SEP> Wachs- <SEP> geringes <SEP> Wachs- <SEP> beschränktes <SEP> geringes <SEP> Wachstum,
<tb> Extrakt-Eisen- <SEP> tum <SEP> tum <SEP> Wachstum, <SEP> weisslich
<tb> Agar <SEP> farblos
<tb> AM <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine
<tb> 0 <SEP> matt <SEP> rötlich- <SEP> keinn <SEP> keine <SEP> keine
<tb> purpur
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
Tabelle III (Fortsetzung)
EMI5.1
<tb>
<tb> StamE864No. <SEP> S-2 <SEP> Variante <SEP> No. <SEP> S-26 <SEP> Variante <SEP> Ho. <SEP> S-7 <SEP> Variante <SEP> No. <SEP> Y-29 <SEP>
<tb> 7. <SEP> Tyrosin- <SEP> G. <SEP> VM <SEP> beschränktes <SEP> geringes <SEP> Wachs- <SEP> geringes <SEP> Wachs- <SEP> geringes <SEP> Wachstum, <SEP>
<tb> Agar <SEP> Wachstum, <SEP> tum, <SEP> blass <SEP> turn, <SEP> leicht <SEP> goldfarben
<tb> (ISP <SEP> No.
<SEP> <SEP> olivegran <SEP> gelblich <SEP> rosa <SEP> gelblich <SEP> braun <SEP>
<tb> AN <SEP> reichlich, <SEP> blass <SEP> spärlich, <SEP> weiss <SEP> I <SEP> spärlich, <SEP> blass <SEP> keine <SEP> I <SEP>
<tb> bläulich, <SEP> grün <SEP> gelb <SEP> 1 <SEP>
<tb> D <SEP> keine <SEP> keine <SEP> matt <SEP> rötlich-keine <SEP>
<tb> purpur
<tb> 8. <SEP> Glucose <SEP> G. <SEP> VM <SEP> geringes <SEP> Wachs-spärliches <SEP> spärliches <SEP> spärliches <SEP> Wachsturn, <SEP> leicht <SEP> Wachstum, <SEP> Wachstum, <SEP> turn, <SEP> gelb <SEP> bis
<tb> gelblich <SEP> leicht <SEP> braun <SEP> leicht <SEP> gelblich <SEP> gelblich <SEP> braun
<tb> braun <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> braun
<tb> rötlich-braun
<tb> AM <SEP> spärlich <SEP> weiss <SEP> spärlich <SEP> weiss <SEP> keine <SEP> keine
<tb> D <SEP> keine <SEP> keine <SEP> rötlich-purpur <SEP> keine
<tb> g.
<SEP> 8ennetts- <SEP> G. <SEP> VM <SEP> mässiges <SEP> Wachs- <SEP> geringes <SEP> Wachs- <SEP> mässiges <SEP> Wachs- <SEP> geringes <SEP> WachsAgar <SEP> tun, <SEP> dunkelgrün <SEP> turn, <SEP> farblos <SEP> turn, <SEP> tief <SEP> tum, <SEP> weisslich
<tb> orange
<tb> AM <SEP> reichlich, <SEP> leicht <SEP> spärlich, <SEP> weiss <SEP> keine <SEP> keine
<tb> gräulich <SEP> grün <SEP> und <SEP> leicht
<tb> gräulich <SEP> grün
<tb> D <SEP> olive <SEP> keine <SEP> gräulich-rosa <SEP> keine
<tb>
ISP ="International Streptomyces Project" (vgl. Int.Journal of Systematic Bacteriology, Bd.15, S.313-340, [1955])
G = Wachstum
VM = vegetatives Mycel
AN = Luft-Mycel
0 = diffusionsfähiges Pigment
Physiologische Merkmale
Der Stamm E 864-61 ist ein aerobes und mesophiles Actinomycel.
Die optimale Wachstumstemperatur für diesen Stamm liegt zwischen 32 und 42'C, wobei ein mässiges Wachstum bei 20 bis 48 C erreicht wird. Bei 55 C wird kein Wachstum beobachtet. Die physiologischen Reaktionen und der Kohlehydratverbrauch der ursprünglichen Stämme und der Variantenstämme sind in Tabellen IV und V aufgezeigt.
<Desc/Clms Page number 6>
Tabelle IV Physiologische Reaktionen
EMI6.1
<tb>
<tb> Versuch <SEP> Verhalten <SEP> Verfahren <SEP> und <SEP> Medium
<tb> S-2 <SEP> S-26 <SEP> Y-29
<tb> Nitrit <SEP> aus <SEP> Nitrat-+-Czapeks <SEP> Sucrose-Nitrat
<tb> in <SEP> anorganischem <SEP> Brühe <SEP> (vgl. <SEP> Applied <SEP> MicroMedium <SEP> biology, <SEP> Bd. <SEP> 9, <SEP> S. <SEP> 55-65,
<tb> [1961]} <SEP> * <SEP>
<tb> Nitrit <SEP> aus <SEP> Nitrat <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> Hefe-Extrakt, <SEP>
<tb> in <SEP> organischem <SEP> l% <SEP> Glukose, <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> KNOa, <SEP>
<tb> Medium <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> CaCOa
<tb> Natriumchlorid <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum <SEP> bei <SEP> BASAL-Medium <SEP> : <SEP> 1% <SEP> HefeToleranz <SEP> 4% <SEP> NaCI <SEP> oder <SEP> geringerer <SEP> Extrakt, <SEP> 2% <SEP> lösliche
<tb> Konzentration <SEP> ;
<SEP> kein <SEP> Stärke, <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP> Agar
<tb> Wachstum <SEP> bei <SEP> 5% <SEP> NaCI
<tb> Caseinhydrolyse <SEP> ++ <SEP> ++-Lüdermannsches <SEP> Agarmedium <SEP>
<tb> im <SEP> Agarmedium <SEP> (vgl. <SEP> Int. <SEP> Journal <SEP> of
<tb> Systematic <SEP> Bacteriology,
<tb> Bd. <SEP> 21, <SEP> S. <SEP> 240-247, <SEP> [1971]) <SEP>
<tb> Reaktionen <SEP> in
<tb> Mager-Med-Milch
<tb> Koagulation <SEP> ++ <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> Peptonisierung <SEP> +
<tb> Gelatineverflüssigung <SEP> ++ <SEP> + <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 0% <SEP> Malz-Extrakt,
<tb> 0, <SEP> 4% <SEP> Hefe-Extrakt,
<tb> 0, <SEP> 4% <SEP> Glukose, <SEP> 16% <SEP> Gelatine
<tb> HzS-Produktion
<tb> aus <SEP> L-Cystein <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> L-Cystein <SEP> (0, <SEP> 1%) <SEP> Zugabe <SEP> zu
<tb> Trypton-Hefe-Extrakt-Brühe
<tb> (ISP <SEP> No. <SEP> 1 <SEP> Medium) <SEP> mit
<tb> Agar.
<SEP> H, <SEP> S <SEP> Nachweis <SEP> mit
<tb> einem <SEP> Papierstreifen <SEP> enthaltend <SEP> 10% <SEP> wässerige
<tb> Bleiazetatlösung.
<tb>
Hydrolyse <SEP> des
<tb> Tyrosin <SEP> + <SEP> L-Asparagin <SEP> wurde <SEP> von <SEP> dem
<tb> Tyrosinagar <SEP> weggelassen
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
Tabelle IV (Fortsetzung)
EMI7.1
<tb>
<tb> Versuch <SEP> Verhalten <SEP> Verfahren <SEP> und <SEP> Medium
<tb> S-2 <SEP> S-26 <SEP> Y-29
<tb> Melanoidbildung-.--Tyrosinagar <SEP> und <SEP> PeptonHefe-Eisen-Agar
<tb> Katalase <SEP> Übernacht-Wachstum <SEP> auf
<tb> Nähragar. <SEP> Wasserstoffperoxyd-Losung
<tb> Oxydase---Ubernacht-Wachstum <SEP> auf
<tb> Nähragar. <SEP> Kovac-Reagens
<tb> Temperatureinfluss <SEP> Maximales <SEP> Wachstum <SEP> Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt- <SEP>
<tb> bei <SEP> 32 <SEP> bis <SEP> 42'C. <SEP> Agar
<tb> Mässiges <SEP> Wachstum
<tb> bei <SEP> 20 <SEP> und <SEP> 48'C.
<tb>
Kein <SEP> Wachstum <SEP> bei
<tb> 55 C.
<tb>
EMI7.2
:Tabelle V Kohlenhydratverbrauch des Stammes E 864-61
EMI7.3
<tb>
<tb> Ursprg <SEP> J. <SEP> Stamm <SEP> Varianten <SEP> Nr.
<tb> No. <SEP> S-2 <SEP> S-26 <SEP> S-7 <SEP> Y-29
<tb> 1. <SEP> Glycerol <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 2. <SEP> D <SEP> (.-)-Arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 3. <SEP> L <SEP> (+)-Arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 4. <SEP> D-Xylose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 5. <SEP> D-Ribose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 6. <SEP> L-Rhamnose <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> 7. <SEP> D-Glucose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> (positive <SEP> control)
<tb> 8. <SEP> D-Galactose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 9. <SEP> D-Fructose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 10. <SEP> D-Mannose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 11.
<SEP> L <SEP> {-)-Sorbose---- <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
Tabelle V (Fortsetzung)
EMI8.1
<tb>
<tb> Ursprgl. <SEP> Stamm <SEP> Varianten <SEP> Nr.
<tb> No. <SEP> S-2 <SEP> S-26 <SEP> S-7 <SEP> Y-29
<tb> 12. <SEP> Sucrose
<tb> 13. <SEP> Lactose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 14. <SEP> Cellobiose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 15. <SEP> Melibiose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 16. <SEP> Trehalose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 17. <SEP> Raffinose
<tb> 18. <SEP> D <SEP> (+)-Melezitose----
<tb> 19. <SEP> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 20. <SEP> Dulcitol
<tb> 21. <SEP> Inositol <SEP> + <SEP> +
<tb> 22. <SEP> D-Mannitol <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 23. <SEP> D-Sorbitol
<tb> 24. <SEP> Salicin <SEP> +
<tb> 25.
<SEP> Cellulose
<tb>
EMI8.2
Taxonomie
Die morphologischen Merkmale und die Zellwandzusammensetzung des Stammes E864-61 zeigten an, dass der Organismus in die Familie Micromonosporaceae Krasilnikow [1938), zu klassifizieren ist, beschrieben in dem Handbuch vo Bergey "Determinative Bacteriology". 8. Auflage. [1975].
Verglichen mit der Art Micromonosporaceae, Stamm E864-61 unterscheidet sich von der Art Micromonospora durch die Bildung eines Luft-Mycels und durch dessen Zellwandzusammensetzung der Type IV, obgleich Rhamnose an Stelle von Arabinose vorliegt. Er unterscheidet sich auch von der Art Thermoactinomycels, Actinobifida, Thermomonospora. Microbispora und Micratetraspora durch die Sporenmorphologie und der Zellwandart (Type III für diese Arten). Der Stamm E864-61 ist sehr ähnlich der Art Micropolyspora mit Bezug auf den Zellwandtyp, die Sporenmorphologie und die Art der Sporenbildung. Acht Spezies sind unter der Art Micropolyspora beschrieben, wobei ein beträchtlicher Unterschied bei diesen Spezies mit Bezug auf die Zahl von Sporen in einer Kette beobachtet wird.
Micropolyspora caesia soll, wie beschrieben ist, 1 bis 5 Sporen haben und 3 Spezies sollen 5 bis 20 Sporen in einer Kette aufweisen. Der Stamm E864-61 ist ähnlich dem Micropolyspora caesia Kalakoutskii [1964], insofern als er vorherrschend Einzelsporen und gelegentlich Ketten von 2 bis 8 Sporen bildet. Ausserdem ist der Stamm ähnlich M. caesia mit Bezug auf die Farbe des Luft-Mycels, den Temperaturbereich beim Wachsen und die Zellwandtype, obgleich er sich von letzterem mit Bezug auf die Bildung von 2 Arten von diffusionsfähigen Pigmenten unterscheidet. Demnach wird der Stamm E864-61 als eine neue chromogene Subspezies von Micropolyspora caesia gewertet.
Da der Stamm E864-61 auf natürliche Weise oder künstlich leicht Mutanten bildet, sei festgestellt, dass die Erfindung nicht auf dem ursprünglichen Stamm S-2 oder die Varianten S-26, S-7 oder Y-29 beschränkt ist. Die Erfindung umfasst vielmehr alle Bu-2313 bildenden natürlichen und
<Desc/Clms Page number 9>
künstlichen Mutanten und Varianten, die aus den beschriebenen Organismen mittels Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoffsenf, Phage-Aussetzung u. dgl. erhalten werden können. Wie dies auch für andere Antibiotika zutrifft, wird angenommen, dass eine bessere Ausbeute an Bu-2313 durch Auswahl von produktionsfreudigen Stämmen nach Einzelkolonien-Auswahl durch Behandlung mit verschiedenen Mutagenen oder durch genetische Verfahrensweisen der Rekcmbination, Umbildung oder Überführung erzielt werden kann.
Herstellung des Antibiotikums
Der antibiotische Komplex Bu-2313 wird erhalten, indem ein Stamm von Micropolyspora caesia E864-61 A. T. C. C. No 31295, 31296,31297 oder 31298) unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium kultiviert wird. Die allgemein für Kulturen von andern Actinomyceten verwendeten Verfahren sind zur Kultivierung von Micropolyspora caesia E864-61 anwendbar. Das Nährmedium soll eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen z. B. Glycerin, Glucose, Fructose, Mannose, Stärke, Dextrin, Maltose, Melassen, Öle, Fette u. dgl., entweder in gereinigter oder in roher Form enthalten. Ferner soll das Nährmedium auch ein oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen enthalten wie z. B.
Sojabohnenmehl, Fischmehl, Malz-Extrakt, Pepton, Hefe-Extrakt, lösliche Destillatanteile (distiller's solubles), Glutenmehl, Maisquellwasser, Baumwollsaatmehl, Kasein, hydrolisierte Proteinverbindungen, Nitrate. Ammoniumsalze, Harnstoff u. dgl. Dem Medium können auch anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und Spuren von Schwermetallsalzen, z. B. Kupfer, Zink, Mangan, Eisen u. dgl. zugesetzt werden. In der belüfteten submersen Kultur kann auch ein Antischaummittel, z. B. flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl, Fett oder Silicone verwendet werden.
EMI9.1
Fermentationsmediums soll im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 10, vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6 bis ungefähr 8 liegen. Gewöhnlich wird die optimale Produktion in 3 bis 7 Tagen erhalten.
Wenn die Fermentation in einem Behälter ausgeführt wird, ist es von Vorteil, ein pflanzliches Inoculum in einer Nährmittelbrühe zu bilden, in dem die Kulturbrühe mit einer Schrägoder Bodenkultur oder einer gefriergetrockneten Kultur des Organismus inokuliert wird. Ein in dieser Weise erhaltenes wirksames Inokulum wird aseptisch in das Fermentationsmedium eingeführt. Die antibiotische Wirksamkeit in der Fermentationsbrühe kann mittels eines Versuches mit Papierscheibe Agarplatte (paper disc-agar plate assay) unter Verwendung von Bacteroides fragilis als Testorganismus gebildet auf GAM (Gifu anerobe medium, Nissui) unter anaeroben Bedingungen bestimmt werden. Nachdem die optimale Wirksamkeit der Brühe erhalten wurde, wird diese vorzugsweise unter Verwendung eines Filterhilfsmittels abfiltriert.
Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen, wonach das Filtrat und die Waschwasser auf einen pH-Wert von ungefähr 8 gebracht werden und durch eine Säule von einem nichtionischen, macrovernetzten (macroporösen) Polymerharz, z. B. Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries) oder Amberlite XAD-2 (Rohm und Haas
EMI9.2
werden kombiniert, in Vakuum konzentriert und eingedampft oder gefriergetrocknet, um den rohen Bu-2313-Komplex zu erhalten. Der rohe so erhaltene Feststoff kann chromatographisch auf einem macrovernetzten Harz, wie oben angegeben, und/oder durch Siliciumdioxydgelchromatographie in seine Komponenten Bu-2313A und Bu-2313B geteilt werden.
Bei Fermentierung einiger Stämme von Micropolyspora caesia E864-61 wurde festgestellt, dass der Zusatz von Glycin zu dem Fermentationsmedium, z. B. 1%, die Bildung von Bu-2313A unterdrückt und zur Bildung von Bu-2313B als Hauptprodukt führt.
Physikalisch-chemische Eigenschaften von Bu-2313A und Bu-2313B
Bu-2313A und Bu-2313B sind beide saure Substanzen, die in Form von gelben Kristallen isoliert werden. Sie sind leicht löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkoholen, Äthylacetat, Chloroform und Benzol, ein wenig löslich in Hexan und alkalisch gemachtem Wasser, jedoch praktisch unlöslich in Wasser. Sie sind in saurer Lösung stabil, jedoch weniger stabil in alkalischer Lösung, wobei sie, wenn sie über Nacht in n/10 NaOH-Lösung bei Raumtemperatur gehalten werden, inaktiviert werden. Beide Bestandteile geben eine positive
<Desc/Clms Page number 10>
Reaktion mit Eisen- (III)-chlorid, jedoch keine Reaktion in Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi und Tollen's Umsetzung.
Bu-2313A und Bu-2313B können voneinander durch zwei Dünnschichtchromatographie-Systeme unterschieden werden :
EMI10.1
<tb>
<tb> Bestandteil <SEP> Rf
<tb> System <SEP> 1* <SEP> System <SEP> 2**
<tb> Bu-2313A <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 39
<tb> Bu-2313B <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 30
<tb>
* Siliciumdioxydgel, Chloroform-Methanol (100 : 3) ** Siliciumdioxydgel, Benzol-Methanol (4 : 1)
EMI10.2
Bu-2313A zeigt einen pKa'-Wert von 5, 2 in 50% wässeriger Äthanollösung bei einem Titrationsäquivalent von 519, wobei das Massespektrum einen molekularen Ion-Peak bei m/e 517 aufzeigt.
Bu-2313B schmilzt bei 160 bis 162 C und ist optisch aktiv [α]D22 = - 69,9 (C 0,3, MeOH) und -34,9 (c 0,93, CHCl,). Bu-2313B zeigt einen pKa'-Wert von 4, 9 in 46%iger wässeriger Äthanollösung bei einem Titrationsäquivalent von 509 und weist einen molekularen Ion-Peak bei m/e 5Q3 im Massespektrum auf.
Die Ultraviolettspektra von Bu-2313A und Bulb in verschiedenen Lösungsmitteln sind in Fig. 1 bzw. Fig, 2 gezeigt ; die Absorptionsmaxima sind die folgenden :
EMI10.3
<tb>
<tb> Lösungsmittel <SEP> Bu-2313A: <SEP> #max <SEP> in <SEP> nm <SEP> (E1cm1%)
<tb> Äthanot <SEP> 235(330), <SEP> 298(290), <SEP> 344(535), <SEP> 355 <SEP> (555)
<tb> N/10 <SEP> NaOH-5% <SEP> Äthanol <SEP> 257 <SEP> (400), <SEP> 293 <SEP> (415), <SEP> 337 <SEP> (520) <SEP>
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> Phosphatpuffer <SEP> 261 <SEP> (418), <SEP> 291 <SEP> (430). <SEP> 339 <SEP> (482) <SEP>
<tb> N/M <SEP> HCl-5%-Äthanol <SEP> 241(310), <SEP> 361(690), <SEP> 373(670)
<tb> Lösungsmittel <SEP> Bu-2313B <SEP> :
<SEP> #max <SEP> in <SEP> nm <SEP> (E1cm1%)
<tb> Äthanol <SEP> 239 <SEP> (220), <SEP> 295(260), <SEP> 352(730), <SEP> 368(610)
<tb> N/10 <SEP> NaOH-5% <SEP> Äthanol <SEP> 248 <SEP> (328), <SEP> 295 <SEP> (415), <SEP> 332 <SEP> (600) <SEP>
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> Phosphatpuffer <SEP> 251 <SEP> (335), <SEP> 294 <SEP> (454), <SEP> 332 <SEP> (580) <SEP>
<tb> N/10 <SEP> HC1-5% <SEP> Äthanol <SEP> 241 <SEP> (210), <SEP> 359 <SEP> (656), <SEP> 370 <SEP> (665) <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Die Infrarotspektra von Bu-2313A und Bu-2313B (in KBr-Kugeln) sind in Fig. 3 bzw. Fig. 4 gezeigt ; sie sind einander sehr ähnlich bei charakteristischen Absorptionsbanden bei 1730,1660, 1630, 1580 und 1210 cm-'.
Eine scharfe Bande ist bei dem Bestandteil A bei 1500 cm-', wogegen die Komponente B charakteristische N-H-Absorptionen bei 3200 bis 3400 cm-'zeigt, die bei Bestandteil A nicht vorliegen. Die Proton-NMR-Spektra von Bu-2313A und Bu-2313B (in CDCI,) sind in Fig. 5 bzw. Fig. 6 gezeigt, wobei das Vorliegen von 5 C-Methylgruppen, einer Methylestergruppe und eines trans-Diensäurechromophoren ersichtlich wird. Das NMR-Spektrum des Bestandteils A zeigt ein N-Methylsignal bei s 3, 03 ppm, das bei dem Bestandteil B nicht vorliegt. Der molekulare Ion-Peak wurde bei einer Massespektroskopie für Bu-2313A (m/e 517) und Bu-2313B (m/e 503) beobachtet.
Wesentlichere Framgent-ion-Peaks wurden bei Massespektra bei m/e 221 (Grundpeak für Bestandteil B), m/e 235 (Grundpeak für Bestandteil A) und m/e 283 (starker Peak für beide Komponenten A und B).
Bu-2313A und Bu-2313B sind saure Substanzen und diese Substanzen sowie auch deren Mischung bilden Salze mit Basen. Unter der Bezeichnung "nicht giftige, pharmazeutisch annehmbare Salze" sollen deren Salze mit metallischen Kationen, z. B. Alkalimetall-oder Erdalkalimetallkationen, wie Natrium, Kalium, Kalzium und Magnesium mit eingeschlossen werden.
Biologische Eigenschaften von Bu-2313A und Bu-2313B
Antibakterielles Spektrum
Die minimale Hemmkonzentration (MIC) von Bu-2313A und Bu-2313B wurde nach dem Serienzweifachen Agarverdünnungsverfahren (serial two-fold agar dilution method) unter Verwendung einer Vorrichtung für mehrfache Inoculierung gegenüber einer Vielzahl von aeroben und anaeroben Bakterien bestimmt. Im allgemeinen wurde ein Nähr-Agarmedium (Eiken) für aerobe Bakterien, ein Gonococcus- (GC)-Medium (Eiken) für anspruchsvolle aerobe Organismen wie Streptococci, Neisseria und Hemophilus Spezies und GAM Agarmedium (Nissui) für anaerobe Bakterien.
Die in vitro Wirksamkeiten von Bu-2313A und Bu-2313B gegenüber verschiedenen aeroben und anaeroben Organismen sind in den Tabellen VI und VII zusammen mit den Wirksamkeiten von Tirandamycin und Clindamycin aufgezeigt, die als Bezugsverbindungen eingesetzt werden. Bu-2313A und Bu-2313B hemmten das Wachstum verschiedener anaerober Bakterien bei niederen Konzentrationen, zeigten jedoch eine mässige bzw. schwache Wirksamkeit gegenüber vielen der bekannten aeroben Organismen, wie S. aureus, E. coli und K. pneumoniae. Jedoch waren Stämme von Bazillus-Spezies, Streptococci, Neisseria meningitidis. N. gonorrhoeae und Hemophilus influenzae gegenüber Bu-2313A und Bu-2313B empfindlich.
Im allgemeinen sind die Wirksamkeit und das antibakterielle Spektrum von Bu-2313A und Bu-2313B sehr ähnlich der Wirksamkeit und dem antibakteriellen Spektrum von Tirandamycin. wobei die in vitro Wirksamkeit von Bu-2313B etwas grösser zu sein scheint als jene von Bu-2313A.
Einfluss der Inoculum-Grösse
Der Einfluss der Inoculum-Grösse auf die MIO wurde mit Bezug auf zwei anaerobe Organismen (B. fragilis und C. perfringens) unter Verwendung von GAM-Brühe und Agarmedien untersucht.
Wie in Tabelle VIII gezeigt, waren die MIC's von dupa und Bu-2313B durch die Grösse des Inoculums, bestimmt nach dem Brühe-Verdünnungsverfahren, sehr stark beeinflusst.
Bakterizide Wirksamkeit
Das bakterizide Potential von Bu-2313A und Bu-2313B wurde mit Bezug auf zwei anaerobe
EMI11.1
führt, indem 0, 1 ml der Brühe von jedem trübungsfreien Röhrchen nach MIC-Bestimmung auf eine Platte gebracht wurden. GAM Agarplatten wurden für die Zellenzählung von B. fragilis und C. perfringens und Nährmittelagar mit einem Gehalt von 5% Pferdeserum für S. pyogenes verwendet, wobei die Platten 18 h bei 370C inkubiert wurden. Eine antibiotische Konzentration, die ein Wachstum von weniger als 100 Kolonien pro Platte erlaubt, wurde als bakterizid gewertet (ursprüngliche Inoculum-Grösse : 10 s-106 Zellen [ml).
Wie Tabelle IX zeigt, scheint die antibakterielle Wirkung von BU-2313A und Bu-2313B eher bakteriostat als bakterizid zu sein.
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle VI
EMI12.1
EMI12.2
<tb>
<tb> Code <SEP> No. <SEP> Versuchs- <SEP> Versuchs- <SEP> MIC <SEP> ( g/ml)
<tb> organismen <SEP> medium <SEP> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiran- <SEP> Clindamycin <SEP> damycin
<tb> Ec-3 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 12,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> Juhl <SEP> A15119
<tb> Ec-8 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 25
<tb> K-12 <SEP> A9632
<tb> Kp-2 <SEP> Klebsiella <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> pneumoniae <SEP> A9678 <SEP> I <SEP>
<tb> Sm-1 <SEP> Serratia <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 50
<tb> marcescens <SEP> A20019
<tb> Pa-13 <SEP> Pseudomonas <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> aeruginosa <SEP> A9843
<tb> Pm-1 <SEP> Proteus <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> mirabilis <SEP> A9554
<tb> Pg-1 <SEP> Proteus <SEP> A <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP> > 100 <SEP> 100
<tb> morganii <SEP> A9553
<tb> Sa-1 <SEP> Staphylococcus <SEP> A <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 100 <SEP> 0,
<SEP> 1 <SEP>
<tb> aureus <SEP> 209P
<tb> Sa-2 <SEP> Staphylococcus <SEP> A <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> aereus <SEP> Smith
<tb> Sa-8 <SEP> Staphylococcus <SEP> A <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> aureus <SEP> 52-34
<tb> si-i <SEP> Sarcina <SEP> lutea <SEP> A <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> PCT-1001
<tb> Mf-1 <SEP> Micrococcus <SEP> A <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 0125 <SEP>
<tb> flavus
<tb> Bc-1 <SEP> Bacillus <SEP> cereus <SEP> A <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0,4 <SEP> 0,4
<tb> ATCC <SEP> 10702 <SEP> A
<tb> Bs-1 <SEP> Bacillus <SEP> A <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> subtilis <SEP> PCI-219
<tb> Sp-3 <SEP> Streptococcus <SEP> B <SEP> 0,8 <SEP> 0,4 <SEP> 0,8 <SEP> 0,
0125
<tb> pyogenes <SEP> A9604
<tb> Sp-9 <SEP> Streptococcus <SEP> B <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 0125 <SEP>
<tb> pyogenes <SEP> A20201
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Tabelle VI (Fortsetzung)
EMI13.1
<tb>
<tb> Code <SEP> No. <SEP> Versuchs-Versuchs-MIC <SEP> (pg/ml) <SEP>
<tb> organismen <SEP> medium <SEP> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiran-Clindamycin <SEP> damycin
<tb> Sv-8 <SEP> Streptococcus <SEP> B <SEP> 0,8 <SEP> 0,4 <SEP> 0,4 <SEP> 0,025
<tb> viridans <SEP> A21354
<tb> Dp-4 <SEP> Diplococcus <SEP> B <SEP> 0,8 <SEP> 0,4 <SEP> 0,4 <SEP> 0,0125
<tb> pneumoniae <SEP> A9585
<tb> Nm-2 <SEP> Neisseria <SEP> B <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> meningitidis <SEP> A20049
<tb> Nm-4 <SEP> Neisseria <SEP> B <SEP> 3,1 <SEP> 1,6 <SEP> 0,8 <SEP> 0,
025
<tb> meningitidis <SEP> A21496
<tb> Ng-1 <SEP> Neisseria <SEP> B <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> gonorrhoeae <SEP> A15112
<tb> Ng-4 <SEP> Neisseria <SEP> B <SEP> 0,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0,4 <SEP> 0,2
<tb> gonorrhoeae <SEP> A20154
<tb> Hi-3 <SEP> Hemophilus <SEP> B <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> influenzae <SEP> A9832
<tb> Hi-7 <SEP> Hemophilus <SEP> B <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> influenzae <SEP> A20188
<tb>
A : Nähragar (Eiken) B : Gonococcus-Medium (Eiken) A enthält (g/l): Rindfleischextrakt 5, 0 ; Pepton 10,0: NaCl 5,0; Agar 15, 0.
B enthält (g/l): Proteose-Pepton 15,0: Maisstärke 1,0: NaCl 5,0: KH2PO4 4,0; Agar 10. 0.
<Desc/Clms Page number 14>
Tabelle VII In vitro Wirksamkeit gegenüber anaeroben Bakterien
EMI14.1
<tb>
<tb> Code <SEP> No. <SEP> Versuchsorganismen <SEP> MIC <SEP> (pg/ml)
<tb> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiran-Clindamycin <SEP> damycin
<tb> Bf-1 <SEP> Bacteroides <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> fragilis <SEP> A20926
<tb> Bf-3 <SEP> Bacteroides <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,05
<tb> fragilis <SEP> A20928-1
<tb> Bf-4 <SEP> Bacteroides <SEP> 0.
<SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,2 <SEP> 0,05
<tb> fragilis <SEP> A20929
<tb> Bf-6 <SEP> Bacteroides <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> fragilis <SEP> A20930
<tb> Bf-7 <SEP> Bacteroides <SEP> 0,2 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,05
<tb> fragilis <SEP> A20932
<tb> Bf-10 <SEP> Bacteroides <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> fragilis <SEP> A20935
<tb> Sm-1 <SEP> Sphaerophorus <SEP> 0,2 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,025
<tb> necrophorus <SEP> A15202
<tb> So-1 <SEP> Sphaerophorus <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0.
<SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> pseudonecrophorus <SEP> A20013
<tb> Fo-1 <SEP> Fusobacterium <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> mortiferum <SEP> ATCC <SEP> 9817
<tb> Fv-1 <SEP> Fusobacterium <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,05
<tb> varium <SEP> ATCC <SEP> 6501
<tb> Ac-1 <SEP> Acidoaminococcus <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> fermentans <SEP> ATCC <SEP> 25085
<tb> Vp-1 <SEP> Veillonella <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0.
<SEP> 05 <SEP>
<tb> parvula <SEP> ATCC <SEP> 17745
<tb> Cb-1 <SEP> Clostridium <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> acetobutylicum <SEP> IAM <SEP> 19011
<tb> Cc-1 <SEP> Clostridium <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> caproicum <SEP> IAM <SEP> f9228
<tb> Ch-1 <SEP> Clostridium <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> chavoei <SEP> A9561
<tb> Cp-l <SEP> Clostridium <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0,1 <SEP> 0,025
<tb> perfringens <SEP> A9635
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
Tabelle VII (Fortsetzung)
EMI15.1
<tb>
<tb> Code <SEP> No.
<SEP> Versuchsorganismen <SEP> MIC <SEP> (pg/ml)
<tb> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiran-Clin- <SEP>
<tb> damycin <SEP> damycin
<tb> Cp-2 <SEP> Clostridium <SEP> 0,4 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 025
<tb> perfringens <SEP> A21284
<tb> Pp-1 <SEP> Peptocuccus <SEP> 0,2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> prevotii <SEP> ATCC <SEP> 9321
<tb> Pe-101 <SEP> Peptococcus <SEP> 0,2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,2
<tb> aerogenes <SEP> ATCC <SEP> 14963
<tb> Pb-1 <SEP> Peptostreptococcus <SEP> 0,4 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0,2 <SEP> 0,8
<tb> anaerobius <SEP> B43
<tb>
Tabelle VIII Einfluss der Inoculum-Grösse
EMI15.2
<tb>
<tb> Inoculum <SEP> MIC <SEP> (pg/ml) <SEP> in <SEP> GAM-Agar
<tb> Grösse <SEP> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiranda-ClindaZell/ml <SEP> mycin <SEP> mycin
<tb> B. <SEP> fragilis <SEP> 1. <SEP> 2x <SEP> 10'' <SEP> 0.
<SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 025
<tb> A20928-1 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2 <SEP> 0,025
<tb> C. <SEP> perfringens <SEP> 7 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,8 <SEP> 0,0125
<tb> A9635 <SEP> 7 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 0,8 <SEP> 0,0125
<tb> Inoculum <SEP> MIC <SEP> ( g/ml) <SEP> in <SEP> GAM-Brühe
<tb> Grösse <SEP> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiranda- <SEP> ClindaZell/ml <SEP> mycin <SEP> mycin
<tb> B. <SEP> fragilis <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 0,006 <SEP> 0,013 <SEP> 0,006 <SEP> 0,025
<tb> A20928-1 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> 0,0 <SEP> 0,4 <SEP> 0,2 <SEP> 0,05
<tb> C.
<SEP> perfringens <SEP> 1, <SEP> 2x <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> A9635 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 10'100 <SEP> 25 <SEP> 12,5 <SEP> 12,5
<tb>
GAM = Gifu anaerbes Medium, Nissui
<Desc/Clms Page number 16>
Tabelle IX Bakterizide Wirksamkeit
EMI16.1
<tb>
<tb> Inoculum <SEP> MIC <SEP> a <SEP> MBC <SEP> (pg/ml)
<tb> Grösse <SEP> Bu-2313A <SEP> Bu-2313B <SEP> Tiranda-Clinda- <SEP>
<tb> Zell/ml <SEP> mycin <SEP> mycin <SEP>
<tb> MIC <SEP> MBC <SEP> MIC <SEP> MBC <SEP> MIC <SEP> MBC <SEP> MIC <SEP> MBC
<tb> B. <SEP> fragilis
<tb> A20928-1 <SEP> 2, <SEP> 8xl0. <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> > 0. <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 006 <SEP> > 0. <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> > <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0. <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> C. <SEP> perfringens
<tb> A9635 <SEP> 1. <SEP> 2x10'' <SEP> 0.
<SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes
<tb> A20201 <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 0,4 <SEP> 12,5 <SEP> 0,2 <SEP> 12,5 <SEP> 0,4 <SEP> > 12,5 <SEP> 0,05 <SEP> 6,3
<tb>
Mäuse-Blutspiegel
Die Blutspiegel in Mäusen nach subkutaner oder oraler Verabreichung von Bu-2313B (Na-Salz), Clindamycin und Flagyl bei bestimmten Dosierungen (100, 50, 25 und 12, 5 mg/kg) ermittelt. Die Blutproben wurden aus orbitalen Krümmungen (orbital sinuses) gesammelt und unter Verwendung von B. fragilis A20926 als Testorganismus nach dem Papier-Scheiben-Agarplatten-Verfahren untersucht. Die Resultate sind in Tabelle X zusammengefasst.
Die oberen Blutspiegel, die mit Bu-2313B erhalten wurden, waren annähernd 3 bis 4 mal höher als jene von Clindamycin sowohl bei parenteraler als auch bei oraler Verabreichung, wobei Flagyl bessere Absorptionen als Bu-2313B zeigte.
Tabelle X
Blutspiegel von Mäusen
Subkutane Verabreichung
EMI16.2
<tb>
<tb> Antibiotika <SEP> Dosis <SEP> Blutspiegel <SEP> (pg/ml)
<tb> mg/kg <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 1h <SEP> 2h
<tb> Bu-2313B <SEP> 100 <SEP> 28 <SEP> 34 <SEP> 38 <SEP> 29
<tb> 50 <SEP> 25 <SEP> 27 <SEP> 20 <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 25 <SEP> 12 <SEP> 10 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Clindamycin <SEP> 100 <SEP> 11 <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 5,2 <SEP> 0, <SEP> 4
<tb> 50 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 25 <SEP> 3. <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 12.
<SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
Tabelle X (Fortsetzung)
EMI17.1
<tb>
<tb> Antibiotika <SEP> Dosis <SEP> Blutspiegel <SEP> (pg/ml)
<tb> mg/kg <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h
<tb> Flagyl <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 121 <SEP> 98 <SEP> 40
<tb> 50 <SEP> 32 <SEP> 32 <SEP> 26 <SEP> 12
<tb> 25 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 12 <SEP> 8, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb>
Orale Verabreichung
EMI17.2
<tb>
<tb> Antibiotika <SEP> Dosis <SEP> Blutspiegel <SEP> (pg/ml)
<tb> mg/kg <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 1 <SEP> hr. <SEP> 3 <SEP> hr. <SEP> 5 <SEP> hr.
<tb>
Bu-2313B <SEP> 100 <SEP> 12 <SEP> 5. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP>
<tb> 50 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 25 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 12. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> - <SEP>
<tb> Clindamycin <SEP> 100 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0,6
<tb> 50 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 25 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> - <SEP>
<tb> 12,5 <SEP> 0,6 <SEP> 0,4 <SEP> 0,3
<tb> Flagyl <SEP> 100 <SEP> 56 <SEP> 41 <SEP> 24 <SEP> 13
<tb> 50 <SEP> 20 <SEP> 15 <SEP> 11
<tb> 25 <SEP> 8. <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 6. <SEP> 1 <SEP>
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 3.
<SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb>
In vivo Wirksamkeit
Die Wirksamkeit von Bu-2313A und Bu-2313B in vivo wurde bei Mäusen untersucht, die mit B. fragilis A20926 (lokal), C. perfringens A9635 und S. pyogenes A20201 (systemisch) infiziert waren.
Eine lokalisierte Infektion von B. fragilis wurde durch subkutane Injektion in den Nacken von Mäusen einer 0, 5 ml bakteriellen Suspension mit einem Gehalt von 2-5 x 10. Zellen und 10 mg mikrokristalliner Zellulose verursacht. Die Behandlung erfolgte subkutan oder oral einmal täglich während 5 Tagen, wobei 30 min nach erfolgter Infektion begonnen wurde. Eine Gruppe von 5 Mäusen wurde jeweils verwendet, wobei die Tiere am 6. Tag seziert wurden, um die Grösse des subkutanen Abszesses zu messen.
Das Ansprechen jedes Tieres wurde je nach der Grösse der Läsion mit 0 bis 5 bezeichnet, wobei die Summe der Läsionsbezeichnungen durch die Anzahl der in einer Gruppe eingesetzten Mäuse dividiert wurde, um den Einzelwert für jede Behandlung und die Kontrollgruppe zu erhalten. Den Durchschnittswert der Kontrollgruppe als 100% Infektionspegel genommen, wurde der relative Infektionspegel für jede der behandelten Gruppen berechnet und ein PD50 -Wert mittels einer log-Probit-
<Desc/Clms Page number 18>
auftragung bestimmt. Die mit Bu-2313B erhaltenen Resultate sind zusammen mit jenen von Clindamycin und Flagyl in Tabelle XI gezeigt. Clindamycin war bei diesem Infektionsversuch aktiver als Bu-2313B oder Flagyl.
Eine systemische Infektion von C. perfringens oder S. pyogenes wurde in Mäusen durch intraperitoneale Verabreichung einer letalen Dosis des Pathogens in einer 5% Suspension von Schweinemagen-Mucin (American Laboratories) bewirkt. Das Antibiotikum wurde subkutan oder oral knapp vor der bakteriellen Infektion verabreicht. Der PD50 -Wert wurde nach 5 Tagen bestimmt. Wie Tabelle XII zeigt, ergab Bu-2313B einen ziemlich guten Schutz gegenüber diesen systemischen Infektionen sowohl bei subkutaner als auch bei oraler Verabreichung, während Bu-2313A bei oraler Verabreichung unwirksam war. Clindamycin war bei diesen in vivo Versuchen am wirksamsten.
Tabelle XI
Lokalisierte Infektion mit B. fragilis
EMI18.1
<tb>
<tb> Subcutan <SEP> Behandlung
<tb> Antibiotika <SEP> Dosis <SEP> Einzelwert <SEP> Summe <SEP> Durch- <SEP> Infek- <SEP> SC <SEP>
<tb> t <SEP> mg/kg) <SEP> der <SEP> schnitts- <SEP> tions- <SEP> PD <SEP> 50 <SEP>
<tb> Werte <SEP> wert <SEP> pegel
<tb> Bu-2313B
<tb> Na-Salz <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 2, <SEP> 3, <SEP> 3,3 <SEP> 11 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 52, <SEP> 4 <SEP> 60 <SEP> mg/kg
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 3. <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 14 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 66, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 17 <SEP> 3. <SEP> 4 <SEP> 81. <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> 4.
<SEP> Q <SEP> 95, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Clindamycin <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 1, <SEP> 1,2 <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 19. <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> mg/kg <SEP>
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 1,1, <SEP> 1,2, <SEP> 2 <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 33, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 2. <SEP> 2, <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 47, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 4,4, <SEP> 4, <SEP> 4.
<SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 95, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Flagyl <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 2,2, <SEP> 2, <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 47, <SEP> 6 <SEP> 35 <SEP> mg/kg
<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 2,2, <SEP> 2,3, <SEP> 3 <SEP> 12 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 57, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 3,3, <SEP> 3, <SEP> 4,4 <SEP> 17 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 81, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 4.
<SEP> 4,4, <SEP> 4,4 <SEP> 20 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 95, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> 4, <SEP> 4,4, <SEP> 4,5 <SEP> 21 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 100
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Tabelle XI (Fortsetzung) Orale Behandlung
EMI19.1
<tb>
<tb> Antibiotika <SEP> Dosis <SEP> Einzelwert <SEP> Summe <SEP> Durch- <SEP> Infek- <SEP> PO <SEP>
<tb> (mg/kg) <SEP> der <SEP> schnitts- <SEP> tions- <SEP> PD <SEP> 50 <SEP>
<tb> Werte <SEP> wert <SEP> pegel
<tb> Bu-2313B <SEP> zirka
<tb> Na-Salz <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 2, <SEP> 2, <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 12 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 57, <SEP> 1 <SEP> 220 <SEP> mg/kg
<tb> 25 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 3,3, <SEP> 3 <SEP> 15 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 71, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 4,4 <SEP> 17 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 81, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 1,
<SEP> 6x5 <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4,4 <SEP> 20 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 95, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Clindamycin <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 0,4 <SEP> 9,5 <SEP> 11 <SEP> mg/kg
<tb> 25 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 2, <SEP> 2. <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 42, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 6. <SEP> 3x5 <SEP> 2, <SEP> 2, <SEP> 3, <SEP> 3,3 <SEP> 13 <SEP> 2,6 <SEP> 61,9
<tb> 1, <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 4,4, <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 95, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Flagyl <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 0,1, <SEP> 2,2, <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 1,6 <SEP> 38,1 <SEP> 50 <SEP> mg/kg
<tb> 25 <SEP> x5 <SEP> 2,2, <SEP> 3, <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 13 <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 61.
<SEP> 9 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 3,3, <SEP> 3, <SEP> 4,4 <SEP> 17 <SEP> 3,4 <SEP> 81,0
<tb> 1, <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 5 <SEP> 4,4, <SEP> 4, <SEP> 4,4 <SEP> 20 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 95, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 21 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 100
<tb>
Tabelle XII Systemische Infektion mit C. Perfringens und S.
Pyogenes
EMI19.2
<tb>
<tb> PDgjj <SEP> tmg/kg) <SEP>
<tb> C. <SEP> Perfringens <SEP> S. <SEP> pyogenes
<tb> sc <SEP> po <SEP> sc <SEP> po
<tb> Bu-2313A <SEP> 6,25 <SEP> NA <SEP> at <SEP> 50 <SEP> 7,6 <SEP> Na <SEP> at <SEP> 25
<tb> Bu-2313B <SEP> 6,25 <SEP> 30 <SEP> 9 <SEP> 25
<tb> Tirandamycin <SEP> 17 <SEP> 60 <SEP> 9,7 <SEP> 50
<tb> Clindamycin <SEP> 0,08 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0,3 <SEP> 2, <SEP> 1
<tb> Flagyl <SEP> 31 <SEP> 60 <SEP> NT <SEP> NT
<tb>
NA : Keine Aktivität NT : Kein Versuch
<Desc/Clms Page number 20>
Akute Toxizität
Die akuten LD 50 -Werte von Bu-2313A und B wurden nach subkutane, intraperitonealen und oralen Verabreichungen bestimmt. Es wurde sowohl die freie Säure als auch das Natriumsalz von
Bu-2313 untersucht. Die Resultate sind in Tabelle XIII aufgezeigt.
BU-2313B zeigte eine wesentlich i geringere Toxizität als Bu-2313A, was in Anbetracht eines nur geringen Unterschiedes in der Struk- tur beider Bestandteile (Vorliegen oder Nichtvorliegen einer N-Methylgruppe) von Interesse ist.
Tabelle XIII
Akute Toxizität
EMI20.1
<tb>
<tb> LDg <SEP> (mg/kg) <SEP>
<tb> sc <SEP> ip <SEP> po <SEP>
<tb> Bu-2313A <SEP> (freie <SEP> Säure) <SEP> 90 <SEP> 14 <SEP> 90
<tb> Bu-2313A <SEP> (Na-Salz) <SEP> 90 <SEP> 14
<tb> Bu-2313B <SEP> (freie <SEP> Säure) <SEP> 225 <SEP> 115
<tb> Bu-2313B <SEP> (Na-Salz) <SEP> 200 <SEP> 55 <SEP> 280
<tb>
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen umfassen den Bu-2313-Komplex, deren Bestand- teile Bu-2313A und Bu-2313B und die Salze und Mischungen dieser Verbindungen. Pharmazeutische
Präparate können eine oder mehrere der vorstehend genannten antibiotischen Verbindungen zusam- men mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten. Solche Zusammensetzungen können auch weitere antibakterielle Mittel einschliessen.
Die Präparate können in beliebiger pharmazeuti- scher Form je nach der Art der gewünschten Verabreichung hergestellt werden. Beispiele für solche
Präparate sind feste Zusammensetzungen für orale Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen,
Pulver und Granulate, flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung, z. B. Lösungen,
Suspensionen, Sirupe und Elixiere und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösun- gen, Suspensionen oder Emulsionen.
Ebenso wie bei andern Antibiotika hängt die Dosierung von Bu-2313A oder B von dem Gewicht, dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten sowie von der Art der Erkrankung ab ; die Dosierung wird dem Arzt überlassen. Im allgemeinen wird die orale Dosis im Bereich von
50 bis 750 mg Bu-2313A oder B oder Mischungen dieser Verbindungen 3 bis 4 mal täglich liegen.
Die Erfindung soll an Hand von Beispielen ohne Einschränkung auf dieselben näher erläutert werden.
Beispiel 1 : Herstellung der Impfkultur und Fermentierung in einem kleineren Kolben.
Eine Agar-Schrägkultur des Bu-2313 bildenden Organismus, Stamm E864-61 NI Y-29 (ATCC 32198), wurde verwendet, um 100 ml eines flüssigen, pflanzlichen Mediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu inoculieren, der die folgenden Bestandteile enthielt : 3% Glukose, 3% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser und 0, 5% CaCO . Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Sterilisierung auf 7, 0 eingestellt. Die Impfkultur wurde 3 Tage auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung (250 Umdr/min) bei 34'C inkubiert, wonach 2 bis 3 ml der Kultur in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingebracht wurden, der 100 ml des Fermentationsmediums bestehend aus 3% Sucrose, 3% Leinsamenmehl, 0, 3% (NH,), SO" 0, 003% ZnS04. 7H"0 und 0, 5% CaCO, enthielt.
Die antibiotische Wirksamkeit erreichte ein Maximum nach 4 bis 7tägigem Schütteln bei 28'C. Der PH-Wert der Brühe stieg mit fortschreitender Fermentation allmählich an und erreichte bei einer antibiotischen Wirksamkeit von 150 pg/ml den Wert von 8, 1 bis 8, 8. Die antibiotische Wirksamkeit der Fermentationsbrühe wurde mittels dem Papier-Scheiben-Agarplattenverfahren unter Verwendung von Bacteroides fragilis als Testorganismus, gezüchtet auf GAM Agarplatten (Gifu anaerobes Medium von Nissui) unter anaeroben
<Desc/Clms Page number 21>
Bedingungen, bestimmt.
Beispiel 2 ; Fermentation in grösserem Massstab.
Eine Impfkultur (110 l), hergestellt aus einer Agar-Schrägkultur des Stammes E864-61 No Y-29, wurde auf 1500 1 Fermentationsmedium mit einem Gehalt von 3% Glucose, 3% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser und 0, 5% CaCO3 in einem 2500 1 Tank inokuliert. Die Fermentation wurde unter Rühren (200 Umdr/min) bei 31 C ausgeführt, wobei die Belüftung 1000 1/min betrug. Nach 72 h erreichte der pH-Wert der Fermentationsbrühe 8, 2 und betrug die antibiotische Wirksamkeit 265 pg/ml.
Beispiel 3 : Isolierung und Reinigung
Eine Fermentationsbrühe (1500 l, mit einer Wirksamkeit von 200 pg/ml) wurde unter Verwendung eines Filterhilfsmittels filtriert, wonach der Mycelkuchen mit Wasser gewaschen wurde. Das Filtrat wurde mit dem Waschwasser vereinigt, auf einen pH-Wert von 8, 3 gebracht und auf eine Säule eines makrovernetzten Harzes aufgebracht. Die Säule wurde mit Wasser (400 1) und 40% wässe-
EMI21.1
wickelt. Die wirksamen Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zu einem wässerigen Konzentrat eingeengt. Der erhaltene Mycelkuchen (360 kg) wurde in Methanol (300 l) suspendiert und unter Rühren extrahiert. Dieser Vorgang wurde 2 mal wiederholt, wonach der kombinierte Methanolextrakt (700 l) im Vakuum eingeengt wurde.
Die zwei wässerigen Konzentrate, erhalten aus dem HP-20 Eluat und dem Mycelkuchen-Extrakt wurden kombiniert und im Vakuum weiter eingedampft (bis auf 70 1), wonach die wirksamen Bestandteile des Konzentrates 2 mal mit Äthylacetat (2 x 35 l) extrahiert wurden. Der Extrakt wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein öliger Feststoff (1, 03 kg, 220 pg/mg) zurückblieb, der in einer Mischung von Äthylacetat und Methanol (20 : 1, 2, 2 l) gelost und dann auf eine Säule von Aktivkohle (5 l Volumen) aufgebracht wurde. Die Säule wurde mit der gleichen Lösungsmittelmischung entwickelt ; die aktiven Eluate wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei sich ein dunkelbrauner Feststoff bildete, der aus heissem Methanol kristallisiert wurde.
Man erhielt auf diese Weise ein bräunlich-gelbes kristallines Pulver (279 g. 650 pg/mg).
Das so erhaltene kristalline Material bestand aus einer Mischung von Komponenten A und B, deren Trennung mittels Diaion HP-20 Chromatographie erzielt wurde. Ein Teil der Mischung (100 g) wurde in 90% wässerigem Methanol aufgelöst und die Lösung auf eine Säule HP-20-Harz (5 l) aufgebracht. Die Säule wurde unter Bildung von 2 aktiven Fraktionen mit 80% wässerigem Methanol entwickelt. Aus dem Konzentrat der ersten aktiven Fraktion (24 1) wurden hellgelbe nadelförmige Kristalle von Bu-2313B (45 g) erhalten, die zweimal aus Methanol umkristallisiert wurden, wonach man eine analytisch reine Verbindung (32 g) erhielt.
Das zweite aktive Eluat (23 1) wurde im Vakuum konzentriert, wobei eine Mischung von Bestandteilen A und B (etwa 20 g) erhalten wurde, die mittels Siliciumdioxydgel-Säulenchromatographie, entwickelt mit Chloroform, geteilt wurde. Reine Kristalle der Komponente A (4 g) wurden nach Umkristallisation aus den sich schnell bewegenden Fraktionen erhalten, wobei eine zusätzliche Menge der Komponente B (7, 5 g) aus dem letzten Teil der Eluate gewonnen wurde.
Analyse der reinen kristallinen Produkte :
EMI21.2
<tb>
<tb> Bu-2313A <SEP> - <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> CHNO, <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 62, <SEP> 65, <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 82. <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 71, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 27, <SEP> 82. <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 62, <SEP> 57, <SEP> H <SEP> = <SEP> 6. <SEP> 64, <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 60, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 28. <SEP> 20 <SEP>
<tb> (durch <SEP> den <SEP> Unterschied).
<tb>
Bu-2313B <SEP> - <SEP> berechnet <SEP> für <SEP> CH <SEP> NO, <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 62, <SEP> 03, <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 56, <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 78, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 28. <SEP> 63. <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 61, <SEP> 77, <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 80, <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 65, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 28, <SEP> 78 <SEP>
<tb>
EMI21.3
Bu-2313B (100 mg) wurden in 4 ml heissem Brombenzol aufgelöst, wonach Petroläther tropfenweise zugesetzt wurde, bis eine geringe Trübung entstand. Die Lösung wurde zur Vervollständigung der Kristallisation über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Brombenzolsolvat von
EMI21.4
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
<tb>
<tb> Ò'= <SEP> -51, <SEP> 2' <SEP> (c <SEP> 0, <SEP> 88,berechnet <SEP> : <SEP> = <SEP> 56, <SEP> 64, <SEP> H <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 90, <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 06, <SEP> Br <SEP> = <SEP> 11, <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 23, <SEP> 60. <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 56. <SEP> 87. <SEP> H <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 84, <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 19, <SEP> Br <SEP> = <SEP> 12, <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 23, <SEP> 00 <SEP>
<tb>
(aus der Differenz).
Beispiel 5 : Herstellung des Natriumsalzes von Bu-2313B.
Zu einer Lösung von 200 mg von Bu-2313B in 10 ml Methylenchlorid wurden 30 ml Wasser zugesetzt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise unter Rühren 1 n NaOH hinzugefügt, bis der pH-Wert 11,5 betrug. Nach 30 min währenden Rühren wurde die Lösungsmittelschicht abgetrennt und die wässerige Schicht zweimal mit je 30 ml n-Butanol extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der so erhaltene Feststoff wurde in einer kleinen Menge Aceton
EMI22.2
(c 0, 94, Methanol).
EMI22.3
<tb>
<tb>
Analyse <SEP> für <SEP> CHNO, <SEP> Na. <SEP> H <SEP> O <SEP> : <SEP>
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> 57, <SEP> 46, <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 26, <SEP> N <SEP> = <SEP> 2, <SEP> 58, <SEP> Na <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 24, <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 29, <SEP> 46. <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 57, <SEP> 57, <SEP> H <SEP> =6, <SEP> 29. <SEP> N=2. <SEP> 39, <SEP> Na <SEP> =4, <SEP> 21. <SEP> 0= <SEP> 29. <SEP> 54 <SEP>
<tb>
(aus der Differenz).
Beispiel 6 : Herstellung des Natriumsalzes von Bu-2313A.
Es wurde wie im Beispiel 5 verfahren, wobei jedoch an Stelle des Bu-2313B eine gleiche Menge Bu-2313A eingesetzt und das Natriumsalz von Bu-2313A gebildet wurde.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika (Bu-2313A und Bu-2313B), dadurch gekennzeichnet, dass einer der Stämme von Micropolyspora caesia A. T. C. C. 31295, 21296. 31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässerigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, kultiviert wird, bis eine beträchtliche Menge der antibiotischen Mischung durch diesen Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet ist. und gegebenenfalls die antibiotische Mischung bzw. die einzelnen Antibiotika aus dem Kulturmedium isoliert werden.