DK171135B1 - Sur poly(cyclisk-ether)-forbindelse, fremgangsmåde til fremstilling deraf og biologisk ren mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmåden samt foderblandinger indeholdende forbindelsen og en fremgangsmåde til fremme af svins eller kvægs vækst - Google Patents

Description

DK 171135 Bl i

Denne opfindelse angår en hidtil ukendt poly(cyclisk-ether)-forbindelse med formlen OM« 5 fMe

Me I ^Me Qg« ge

MeO "‘T^C .. = " I u y i T \r—\ Me r—VM« —.Η l—. -Me

C A-L —^""H

10 5 1 u ° Λ° c CT Γθ \ V.

s L· H Li u HO Me OH

Me Me HH

(I) hvori Me=CHg, som har den viste absolutte stereokemi, og 15 farmaceutisk acceptable salte deraf med baser, en gæringsfremgangsmåde til fremstilling deraf og en biologisk ren mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmåden samt foderblandinger til kvæg eller svin eller til fjerkræ indeholdende forbindelsen og en fremgangsmåde til 20 fremme af væksten og/eller forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos svin eller kvæg.

Forbindelsen (l) er et hidtil ukendt medlem af gruppen af sure poly(cyclisk-ether)-antibiotika. Denne familie in-25 kluderer sådanne velkendte midler som monensin (The Merck Index, 10th Ed., Merck and Co., Inc., Rahway, N.J., 1983, monograph no. 6100), nigericin (loc. cit., monograph no. 6390), narasin (loc. cit., monograph no. 6271), lasalocid (loc. cit., monograph no. 5204) og salinomycin (loc.

30 cit., monograph no. 8193). Emnet er blevet gennemgået af Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. Mocrobiol., vol. 22, side 177-223 (1977). Nærmest beslægtet strukturelt med den foreliggende forbindelse er portmicin, et antibiotikum som uafhængigt er rapporteret af Hamill et 35 al., US patentskrift nr. 4 582 822 og af Kusakabe et al., EP offentliggørelsesskrift nr. 158 179; Tetrahedron Letters, vol. 28, side 3357-3360 (1987); J. Antibiotics, DK 171135 B1 2 vol. 40, side 237-238 (1987). Den sidstnævnte forbindelse har et a-hydrogenatom på tetrahydrofuran-B-ringen, hvor den foreliggende forbindelse har en a-methylgruppe. Disse forbindelser er alment kendte som coccldlostater, som 5 vækstfremmende foderadditiver og/eller som midler, der er nyttige mod svinedysenteri.

Forbindelsen (I) er også påvist at have udmærket antibak-teriel aktivitet over for Gram-positive organismer og 10 over for Treponema hyodysenteriae (organismen der fremkalder svinedysenteri) samt anticoccidial aktivitet. Sammenligninger af anticoccidiale prøvningsdata for forbindelsen (I) med publiceret information vedrørende aktiviteten af portmicin indikerer, at den her omhandlede for-15 bindelse (I) virker 2-10 gange stærkere over for forskellige arter af coccidier end portmicin.

En kultur af Actinomadura sp., ATCC 53708, producerer, når den dyrkes under aerobe betingelser i vandige medier, 20 det her omhandlede hidtil ukendte sure poly(cyclisk-ether)-antibiotikum med den ovenfor anførte formel (I).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstiling af forbindelsen med formlen (1) eller farmaceutisk acceptable 25 salte deraf med baser, er således særegen ved, at Actinomadura sp. ATCC 53708 dyrkes under neddykkede aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium omfattende en assi-milerbar kilde til carbon og nitogen, indtil der er dannet en udvindelig mængde af forbindelsen med formlen (I).

30

Til anvendelse som anticoccidialt middel, til forhindring eller behandling af svinedysenteri og/eller som vækstfremmende middel behøver forbindelsen (I) ikke at separeres fra gæringsmediet og isoleres i væsentligt ren 35 form, men anvendes alternativt i rå form, enten i udfældet form blandet med mycelium (udvundet ved filtrering af gæringsmediet) eller i fast form opnået ved sprøjte- DK 171135 B1 3 eller frysetørring af hele gæringsmediet.

De farmaceutisk aceptable salte med baser inkluderer, men er ikke begrænset til, salte med kationer af natrium, 5 kalium, calcium, ammoniak, Ν,Ν'-dibenzylethylendiamin, N-methylglucamin (meglumin) og diethanolamin. De foretrukne kationsalte er dem med kalium og natrium.

Opfindelsen angår også foderblandinger, nemlig én til 10 kvæg eller svin, som er særegen ved, at den Indeholder forbindelsen med formlen (I) eller farmaceutisk acceptable salte deraf med baser i en mængde, som er effektiv til at fremme kvægets eller svinenes vækst og/eller forbedre deres foderudnyttelse eller til at forhindre eller be-15 handle dysenteri hos svin, og en anden til fjerkræ, som er særegen ved, at den indeholder forbindelsen med formlen (I) eller farmaceutisk acceptable salte deraf med baser i en mængde, som er effektiv til at bekæmpe coccidie-infektion hos fjerkræet.

20

Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til fremme af væksten og/eller forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos svin eller kvæg, hvilken fremgangsmåde er særegen ved, at svinene eller kvæget indgives en vækst-25 fremmende eller foderudnyttelseseffektivitetsfremmende mængde af forbindelsen med formlen (I) eller farmaceutisk acceptable salte deraf med baser i form af en foderblanding. 1 2 3 4 5 6

Den ene foderblanding ifølge opfindelsen kan således an 2 vendes til at forhindre eller behandle dysenteri hos svin 3 ved, at svinene via foderblandingen Indgives en forbin 4 delse med formlen (I) eller farmaceutisk acceptable salte 5 deraf med baser i en mængde, som er effektiv til forhind- 6 ring eller behandling af dysenteri hos svinene,, og den anden foderblanding ifølge opfindelsen kan anvendes ved en fremgangsmåde til bekæmpelse af coccidieinfektioner DK 171135 B1 4 hos fjerkræ ved, at fjerkræet via foderblandingen indgives en anticoccidialt effektiv mængde af en forbindelse med formlen (I) eller farmaceutisk acceptable salte deraf med baser.

5

Endelig angår opfindelsen en biologisk ren kultur af Actinomadura sp. ATCC 53708 til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af forbindelsen med formlen (1) eller farmaceutisk acceptable salte deraf 10 med baser.

Kulturen, som er i stand til at producere det omhandlede sure poly(cyclisk-ether)-antibiotikum med formlen (I), betegnes Actinomadura sp. og er blevet deponeret i The 15 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. som typekulturen med accessions nr. ATCC 53708 i overensstemmelse med Budapest-traktatens bestemmelser. Opretholdelse af deponeringen af denne kultur i The

American Type Culture Collection og offentlighedens 20 uhindrede adgang dertil garanteres under hele patentets løbetid.

Denne hidtil ukendte kultur blev afledt fra en jordprøve opsamlet i Tuzla, Istanbul, Tyrkiet og identificeret 1 25 Pfizer Inc.s kultursamling som N777-1. Dens beskrivelse og klassifikation blev tilvejebragt af Dr. L.H. Huang. Denne kultur blev fundet at frembringe snævre dimensioner af hyferne af actinomyceterne, et luftmycelium, på hvilket der frembringes korte sporekæder, og et ufragmenteret 30 substratmycelium. Resultaterne af hel-celle-analyserne viser yderligere, at den tilhører slægten Actinomadura.

En skråkultur af mikroorganismen blev udsået i ATCC 172 væske og dyrket i 4 dage ved 28 °C på en ryster. Kulturen 35 blev derpå centrifugeret i 20 minutter, vasket 3 gange med sterilt destilleret vand og udsået på medier, der almindeligvis anvendes til identifikation af medlemmer af DK 171135 B1 5

Actinomycetales.

Kulturerne blev Inkuberet ved 20 °C, og resultaterne aflæst til forskellige tider, men mest almindelig efter 14 5 dage. Farverne blev beskrevet i almindelig terminologi, men eksagte farver blev bestemt ved sammenligninger med farvemærkater fra The Color Harmony Manual, fourth edition. Metoderne til hel-celle-aminosyre- og -sukker-analyser er de, der er beskrevet henholdsvis i Becker et 10 al., Appl. Microbiol., vol. 12, side 421-423 (1964), og i Staneck et al., Appl Microbiol., vol. 28, side 226-231 (1974) og Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., Vol. 71, side 934-944 (1968).

15 Kulturen blev identificeret som følger:

Gaerekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP nr. 2 medium, Difco) - vækst god, flødefarvet (2 ca) med mørkegrå til sorte (næsten grå række 5 ih, 5 ml) prikker, hævet, rynket; 20 intet til kun lidt luftmycelium, farveløst; bagside flødefarvet til blegt gullig (2 ca, 2 ea) med sorte (næsten grå række 5 ml) prikker; intet opløseligt pigment.

Havremel-agar (ISP nr. 3 medium, Difco) 25 - vækst moderat, flødefarvet (2 ca), let hævet, glat; intet til kun lidt luftmycelium, farveløst; bagside flødefarvet (2 ca); opløseligt pigment flødefarvet (2 ca).

Uorganiske salte-stivelse-agar (ISP nr. 4 medium, Difco) 30 - vækst ringe, flødefarvet (2 ca), tynd, glat; intet til kun lidt luftmycelium, farveløst; bagside flødefarvet (2 ca); intet opløseligt pigment.

Glycerol-asparagin-agar (ISP nr. 5 medium, Difco) 35 - vækst ringe til moderat, flødefarvet (2 ca), tynd, glat; intet luftmycelium; bagside flødefarvet (2 ca); intet opløseligt pigment.

DK 171135 B1 6

Czapek-sucrose-agar (Waksman "The Antinomycetes", vol. 2, medium nr. 1, side 328, 1961) - vækst moderat til god, flødefarvet (2 ca), moderat hævet, glat; Intet luftmycelium; bagside flødefarvet (2 5 ca); intet opløseligt pigment.

Glucose-asparagin-agar (ibid., medium nr. 2) - vægt moderat, flødefarvet (2 ca), tynd til moderat hævet, glat til rynket; intet luftmycelium; bagside fløde- 10 farvet ( 2 ca); intet opløseligt pigment.

Gordon og Smith’s tyrosin-agar (Gordon and Smith, J. Bacteriol., 69:147-150, 1955) - vækst moderat til god, flødefarvet (2 ca), let til mo-15 derat hævet, glat til rynket; intet luftmycelium; bagside flødefarvet (2 ca); opløseligt pigment blegt gulligt (2 ea).

Calciummalat-agar (Waksman, Bacteriol. Rev. 21, 1-29, 20 1957) - vækst sparsom, flødefarvet (2 ca), tynd, glat; intet luftmycelium; bagside flødefarvet (2 ca); intet opløseligt pigment.

25 Casein-agar (Gordon and Smith, ibid.) - vækst god, flødefarvet (2 ca), hævet, glat til rynket; intet luftmycelium; bagside blegt gullig (2 ea); gulligt (2 ga) opløselige pigment. 1 2 3 4 5 6

Bennett's agar (Waksman, loc. cit., medium nr. 30, side 2 331) 3 - vækst god, flødefarvet (2 ca), hævet, rynket; intet 4 luftmycelium; bagside flødefarvet til blegt gullig (2 ca, 5 2 ea); opløselige pigment blegt gulligt (2 ea).

6

Emerson’s agar (ibid., medium nr. 28, side 331) - vækst moderat, flødefarvet til blegt gullig (2 ca, 2 DK 171135 B1 7 ea), hævet, rynket; intet luftmycelium; bagside gullig (2 ic); intet opløseligt pigment.

Nutrient agar (ibid., medium nr. 14, side 330) 5 - vækst ringe til moderat, flødefarvet (2 ca), tynd til let hævet; intet luftmycelium; bagside flødefarvet (2 ca); intet opløseligt pigment.

Gelatine-agar (Gordon and Mihm, J. Bacteriol. 73, 15-27, 10 1957) vækst god, flødefarvet (2 ca), hævet, rynket; intet luftmycelium; bagside flødefarvet til blegt gullig (2 ca, 2 ea); opløseligt pigment blegt gulligt (2 ea).

Stivelse-agar (ibid.) 15 - vækst god, flødefarvet (2 ca), hævet, rynket; intet luftmycelium; bagside flødefarvet til blegt gullig (2 ca, 2 ea); intet opløseligt pigment.

Kartoffel-gulerods-agar (Lechevalier, Lab. Clin. Med., 20 71, 934-944, 1968, men der anvendes kun 30 g kartofler, 2,5 g gulerødder og 20 g agar) - vækst ringe til moderat, næsten hvid (næsten grå række 2 ba), tynd, glat; intet til kun lidt luftmycelium, farveløst; bagside farveløs til flødefarvet (2 ca); intet 25 opløseligt pigment.

Vandværksvand-agar (2%) - vækst ringe, flødefarvet (2 ca), tynd, glat; intet til kun lidt luftmycelium, farveløst; bagside farveløs til 30 flødefarvet (2 ca); intet opløselige pigment.

Gauze * s mineralmedium 1 (Gauze et al., Problems in the Classification of Antagonistic Actinomycetes, English Ed., p. 13, 1957) 35 - vækst ringe til moderat, flødefarvet (2 ca), tynd, glat; intet men kun lidt luftmycelium, farveløst; bagside flødefarvet (2 ca); intet opløseligt pigment.

DK 171135 B1 8

Gauze's organisk medium 2 (ibid.) - vækst god, flødefarvet (2 ca), hævet, rynket; intet luftmycelium; bagside flødefarvet til blegt gullig (2 ca, 2 ea)); intet opløseligt pigment.

5

Morfologiske egenskaber - de morfologiske egenskaber blev iagttaget efter 3 ugers inkubation på uorganiske salte-stivelse-agar: luftmyce lium farveløst, hvidt til flødefarvet; sporekæder lige, 10 buede eller krogede, 2-9 sporer pr. sporekæde; sporer kugleformede, ovale til elliptiske, 0,8-1,4 um i diameter eller 1,1-1,8 x 0,8-1,2 um; glatte som afsløret ved skanderende elektronmikroskopi.

15 Biokemiske egenskaber melanin produceres ikke; hydrogensulfid produceres ikke; gelatine smeltes; stivelse hydrolyseres ikke; nitrat reduceres ikke til nitrit; ingen vækst og ingen nedbrydning på hverken Jensen's eller Levine og Schoenlein's 20 cellulosevæske; ingen koagulering og ingen peptonisering af mælk; caseinfordøjelse positiv; tyrosinfordøjelse negativ; calciummalatfordøjelse negativ. Carbonhydratud-nyttelse: glucose, arabinose, fructose, mannitol, rhamno-se, sucrose, xylose, adonitol, cellobiose, glyerol, mal-25 tose, ribose, stivelse og trehalose udnyttes; ionsitol, raffinose, dulcitol, erythritol, galactose, latose, mannose, melezitose, melibiose, a-methyl-D-glucocid, sali-cin, sorbitol og sorbose udnyttes ikke. 1 2 3 4 5 6

De andre positive prøvninger inkluderede udnyttelse af 2 acetat og pyruvat; hydrolyse af esculin; og nedbrydning 3 af xanthin og hypoxanthin. De følgende prøvninger var ne 4 gative: udnyttelse af benzoat, citrat, dextrin, lactat, 5 malat, mucat, oxalat, phenol, propionat og succinat; ned- 6 brydning af adenin og tyrosin; og hydrolyse af hippurat.

DK 171135 B1 9

Temperaturforhold

21 °C 28 °C 37 °C 45 °C

god vækst god vækst god vækst god vækst 5 -

Hel-celle-analyse - hel-celle-hydrolysaterne Indeholdt meso-diaminopimelinsyre, glucose, galactose, madurose, mannose og ribose.

10 Kulturen N777-1 er karakteriseret ved det flødefarvede substratmycelium; det korte farveløse luftmycelium; de korte sporekæder, som er lige, buede eller krogede; og sporerne med glat overflade. Den udnyttede glucose, ara-blnose, frutose, mannitol, rhamnose, sucrose, xylose, 15 adonitol, cellobiose, glycerol, maltose, ribose, stivelse, trehalose, acetat og pyruvat. Xanthin, hypoxanthin og esculin blev nedbrudt. Hel-celle-hydrolysaterne viste tilstedeværelsen af mesodiaminopimelinsyre og madurose. Således tilhører kulturen N777-1 slægten Actinomadura som 20 defineret af H. Lechevalier.

De kendte arter af Actinomadura, som viser lignende flødefarvet substratmycelium og/eller lignende biokemiske egenskaber, inkluderer A. cremea subsp. rifamycini, A.

25 madurae subsp. slmaoensis og A. routienii. Kulturen N777-1 adskiller sig fra A. cremea subsp. rifamycini ved de glatte sporer, den manglende evne til at reducere nitrat, den manglende evne til at udnytte raffinose og udnyttelsen af arabinose og rhamnose.

30

Kulturen N777-1 adskiller sig fra A. madurea subsp. simaoensis ved det flødefarvede i stedet for det farveløse til orangebrune substratmycelium, det farveløse i stedet for det farveløse til lyserødt-hvide luftmycelium, 35 den manglende evne til at reducere nitrat, den manglende evne til at nedbryde tyrosin og evnen til at dekomponere xanthin. Sammenlignet med A. routienii adskiller den sig DK 171135 B1 10 ved fraværet af pseudosporangler; den manglende evne til at hydrolysere stivelse; den manglende evne til at koagulere mælk og evnen til at udnytte mannitol, frugtose og glycerol.

5

Kulturen N777-1 ligner A. albolutea i de fleste af de biokemiske prøvninger, men adskiller sig fra denne ved den manglende evne til at hydrolysere stivelse, den manglende evne til at koagulere mælk, det flødefarvede i 10 stedet for det brune til mørkebrune substratmycelium og de korte i stedet for de lange sporekæder.

På basis af de ovenfor fremlagte data betragtes kulturen N777-1 som et medlem af slægten Actinomadura og betegnes 15 Atinomadura sp. Den er blevet deponeret i the American Type Culture Collection under acessionsnummeret ATCC 53708.

Den antibiotiske forbindelse (I) ifølge opfindelsen 20 produceres let af den omhandlede Actinomadura sp. ved dyrkning af denne ved fra ca. 24 til ca. 36 °C under neddykkede betingelser med omrøring og beluftning på medier bestående af carbonhydratkilder, såsom sukkerarter, stivelser, glycerol; stoffer indeholdende organisk nitrogen, 25 såsom sojabønnemel, caseinaminosyrer, gærekstrakt; vækststoffer, såsom "grain solubles", fiskemel, bomuldsfrømel; mineralsalte indeholdende sporelementer, såsom jern, cobalt, kobber, zink, osv. og calciumcarbonat eller phos-phater som puffermidler. Efter at væksten er fuldført, 30 udvindes antibiotikummet let ved ekstraktion af hele væsken med et organisk opløsningsmiddel, såsom n-butanol, methylisobutylketon eller chloroform ved pH-værdier i området 4,0-8,0; ved frafiltrering af myceliet, som indeholder det udfældede antibiotikum, idet filtratet 35 smides væk; eller ved simpelt hen at sprøjtetørre eller frysetørre hele væsken. Alternativt ekstraheres myceliet eller den tørrede helvæske med et af de nævnte organiske DK 171135 B1 11 opløsnlngemldler. Den rensede antibiotiske forbindelsen kan om ønsket isoleres fra den organiske ekstrakt ved standardmetoder til koncentrering, dannelse af salt eller fri syre, kromatografi, udfældning og/eller krystallisa-5 tion som eksemplificeret nedenfor.

På den sædvanlige måde ved udførelse af gæring fremstilles først et inoculum ved skrabning af vegetative celler, voksende på et egnet medium, fra skråsubstrater eller 10 Roux-flasker, som er blevet podet med Actinomadura sp.

ATCC 53708. De resulterende vegetative celler anvendes så til at inoculere rystekolber eller inoculumtanke, der også indeholder egnede vækstmedier. Alternativt inocule-res inoculumtankene fra rystekolberne. Efter en egnet 15 vækstperiode (almindeligvis 120-144 timer i rystekolber og 168-196 timer i inoculumtanke) inoculeres en fermentor, der også indeholder egnet vækstmedium, under aseptiske betingelser med vegetativ væske fra rystekolberne eller inoculumtankene. Efter fuldførelse af væksten 20 (almindeligvis på 120-196 timer) udvindes den antibiotiske forbindelse i en rå eller ren form, som ønsket, ved en eller anden af de metoder, som alment er beskrevet ovenfor, eller ved specifikke metoder, som er eksemplifieret nedenfor. Forbindelsen med formlen (I) prøves for in 25 vitro antibakteriel aktivitet ved standardmetoder, hvorved de minimale inhiberende koncentrationer (MIC) i μ g/ml overfor en eller flere mikroorganismer måles. Én sådan procedure er den, der anbefales af the International Collaborative Study in Antibiotic Sensitivity Testing 30 (Ericsson and Sherris, Acta Pathologica et Microbiologica Scandinav., Supp. 217, Section B: 64-68 (1971), og hvorved der anvendes hjerne-hjerte-infusions-(BHI)-agar og en inoculareplikationsindretning. Reagensglas dyrket natten over fortyndes 100 gange til anvendelse som standardino-35 culum (20 000-100 000 celler i omkring 0,002 ml anbringes på agaroverfladen; 20 ml BHI-agar/skål). Der anvendes 12 dobbeltfortyndinger af prøveforbindelsen, idet begyndel- DK 171135 B1 12 seskoncentrationen a£ forbindelsen er 200 ug/ml. Der ses bort fra enkelte kolonier, når pladerne aflæses efter 18 timer ved 37 °C. Prøveorganismens følsomhed (MIC) accepteres som den laveste koncentration af forbindelsen, som 5 er 1 stand til at frembringe fuldstændig lnhibering af vækst bedømt med det blotte øje. Ligesom andre poly(cyc-lisk-ether)-antibiotika udviser den omhandlede forbindelse med formlen (I) typisk Gram-positiv antibakteriel aktivitet såvel som aktivitet overfor Treponema hyodysen-10 teriae (det kausative agens for svinedysenteri) som belyst i tabel I.

TABEL I

15 IN VITRO ANTIBAKTERIEL AKTIVITET AF

FORBINDELSEN MED FORMLEN (I)

Organisme Stamme nr. MIC, wg/ml 20 Clostridium perfringens 10A006 0,39 10A009 0,20

Actinomyces pyogenes 14D002 0,39 14D008 0,39 25 14D011 0,39

Treponema hyodysenteriae 94A001 0,20 94A002 0,20 94A007 0,20 30

Effektivitetsdata for forbindelsen med formlen (I) og dens salte overfor coccidieinfektioner hos kyllinger opnås ved den følgende metode. Grupper på 3-5 ti dage gamle pathogenfrie hvide leghorn cockerel kyllinger fod-35 res med et opblødt foder indeholdende forbindelsen (1) eller dens natrium- og/eller kaliumsalt ensartet disper-geret deri. Efter at have været på denne ration i 24 DK 171135 B1 13 timer inoculeres hver kylling per os med oocyster af den bestemte art af Eimeria, som skal prøves. Andre grupper på 3-5 ti dage gamle kyllinger fodres med et lignende opblødt foder uden forbindelsen (I) eller dens salte. De 5 Inficeres også efter 24 timer og tjener som Inficerede kontroller. Endnu en gruppe på 3-5 ti dage gamle kyllinger fodres med det samme opblødte foder uden antibiotikum og Inficeres Ikke med coccldler. Disse tjener som normale kontroller. Resultaterne af behandlingen be-10 dømmes efter 5 dage 1 tilfælde af E. acervulina og efter 6 dage for alle andre coccldlearter.

De kriterier, der anvendes til at måle anticoccidial aktivitet, består af læsionstal på 0-4 for E. tenella efter 15 J. E. Lynch, "A New Method of the Primary Evaluation of Antioccidial Activity", Am. J. Vet. Res., 22, 324-326, 1961; og 0-3 for de andre arter baseret på en modifikation af det pointsystem, der er udformet af J. Johnson og W. H. Reid, "Anticocidial Drugs. Lesion Scoring 20 Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit., 28, 30-36 1970. Aktiviteten måles ved at dividere læsionstallet for hver behandlet gruppe med læsionstallet for den inficerede kontrol. Ved denne prøvning udviser forbindelsen (I) og dens kationsalte 25 udmærket aktivitet overfor infektioner af Eimeria tenel-la, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti og E. necatrix hos fjerkræ, når de inkorporeres i kyllingernes opblødte foder i niveauer på ca. 1,0-25 ppm. F.eks. udviste forbindelsen med formlen (I) overfor en sensitiv E. tenella 30 100% bekæmpelse af læsioner ved doser så lave som 5 ppm.

Forbindelsen Ifølge opfindelsen med formlen (I) er også alment nyttig i kombination med visse andre kendte anti-coccidiale midler, såsom nicarbazin, 4,4'-dinitrocarbani-35 lid eller en naphthalenamin som defineret af Hamill et al. i det ovennævnte US patentskrift nr. 4 582 822.

DK 171135 B1 14

Til forhindring eller bekæmpelse af coccidiose hos fjerkræ indgives forbindelsen ifølge opfindelsen oralt til fjerkræ i en egnet bærer. Hensigtsmæssigt indgives lægemidlet simpelthen i drikkevandet eller i fjerkræfoderet, 5 således at der indtages en terapeutisk dosering af midlet med den daglige vand- eller foderration. Midlet kan udmåles direkte i drikkevand, fortrinsvis i form af et flydende koncentrat, eller sættes direkte til foderet som sådant eller i form af en præmix eller et koncentrat. En 10 præmix eller et koncentrat af det terapeutiske middel i en bærer anvendes almindeligvis til inkludering af midlet i foderet. Det terapeutiske middel kan være i væsentlig ren form (f.eks. den frie syre eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf) eller i rå form, såsom aktivi-15 tetsafprøvet vådt eller tørt mycelium eller tørret helvæske. Egnede bærere er flydende eller faste efter ønske, såsom vand, forskellige mel, f.eks. sojabønnemel, hørfrømel, majskolbemel og mineralblandinger, såsom de der almindeligvis anvendes i fjerkræfoderer. En særlig effektiv 20 bærer er fjerkræfoderet selv, dvs. en lille portion fjerkræfoder. Bæreren letter ensartet fordeling af de aktive materialer i det færdige foder, med hvilket præmixen blandes. Dette er vigtigt, fordi der kun kræves små mængdeforhold af de omhandlede kraftige midler. Det er vig-25 tigt, at forbindelsen blandes grundigt i præmixen, og derefter i foderet. I denne henseende kan midlet disper-geres eller opløses i et egnet olieagtigt medium, såsom sojabønneolie, majsolie, bomuldsfrøolie og lignende, eller i et flygtigt organisk opløsningsmidel og derpå blan-30 des med bæreren. Det vil indses, at mængdeforholdene af det aktive materiale i koncentratet kan varieres bredt, eftersom mængden af midlet i det færdige foder kan indstilles ved blanding af det passende mængdeforhold af præmixen med foderet til opnåelse af et ønsket niveau af 35 terapeutisk middel.

DK 171135 B1 15 Højstyrke-koncentrater blandes af foderfabrikanten med protelnholdig bærer, såsom sojabønnemel og andre mel som beskevet ovenfor, til fremstilling af koncentrerede supplementer, som er egnede til direkte fodring til fjerkræ.

5 I sådanne tilfælde får fjerkræet lov at Indtage den sædvanlige kost. Alternativt sættes sådanne koncentrerede supplementer direkte til fjerkræfoderet til dannelse af et næringsmæssigt afbalanceret færdigt foder Indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af en eller flere af for-10 bindeiserne Ifølge opfindelsen. Blandingerne blandes grundigt ved standardprocedurer, såsom 1 en dobbeltskålsblander, for at sikre homogenitet.

Anvendt på fjerkræ vil anvendelsesniveauerne af den om-15 handlede forbindelse variere under forskellige omstændigheder. Kontinuert lægemiddelbehandling 1 lavt niveau under vokseperioden; dvs. under de første 5-12 uger for kyllinger, er en effektiv profylaktisk foranstaltning.

Ved behandlingen af etablerede Infektioner kan højere ni-20 veauer være nødvendige for at overvinde infektionen.

Anvendelsesniveauet af forbindelsen (I) i foder vil almindeligvis være i området fra omkring 1,0 til omkring 25 ppm, fortrinsvis i området fra omkring 2,5 til omkring 12,5 ppm. Når den indgives i drikkevand, vil niveauet væ-25 re det, som vil give den samme daglige dosis af lægemiddel ganget med vægtforholdet mellem det gennemsnitlige daglige foderforbrug og den gennemsnitlige daglige vandindtagelse . 1 2 3 4 5 6

Aktiviteten af forbindelsen med formlen (I) og dens salte 2 til fremme af vækst og/eller forøgelse af foderudnyt 3 telseseffektiviteten hos svin eller kvæg kan måles direk 4 te ved fodring af prøvegrupper af dyrene med forskellige 5 niveauer af forbindelsen (I) eller et salt deraf i fode- 6 ret. Alternativt beskriver GB patentskrift nr. 1 666 826 i detaljer en in vitro rumen metode til bedømmelse af antibiotika i fodere.

DK 171135 B1 16

Til anvendelse ved forhindringen eller behandlingen af svinedysenteri eller ved fremme af vækst og/eller forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos kvæg eller svin indgives forbindelsen med formlen (I) eller et salt 5 deraf fortrinsvis som et foderadditiv. Foderne fremstilles ifølge metoder, som er fuldstændig analoge med dem, der er beskrevet detaljeret ovenfor til fremstilling af fjerkræfoder, idet der på samme måde sørges for at fremstille fodere, hvori det terapeutiske middel er ensartet 10 dispergeret. Anvendelsesniveauet af forbindelsen (I) i kvæg- eller svinefoder vil alindeligvis være i området fra omkring 0,25 til omkring 25 ppm. Hos drøvtyggere kan forbindelsen med formlen (I) også indgives oralt i form af en bolus, som tilbageholdes i den rumenoretikulære sæk 15 og afgiver det terapeutiske middel med en i det væsentlige konstant hastighed over et forlænget tidsrum, f.eks.

4-8 uger, således at den tilvejebringer en dosis ækvivalent med den ovenstående daglige dosis i foder, dvs.: 20 gennemsnitlig daglig dosis i mg - (0,25 - 25) x gennemsnitligt dagligt foderforbrug i kg.

Som eksempel på en sådan bolus med styret afgivelse kan nævnes den, som er beskrevet af Cardinal US i patent-25 skrift nr. 4 601 893.

Opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.

30 EKSEMPEL 1 Gæring af Actinomadura sp. ATCC 53708

Isolering af forbindelsen (I) som natriumsaltet 35

Atinomadura sp. blev først dyrket ved inoculering af faste medier på skråsubstrater eller Roux-flasker med DK 171135 B1 17 ATCC 52708 kulturen under anvendelse af ATCC medium nr.

172 fremstillet og med sammensætning som følger: 2/1 5 Glucose 10

Opløselig stivelse 20 Gærekstrakt 5

Enzymetisk casein hydrolysat 1

Calciumcarbonat 1 10 Destilleret vand til 1000 ml? pH til 7,0 med Κ0Η; tilsæt agar 20 I mellemtiden blev der forberedt rystekolber under anvendelse af det ene eller det andet af de følgende medier: 15 C' g/1 JDYTT g/1

Cerelose 10 Cerelose 10

Sojamel 10 Majsstivelse 5 20 Majsgæringstørstof 5 Majsstøbevand 5

Majsstivelse 10 Enzymatisk casein- 5 hydrolysat

Natriumchlorid 5 Cobaltchlorid 0,002

Cobaltchlorid 0,002 Calciumcarbonat 3 25 Calciumcarbonat 1 100 ml medium blev fordelt i 300 ml rystekolber og steriliseret ved 120 °C og 103 kPa i 30 minutter. Efter afkøling blev mediet inoculeret med en vegetativ celle-30 suspension skrabet af fra den ovennævnte Actinomadura sp. skråkultur. Kolberne blev rystet ved 28 °C på en ryster med en forskydning på 3,8-6,4 cm og 145-200 slag pr. minut i 5-7 dage.

35 I mellemtiden blev der forberedt 5 liter gæringsbeholdere indeholdende 3 liter af et at de ovennævnte C- eller JDYTT-medier eller det følgende medium: DK 171135 B1 18 UKi-2 g/i

Cerelose 45

Sojamel 10 5 Majsstivelse 10

Cobaltchlorid 0,002

Magnesiumcarbonat 3

Mangansulfat 0,10

Jern(III)-sulfat 0,10 10

Et antiskumningsmiddel (polypropylenglycol P2000 indeholdende 10 vægt-% ethylenoxid, 1 ml) blev tilsat, og beholderne blev lukket og steriliseret ved 120 °C og 103 kPa i 45 minutter. Beholderne blev derpå inoculeret med én rys-15 tekolbe (ca. 3% inoculum), gæret i 120-168 timer ved 30 °C under omrøring med 1700 omdr./ min med en beluft-ningshastighed på 1 volumen luft pr. volumenvæske pr. minut.

20 Efter at gæringen var fuldført (baseret på en antibioti-kumpladeprøvning overfor B. subtilis ATCC 6633), blev fermentorerne stoppet og indholdet filtreret ved den naturlige pH-værdi ved hjælp af diatoméjord. Filterkagen blev opslæmmet i methanol, koncentreret i vakuum, for-25 tyndet med 2-3 volumener vand og derpå ekstraheret 2 gange med 1/3-1/2 volumen af enten methylisobutylketon eller n-butanol. Opløsningsmiddellaget blev adskilt fra den vandige fase ved sugning eller centrifugering, filtreret til fuldstændig klarhed og koncentreret i vakuum til 30 opnåelse af den antibiotiske forbindelse med formlen (1) i rå form som en viskos olie.

Bioaktiviteten af væsken og efterfølgende udvindingsstrømme kan følges ved anvendelse af en følsom stamme af 35 Bacillus subtilis ATCC 6633 eller Staphylococcus aureus ATCC 6538. Komponenterne i væsken og udvindingsstrømmene kan visualiseres ved anvendelse af "Analtech silica gel DK 171135 B1 19 GF" plader med ethylacetat som elueringsmiddel. De udviklede plader sprøjtes med vanillinreagens (3 g vanillin 1 75 ml ethanol og 25 ml 85% phosphorsyre) og opvarmes til 80 °C. Det antibiotiske produkt med formlen (I) viser sig 5 som en purpurfarvet plet. Den udviklede tic-plade kan også overlejres med agar podet med enten S. aureus eller B. subtilis, hvortil der er blevet tilsat 2,3,5-triphe-nyl-2H-tetrazoliumchlorid-monohydrat, og inkuberes ved 37 °C i 16 timer for at visualisere den antibiotiske forbin-10 delse (hvide pletter mod en lyserød baggrund).

Opskalering i store gæringsbeholdere blev udført ved præparering af rystekolber indeholdende 0,7 liter C- eller JDYTT-medium. Rystekolbe-inoculumet blev gæret i 5-7 dage 15 ved 28 °C og anvendt til at inoculere en 200 eller en 6000 liters gæringsbeholder indeholdende henholdsvis 100 eller 4000 liter UK1-2 medium. Der blev anvendt tilnærmelsesvis 1 liter inoculum i hver tank. Efter at have foregået i 7-10 dage blev gæringerne høstet.

20

Helvæsken fra det mindre gæringsforløb blev ekstraheret med 50 liter methyl i sobu tylketon ved den naturlige pH-værdi. Den organiske ekstrakt blev koncentreret under vakuum på en cyklondestillator og roterende inddamper til 25 en olie. Denne olie blev kromatograferet 2 gange på 500 g silicagel af søjlekvalitet opslæmmet i hexan. Den første kolonne blev udviklet med ethylacetat, og den anden med 1:1 CHClg/acetone. Produktholdige fraktioner blev identificeret ved tic under anvendelse af den ovenfor beskrevne 30 metode. De aktive fraktioner fra den anden silicagel-kolonne blev endelig kromatograferet på florisil under anvendelse af CHClg/CHgOH 19:1 som elueringsmiddel. Produktfraktioner blev kombineret, rystet med fortyndet HgP04 og derpå med dibasisk-natriumphosphat-puffer til 35 dannelse af natriumsaltet, tørret over Na2S04, inddampet, og remanensen krystalliseret fra ether til isolering af natriumsaltet af forbindelsen med formlen (I), 915 mg; DK 171135 B1 20 smp. 245-249 °C, [«]β25 - 19,0° (c-1, CH3OH).

Analyse beregnet for C45H77®i4Na: C 62,47, H 8,97, 5 Fundet: C 62,89, H 9,22.

13 C-NMR [kemisk skift (ppm) i CDCl^ med antal hydrogenatomer 1 parenteser]: 182,8 (O), 110,0 (0), 106,0(0), 99,1 (1), 87,2 (1), 10 86,9 (0), 86,2 (1), 86,2 (0), 84,8 (1), 83,4 (0), 82.6 (1), 80,2 (1), 78,5 (1), 75,2 (1), 74,8 (1), 74.6 (1), 66,4 (1), 60,3 (3), 57,9 (3), 56,9 (3), 44,5 (1), 39,0 (1), 36,9 (1), 36,8 (2), 35,9 (2), 35.4 (2), 35,2 (2), 35,1 (1), 35,0 (1), 31,3 (2), 15 30,9 (2), 30,5 (1), 28,2 (3), 27,1 (2), 26,1 (2), 25,0 (3), 21,0 (3), 18,3 (3), 16,7 (3), 15,3 (3), 13.4 (3), 13,1 (3), 11,2 (3), 10,7 (3) og 10,6 (3).

Oparbejdning af helvæsken fra gæringen 1 den store tank 20 blev udført ved ekstraktion af de tilnærmelsesvis 4000 liter helvæske med 1800 liter methylisobutylketon, fra-skillelse af opløsningsmiddelfasen på en Podbielnack-ekstraktor og koncentrering af opløsningsmiddelfraktionen til en tynd sirup i vakuum. Koncentratet blev udrevet 2 25 gange med et lige så stort volumen rent methanol, metha-nolfraktionen blev adskilt fra den i methanol uopløselige olie, og methanolfraktionen koncentreret i vakuum til en sirup. Denne blev ekstraheret 2 gange med haxan, og de kombinerede hexanfraktioner ekstraheret med acetonitril.

30 Acetonltrilekstrakten blev gemt til fremtidig udvinding.

Hexanfraktionen blev derpå koncentreret i vakuum og derefter batch-kromatograferet på silicagel. Silicagelen blev desorberet på en filtertragt først med hexan, derpå med methylenchlorid, ethylacetat og endelig med acetone.

35 De aktive fraktioner, som var i C^Clj- og ethylacetat-eluaterne, blev koncentreret, opløst i hexan, som blev vasket med surt vand, og derpå ekstraheret med 1% N- DK 171135 B1 21 methyl-D-glucamin i vand. Den vandige fase blev udsaltet med natriumchlorid og ekstraheret 2 gange med et lige så stort volumen ethylacetat. De organiske lag blev kombineret, behandlet med aktivt kul, filtreret, vasket med pH 5 9,0 natriumphosphat-puffer, tørret over natriumsulfat, koncentreret i vakuum og krystalliseret fra ether, hvilket gav 50,8 g natriumsalt identisk med produktet fra gæringen i mindre målestok.

10 EKSEMPEL 2

Forbindelse (I) 1 form af den frie syre

Den frie syreform af den antibiotiske forbindelse med 15 formlen (I) blev fremstillet ved kraftig rystning af en chloroformopløsning af natriumsaltet med et lige så stort volumen fortyndet saltsyre med pH 2 1 en skillekstragt. Faserne blev adskilt, og chloroformlaget blev vasket med vand og derpå inddampet under vakuum, hvilket gav den 20 frie syre; smp. 87-90 °C, [e]D^5 -6,9° (c=l, methanol).

Analyse beregnet for C45H7g°i4 ’ 0,5^0: C 63,43, H 9,34,

Fundet: C 63,35, H 9,53.

25 EKSEMPEL 3

Natriumsaltet af forbindelsen (I) 30 Den frie syre fra det forudgående eksempel (45 mg) blev opløst 1 100 ml chloroform. Der tilsattes en opløsning af natriumcarbonat (0,5 g) i vand (100 ml), og den resulterende blanding blev derpå anbragt i en skilletragt og rystet kraftigt i flere minutter. Chloroformlaget blev 35 skilt fra, og det vandige lag vasket med frisk chloroform. De kombinerede chloroformekstrakter blev tørret over natriumsulfat, filtreret og inddampet, hvilket gav DK 171135 B1 22 41 mg af natriumsaltet; snip. 230-235 °C.

Analyse beregnet for C^H^O^Na: C 62,47, H 8,97, 5 Fundet: C 62,20, H 9,14.

EKSEMPEL 4

Rubidiumsaltet af forbindelsen (I) 10

Til fremstilling af rubidiumsaltet af forbindelsen med formlen (I) blev den frie syre (30 mg) opløst i 50 ml chloroform. Der sattes rubidiumcarbonat (35 mg i 25 ml vand) til chloroformopløsningen, og blandingen blev om-15 rørt i 2 timer. Den organiske fase blev skilt fra, og det vandige lag blev ekstraheret med et lige så stort volumen chloroform. De kombinerede chloroformekstrakter blev inddampet til et hvidt fast stof. Rubidiumsaltet blev omkrystalliseret ved langsom inddampning fra ether, og rønt-20 genstrukturen blev bestemt på de resulterende krystaller af Dr. J. Bordner.

EKSEMPEL 5 25 Kaliumsaltet af forbindelsen (I)

Til fremstilling af kaliumsaltet af den antibiotiske forbindelse med formlen (I) blev den frie syre (130 mg) opløst i 100 ml chloroform. Der tilsattes K2C03 (100 mg) 30 i 100 ml vand, og den resulterende blanding blev omrørt i flere minutter og derpå anbragt i en skilletragt og rystet kraftigt i flere minutter. Den organiske fase blev skilt fra og inddampet under vakuum, hvilket gav kaliumsaltet af forbindelsen (I) som et hvidt pulver; smp. 255-25 35 260 °C, [a] = 19,6° (c=l, chloroform).

DK 171135 B1 23

Analyse beregnet for C45H77°i4K; C 61,34, H 8,81,

Fundet: C 60,91, H 8,83.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Sur poly(cyclisk-ether)-forbindelse med formlen

5 OM« ( y-«· OM· V_o Me, ! >M. <T\ M· S* *0 Mei—N Me l—Η Ϊ—i —Me T T i 0 c Ο Γο 4. Ξ i H J u HO Me OH Me Me HH (I) 15 hvori Me=CHg, og farmaceutisk acceptable salte deraf med baser.

2. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at de er natrium- og kaliumsalte.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Actinomadura sp. ATCC 53708 gæres under neddykkede aerobe betingelser i et 25 vandigt næringsmedium omfattende en assimilerbar kilde til carbon og nitrogen, indtil der er dannet en udvindelig mængde af forbindelsen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 30 ved, at forbindelsen separeres fra gæringsmediet eller udvindes i udfældet form som en blanding med mycelium ved filtrering af gæringsmediet. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 35 ved, at forbindelsen udvindes i rå form ved sprøjte eller frysetørring af hele gæringsmediet. DK 171135 B1

6. Foderblanding til kvæg eller svin, kendetegnet ved, at den indeholder en forbindelse ifølge krav 1 i en mængde, som er effektiv til forhindring eller behandling af dysenteri hos svin eller til fremme af kvæ- 5 gets eller svinenes vækst og/eller forbedring af deres foderudnyttelse.

7. Fremgangsmåde til fremme af vækst og/eller forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos svin eller kvæg, 10 kendetegnet ved, at svinene eller kvæget indgives en vækstfremmende eller foderudnyttelseseffektivitetfremmende mængde af en forbindelse ifølge krav 1 i form af en foderblanding.

8. Foderblanding til fjerkræ, kendetegnet ved, at den indeholder en forbindelse ifølge krav 1 i en mængde, som er effektiv til at bekæmpe coccidieinfektioner hos fjerkræet.

9. Biologisk ren kultur af Actinomadura sp. ATCC 53708 til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 3-5.

10. Kultur ifølge krav 9, kendetegnet ved, at 25 den er i frysetørret form. 1 35