NO164422B - Fremgangsmaate for fremstilling av en sur polycyklisk etermed antibiotisk virkning. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotisk stoff, betegnet CP-63 517 som ble isolert ved fermentering av en ny stamme av arten Streptomyces isolert fra en jordprøve samlet i Okayama Prefecture, Japan

og gitt kodenummeret N497-34. Strukturelt er det nye antibiotikum fremstilt ifølge denne oppfinnelsen et nytt medlem av de sure polycykliske eter-antibiotika (ionofore). Denne familien av antibiotika omfatter dianemycin [J. Antibiotics, 22, 161

(1969)] og ibid., 33, 137 (1980); monensin [J. Amer. Chem.soc,

89,5737 (1967)]; salinomycin [J. Antibiotics, 27, 814 (1974)]; Antibiotic TM-531 omtalt i US-patent nr. 4 269 971 og Antibiotic 53.607 omtalt i US-patent nr. 4 361 649.

Oppfinnelsen gir en fremgangsmåte for fremstilling av en ny sur polycyklisk eter med antibiotisk virkning, betegnet CP-63.517 som har den kjemiske formel:

og farmasøytisk godtagbare kationsalter derav, som er aktive overfor en rekke mikroorganismer og er effektive når det gjelder å kontrollere coccidiose,enteritis, svinedysenteri og theilerio-se, samt er effektive når det gjelder å øke veksten hos svin og drøvtyggere og frembringe øket effektivitet av forutnyttelse hos svin og kveg.

CP-63.517 har blitt isolert ved dyrkning a<y> en ny stamme som er isolert fra en jordprøve samlet i Okayama Prefecture, Japan. Den nevnte stamme fikk betegnelsen N497-34 og er blitt identifisert som en ny stamme av Streptomyces endus, subsp. aureus. ■ Den er nå oppbevart hos American Type Culture Cellec-tion under tilvekstnummer 39574.

Effektiviteten av forutnyttelse hos svin og kveg kan økes ved hjelp av antibiotikumet med formel (I) eller et farmasøytisk godtagbart salt derav. En forbedret næringsmiddelsammensetning for kveg eller svin omfatter nevnte antibiotikum eller dets salter. Antibiotikumet CP-63.517 eller et farmasøytisk godtagbart salt derav fremstilles ved å dyrke nevnte nye stamme av Streptomyces endus subsp. aureus i et vandig kulturmedium

som inneholder en assimilerbar kilde av karbon, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede aerobe fermenterings-betingelser, ved en temperatur fra 24 til 36°C.

En biologisk ren kultur av den nevnte nye stamme av arten Streptomyces endus subsp. aureus, ATCC-39574 brukes hensikts-messig.

Den antibiotiske substans fremstilles ved fermentering av en stamme betegnet N497-34, som ble isolert fra en jordprøve samlet i Okayama Prefecture, Japan. Kultur N497-34 ble karakterisert og identifisert av Liang H. Huang, Phd., Central Research, Pfizer Inc., Groton, Connecticut, USA, som beskrevet her nedenfor .

Ved undersøkelse ble kultur N497-34 gjenkjent som et Streptomyces-spesie på grunn av den smale dimensjon av hyfene, dannelse av luftmycelium og sporer dannet i kjeder på luft-myceliet.

Kultur N497-34 ble sådd ut fra en skråkultur i ATCC nr.

172 næringssubstrat og dyrket i fire dager ved 28°C på en rystemaskin. Den ble deretter sentrifugert i 20 minutter, vasket tre ganger med sterilt destillert vann og sådd ut på medier vanlig brukt for å identifisere medlemmer av Actinomycetales.

Kulturen ble inkubert ved 28°C, og resultatene avlest på forskjellige tidspunkter, men mest vanlig ble de tatt etter 14 dager. Farvene ble beskrevet i vanlig terminologi, men eksakte farver ble bestemt ved sammenligning med farveprøver fra Color Harmony Manual, fjerde utgave. Fremgangsmåtene med aminosyre-og sukker-analyse av hele celler er de som er beskrevet i Becker et al., Appl. Microbiol., 12, 421-423 (1964); og Lechevalier, J.Lab.Clin. Med., 71, 934-944 (1968). Til sammenligningsformål ble Streptomyces endus subsp. aureus NRRL 12174 skaffet fra Northern Region Research Center' (NRRC), U.S.D.A., Peoria, Illinois.

Identifikasjonsmedia brukt til karakterisering av kulturen og referanser for deres sammensetning, er som følger: 1. Tryptone-Yeast Extract Broth - (ISP nr. 1 medium, Difco) . 2. Yeast Extract-Malt Extract Agar - (ISP nr. 2, medium, Difco) .

3. Oatmeal Agar - (ISP nr. 3 medium, Difco) .

4. Inorganic Salts-Starch Agar - (ISP nr. 4 medium, Difco) . 5. Glycerol-Asparagine Agar - (ISP nr. 5 medium, Difco). 6. Peptone-Yeast Extract Iron Agar - (ISP nr. 6, medium, Difco) . 7. Czapek-Sucrose Agar - S. A. Waksman, The Actinomycetes, vol. 2, medium nr. 1, s. 328, 1961. 8. Glucose-Asparagine Agar - samme sted, medium nr. 2, s. 328. 9. Bennett's Agar - samme sted, medium nr. 30, s. 331. 10. Emerson's Agar - samme sted, medium nr. 28, s. 331. 11. Nutrient Agar - samme sted, medium nr. 14, s. 330. 12. Gordon and Smith's Tyrosine Agar - R. E. Gordon og M. M. Smith, J. Bact., 69, 147-150 (1955).

13. Casein Agar - samme sted.

14. Calcium Malate Agar - S. A. Waksman, Bact.

Rev., 21, 1-29 (1957) . 15. Gelatin - R. E. Gordon og J- M, Mihm, J. Bact., 73, 15-27 (1957).

16. Starch - samme sted.

17. Organic Nitrate Broth - samme sted.

13. Dextrose Nitrate Broth - S. A. Waksman, The Actinomycetes, vol. 2, medium nr. 1, s. 328, 1961, med 3 g dekstrose istedenfor 30 g sukrose og uten agar. 19. Potato Carrot Agar - M. P. Lechevalier, J. Lab. and Clinical Med., 71, 934-944 (1968), men bruk bare 30 g poteter, 2,5 g gulerøtter og 20 g agar.

20. 2 % Tap Water Agar.

21. Skirn Milk - Difco.

22. Cellulose-utnyttelse -

a) H. L. Jensen, Proe. Linn. Soc. N.S'.W., 55, 231-248 (1930).

b) M. Lavine og H. W. Schoenlein, A. Compilation

of Culture media, medium nr. 2511, 1930.

23. Karbohydrater - ISP nr. 9 medium, Difco.

24. Temperaturområde - ISP nr. 2 medium pluss 50 ml kokosnøttmelk pr. liter av mediet.

Kultur N497-34 viste de følgende karakteristika med farver og hel-celle aminosyre- og sukkeranalyser bestemt ifølge de ovenfor nevnte fremgangsmåter.

Yeast Extract- Malt Extract Agar - Vekst god, hvit, blekt gul til blekt rosa-grå (lea, 1 l/2ca. "near gray" serie 3dc, 5dc, 5fe), opphøyet rynket, luftmycelium samme som overflaten; bakside brun (2pg, 3ne); oppløselig pigment gulaktig brunt (21c,3nc) .

Oatmeal Agar - Vekst moderat til god, "offwhite", grå til rosa-grå ("near gray" serie 3fe, 5fe, 7fe, 7ih), svakt opphøyet, glatt, fløyelsaktig, luftmycelium samme som overflaten; baksiden blekt gul (2ca) til grå ("near gray" serie 3dc, 3fe); opplø-selig pigment blekt gulaktig til gulaktig (1 l/2ea, 1 1/2 ga).

Inorganic Salts- Starch Agar - Vekst moderat til god, hvit-aktig gul til rosa-grå (1 l/2ca, "near gra:y" serie lba, 5fe, 7fe, 7ih), opphøyet rynket, luftmycel samme som overflaten; bakside gulaktig til rosa-grå (1 l/2ga, "near graiy" serie 5fe) ; oppløselig pigment gulaktig (1 l/2ga, 1 l/2ea) .

Glycerol- Asparagin' Agar - Vekst dårlig til moderat, "off-white" ("near gray" serie 2ba), tynn glatt, eller fremstår som isolerte kolonier, luftmycelium "offwhite"; bakside farve-løs til blekt gulaktig (1 l/2ca); intet oppløselig pigment.

Czapek- Sucrose Agar - Vekst moderat, blekt "offwhite"

("near" 1 l/2ca, "near gray" serie 2cb), tynn glatt, med sirku-lære eller buede linjer, intet luftmycelium; bakside kremfarvet (1 l/2ca).

Glucose- Asparagin Agar - Vekst god, grå, rosa-grå ("near gray" serie 3fe, 5fe) til gulaktig (lea, lga), moderat opphøyet, rynket eller granulert, luftmycelium samme som overflaten; bakside gulaktig grå til grå (2gc,2ge, "near gray" serie 3fe,

3ih); oppløselig pigment gulaktig (1 l/2ia, 1 l/21a).

Gordon and Smith' s Tyrosine Agar - Vekst moderat, "off-white" ("near gray" serie 2ba), moderat opphøyet, rynket eller fremstår som isolerte kolonier, luftmycelium "offwhite";

bakside blekt gul (1 l/2ca, 1 l/2ea); oppløselig pigment blekt gult (2ea) .

Calcium Malate Agar - Vekst moderat, hvit til "offwhite"

("near gray" serie lba), tynn, glatt eller fremstår som isolerte kolonier; luftmycelium sparsomt, hvitt til "offwhite", bakside kremfarvet (1 l/2ca); oppløselig pigment kremfarvet (1 l/2ca).

Casei n Agar - Vekst god, hvit til blekt gråaktig kremfarvet ("near" 2ec, 3ec), moderat opphøyet, fint rynket, intet luftmycelium, bakside blekt lavendelfarvet (3ec); oppløselig pigment blekt lavendelfarvet (4ec).

Bennett' s Agar - Vekst god, hvit, blekt gul til rosa-grå

(lea, "near gray" serie 5fe, 7fe, 7ih), opphøyet, rynket, luftmycelium samme som overflaten; baksiden lavendelgrå (4ig, 41i, 5ig, 51i); op<p>løselig pigment gulaktig (1 l/2na).

Emerson Agar - Vekst god, hvit til "offwhite", opphøyet, rynket, eller fremstår som isolerte kolonier, med hvitt til "offwhite" luftmycelium; bakside gulaktig brun (2ea, 21c); oppløselig pigment brunt (31c).

Nutrient Agar - Vekst moderat, hvic, rynket, opphøyet eller fremstår som isolerte kolonier, luftmycelium hvitt; bakside kremfarvet (1 l/2ca); intet oppløselig pigment.

Gelatin Agar - Vekst god, hvit til kremfarvet (1 l/2ca) , moderat opphøyet, rynket, luftmycelium hvitt, bakside kremfarvet (2ca); intet oppløselig pigment.

Starch Agar - Vekst god, hvit, opphøyet, rynket, luftmycelium hvitt, bakside blekt gul til gulaktig brun (2ea,21c); opp-løselig pigment kremfarvet (2ca).

Potato Carrot Agar - Vekst moderat, grå til rosa-grå ("near gray" serie 3fe, 5fe, 7fe, 7ih), fløyelsaktig, opphøyet i sent-rum men tynn mot kantene, glatt, luftmycelium samme som overflaten; baksiden rosa-grå ("near gray" serie 5fe, 5ih); oppløselig pigment kremfarvet (1 l/2ca).

Tap Water Agar - Vekst moderat til god, grå til rosa-grå

("near gray" serie 3fe, 5fe, 5ih); fremgår som forhøyde,

isolerte fløyelsaktige kolonier; luftmycelium grått til rosa-• grått; bakside grå til mørk grå ("near gray" serie 5ih, 3ih, 3ml); intet oppløselig pigment.

Morfologiske egenskaper - De morfologiske egenskaper ble observert på havremelsagar etter 14 dagers inkubering; spore-massen i "Gray color series", sporoforene monopodisk forgrenet, sporekjeder spiralformet, av liten diameter (3 til 4 nm), svakt åpen, 3 til 7 vindinger pr. sporekjede, 10 til 50 sporer pr. sporekjede; sporene korte stavformede, noen ganger kulefor-met, ovale eller elliptiske, rette eller svakt buet, og noen av de svakt buede har ikke-parallelle ender og synes således å være femvinklet, 1,0-1,8 x 0,9-1,2 pm eller 0,9-1,2 pm i diameter;

vorteaktige, som vist ved avsøkende elektronmikroskopi.

Biokjemiske egenskape- r - Melanin produseres ikke; hydrogen-sulfid produseres; gelatin gjøres flytende; stivelse hydrolyse-res; nitrat reduseres til nitritt; god vekst på Levine og Schoenleins cellulose-næringssubstans, men dårlig vekst på Jensens celiulose-næringssubstans; ingen dekomponering på noen av cellulose-næringssubstansene; koagulering og klaring på melk, kasein-fordøyelse positiv; kalsiummaleat-fordøyelse positiv; tyrosin-fordøyelse negativ. Karbonhydratutnyttelse; glykose, arabinose, fruktose, inositol, mannitol, raffinose, rhamnose, sukrose og xylose ble alle utnyttet.

Ved cellevegg-analyser av kultur N497-34 ble det funnet

at hydrolysater av hele celler inneholdt LL-diaminopimelinsyre men ingen karakteristiske sukkerarter. Kultur N497-34 karakte-riseres ved grå farve på sporemasser, negativ melaninreaksjon, sporekjeder i spiralform og sporer med vorteaktig overflate. Disse trekk og resultatene av analyser av hele celler plasserer kulturen i slekten Streptomyces. Når den sammenlignes med be-skrivelser av kjente spesier av Streptomyces rapportert i litte-raturen, ligner den meget på S. endus Anderson & Gottlieb subsp. aureus Tomita, Nakano, Sato, Shirahata, Yoshida & Morimoto NRRL 12174, som beskrevet i Japan Kokai Tokkyo Koho, 57-4975, publisert 11. januar 1982. Denne siste ble innhentet

fra NRRL og ble sammenlignet side om side med N497-34. Bort-sett fra det faktum at N497-34 men ikke NRRL 12174, vokser ved 45°C og koagulerer melk, deler begge kulturer de samme biokjemiske og fysiologiske egenskaper. På ISP nr. 2-medium, ISP nr. 4-medium og Bennetts agar produserer kultur N497-34 mer rosa-grått luftmycel uten gult exudat, dens kolonier på ISP nr. 5-medium og "nutrient-agar" er mindre, dens kolonier på Czapek-sukrose viser kremfarvede linjer eller sirkler; dens kolonier på glukose-asparagin er rosa-grå istedenfor hvite til kremfarvede, og danner gult istedenfor intet oppløselig pigment. Disse variasjoner mellom kulturene er mindre og kan forekomme mellom forskjellige stammer av Streptomyces. Kulturen N497-34 betrak-tes derfor som en ny stamme av Streptomyces endus Andersen & Gottlieb subsp. aureus Tomita, Nakano, Sato, Shirahata,

Yoshida & Morimoto. Den er deponert hos American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, , USA under vilkårene i Budapest-traktaten av 10. januar 1984, under tilvekstnummer ATCC-39574. Stabiliteten til den oppbe-varte kultur N497-34 ved American Type Culture Collection er ga-rantert gjennom hele det effektive liv av ethvert patent gitt på grunnlag av denne anmeldelse; adgang til kulturen N497-34 er mulig i løpet av ventetiden på denne patentsøknaden, for én bestemt av Commissioner of Patents and Trademarks å være beret-tiget dertil under .35 USC 122 og 37 CFR 1.14; og alle restrik-sjoner på tilgjengeligheten til den' deponerte kultur vil bli ugjenkallelig fjernet når det gis et patent i henhold til an-meldelsen .

Den nye antibiotiske substans fremkommer ved fermentering av den nye stamme av Streptomyces endus subsp. aureus, ATCC-39574 og ekstrahering av hele næringsoppløsningen ved naturlig pH med metylisobutylketon og konsentrering av oppløsningen til en viskøs olje. Oljen ble suspendert i heptan og behandlet i porsjoner med silikagel. Silikagelkaken ble utvasket med kloroform, kloroform/etylacetat, etylacetat og etylacetat/aceton. Etter konsentrering ga etylacetatfraksjonen en mindre mengde urent produkt og fra denne ble Antibiotic CP-63.517 utkrystalli-sert som det blandede natrium/kalium-salt.

Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-3 9574 kan dyrkes ved én temperatur fra 24 til 36°C i neddykket tilstand under rysting og lufting, på medier som består av karbohydratkilder såsom sukkerarter, stivelser, glycerol; organiske nitrogen-substanser såsom soyabønne-me1, kasaminosyrer, gjærekstrakt; vekstsubstanser såsom de oppløselige stoffer i korn, fiskemel, bomullsfrømel; mineralsalter som inneholder sporelementer såsom jern-, kobolt-, kobber-, sink- og kalsium-karbonat eller -fosfa-ter som bufferstoffer. Antibiotikumet kan samles opp ved å ekstrahere hele næringssubstansen med forskjellige organiske oppløsningsmidler, f.eks. n-butanol, metylisobutylketon eller kloroform, ved pH innen området fra 4,0 til 8,0, eller å skille mycelet fra etter at veksten er avsluttet og ekstrahere mycelet; filtratet kastes. Ekstrakten konsentreres til en tynn sirup, løses opp i heptan, f.eks. , og kromatograferes på silikagel for å få den rene forbindelsen.

Inokulum fremstilles ved å skrape vegetative celler fra skråkulturer eller Roux-kolber inokulert med ATCC-39574-kultur. Et fast medium egnet til startvekst på skråkultur og Roux-kolber er ATCC-medium nr. 172.

♦Registrert handelsnavn for enzymatisk oppløsning av kasein, Humko Sheffield Chemical■Co., Inc.

Vegetative celler fra skråkulturer brukes til å inokulere enten rystekolber eller inokulumtanker; eller alternativt inokuleres inokulumtankene fra rystekolbene. I rystekolbene vil veksten vanligvis ha nådd sitt maksimum på 96 til 120 timer mens veksten i inokulumtankene vanligvis vil være i den mest gunsti-ge fase på 72 til 96 timer. En fermentor inokuleres med vegetativ næringssubstans fra inokulumkolben eller -tanken under

fullstendig aseptiske forhold og fermenteres i et tidsrom på

48 til 120 timer. Lufting foregår i rystekolben ved rysting på en rystemaskin eller i tankene ved at steril luft presses gjennom en spreder med en hastighet på 1/2 til 2 volum luft pr. volum næringssubstans pr. minutt. Rystehastigheten (nøringen) avhenger av typen røremaskin som benyttes, en rystekolbe kjøres gjerne med 150 til 200 cykler pr. minutt (CPM) og en fermentor med 300 til 1700 omdreininger pr. minutt(RPM). Sterilitet må til enhver tid opprettholdes. Temperaturen reguleres mellom 28 og 36°C. Skumming under fermenteringen kan kontrolleres ved sterile antiskummidler, f.eks. raffinert soyabønneolje eller andre passende antiskummidler som tilsettes til sammensetningen eller til fermentoren aseptisk etter behov etter inokuleringen.

Vann til 1 liter pH .6,9-7,0

♦Registrert handelsnavn for enzymatisk oppløsning av kasein, Humko Sheffield Co., Inc.

100 ml medium fordeles i 300 ml rystekolber og sterilise-res ved 120°C og 1,07 kg/cm<2> i 30 minutter. Etter avkjøling inokuleres mediet med en vegetativ cellesuspensjon fra S.endus subsp. aureus-skråkulturen ATCC-39574 som er dyrket på ATCC 172-medium i agar. Kolbene rystes ved 28°C på en roterende ryste-

maskin som har en forskyvning på 3,C-5,1 cm (1,5 til 2,5 inches) og 150 til 200CPM i 3-4 dager. En kolbe brukes til å inokulere et 5-liters fermenteringskar som inneholder 3 liter av ett av.de følgende media: CN-2 (nedenfor) eller CL13MZ eller JDY TT (over).

1 ml av et antiskummiddel ble tilsatt, deretter ble karet lukket og sterilisert ved 120°C og 1,07 kg pr. cm<2> (15 psi) i 4 5 minutter. Karene ble inokulert med én (omtrent 3 % inokulum) kolbe, fermentert i 96 til 144 timer ved 30°C, rørt ved 1700 RPM med en lufthastighet på ett volum luft pr. volum væs-ke pr. minutt.

Da fermenteringen var fullført (basert på en antibiotisk skål-analyse mot B. subtilis ATCC 6633), ble fermentorene stop-pet, filtrert ved naturlig pH med hjelp av et filtreringshjel-pemiddel, for eksempel Celite. Filterkaken ble slemmet opp i metanol, konsentrert i vakuum, fortynnet med 2-3 volum vann, deretter ekstrahert to ganger med 1/3 til 1/2 volum oppløsnings-middel som ikke er blandbart med vann, såsom metylisobutylketon eller n-butanol. Laget med oppløsningsmiddel ble skilt fra vannfasen ved oppsuging eller sentrifugering, filtrert, og filtratet konsentrert i vakuum til en viskøs olje.

Bioaktiviteten i næringsoppløsningen og påfølgende frem-stillingsstadier kan følges ved å bruke en følsom stamme av Bacillus subtilis ATCC 6633 eller Staphylococcus aureus ATCC 6538. Komponentene i næringsoppløsningen og fremstillings-stadier kan visualiseres ved tynnskikt-kromatografering (tic) med bruk av silikagel-plater<*> i ren etylacetat. De utviklede plater sprayes med vanillinreagens (3 g vanillin i 75 ml etanol) og 25 ml 85 % fosforsyre) og varmes til 80°C. Antibiotikumet CP-63.517 fremstår som en grønnaktig flekk. Den utviklede tlc-plate kan også overtrekkes med agar tilsådd med enten S. aureus eller eller B. subtilis hvortil tetrazolium-farve-stoff<**> er tilsatt, og inkuberes ved 37°C i 16 timer for å vi-sualisere antibiotikumet (hvitt mot rosa bakgrunn).

<*> Silica gel G (70-230M ASTM) E. Merck

<**> 2,3,5 Triphenyl-2H tetrazolium chloride monohydrate, 98% Aldrich Chemical Co., Inc. T-8485-9.

Oppskalering i store fermentorer ble utført ved å lage i stand rystekolber som inneholdt 0,7 liter CL13MZ- eller JDY TT-medium . Inokulumet i rystekolbene ble fermentert i 3 til 5 dager ved 28°C og brukt til å inokulere en 190 eller 6540 liters (50 eller 1700 gallons)fermentor som inneholdt 96 eller 4600 liter (25 eller 1200 gallons)av JDY TT-medium. Omtrent én liter inokulum ble brukt i tanken. Etter fermentering i 5 til 7 dager, ble fermentoren høstet og ga omkring 96 eller 4230 liter (25 eller 1100 gallons) respektivt. Hele næringsoppløsningen ble ekstrahert med 1/5 volum metylisobutylketon ved naturlig pH, separert i en Alpha DeLaval-separator eller en Podbielniak-ekstraktor og oppløsningen ble konsentrert i vakuum til en ol-je. Oljen ble videre konsentrert til en sirup, som ble suspendert i heptan, rørt med silikagel, filtrert gjennom et lag silikagel og vasket gjentatte ganger med heptan. Antibiotikumet ble trinnvis vasket ut med kloroform, !<ioroform/etylacetat, etylacetat og til slutt 50 % aceton i etylacetat. Utvaskingen ble fulgt med tynnskiktkromatografi og bioanalyse av fraksjonene. De aktive deler ble forent, konsentrert og kromatografert omigjen for å isolere antibiotikumet CP-63.517. Ved å sende de aktive eluater gjennom en kolonne med granulert karbon, fjernes forstyrrende materialer og gjenvinningen forbedres slik at krystallinsk CP-63.517 fremkom.

Den antibiotiske forbindelse fremstilt i henhold til denne oppfinnelsen, med formel (I), er sur og den vil danne kationsalter ved reaksjon med basiske reagenser. Alle slike salter er innenfor denne oppfinnelsens område. Disse saltene fremstilles ved vanlige fremgangsmåter for polyeter- (ionofore) antibiotika. I én fremgangsmåte vaskes en oppløsning av forbindelsen med formel (I) i et flyktig organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, med en vandig oppløsning som inneholder minst én støkiometrisk ekvivalent, og fortrinnsvis et stort overskudd, av et passende basisk reagens. Etter tørring av oppløsningen i det organiske oppløsningsmidlet dampes den inn i vakuum og gir det ønskede kationsaltet. Typiske basiske reagenser som kan benyttes til dette formål, omfatter alkalimetall-hydroksyder såsom natriumhydroksyd og kaliumhydroksyd, jordal-kalimetallhydroksyder, såsom kalsiumhydroksyd og bariumhydrok-syd og ammoniumhydroksyd.

Antibiotikum CP-63,517 viser hemmende virkning på veksten til en rekke Gram-positive mikroorganismer.. I tabell I nedenfor er resultatene av in vitro-MIC-undersøkelser oppsummert.

Til disse undersøkelsene inokuleres hver organisme i en serie prøverør med CP-63.517 for å bestemme den minste konsentrasjon av antibiotikumet i mcg/ml som hemmer veksten av organismen i en periode på 24 timer (MIC).

Svinedysenteri er en av de mest vanlige svinesykdommer som er diagnostisert i De Forente S'_ater. I tillegg er sykdommen alminnelig utbredt i mange andre land og forårsaker årlig tap for mange tusen dollar i besetningen til svineoppdrettere omkring i verden. Det er nylig oppdaget at en stor spirochet er organismen som forårsaker sykdommen. Denne organismen, Treponema hyodysenteriae, er nå isolert og er vist å være i stand til å forårsake sykdommen [D. L. Harris et al.: "Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet-. Med./SAC, 67: 61-64,. 1972]. Testdata som er referert her senere, angår undersøkelser som er utført med denne organismen. Det må be-merkes at det ikke er kjent hvor vidt T. hyodysenteriae er den eneste forårsakende organisme når det gjelder svinedysenteri. Fra tilgjengelige data, imidlertid, kan det sluttes at den er

en primær kilde til infeksjonen.

Den velkjente protozoiske lidelse, coccidiose, fortsetter

å være et alvorlig problem og kontroll av denne er av økonomisk betydning for veterinærvidenskapen, særlig for fjærfe-industri-en. Coccidiose skyldes infeksjon med en eller flere arter av Eimeria eller Isospora (for en oversikt, se Lund og Farr i "Diseases of Poultry", 5. 'utgave, Biester and Schwartz, Eds., Iowa State University Press, Ames, Ia., 1965, s. 1056-1096).

Det er seks arter av coccidier som frembringer lett påviselig dødelighet hos mottagelige kyllinger. Eimeria tenella, E.neca-trix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima og E. mivati gjør skade enten direkte gjennom destruksjon av epitelcellene i for-døyelseskanalen eller indirekte gjennom dannelse av toksiner.

Tre andre arter av protozoer som tilhører samme slekt, betrak-tes som relativt uskadelige; imidlertid er E.mitis, E. hagani og E. praecox i stand til å redusere vektøkningen, senke for-ingseffekten og virke negativt inn på eggproduksjonen.

Antibiotikum CP-63.517 og dets kationsalter viser utmerket virkning mot coccidioseinfeksjoner hos fjærfe. Når det er inklu-dert i kyllingenes diett i nivåer på 5 til 40 ppm, er disse for-bindelsene effektive når det gjelder å kontrollere infeksjoner som skyldes Eimeria tenella og E. acervulina.

Virkningsdata for Antibiotic CP-6 3.517 og dets salter mot coccidieinfeksjoner hos kyllinger ble oppnådd på følgende måte: Grupper på 3-5 ti dager gamle SPF hvite italiener-hanekyllinger ble foret med en maskdiett som inneholdt Antibiotic CP-63.517, dets natrium- og/eller kalium-salt, eller de kjente medikamen-ter Monensin eller Stenorol, jevnt fordelt deri. Etter å ha vært på denne kosten i 24 timer ble hver kylling inokulert gjennom munnen med cocyster av den spesielle Eimeria-art som skulle undersøkes. Andre grupper på 3-5 ti dager gamle kyllinger ble gitt tilsvarende maskdiett fri for testforbindelse. Disse ble også infisert etter 24 timer og tjente som infiserte kontroller. Nok en gruppe på 3-5 ti dager gamle kyllinger fikk maskdiett

fri for noen testforbindelse og ble ikke infisert med coccidier. Disse tjente som normale kontroller. Resultatet av behandlinge-ne ble vurdert etter 5 dager når det gjaldt E. acervulina, og 6 dager for andre smitte-påkjenninger.

Tabell II oppsummerer resultatene som ble oppnådd.

Tabell II ( forts■) :

<*>Tallene i parentes er gjentatte resultater;

Monensin, se f.eks. US-patentskrift 3 501 563 ; J. Amer. Soc . , 89 , 5737 (1967); Stenorol (Halofuginone) , se f.eks. US-patentskrift 3 320 124.

''"Kriteriene som er brukt for å måle anticoccidiell virkning besto av skadepoeng fra 0 til 4 for Eimeria tenella ifølge J. E. Lynch, "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res. 22: 324-325 (1961); og 0 til 3 for de andre arter basert på en modifikasjon av poengsystemet som'er utviklet av J. Johnson og W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Technique in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit, 28: 30-36

(1970). Et konstant forhold ble oppnådd ved å dividere skadepoengene fra hver behandlet gruppe med skadepoengene for den infiserte kontroll.

Som vist ved data i Tabell I, har den nye antibiotiske substans fremstilt i henhold til denne oppfinnelsen antibakte-riell virkning overfor en rekke Gram-positive bakterier, såsom Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis og Streptococcus pyogenes. Dette gjør forbindelsen med formel (I) og dens salter anvendelige til sanitære formål, såsom håndvask og sterili-sering av overflater og utstyr på sykehus.

Antibiotikumet med formel (I) og de farmasøytisk godtagbare basesalter derav, øker effekten av forutnyttelsen hos svin og drøvtyggere, dvs. de virker som vekstfremskyndere. Mekanismen for utnyttelse av den hovedsaklige del av næringen (karbohydrater) i drøvtyggerfor er vel kjent. Mikroorganismer i dyrets vom degraderer karbonhydrater og danner monosakkari-der og deretter overføres disse monosakkaridene til pyrovat-forbindelser. Pyrovatene metaboliseres ved mikrobiologiske prosesser og danner acetater, butyrater eller propionater, kollektivt kjent som flyktige fettsyrer (VFA). For en mer de-taljert drøftelse, se Leng i "Physiology of Digestion and Meta-bolism in the Ruminant", Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 19 70, s.408-410. Den relative grad av VFA-utnyttelsen er drøftet av McCullough i "Feddstuffs", 10. juni 1971, side 19; Eskeland et al. i J.An.Sei., 33, 282

(1971); og Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol.2, 1971, s.622 og 625. Selv om acetatene og butyratene utnyttes, utnyttes propionatene med større effekt. En gunstig forbindelse stimulerer derfor dyrene .til å produsere en større andel av propionater ut fra karbonhydrater, og øker derved graden av karbonhydratutnyttelse. Verdien av dyrefor generelt er blitt bestemt direkte ved å fore dyrene. Britisk patent nr. 1 197 826 beskriver i detalj en in vitro-teknikk for drøvtyggere, hvorved forandringer som skjer i foret på grunn av mikroorganismen, måles mer hurtig og med større nøyaktighet ved vurdering av dyrefor. Denne teknik-ken omfatter bruken av et apparat hvori dyrenes fordøyelsespro-sesser foregår og undersøkes in vitro. Dyreforene, inokulum til vomen og forskjellige vekstfremmende stoffer introduseres i og tas ut fra en laboratorieenhet under omhyggelig kontroller-te betingelser, og forandringene som finner sted, undersøkes kritisk og progressivt i løpet av fordøyelsen av foret ved mik-roorganismene. En økning i propionsyreinnholdet i vom-væsken indikerer at en ønsket reaksjon i den totale drøvtygging har skjedd på grunn av det vekstfremmende stoff i forsammensetnin-ger. Endringen i propionsyreinnhold uttrykkes som prosent av propionsyreinnholdet som er funnet i vomvæsken i kontrollen. Langsiktige in vivo foringsundersøkelser er brukt for å vise en pålitelig korrelasjon mellom propionsyreøkning i vomvæsken og øket ytelse hos dyrene. Vomvæsken samles fra en kalv med innsatt rør, som fores med et handelsfor for oppfeting pluss høy. Vomvæsken filtreres umiddelbart gjennom osteklede, og 10 ml tilsettes til en 50 ml konisk kolbe som inneholder 400 mg standardsubstrat (68 % maisstivelse + 17% cellulose + 15% ekstrahert soyabønnemel), 10 ml av en buffer pH 6,8 og testforbindelsen. Kolbene gasses med oksygenfritt nitrogen i omkring 2 minutter, og inkuberes i et vannbad med rysting ved 39°C i omkring 16 timer. Alle tes-ter utføres i tre eksemplarer. Etter inkubering blandes 5 ml av prøven med 1 ml 25% meta-fosforsyre. Etter 10 minutter tilsettes 0,25 ml maursyre og blandingen sentrifugeres ved 1500 RPM i 10 minutter. Prøvene analyseres - deretter ved gass-væskekromatografi ifølge fremgangsmåten til D. W. Kellog, J. Dairy Science, 52, 1600 (1969). Høyden på toppene for eddik-, propion- og smørsyre bestemmes for prøver fra ubehandlede og behandlede inkuberte kolber. Når det ble undersøkt ved denne in vitro-fremgangsmåten, var Antibiotic CP-6 3.517 i nivåer på 20 og 10 mikrogram pr. milliliter årsak til økninger på 96% og 95% henholdsvis, i dan-nelsen av propionsyre i forhold til produktet i kontrolloppløs-ningen uten tilsatt Antibiotic CF-63.517. Ved sammenligning frembragte det kommersielt tilgjengelige Monensin (et annet polycyklisk eter-antibiotikum) ved 10 ug/ml en økning på rundt 20 % propionsyre i forhold til kontrollen [J.Amer.Chem.Soc.,

89, 5737 (1967)].

Sammenlignet med Salinomycin [J.Antibiotics, 27; 814 (1974)] frembragte Antibiotic CP-6 3,517 omtrent 86% økning i propionsyre ved et nivå på 20 ug/ml og rundt 66% økning ved 5 ng/ml sammenlignet med økningen på rundt 6 5% for Salinomycin ved 10 ng/ml.

Basert på disse data kan det forutsies at Antibiotic CP-63.517 vil forbedre forutnyttelsen hos drøvtyggere såsom kveg og sauer og hos dyr med én mage, såsom svin og kaniner. Antibiotic CP-63.517 kan blandes inn i forsammensetningene som den frie syre, natriumsalt, kaliumsalt eller blandinger derav. Urensede former av Antibiotic CP-63.517 eller tørret fermente-ringsoppløsning som inneholder antibiotikumet, kan blandes inn i forsammensetningene i de ønskede styrkekonsentrasjoner.

Det følgende eksempel er gitt utelukkende som videre illustrering.

EKSEMPEL

Isolering av Antibiotic CP- 63. 517 fra fermenterings-oppløsning

Hele oppløsningen fra en 10 kars fermentering av kultur ATCC-39574 (totalt volum omtrent 25 liter) ble ekstrahert med halve volumet av metylisobutylketon. Ekstrakten ble konsentrert i vakuum til en brun olje (20 g). Dette materialet ble kromatografert på en 5x100 cm kolonne pakket med silikagel til kromatografering, i etylacetat. Kolonnen ble utviklet med etylacetat med en strømningshastighet på 10 ml/minutt. Det ble tatt fraksjoner på 10 ml hver. Disse fraksjonene ble undersøkt ved tynnskiktkromatografi på silikagelplater utviklet i etylacetat. Platene ble dusjet med 3% vanillin i etanol-85% fosforsyre (3:1) og varmet til 80°C. Det ønskede antibiotikum CP-63.517 kommer til syne som en grønn flekk ved disse betingelse-ne. Fraksjonene som inneholdt CP-63.517 ble forent (totalvolum omtrent 300 ml) og rørt med 2 gram Darco G60<*> karbon i 15 minutter. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble rørt med 300 ml 5% natriumfosfat dibasisk buffer og pH justert til 10,0 med IN NaOH. Fasene ble skilt og etylacetat ble tørret over vannfritt natriumsulfat, filtrert og dampet inn i vakuum. Den gule vis-køse oljen som ble igjen etter inndampingen, ble løst opp i et lite volum aceton, hvorved det ble krystallisering. Krystallene ble samlet ved filtrering og tørret i vakuum, 'og det ga 800 mg CP-63.517 som natriumsaltet; smp. 215-220°C, UV lambda (maks)

is

232 nanometer, E, 1 cm= 155. Infrarødt spekter (KBr) cm ;

3436, 2964, 2928, 2871, 2728, 1666, 1563, 1462, 1404,

1372, 1319, 1293, 1271, 1234, 1205, 1167, 1100, 1050,

1033, 995, 980, 967, 940, 926, 902, 858, 538.

Optisk rotasjon: tQiD = +25° (C = 0,5, metanol).

Analyse:

Beregnet for C,,H_-0,.Na: C, 63,49; H, 8,89; N, 0,0

Funnet: C, 62,45; H, 8,61; N, 0,0.

<*> ICI America Inc., Wilmington, Delaware 19899.

Den frie syre-form av CP-63.517 ble fremstilt ved å røre

en kloroformoppløsning av CP-6 3.517 med samme volum vann og å senke pH til 3,0 med fosforsyre. Fasene ble deretter skilt og kloroformen ble dampet bort i vakuum, og det ga den frie syre

av CP-63.517 som et amorft fast stoff, smp. 95-l05°C.

UV lambda _1 (maks) 232 nanometer, ETl1 es3 -m= 161. Infrarødt spekter (KBr) cm : 3474, 2968, 2932, 2877, 1715, 1670, 1460, 1380, 1315,

1265, 1233, 1202, 1165, 1113, 1099, 1066, 1046, 1021,

987, 950, 923, 900.

Optisk rotasjon: [alD = +47,4° (C = 0,5, metanol).

Analyse:

Beregnet for C,,Hlo0,.: C, 65,10; H, 9,07; 0, 25,83

4 / /o 14

Funnet: C, 64,05; H, 8,98; 0, 27,03 (ved differanse).

Strukturen (I) til CP-63.517 ble bestemt ved <1>H-NMR og "high resolution mass spectra"-undersøkelser utført av Karl B. Whipple, PhD. og R.S.Ware, Central Research, Pfizer Inc., Groton, Connecticut, USA.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet med formel: hvor Me er metyl, eller et farmasøytisk godtagbart kationsalt derav, karakterisert ved dyrking av Streptomyces endus subsp. aureus, ATCC-39574 i et vandig kulturmedium som inneholder en assimilerbar kilde av karbon, nitrogen og uorganiske salter under neddykkede aerobe fermente-ringsbetingelser, ved en temperatur fra 24 til 3 6°C.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte antibiotikum isoleres i form av sitt natrium- eller kaliumsalt ved ekstrahering, konsentrering og kromatografering.

3. Anvendelse av antibiotikumet fremstilt i henhold til krav 1, for å øke virkningsgraden av forutnyttelse hos svin eller kveg, ved at antibiotikumet eller et farmasøytisk godtagbart salt derav settes til foret i en mengde som er effektiv til å øke forutnyttelsen.