Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku oznaczonego symbo¬ lem CP-63517, wyodrebnionego z fermentacji nowego szczepu rodzaju Streptomyces, wyizolowa¬ nego z próbki gleby pobranej w prefekturze Okayama w Japonii i oznaczonego numerem kodo¬ wym N 497-34. Strukturalnie, nowy antybiotyk wytwarzany sposobem wedlug wynalazku nalezy do grupy kwasowych antybiotyków policyklicznoeterowych (jonoforowych). Do tej grupy anty¬ biotyków naleza dianemycyna [J. Antibiotics, 22, 161 (1969) oraz ibidem 33,137 (1980)], monen- syna [J. Amer. Chem. Soc.,89,5737 (1967)], salinomycyna [J. Antibiotics, 27,814 (1974)], antybio¬ tyk TM-531 znany z opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4 269 971 i antybiotyk 53 607 znany z opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4 361 649.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego, kwasowego, policyklicznoetero- wego antybiotyku oznaczonego symbolem CP-63517 o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym Me oznacza grupe metylowa i jego dopuszczalnych w farmacji kationowych soli, które to zwiazki sa aktywne wobec wielu drobnoustrojów i wykazuja skutecznosc w leczeniu kokcydiozy, biegunki u swin, a takze przyspieszaja wzrost swin i przezuwaczy oraz wplywaja na skuteczniejsze wykorzystanie pokarmu przez swinie i bydlo. Sposób ten polega na hodowaniu nowego szczepu Streptomyces endus odmiana Aureus ATCC-39574 w wodnej pozywce hodowlanej, korzystnie w temp.24-36°C.Antybiotyk CP-63517 zostal wyobrebniony z hodowli li nowego szczepu wyizolowanego z próbki gleby pobranej w prefekturze Okayama w Japonii. Szczep ten oznaczono symbolem N497-34 i zidentyfikowanojako nowy szczep Streptomyces endus odmiana aureus. Znajduje sie on obecnie w depozycie w American Type Culture pod numerem 39574.Sposób zwiekszania wykorzystywania pokarmu przez swinie i bydlo polega na podawaniu tym zwierzetom antybiotyku o wzorze 1 lub jego dopuszczalnej w farmacji soli. Ulepszona mieszanka paszowa dla bydla lub swin zawiera nowy antybiotyk lub jego sól.Substancje antybiotyczna wytwarza sie sposobem wedlug wynalazku w procesie fermentacji szczepu oznaczonego symbolem N 497-34, wyizolowanego z próbki gleby pobranej w prefekturze2 145 197 Okayama w Japonii. Szczep N 497-34 zostal scharakteryzowany i zidentyfikowany przez dr Liang H. Huanga z Central Research, Pfizer Inc., Groton, Connecticut, Stany Zjednoczone Ameryki,jak to opisano ponizej.Po przebadaniu, hodowle N 497-34 rozpoznano jako gatunek Streptomyces ze wzgledu na male wymiary strzepków, wytwarzanie grzybni powietrznej i zarodniki tworzace lancuchy w grzybni powietrznej.Hodowle szczepu N 497-34 ze skosu przeszczepiano do pozywki ATCCnr 172 i hodowano w ciagu czterech dni w temperaturze 28°C na trzesawce. Hodowle wirowano w ciagu 20 minut, przemyto trzy razy jalowa woda destylowana i przeszczepiano na pozywki zwykle stosowane dla identyfikacji Actinomycetales.Hodowle inkubowano w temperaturze 28°C i wyniki obserwowano po uplywie róznego okresu czasu, najczesciej po 14 dniach. Barwy opisano stosujac typowa terminologie z tym, ze dokladna barwe okreslano przez porównywanie z wzorcami barw z "Color Harmony Manual", * wydanie 4. Analize aminokwasowa i cukrowa calych komórek wykonywano w sposób opisany przez Beckera i wspl. w Appl. Microbiol., 12, 421-423 (1964) i przez Lechevaliera w J. Lab. Clin.Med., 71, 934-944 (1968). Dla porównania otrzymano z Northern Regional Research Center (NRRC), U.S.D.A., Peoria, Illinois, szczep Streptomyces endus odmiana aureus NRRL 12174.Dla charakterystyki drobnoustroju stosowano nastepujace podloza identyfikacyjne o poda¬ nym ponizej skladzie: l.Trypton z wyciagiem drozdzowym (ISP^pozywka Difco, ISP^l). 2.Agar z wyciagiem drozdzowym i wyciagiem slodowym (pozywka ISP^2, Difco). 3.Agar owsiany (Difco, ISIV3). 4.Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi (pozywka ISP^4, Difco). 5.Agar glicerynowo-asparaginowy (pozywka ISP^5,Difco). ó.Agar zelazowy z peptonem i wyciagiem drozdzowym (pozywka ISPt^6, Difco). 7.Agar Czapek'a z sacharoza S.A. Waksman, The Actinomycetes, tom 2, pozywka nr 1, str. 328, 1961. 8.Agar glukozowo-asparaginowy, j.w., pozywka nr 2, str, 328. 9.Agar Bennetta, j.w., pozywka nr 30, str. 331. lO.Agar Emersona, j.w., pozywka nr 28, str. 331. 11.Agar odzywczy, j.w., pozywka nr 14, str. 330. 12.Agar tyrozynowy Gordona i Smitha, R.E. Gordon i M.M. Smith, J.Bact., 69, 147-150 (1955). 13.Agar kazeinowy, j.w. 14.Agar z jablczanem wapnia, S.A. Waksman., Bact. Rev. 21,1-29 (1957). 15.Zelatyna. R.E. Gordon i J.M. Mihm, J. Bact., 73, 15-27 (1957). 16.Skrobia, j.w. 17.Pozywka z organicznym azotanem, j.w. 18.Pozywka z dekstroza i azotanem, S.A. Waksman, The Actinomycetes, tom 2, pozywka nr 1, str. 328, 1961, z tym, ze stosowano 3 g dekstrozy zamiast 30 g sacharozy i nie stosowano agaru. 19. Agar ziemniaczano-marchwiowy, M.P.Lechevalier, J. Lab. and Clinical Med. 71,934-944 (1968), ale stosowano tylko 30 g ziemniaków, 2,5 g marchwi i 20 g agaru. 20.2% agar w wodzie wodociagowej. 21.Mleko zbierane, Difco. 22.Przyswajanie celulozy: (a)H.L.Jensen, Proc. Linn, Soc. N.S.W.,55, 231-248 (1930). (b)M.Levine i H.W.Schoenlein, A Compilation of Culture media, pozywka nr 2511, 1930. 23.Weglowodany, pozywka ^ 9, Difco. 24.Zakres temperatury, pozywkaISIV 2 z dodatkiem 50 ml mleczka kokosowego najeden litr pozywki.Drobnoustrój N 497-34 wykazal nastepujaca charakterystyke. Barwy okreslano i wykorzy¬ stano analizy aminokwasowa i cukrowa calych komórek, stosujac podane powyzej metody.Agar z wyciagiem drozdzowym i wyciagiem slodowym-Wzrost dobry, barwa biala, bladozólta do bladorózowej (lea, V/2 ca, blisko szarych serii 3dc, 5dc, 5fe), powierzchnia podniesiona,145 197 3 pomarszczona, grzybnia powietrzna taka samajak powierzchnia: spód brazowy (2pg, 3ne); rozpu¬ szczalny pigment zóltawobrazowy (21c, 3nc).Agar owsiany-Wzrost umiarkowany do dobrego, barwa bialawa, szara do rózowoszarej blisko serii szarych (3fe, 5fe, 7fe, 7ih), powierzchnia nieco podniesiona, gladka, aksamitna, grzyb¬ nia powietrzna taka samajak powierzchnia; spód bladozólty (2ca) do szarego (blisko szarych serii 3dc, 3fe); rozpuszczalny pigment bladozóltawy do zóltawego (l1/2ea, l2/2ga).Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi-Wzrostubogi do umiarkowanego, barwa bialawo- zóltawa do rózowoszarej (l1/2ca, blisko szarych serii lba, 3fe, 7fe, 7ih), powierzchnia podniesiona, pomarszczona, grzybnia powietrzna taka sama jak powierzchnia; spód zóltawy do rózowoszarego (l1/2ga, blisko szarych serii 5fe); rozpuszczalny pigment zóltawy (l1/2ga, l1/2ea).Agar glicerynowo-asparaginowy-Wzrost ubogi do umiarkowanego, barwa bialawa (blisko szarych serii 2ba), powierzchnia cienka, gladka lub majaca wyglad izolowanych kolonii, grzybnia powietrzna bialawa; spód bezbarwny do bladozóltawego (l1/2ca); brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar Czapek'a z sacharoza-Wzrost umiarkowany, barwa bialawa (blisko l1/2ca, blisko szarych serii 2cb), powierzchnia cienka, gladka z kolistymi lub krzywymi liniami, brak grzybni powietrznej; spód kremowy (l1/2ca); rozpuszczalny pigment kremowy (l1/2ca).Agar glukozowo-asparaginowy-Wzrost dobry, barwa szara, rózowoszara (blisko szarych serii 3fe, 5fe) do zóltawej (lea, Iga), powierzchnia umiarkowanie podniesiona, pomarszczona lub ziarnista, grzybnia powietrzna taka sama jak powierzchnia ; spód zóltawoszary do szarego (2gc, 2ge, blisko szarych serii 3fe, 3ih); rozpuszczalny pigment zóltawy (l1/2ia, l1/2la).Agar tyrozynowy Gordona i Smitha-Wzrost umiarkowany, barwa bialawa (blisko szarych serii 2ba), powierzchnia umiarkowanie podniesiona, pomarszczona lub majaca wyglad izolowa¬ nych kolonii, grzybnia powietrzna bialawa; spód bladozólty (l1/2ca, l1/2ea); rozpuszczalny pigment bladozólty (2ea).Agar z jablczanem wapnia-Wzrost umiarkowany, barwa biala do bialawej (blisko szarych serii lba), powierzchnia cienka, gladka lub majaca wyglad izolowanych kolonii; grzybnia powietrzna skapa, biala do bialawej; spód kremowy (l1/2ca); rozpuszczalny pigment kremowy (l1/2ca).Agar kazeinowy-Wzrost dobry, barwa biala do bladoszarawokremowej (blisko 2ec, 3ec), powierzchnia umiarkowanie podniesiona, drobno pomarszczona, brak grzybni powietrznej; spód bladolawendowy (3ec); rozpuszczalny pigment bladolawendowy (4ec).Agar Bennetta-Wzrost dobry, barwa biala, bladozólta do rózowoszarej (lea, blisko serii 5fe, 7fe, 7ih), powierzchnia podniesiona, pomarszczona, grzybnia powietrzna taka sama jak powierzchnia; spód lawendowoszary (4ig, 41i, 5ig, 51i): rozpuszczalny pigment zóltawy (l1/2na).Agar Emersona-Wzrost dobry, bialy do bialawego, powierzchnia podniesiona, pomarszczona lub majaca wyglad izolowanych kolonii, z biala do bialawej grzybnia powietrzna; spód zóltawo¬ brazowy (2ea, 21c); rozpuszczalny pigment brazowy (31c).Agar odzywczy-Wzrost umiarkowany, barwa biala, powierzchnia pomarszczona, podnie¬ siona lub majaca wyglad izolowanych kolonii, grzybnia powietrzna biala; spód kremowy (l1/2ca); brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar zelatynowy—Wzrost dobry, barwa biala do kremowej (l1/2 ca), powierzchnia umiar¬ kowanie podniesiona, pomarszczona, grzybnia powietrzna biala; spód kremowy (2ca); brak rozpu¬ szczalnego pigmentu.Agar skrobiowy-Wzrost dobry, barwa biala, powierzchnia podniesiona, pomarszczona, grzybnia powietrzna biala; spód bladozóltawy do zóltawobrazowego (2ea, 2ic); rozpuszczalny pigment kremowy (2ca).Agar ziemniaczano-marchwiowy-Wzrost umiarkowany, barwa szara do rózowoszarej (blisko szarych serii 3fe, 5fe, 3fe, 7ih), powierzchnia aksamitna, podniesiona w srodku, a cienka przy brzegach, gladka, grzybnia powietrzna taka sama jak powierzchnia; spód rózowoszary (blisko szarych serii 5fe, 5ih); rozpuszczalny pigment kremowy (l1/2ca).4 145197 Agar z woda wodociagowa-Wzrost umiarkowany do dobrego, barwa szara do rózowoszarej (blisko szarych serii 3fe, 5fe, 5ih); powierzchnia wyglada jak podniesiona, izolowane aksamitne kolonie; grzybnia powietrzna szara do rózowoszarej; spód szary do ciemnoszarych (blisko szarych serii 5ih, 3ih, 3ml); brak rozpuszczalnego pigmentu.Wlasciwosci morfologiczne-Wlasciwosci morfologiczne obserwowano na agarze owsianym po 14 dniach inkubowania : masa zarodnikówo barwie z serii szarych; sporofory monopodialnie rozgalezione; spiralne lancuchy zarodników o malej srednicy (3 do 4 //m), nieco otwarte, 3 do 7 skretów w jednym lancuchu zarodników, 10 do 50 zarodników w lancuchu; zarodniki krótkie w ksztalcie precików, niekiedy kuliste, owalne lub eliptyczne, proste lub nieco zakrzywione, niektóre nieco zakrzywione maja nierównolegle konce i wygladaja na pieciokatne, srednica 1,0-1,8 x 0,9-1,2 yum lub 0,9-1,2 //m; brodawki obserwowane za pomoca mikroskopu elektronowego.Wlasciwosci biochemiczne-Melamina nie jest wytwarzana; siarkowodór jest wytwarzany; zelatynajest uplynniana; skrobiajest hydrolizowana; azotany sa redukowanedo azotynów; dobry wzrost na pozywce celulozowej Levine'a i Schoenleina, ale ubogi wzrost na pozywce celulozowej Jensena; brak rozkladu na obu pozywkach celulozowych; koagulacja i klarowanie mleka; próby na trawienie kazeiny ijablezanu wapnia pozytywne; próba na trawienie tyrozyny negatywna; Przyswa¬ janie weglowodanów: przyswajane sa glukoza, arabinowa, fruktoza, inozytol, mannitol, rafinoza, ramnoza, sacharoza i ksyloza.Zaleznosci temperaturowe 21°C 28°C 37°C 45°C Wzrost dobry Wzrost doskonaly Wzrost dobry Wzrost umiarkowany Na podstawie analizy sciany komórkowej drobnoustroju N 497-34 stwierdzono, ze hydroli¬ zaty calych komórek zawieraja kwas LL-dwuaminopimelinowy, ale nie zawieraja charakterysty¬ cznych cukrów. Hodowla szczepu N 497-34 charakteryzuje sie szara barwa zarodników w masie, negatywna reakcja melaminowa, spiralnymi lancuchami zarodników i zarodnikami z pokryta brodawkami powierzchnia. Tecechy oraz wyniki analizy calych komórek pozwalaja na zaliczenie drobnoustroju do rodzaju Streptomyces. Gdy porównuje sie go z opisem znanego gatunku Strep- tomyces z literatury, przypomina on dokladnie S. endus, Anderson i Gottlieb, odmiana aureus, Tomka, Nakano, Sato, Shirahata, Yoshida i Morimoto, NRRL 12174, opisany w Japan Kokai TokkyoKoho, 57-4975, 11 stycznia 1982 r. Szczep ten otrzymano z NRRL i porównywano go punkt po punkcie z N 497-34. Z wyjatkiem faktu, ze N 497-34, w przeciwienstwie do NRRL 12174, wzrasta w temperaturze 45°C i koaguluje mleko, oba szczepy wykazuja takie same wlasciwosci biochemiczne i fizjologiczne. Na podlozu ISP^2, podlozu ISP^4 i agarze Bennetta drobnoustrójN 497-34 wytwarza wiecej rózowoszarej grzybni powietrznej bez zóltych wysieków; jego kolonie na podlozu ISP^5 i agarze odzywczym sa mniejsze;jego kolonie na agarze Czapek'a z sacharoza maja kremowe linie lub kólka;jego kolonie na agarze glukozowo-asparaginowym sa raczej rózowoszare niz biale do kremowych i wytwarzaja raczej niz nie wytwarzaja zólty rozpuszczalny pigment. Te róznice hodowlane maja mniejsze znaczenie i moga wystepowac miedzy róznymi szczepami gatunku Streptomyces. DrobnoustrójN 497-34 uwaza sie wiec za nowy szczep Streptomyces endus, Anderson i Gottlieb, odmiana aureus, Tomka, Nakano, Sato, Shirahata,Yoshida, Morimoto.Szczep zostal zdeponowany w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rock- ville, Maryland 20852, U.S.A., pod numerem ATCC-39574, na warunkach okreslonych Ukladem Budapesztenskim z 10 stycznia 1984 r. Trwalosczdeponowanej hodowli N 497-34 w American TypeCulture Collectionjest gwarantowana przez okres trwania kazdego patentu udzielonego na podstawie mniejszego zgloszenia. Dostep do szczepu N 497-34jest osiagalny podczas zalatwiania tego zgloszenia dla uznanych za upowaznionych do tego przez Komisarza do spraw Patentów i Znaków Towarowych,zgodnie z 35 USC 122 i 37 CFR1.14 Wszystkie ograniczenia dostepnosci do zdeponowanej hodowli beda nieodwolalnie usuniete po udzieleniu patentu naniniejsze zgloszenie.Nowa substancje antybiotyczna wytwarza sie sposobem wedlugwynalazku w procesie fermen- tacji nowego szczepu Streptomyces endus odmiana aureus, ATCC-39574,ekstrakcji calej brzeczki, przy naturalnym pH, ketonem metylowizobutylowym i zatezaniu ekstraktu do postaci gestego145197 5 oleju. Oleisty produkt zawiesza sie w heptanie i próbki traktuje sie zelem krzemionkowym. Zel krzemionkowy eluuje sie chloroformem, mieszanina chloroformu i octanu etylu, octanem etylu i mieszanina octanu etylu i acetonu. Po zatezeniu, z frakcji octanowej otrzymano mala ilosc surowego produktu, z którego krystalizowano antybiotyk CP-63517 w postaci mieszanej soli sodowo-potasowej.Streptomyces endus odmiana aureus ATCC-39574 moze byc hodowany w temperaturze od 24°C do 36°C, w warunkach hodowli podpowierzchniowej z napowietrzaniem, w pozywce zawiera¬ jacej zródla weglowodanów, takich jak cukry, skrobie, gliceryna, substancje zawierajace organi¬ czny azot, takie jak maka sojowa, kwasy kazaminowe, wyciag drozdzowy, substancje wzrostowe, takie jak rozpuszczalna pozostalosc z fermentacji alkoholowej, maczka rybna, maczka z nasion bawelny, sole mineralne zawierajace pierwiastki sladowe, takiejak zelazo, kobalt, miedz, cynk oraz weglan wapniowy lub fosforany jako srodki buforujace. Antybiotyk mozna wyodrebniac droga ekstrakcji calej brzeczki róznymi rozpuszczalnikami organicznymi, np. butanolem, ketonem mety- lowoizobutylowym lub chloroformem, przy pH od 4,0 do 8,0 lub tez oddzielania grzybni po zakonczeniu fermentacji i jej ekstrakcji. Przesaczjest odrzucany, a ekstrakt zatezany do konsysten¬ cji rzadkiego syropu, rozpuszczany w heksanie i np. chromotografowany na zelu krzemionkowym w celu uzyskania czystego zwiazku.Inokulum przygotowuje sie zdrapujac komórki wegetatywne z hodowli na skosach lub w butlach Roux zaszczepionej drobnoustrojem ATCC-39574. Stala pozywka odpowiednia dla uzy¬ skania poczatkowego wzrostu na skosach i w butlach Roux jest pozywka ATCC nr 172.ATCC 172 Skladnik Glukoza Skrobia rozpuszczalna Wyciag drozdzowy NZ Amine A* Weglan wapniowy Destylowanawoda do 1000 ml; pH doprowadzone za pomoca KOH do 7,0 Agar G/litr 10 20 5 1 1 20 *Nazwa firmowa enzymatycznego hydrolizatu kazeiny produkowanego przez Humko Sheffield Chemical CO., Inc.Komórki wegetatywne ze skosów stosuje sie do zaszczepiana albo kolb trzesawkowych lub tanków szczepiennych albo alternatywnie tanki szczepienne szczepi sie materialem z kolb trzesaw¬ kowych. W kolbach trzesawkowych wzrost na ogól osiaga maksymalny poziom po 96-120 godzi¬ nach, natomiast w tankach szczepiennych wzrost zwykle jest najlepszy po 72-96 godzinach.Fermentor zaszczepia sie wegetatywna brzeczka z kolb lub tanków szczepiennych, w calkowicie jalowych warunkach i fermentuje w ciagu 48 do 120 godzin. Kolby trzesawkowe napowietrza sie poprzez mieszanie na trzesawce, a fermentory przez przepuszczanie jalowego powietrza za posred¬ nictwem belkotki w ilosci od 0,5 do 2 objetosci na objetosc brzeczki na minute. Szybkosc mieszania zalezy od typu stosowanego mieszadla; kolby wstrzasa sie zwykle z czestotliwoscia 150 do 200 cyklów na minute (CPM), a mieszadlo w fermentatorze pracuje z szybkoscia od 300 do 1700 obrotów na minuminute (RPM). Przez caly czas musza byc zachowane jalowe warunki. Tempera¬ ture ustala sie w zakresie 28-36°C. Pienienie podczas fermentacji kontroluje sie za pomocajalowych srodków przeciwpiennych, takich jak np. rafinowany olej sojowy lub inny odpowiedni srodek przeciwpienny, który dodaje sie podczas przygotowywania fermentora lub pózniej po zaszczepie¬ niu, zachowujac jalowosc.Do hodowli w kolbach trzesawkowych stosuje sie jedna z ponizszych pozywek: CL 13 MZ Skladnik G/litr Glukoza 20 Makasojowa 10^ 6 145197 NZ AmineYTT* 5 Siarczansodowy 0,5 Chlorekkobaltu 0,002 Weglanwapniowy 2 Woda do 1 litra, pH 6,9-7,0 JDYTT Skladnik G/litr Cereloza 10 Skrobiakukurydziana S Wyciag namokowykukurydzy 5 NZ AmineYTT* 5 Chlorekkobaltu 0,002 Weglanwapniowy 3 Woda do 1 litra, pH 6,9-7,0 ?Nazwa handlowa enzymatycznego hydrolizatu kazeinyprodukowanegoprzez Humko Shef¬ field Co., Inc.Sto mililitrów pozywki umieszcza sie w kolbach trzesawkowych o pojemnosci 300 ml i wyjalawia w temperaturze 120°C, pod cisnieniem 1,07 kg/cm2, w ciagu 30 minut. Po ochlodzeniu, pozywke zaszczepia sie zawiesina wegetatywnych komórek z hodowli S. endus odmiana aureus (ATCC-39574) na skosach agarowych na podlozu ATCC 172. Kolby wtrzasa sie w temperaturze 28°C na trzesawce obrotowej o skoku 3,8-5,1 cm, przy 150 do 200 CPM, w ciagu 3 do 4 dni. Jedna kolbe uzywa sie do zaszczepiania pieciolitrowego fermentora zawierajacego trzy litry jednej z nastepujacych pozywek: CN-2 (ponizej) albo CL 13 MZ lub JDY TT (powyzej).CN-2 Skladnik G/litr Cereloza 10 Skrobiakukurydziana 10 Makasojowa 10 NZ AmineYTT* 10 Chlorekkobaltu 0,002 Weglanwapniowy 1 ?Nazwa firmowa enzymatycznego hydrolizatu kazeiny produkowanego przez Humko Shef¬ field Co., Inc.Dodaje sie 1 ml srodka przeciwpiennego i fermentory zamyka sie i wyjalawia w temperaturze 120°C i pod cisnieniem 1,07 kg/cm2, w ciagu 45 minut. Fermentory zaszczepiano jedna (okolo 3% inokulum) kolba fermentowana w ciagu 96 do 144 godzin w temperaturze 30°C i mieszana przy 1700 obrotach na minute oraz napowietrzana powietrzem w iloscijedna objetosc na objetosc cieczy na minute.Po zakonczeniu fermentacji, co okresla sie na podstawie oznaczen na krazkach antybioty- cznych wobec B. subtilis ATCC6633, fermentory zatrzymuje sie, brzeczke saczy sie przy natural¬ nym pH stosujac pomoc filtracyjna, np. celit. Osad na filtrze zawiesza sie w metanolu, zateza pod zmniejszonym cisnieniem, rozciencza sie 2-3 objetosciami wody i nastepnie ekstrahuje sie dwu¬ krotnie 1/3 do 1/2 objetosci nie mieszajacego sie z woda rozpuszczalnika, takiego jak keton metylowoizobutylowy lub n-butanol. Warstwe organiczna oddziela sie od wodnej za pomoca zassania lub wirowania, saczy i przesacz zateza pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji gestego oleju.Aktywnosc biologiczna brzeczki i kolejnych roztworów mozna oznaczac stosujac wrazliwy szczep Bacillus subtilis ATCC6633 lub Staphylococcus aureus ATCC6538. Skladniki zawarte w brzeczce i kolejnych roztworach mozna wykrywac za poihoca chromatografii cienkowarstwowej (tle) na zelu krzemionkowym (zel krzemionkowy G, 70-230M ASTM, E.Merck), stosujac do145 197 7 rozwijania octan etylu. Rozwinieteplytki spryskuje sie odczynnikiem wanilinowym (3 g waniliny w 75 ml etanolu i 25 ml 85% kwasu fosforowego ) i ogrzewa do temperatury 80°C. Antybiotyk CP-63517 jest widoczny w postaci zielonkawej plamki. Rozwiniete plytki chromatograficzne mozna takze pokrywac agarem zaszczepionym S. aureus lub B. subtilis, do którego dodaje sie barwnik tetrazoliowy (jednowodzian chlorku 2,3,5-trójfenylo-2H- tetrazolinowego, 98%, Aldrich Chemical Co., Inc. T-8485-9)i zastepnie inkubowac w ciagu 16 godzin w temperaturze 37°C w celu wywolania antybiotyku (biala plama na rózowym podlozu).Fermentacje w duzych fermentorach prowadzono przygotowujac najpierw kolby trzesaw- kowe zawierajace 0,7 litra pozywki CL 13 MZ lubJDY TT. Inokulum w kolbach trzesawkowych fermentowano w ciagu 3 do 5 dni w temperaturze 28°C i stosowano do szczepienia 190 lub 6540 litrów fermentora zawierajacego 96 lub 4600 litrów pozywki JDY TT. Okolo 1 litr inokulum stosowano dla jednego fermentora. Po fermentacji trwajacej od 5 do 7 dni otrzymywano 96 lub 4230 litrów brzeczki. Cala brzeczke ekstrahowano 1/5 objetosci ketonu metylowoizobutylowego przy naturalnym pH, a nastepnie rozdzielano za pomoca separatora Alpha DeLaval lub ekstrak¬ tom Podbielniaka i nastepnie odparowywano rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Pozo¬ staly olej zatezano dalej do konsystencji syropu, który zawieszano w heptanie, mieszano z zelem krzemionkowym, przesaczano przez warstwe zelu krzemionkowego i przemyto zel heptanem.Antybiotyk eluowano kolejno chloroformem, mieszanina chloroformu i octanu etylu, octanem etylu i 50% roztworem acetonu w octanie etylu. Przebieg elucji kontrolowano za pomoca chroma¬ tografii cienkowarstwowej i wywolywania biologicznego frakcji. Polaczone aktywne frakcje zate- zono i chromatografowano powtórnie dla otrzymywania antybiotyku CP-63517.Pczepuszczenie aktywnych eluatów przez kolumne z granulowanym weglem aktywnym pozwolilo na usuniecie przeszkadzajacych materialów i ulatwialo izolacje, w wyniku czego wyodrebniano krystaliczny antybiotyk CP-63517.Zwiazek antybiotyczny wytwarzany sposobem wedlug wynalazku o wzorze przedstawionym na rysunku ma charakter kwasowy i moze tworzyc kationowe sole w reakcji z czynnikami zasadowymi. Wszystkie takie sole moga byc wytwarzane sposobem wedlug wynalazku. Sole takie otrzymuje sie stosujac typowe dla polieterowych (jonoforowych) antybiotyków sposoby. W jed¬ nym z nich, roztwór zwiazku o wzorze 1 w lotnym, nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku organicznym, przemywa sie wodnym roztworem zawierajacym co najmniej jeden równowaznik, a korzystnie duzy nadmiar, odpowiedniego czynnika zasadowego. Roztwór organiczny suszy sie i oparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac pozadana sól kationowa. Typowymi zasa¬ dowymi czynnikami, które mozna stosowac do tego celu, sa wodorotlenki metali alkalicznych, takiejak wodorotlenek sodowy i wodorotlenek potasowy, wodorotlenki metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek wapniowy i wodorotlenek barowy oraz wodorotlenek amonowy.Antybiotyk CP-63517 wykazuje dzialanie hamujace wzrost wielu drobnoustrojów Gram- dodatnich. W przedstawionej ponizej tablicy 1 zestawiono wyniki testów na MIC in vitro.W tym tescie drobnoustrojami zakazano serie testowych próbek z CP-63517 w celu oznaczania najmniej¬ szego stezenia antybiotyku w mcg/ml hamujacego wzrost drobnoustrojuw ciagu 24 godzin (MIC).Dyzenteria u swin jest najczesciej wystepujaca w Stanach Zjednoczonych Ameryki choroba swin. Ponadto, choroba ta jest najczestsza w wielu innych krajach i wywoluje roczne straty w wysokosci wielu tysiecy dolarów w stadach swin na calym swiecie. Ostatnio odkryto, ze drobnous¬ trojem wywolujacym chorobe jest duzy kretek. Drobnoustrój ten, Treponema hyodysenteriae, zostal wyizolowany i wykazano, ze jest on zdolny do wywolywiania choroby [D.L.Harris i wsp., "Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Re- production of the Disease", Vet. MedASAC, 67, 61-64 (1972)]. Cytowane tam wyniki testów dotycza testów prowadzonych z tym drobnoustrojem. Nalezy jednak dodac, ze nie jest wiadomo czy T.hyodysenteriaejestjedynym drobnoustrojem wywolujacym dyzenterie u swin. Zdostepnych danych mozna jednak sadzic, ze jest on glównym zródlem zakazenia.145 197 Tablica 1 Drobnoustrój • CP-63517 MIC mcg/ml Staphylococcus aurcus Staphylococcus epidcrmidis Streptococcus pyogenes Erysip.rhusio Lactobacillus casei L.catenaforme Corynebactcrium pyogenes Peptococcus sp.Haemophilus parahemol.PasteureUa multocida P. haemolytica Bordatella bronchi Dacteroides vulgates Fusobacterium plauti F. Necrophorum Moraxella bovis Treponema hyodysentenae 01A005 01A052 01A110 01A106 01A539 01A543 01B087 01B111 020054 04A005 09B001 09C001 11D001 11D002 11D003 17B001 54B002 59A013 59A048 59B018 59B046 59B061 73A006 73A016 78E032 84G001 84C004 93A001 94A001 94A002 0,39 0,39 0,39 0,78 0,78 3,12 0,78 0,39 0,10 0,39 0,39 0,39 12,5 12,5 12,5 0,10 25 50 0,39 0,39 0,39 50 0,39 6,25 25 0,39 25 50 6,25 6,25 Dobrze znana choroba pierwotniakowa, koksydioza, stanowi ciagle powazny problem i jej zwalczanie ma znaczenie ekonomiczne dla weterynarii, w szczególnosci w przemysle drobiowym.Kokcydioza jest wywolywana przez jeden lub kilka gatunków Eimeria lub Isospora (przeglad znalezc mozna w pracy Lunda i Farra "Diseases of Poultry", 5 wydanie, Biester i Schwarts (wydawcy), Iowa State University Press, Ames.Ia., 1965, str. 1056-1096). Jest szesc gatunków pierwotniaków kokcydiowych wywolujacych latwo zauwazalna smiertelnosc wrazliwych kurczat.Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima i E. miwati powoduja uszkodze¬ nia, bezposrednio przez niszczenie komórek nablonkowych lub posrednio przez wytwarzanie toksyn. Trzyinne gatunki pierwotniaków nalezace do tego samego rodzaju sa uwazane za stosun¬ kowo nieszkodliwe, chociaz E. mitis, E. hafani i E. praecex sa zdolne do zmniejszania przyrostu ciezaru, obnizania wydajnosci zywienia i szkodzenia wytwarzaniu jaj.Antybiotyk CP-63517 i jego kationowe sole wykazuja doskonala aktywnosc wobec zakazen kokcydiozowych u drobiu. Dodane do pokarmu kurczat w ilosci od 5 do 40 ppm, zwiazki te skutecznie zwalczaja zakazenia wywolywane przez Eimeria tenella i E.acervulina.Dane dotyczace skutecznosci antybiotyku CP-63517 i jego soli wobec zakazen koksydiozo- wych u kurczat otrzymywano w nastepujacy sposób. Grupy po 3-5 dziesieciodniowych kogucików rasy SPF bialy leghorn zywiono mieszanka zawierajaca antybiotyk CP-63517, jego sola sodowa i/lub potasowa, znanym srodkiem monensyna lub stenorolem, dobrze wymieszanymi z pokar¬ mem. Po 24 dniach takiego odzywiania kazde kurcze zakazano doustnie oocytami poszczególnych testowanych gatunków Eimeria. Inne grupy, po3-5 dziesieciodniowych kurczatkarmiono podobna mieszanka, ale nie zawierajaca zadnego testowanego zwiazku. Tegrupy równiez zakazano po 24 godzinach i sluzyly onejako zakazone grupy kontrolne. Jeszcze inne grupy 3-5 dziesieciodniowych kurczat zywiono mieszanka nie zawierajaca zadnego testowanego zwiazku i nie zakazano koksy- diami. Sluzyly one jako normalne grupy kontrolne. Wyniki badano po uplywie pieciu dni dla E. acervulina lub po uplywie szesciu dni dla pozostalych drobnoustrojów. Uzyskane wyniki zesta¬ wiono w tablicy 2. 8145 197 Tablica 2 Testowany zwiazek Zakazenie drobnoustrojem Dawka Przecietny (ppm) stopien zakazenia1 Stosunek Przyrost ciezaru w * CP-63517 Eimera tenella Monensynax Eimeria tenella Stenorolx Eimeria tenella CP-63517 Stenorolx Eimeria acervulina Eimeria acervulina 40 30 20 10 5 120 53 9 3 0,75 40 30 20 10 5 9 0,0(0,0) 0,0(0,0) 0,0(0,0) 0,0(1,0) 1,0 0,3(1,0) 2,3(1,7) 0,0(0,0) 0,0(0,0) 1,7(2,3) 1,2(1,2) 0,4(0,6) 0,8(0,4) 1,0(0,6) 2,2 0,0(0,0) 0,0(0,0) 0,0(0,0) 0,0(0,0) 0,0(0,3) 0,3 0,09 (0,32) 0,69 (54) 0,0(0,0) 0,0(0,0) 0,51 (0,73) 0,60 (0,60) 0,20 (0,30) 0,40 (0,20) 0,50(0,30) 1,10 0,0(0,0) 0(2) 0(23) 14(26) 36(66) 63 71(68) 92(99) 63 (77) 86(103) 66(90) 0(0) 0(0) 30(60) 40(0) 11 48(51) x Liczby w nawiasach dotycza wyników powtórzen: Monensyna, patrz np. opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 3 501568; A. Amer. Chem. Soc., 89, 5737 (1967); Stenorol (Halofunginon), patrz np. opis patentowy St.Zjedn.Ameryki nr 3 320124. 1 ] Kryteria stosowane do oznaczania aktywnosci przeciwkoksydiozowej wzaleznosci od uszkodzen ocenianych w skali od 0 do 4 dla Eimeria tenella przyjeto zaJ. E. Lynchem,"A New Method forthe Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res., 22,324-326 (1961); oraz ocenia¬ nych w skali od 0 d 3 dla innych gatunków, w oparciu o system oceny podany przez J. Johnsona i W.H. Reidaw "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniauesin Battery and Floor Pen Experi- ments in Chicks", Exp. Parasit., 28,30-36 (1970). Staly stosunek ustalano dzielac wielkosc uszko¬ dzenia w kazdej traktowanej grupie przez wielkosc uszkodzenia dla zakazonej grupy kontrolnej.Jak wykazuja dane przytoczone w tablicy 1, nowa substancja antybiotyczna otrzymana sposobem wedlug wynalazku posiada aktywnosc przeciwbakteryjna wobec wielu bakterii Gram- dodatnich, takich jak Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis i Streptococcus pyoge- nes. Dzieki temu, zwiazek o wzorze przedstawionym na rysunku i jego sole sa uzyteczne do celów sanitarnych, takich jak mycie rak oraz sterylizacja powierzchni i urzadzen szpitalnych.Ponadto, zwiazek antybiotyczny o wzorze przestawionym na rysunku wykazuje aktywnosc wobec Treponemahyodysenteriae, drobnoustroju wywolujacego dyzenterie u swin. Stad tez sub¬ stancja antybiotyczna o wzorze przedstawionym na rysunku jest uzyteczna dla zwalczania dyzente- rii u swin. Do tego celu, antybiotyk o wzorze przedstawionym na rysunku mozna podawac swiniom sam lub korzystnie w postaci kompozycji farmaceutycznej, w której zwiazek jest zmieszany z dopuszczalnym w farmacji nosnikiem lub rozcienczalnikiem.Kompozycje farmaceutyczna sporzadza sie stosujac zwykle postepowanie uzywane przy wy¬ twarzaniu antybiotyków weterynaryjnych. Np. kapsulki mozna otrzymywac droga napelniania zelatynowych kapsulek zwiazkiem o wzorze przedstawionym na rysunku, korzystnie rozcienczo¬ nym obojetnym rozcienczalnikiem,takim jak glukoza, laktoza, sacharoza, skrobia lub celuloza.Tabletki mozna sporzadzac w rutynowy sposób , np. tabletkujac mieszanine zwiazku o wzorze przedstawionym na rysunku, rozcienczalnika, takiego jak laktoza lub skrobia, srodka wiazacego, takiego jak zelatyna lub guma guar i srodka poslizgowego, takiegojak stearynian magnezowy lub wosk parafinowy. Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku mozna tez podawac doustnie w postaci eliksirów, syropów, roztworów i zawiesin. Roztwory i zawiesiny moga byc wodne, nie- wodne lub czesciowo wodne. Dla podawania pozajelitowego korzystne sajalowe, wodne roztwory.Podawanie pozajelitowe obejmuje podawanie domiesniowe, dootrzewnowe, podskórne i dozylne.Dla podawania dozylnego calkowite stezenie rozpuszczalnych skladników powinno byc takie, aby roztwór byl izotoniczny.10 145 197 Stosunek ilosci zwiazku o wzorze przedstawionym na rysunku do dopuszczalnego w farmacji nosnika bedzie zalezal od przewidzianego dawkowania i drogi podawania, zazwyczaj jednak wynosi od 1:10 do 2:1, w szczególnosci od 1:5 do 1:1.Gdy zwiazek o wzorze przedstawionym na rysunku stosuje sie do leczenia dyzenterii u swin, wówczas dogodnie jest podawac go w mieszance z pokarmem zwierzecym. W takim przypadku, zwiazek o wzorze przedstawionym na rysunku dodaje sie do karmy dla zwierzat w ilosci zapewnia¬ jacej podawanie wlasciwej dawki dziennej zwiazku.Dawkowanie zwiazku o wzorze przedstawionym na rysunku podawanego dla zwalczania dyzenterii u swin okresla ostatecznie przepisujacy lek weterynarz i moze ono zmieniac sie w zaleznosci od drogi podawania i zaawansowania choroby. Zwiazek o wzorze przedstawionym na rysunku nalezyjednak zwykle podawac doustnie w ilosci od 20 do 50 mg/kg ciezaru ciala do 10-30 mg/kg ciezaru ciala, zazwyczaj w dawkach podzielonych. W pewnych przypadkach moze byc wymagane podawanie w ilosciach mniejszych lub wiekszych.Antybiotyk o wzorze przedstawionym na rysunku i jego dopuszczalne w farmacji zasadowe sole zwiekszaja efektywnosc wykorzystania pokarmu u swin i przezuwajacych, to znaczy dzialaja jako czynniki wspomagajace wzrost. Mechanizm przyswajania glównego skladnika pokarmu (weglowodanów) dla przezuwajacych jest dobrze znany.Drobnoustroje obecne w zwaczu zwierze¬ cia degraduja weglowodany do monocukrów i nastepnie monocukry do pirogronianów.Pirogro- niany sa nastepnie metabolizowane w procesach mikrobiologicznych do octanów, maslanów lub propionianów, znanych zbiorczo pod nazwa lotnych kwasów tluszczowych (VFA). Szczególowo rozwazania na ten temat znalezc mozna w pracy Lenga "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", wydawcy Philipson i wsp., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne,Anglia, 1970, str. 408-410. Wzgledna wydajnosc wykorzystywania VFA jest dyskutowana w pracy McCullougha "Feedstuffs", 19czerwca 1971,str. 19;Eskelandaiwsp. wJ. An. Sci.,33,282(1971);orazChurchai wsp., "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", tom 2, 1971, str. 622 i 625. Chociaz octany i maslany sa tez przyswajane, to wykorzystanie propionianów jest bardziej wydajne.Korzystne zwiazki stymuluja wytwarzanie wiekszej ilosci propionianów z weglowodanów i tym samym zwiekszaja stopien wykorzystania weglowodanów.Wartosc pokarmów zwierzecych jest na ogól oznaczana bezposrednio przez karmienie zwie¬ rzat. W brytyjskim opisie patentowym nr 1 197 826 przedstawiono szczególowo technike oznacza¬ nia w zwaczu in vitro, za pomoca której latwiej i dokladniej daja sie zmierzyc zmiany zachodzace w pokarmie, wywolywane przez drobnoustroje. W tej technice stosuje sie aparature, w której procesy trawienia u zwierzat sa prowadzone i badane in vitro. Pokarm zwierzecy, inokulum ze zwacza i rózne stymulatory wzrostu sa dostarczane, a nastepnie pobierane z aparatury laboratoryjnej, w starannie kontrolowanych warunkach, zas zachodzace zmiany sa krytycznie i w sposób ciagly oceniane podczas zuzywania pokarmu przez drobnoustroje. Wzrost zawartosci kwasu propiono- wego w plynie ze zwacza wskazuje na osiagniecie pozadanej calkowitej sprawnosci przezuwania przez zastosowanie stymulatora w mieszance paszowej. Zmiana zawartosci kwasu propionowego jest wyrazanajako procent zawartosci kwasu propionowego znalezionego w kontrolnymplynie ze zwacza. Dla uzyskania wiarygodnej korelacji miedzy przyrostem ilosci kwasu propionowego w plynie ze zwacza i lepszym wzrostem zwierzecia prowadzono dlugotrwale badania zywienia in vivo.Plyn ze zwacza jest zbierany od cielat, którym zalozono przetoke i które karmi sie handlowa pasza tuczaca z dodatkiem siana. Plyn ze zwacza saczy sie natychmiast przez plótno filtracyjne do sera i 10 ml dodaje sie do 50 ml kolby stozkowej zawierajacej 400 mg standardowego substratu (68% skrobi kukurydzianej + 17% celulozy + 15% ekstrahowanej maki sojowej), 10 ml buforu o pH 6,8 i testowany zwiazek. Kolby gazuje sie azotem wolnym od tlenu w ciagu okolo dwóch minut i inkubuje sie wstrzasajac w lazni wodnej w temperaturze 39°C, w ciagu okolo 16 godzin. Wszystkie testy powtarza sie trzykrotnie.Po inkubowaniu, 5 ml próbke miesza sie z 1 ml 25% kwasu metafosforowego. Po uplywie 10 minut dodaje sie 0,25 ml kwasu mrówkowego i mieszanine wiruje sie w ciagu 10 minut przy 1500 obr/min. Próbki analizuje sie za pomoca chromatografii gazowo-cieczowej stosujac metode opi¬ sana przez D.W. Kelloga wJ. Dairy Science, 52,1960 (1969). Oznaczano wysokosci pików kwasu octowego, propionowego i maslowego w próbkach z nietraktowanych i traktowanych kolb inkubacyjnych.145 197 11 Testowanyw powyzszych sposób in vitro antybiotyk CP-63517, zwiekszal w dawce 20 i 10 Mg/ml o odpowiednio 96 i 95% wytwarzanie kwasu propionowego w stosunku do roztworu kontrolnego nie zawierajacego antybiotyku CP-63517. Dla porównania handlowy preparat monomensyna (inny antybiotyk policyklicznoeterowy) daje w stosunku do próby kontrolnej wzrost ilosci kwasu propionowego o okolo 20% [J.Amer.Chem.Soc, 89, 5737 (1967)].W porównaniu z salinomycyna [J. Antibiotics, 27, 814 (1974)] antybiotyk CP-63517 daje wzrost ilosci kwasu propionowego o okolo 86% przy poziomie 20 //g/ml i okolo 66% przy poziomie 5 //g/ml, natomiast salinomycyna okolo 65% przy poziomie 10 //g/ml.W oparciu o powyzsze dane mozna przyjac, ze antybiotyk CP-63517 poprawia wykorzystywa¬ nie pokarmu przez zwierzeta przezuwajace, takiejak bydlo i owce, oraz zwierzetajednozoladkowe, takie jak swinie i króliki. Antybiotyk CP-63517 mozna dodawac do mieszanki paszowej w postaci wolnego kwasu, soli sodowej, soli potasowej, lub ich mieszanin. Surowa postac antybiotyku CP-63517 lub suszona brzeczka fermentacyjna zawierajaca antybiotyk moze byc dodawana do mieszanki paszowej w pozadanym stezeniu.Ponizszy przyklad sluzy dalszemu zilustrowaniu sposobu wedlug wynalazku.Przyklad . Izolacja antybiotyku CP-63517 z brzeczki fermentacyjnej.Cala brzeczke z 10 fermentacji szczepu ATCC-39574 (calkowita objetosc okolo 25 litrów) ekstrahowano polowa objetosci ketonu metylowoizobutylowego. Ekstrakt zatezono pod zmniej¬ szonym cisnieniem do konsystencji brazowego oleju (20 g), który chromatografowano na kolumnie o wymiarach 5x100 cm zaladowanej chromatograficznym zelem krzemionkowym w octanie etylu.Do elucji stosowano octan etylu przepuszczany z szybkoscia 10 ml/minute. Zbierano frakcje po 10 ml i badanoje za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym, stosujac do rozwijania octan etylu. Plytki spryskiwano 3% roztworem waniliny w mieszaninie 3:1 etanolu i 85% kwasu fosforowego i ogrzewanoje nastepnie do temperatury 80°C. Pozadany antybiotyk CP-63517 pojawial sie w tych warunkach w postaci zielonej plamki. Frakcjezawierajace antybiotyk CP-63517 polaczono (lacznie okolo 300 ml) i mieszano w ciagu 15 minut z 2 gramami wegla aktywnego Darco G60 (ICI America Inc., Wilmington, Delaware, 19899). Mieszanine przesaczono, przesacz mie¬ szano z 300 ml 5% roztworu dwuzasadowego fosforu sodowego i pH doprowadzono do 10,0 In roztworem NaOH. Fazy rozdzielono, roztwór octanowy suszono na bezwodnym siarczanem sodowym, przesaczono i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostaly gesty, zólty olej rozpuszczono w malej ilosci acetonu i pozostawiono do krystalizacji. Krystaliczny produkt odsa¬ czono i suszono pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano 800 mg CP-63517 w postaci soli sodowej o temperaturze topnienia 215-220°C.UV:^max 232 nm. e I*n= 155 Widmo w podczerwieni (KBr): 3436, 2964, 2928, 2871, 2728, 1666, 1563, 1462, 1404, 1372, 1319, 1293, 1271, 1234, 1205, 1167, 1100, 1050, 1033, 995, 980, 967, 940, 926, 902, 858, 538 cm"1.Skrecalnosc optyczna: [ct]d = +25° (c = 0,4, metanol).Analiza elementarna dla C47H770i4Na: Obliczono: C 63,49 H 8,89 N 0,0 Znaleziono: C 62,45 H 8,61 N 0,0% Wolny kwas antybiotyku CP-63517 otrzymano mieszajac chloroformowy roztwór CP-63517 z równa iloscia wody i obnizajac pH do 3,0 za pomoca kwasu fosforowego. Fazy rozdzielono i chloroform odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano wolny kwas CP-63517 w postaci bezpostaciowego osadu o temperaturze topnienia 95105°C.UV:*max 232 nm, E H= 161 Widmo w podczerwieni (KBr): 3474, 2968, 2932, 2877, 1715, 1670, 1460, 1380, 1315, 1265, 1233, 1202, 1165, 1113, 1099, 1066, 1046, 1021, 987, 950, 923, 900 cm"1. Skrecalnosc optyczna: [a]D = 47,4° (c = 0,5, metanol).12 145 197 Analiza elementarna dla C47H78O14 : Obliczono: Znaleziono: C 65,10 H9,07 C 64,05 H 8,93 O 25,83 O 27,03 (z róznicy)%.Budowe antybiotyku CP-63517 o wzorze przedstawionym na rysunku oznaczano za pomoca PMR i wysokorozdzielczej analizy masowej. Wykonalito dr Earl B. Whipple i R.S. Warez Central Research, Pfizer Inc., Groton, Connecticut, U.S.A.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym Me oznacza grupe metylowa, lubjego dopuszczalnej w farmacji soli kationowej, znamienny tym, ze hoduje sie Streptomyces endus odmiana aureus ATCC-39574, wykazujacy zdolnosc wytwarzania antybiotyku w wodnej pozywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i soli nieorganicznych w warunkach podpowierzchniowej fermentacji z napowietrzaniem, do czasu otrzymania dajacej sie wyodrebnic ilosci antybiotyku lub jego dopuszczalnej w farmacji soli kationowej. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako Streptomyces endus odmiana aureus stosuje sie mutant szczepu ATCC-39574. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytwarza sie antybiotyk w postaci jego soli sodowej lub potasowej. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze od 24°C do 36°C.OMe ?H ? M? Me Me C02H = Me MeH ^ H Me H JM"CH20H Wzór Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 cgz.Cena 400 zl PL PL PL PL