DK158988B - Polycyclisk-ether-antibioticum, betegnet cp-63517, fremgangsmaade til fremstilling deraf og biologisk ren kultur af en stamme af streptomyces endus subsp. aureus samt fremgangsmaade til foroegelse af foderudnyttelsen hos svin eller kvaeg og naeringsfoderblanding til svin eller kvaeg - Google Patents

Description

DK 158988B

Opfindelsen angår et hidtil ukendt antibiotisk stof, betegnet som CP-63517, som blev isoleret fra gæring af en hidtil ukendt stamme af slægten Streptomyces isoleret fra en jordprøve opsamlet i Okayama-fjræfek-5 turet, Japan, og tildelt kodenummeret N497-34. Strukturelt er antibioticumet ifølge opfindelsen et hidtil ukendt medlem af familien af sure (ionophore) poly-cyclisk-ether-antibiotica. Denne familie af antibiotics inkluderer dianemycin [J. Antibiotics, 22^, 161 10 (1969) og ibid., 33^, 137 (1980)]; monensin [J. Amer-

Chem. Soc., 89^, 5737 (1967)]; salinomycin [J. Antibiotics, 2^7, 814 (1974)]; Antibioticum TM-531 angivet i OS patentskrift nr. 4 269 971 og Antibioticum 53 607 angivet i US patentskrift nr. 4 361 649.

15 Det hidtil ukendte sure polycyclisk - ether-antibioticum, betegnet CPt.63517, har den kemiske, strukturformel 7* OMe £V· 3s oh y ° X L S ψ «ο o ΥΤ'ΙλΑ >H Va7 Μβ 3 II 7 J9. y P'i X·· h -f* \ 31 C02H Me Me Me * ff H i n„

2 3a 33 37 “ . 0H CH2OH

CD Me = CH3 hvori Me betyder methyl, og opfindelsen omfatter også farmaceutisk acceptable kationsalte deraf. Disse forbindelser er aktive over for en række forskellige mi-20 kroorganimer og er effektive til bekæmpelse af cocci- diosis, enteritis, svinedysenteri og theileriosis samt

DK 158988B

2 effektive til fremme af vækst hos svin og drøvtyggere og til forbedring af foderudnyttelsen hos svin og kvæg.

CP-63517 er blevet isoleret ved dyrkning af en hidtil ukendt stamme isoleret fra en jordprøve opsamlet 5 i Okayama-præfekturet, Japan. Denne stamme blev betegnet N497-34 og er blevet identificeret som en ny stamme af Streptomyces endus, subsp. aureus. Den er nu deponeret i the American Type Culture Collection under accessionsnummeret 39574.

10 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til forbedring af foderudnyttelsen hos svin og kvæg ved hjælp af antibioticumet med formlen (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf; en forbedret næringsfodersamme.nsætning. til kvæg eller svin, som 15 har inkorporeret det nævnte antibioticum eller dets salte; en fremgangsmåde til fremstilling af antibioticumet CP-63517 eller farmaceutisk acceptable kation-salte deraf, som er ejendommelig ved, at· Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-39574 eller en mutation deraf 20 med væsentlig samme egenskaber og med evne til at producere antibioticumet ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt kationsalt deraf dyrkes i et vandigt nærings-medium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte under submerse, aerobe gæringsbe-25 tingelser, indtil der er produceret en udvindelig mængde af antibioticumet eller et farmaceutisk acceptabelt kationsalt deraf; og en biologisk ren kultur af stammen Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-39574, som er i stand til at producere antibioticumet CP-63517 eller et farmaceutisk acceptabelt kation-50 salt deraf i udvihcielig mængde, til anvendelse ved udøvelse af denne fremgangsmåde.

Kulturen N497-34 blev karakteriseret og identificeret

DK 158988 B

3 af Liang H. Huang, Ph.D., USA som beskrevet nedenfor.

Ved undersøgelse blev kulturen N497-34 genkendt som en Streptomyces-art på grund af hyfernes snævre dimensioner, produktionen af luftmycelium og sporer båret 5 i kæder på luftmyceliet.

Kulturen N497-34 blev plantet fra et skråsubstrat ud i ATCC nr. 172 næringsvæske og dyrket i 4 dage ved 28 °C på en ryster. Den blev derpå centrifugeret i 20 minutter, vasket tre gange med sterilt destilleret vand og 10 udplantet på medier, som almindeligvis anvendes til identifikation af medlemmer af Actinomycetales.

Kulturen blev inkuberet ved 28 °C, og resultaterne aflæst til varierende tider, men mest almindeligt efter 14 dage. Farverne blev beskrevet i almindelig 15 terminologi, men nøjagtige farver blev bestemt ved sammenligninger med farvemærkater fra the Color Harmony Manual, 6. udgave. Metoderne til hel-celle-aminosyre- og -sukker-analyser er dem, der er beskrevet i Becker et al., Appl. Microbiol., 12^, 421-423 20 (1964); og Lechevalier, J. Lab. Clin. Med. Τ1_, 934-944 (1968). Til sammenligningsformål blev Streptomyces endus subsp. aureus NRRL 12174 skaffet fra Northern Regional Research Center (NRRC), U.S.D.A., Peoria,

Illinois, U.S.A.

25 Identifikationsmedier anvendt til karakterisering af kulturen og referencer vedrørende deres sammensætning er som følger: 1. Trypton-gærekstrakt-væske - (ISP nr.. 1 medium,

Difco).

30 2. Gærekstrakt - maltekstrakt-agar - (ISP nr. 2 medium, Difco).

DK 158988 B

4 3. Havremel-agar - (ISP nr. 3 medium, Difco).

4. Uorganiske salte-stivelse-agar - (ISP nr. 4 medium,

Difco).

5. Glycerol-asparagin-agar - (ISP nr. 5 medium, 5 Difco).

6. Pepton-gærekstrakt-jern-agar - (ISP nr. 6 medium,

Difco).

7. Czapek-saccharose-agar - S.A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, medium nr. 1, side 328, 1961.

10 8. Glucose-asparagin-agar - Ibid, medium nr. 2, side 328.

9. Bennetts agar - Ibid, medium nr. 30, side 331.

10. Emersons-agar - Ibid, medium nr. 28, side 331.

11. Næringsagar - Ibid, medium nr. 14, side 330.

12. Gordon og Smiths tyrosin-agar - R. E. Gordon og 15 M.M. Smith, J. Bact., 69., 147-150 (1955).

13. Casein-agar - Ibid.

14. Calciummalat-agar - S.A. Waksman, Bact. Rev., 21^ 1-29 (1957).

15. Gelatine - R.E. Gordon og J.M. Mihm, J. Bact., 73, 20 15-27 (1957).

16. Stivelse - Ibid.

17. Organisk nitrat-væske - Ibid.

DK 158988 B

5 18. Dextrose-nitrat-væske - S.A. Waksman, The Actino-mycetes, Vol. 2, medium nr. 1, side 328, 1961, med 3 g dextrose i stedet for 30 g saccharose og uden agar.

5 19. Kartoffel-gulerod-agar - M.P. Lechevalier, J. Lab.

and Clinical Med., 7_1, 934-944 (1968), men der anvendes kun 30 g kartoffler, 2,5 g gulerødder og 20 g agar.

20. 2 % Vandvæksvand-agar.

10 21. Skummetmælk - Difco.

22. Celluloseudnyttelse - a) H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. 55, 231-248 (1930).

b) M. Levine and H.W. Schoenlein, A Compilation 15 of Culture media, medium no. 2511, 1930.

23. Carbonhydrater - ISP nr. 9 medium, Difco.

24. Temperaturområde - ISP nr. 2 medium plus 50 ml kokosnødmælk pr. liter medium.

Kulturen N497-34 udviste de følgende egenskaber, hvor 20 farver og hel-celle-aminosyre- og -sukker-analyser blev bestemt ved de ovennævnte metoder.

Gærekstrakt-maltekstrakt-agar - Vækst god, hvid, bleggul til blegt rødliggrå (nær ved grårækken (lea, 1 l/2ca,. nær ved grårækken 3dc, 5dc, 5fe), hævet, rynket, luft-25 mycelium samme som overflade; underside brun (2pg, 3ne); opløseligt pigment guljigbnant (21c, 3nc).

Havremel-aqar - vækst moderat til god, næsten hvid, grå til rødliggrå (nær ved grårækken 3fe, 5fe, 7fe, 7ih), svagt hævet, glat, fløjelsagtig, luftmycelium 30 samme som overflade; underside bleggul (2ca) til grå

DK 158988B

6 (nær ved grårækken 3dc, 3fe); opløseligt pigment bleggulligt til gulligt (1 l/2ea, 1 l/2ga).

Uorganiske salte-stivelee-aqar - Vækst moderat til god, hvidliggul til rødliggrå (1 l/2ca, nær ved grå-5 rækken lba, 5fe, 7fe, 7ih), hævet, rynket, luftmycelium samme som overflade, underside gullig til rødliggrå (1 l/2ga, nær ved grårækken 5fe); opløseligt pigment gulligt (1 l/2ga, 1 1/2 ea).

Glycerol-asp ar aqi'rv-ag ar- vækst ringe til moderat, næsten 10 hvid (nær ved grårækken 2ba), tynd, glat eller forekommende som isolerede kolonier, luftmycelium næsten hvidt; undersiden farveløs til bleggul (1 1/2 ca); intet opløseligt pigment.

Czapek-saccharose-aaar - Vækst moderat, bleg næsten i 15 hvid (nær ved 1 1/32 ca, nær ved grårækken 2cb), tynd glat med cirkulære eliler buede linier, intet luftmycelium; underside flødefarvet (1 1/2 ca); opløseligt pigment flødefarvet (1 1/2 ca).

Glucose-asparaqin-aqar - vækst god, grå. rødliggrå 20 (nær ved' grårækken 3fe, 5fe) til gullig (lea, lga), mode rat hævet, rynket eller granulær, luftmycelium samme som overflade; underside gulliggrå til grå (2gc, 2ge, nær ved grårækken 3fe, 3ih); opløseligt pigment hvidt (1 1/2 ua, 1 l/21a).

25 Gordon and Smith's tyrosin-aqar - vækst moderat, næsten hvid (nær ved grårækken 2ba), moderat hævet, rynket eller forekommende som isolerede kolonier, luftmycelium næsten hvidt; underside bleggul (1 l/2ca, 1 l/2ea); opløseligt pigment bleggult (2ea).

30 Calciummalat-agar - vækst moderat, hvid til næsten hvid (nær ved grårækken lba), tynd, glat eller forekommende som isolerede kolonier; luftmycelium sparsomt, hvidt DK 158988 £ 7 til næsten hvidt; underside flødefarvet (1 l/2ca); opløseligt pigment flødefarvet (1 l/2ca).

Casein-aqar - vækst god, hvid til blegt grålig flødefarvet (nær ved 2ec, 3ec), moderat hævet, fint rynket, 5 intet luftmycelium; underside blegt lavendelfarvét (3ec); opløseligt pigment blegt lavendelfarvet (4ec).

Bennet1s-agar - vækst god, hvid, bleggul til rødliggrå (lea, nær ved grårækken 5fe, 7fe, 7ih), hævet, rynket, luftmycelium samme som overflade; underside lavendel-10 grå (4ig, 41i, 5ig, 51i); opløseligt pigment gulligt (1 l/2na).

Emerson-aqar - vækst god, hvid til næsten hvid, hævet, rynket eller forekommende som isolerede kolonier, med hvidt til næsten hvidt luftmycelium; underside gullig-15 brun (2ea, 21c); opløseligt pigment brunt (31c).

Nærings-agar - Vækst moderat, hvid, rynket, hævet eller forekommende som isolerede kolonier, luftmycelium hvidt; underside flødefarvet (1 l/2ca); intet opløseligt pigment.

20 Gelatineaqar - vækst god, hvid til flødefarvet (1 l/2ca), moderat hævet, rynket, luftmycelium hvidt; underside flødefarvet (2ca); intet opløseligt pigment.

Stivelseaqar - vækst god, hvid, hævet, rynket, luftmycelium hvidt; underside blegt gullig til gullig 25 brun (2ea, 2ic); opløseligt pigment flødefarvet (2ca).

Kartoffel-qullerod-aqar - vækst moderat, grå til rødliggrå (nær ved grårækken 3fe, 5fe, 7fe, 7ih), fløjels-agtig, hævet i midten, men tyndt mod kanten, glat, luft-

DK 158988 B

8 mycelium samme som overflade; underside rødliggrå (nær ved grårækken 5fe, 5ih); opløseligt pigment flødefarvet (1 l/2ca).

Vandværksvand-agar - vækst moderat til god, grå til 5 rødliggrå (nær ved grårækken 3fe, 5fe, 5ih); forekommende som hævede, isolerede, fløjelsagtige kolonier; luftmycelium gråt til rødliggråt; underside grå til mørkegrå (nær ved grårækken 5ih, 3ih, 3ml); intet opløseligt pigment.

10 Morpholoqiske egenskaber - De morphologiske egenskaber blev iagttaget på harvrernelagar efter 14 dages inkubation; sporemasse i gråfarverækken; sporophorer mono-podisk forgrenede; sporekæder spiralformede med lille diameter (3-4 um), svagt åbne, 3-7 vindinger pr. spore-15 kæde, 10-50 sporer pr. sporekæde; sporen kort stavformet, somme tider kugleagtig, oval eller elliptisk, lige eller svagt buet, hvor nogle af de svagt buede har ikke-parallelle ender og således forekommer fem-hjørnede, 1,0-1,8 x 0,9-1,2 pm eller 0,9-1,2 pm i dia-20 meter; vortet ved scanning-elektronmikroskopi.

Biokemiske egenskaber - Melanin produceres ikke; hydrogensulfid produceres; gelatine smeltes; stivelse hydrolyseres; nitrat reduceres til nitrit; god vækst på Levine og Schoenleins cellulosevæske, men ringe 25 vækst på Jensen's cellulosevæske; ingen dekomponering på begge cellulosevæsker; koagulering og klaring på mælk; casein-nedbrydning positiv; calciummalat-nedbryd-ning positiv; tyrosin-nedbrydning negativ. Carbon-hydratudnyttelse: glucose, arabinose, fructose, ino-30 sitol, mannitol, raffinose, rhamnose, saccharose og xyloseuichyttes alle.

DK 158988B

9

Temperaturforhold

21 °C 28 °C 37 °C 4-5 °C

God udmærket god moderat vækst vækst vækst vækst

Ued cellevæganalyser af kulturen N497-34 fandtes det, at hel-celle-hydrolysaterne indeholdt LL-diamino-pimelinsyre, men ingen karakteristiske sukkerstoffer.

Kulturen N497-34 karakteriseres ved grå farve af 3 sporer i masse, negativ melanin-reaktion, spiralformede sporekæder og sporer med en vortet overflade.

Disse træk og resultaterne af hel-celle-katalyser placerer kulturen i slægten Streptomyces. Ved sammenligning med beskrivelser af kendte arter af Streptomyces 10 rapporteret i litteraturen minder den nært om S. endus Anderson & Gottlieb subsp. aureus Tomita, Nakano,

Sato, SHirahata, Yoshida & Morimoto NRRL 12174, som beskrevet i Japan Kokai Tokkyo, Koho 57-4975, publiceret den 11. januar 1982. DeniSidstnævnte blev skaffet fra 15 NRRL og blev sammenlignet side for side med N497-34.

Med undtagelse af, at N497-34, men ikke NRRL 12174, vokser ved 45 °C og koagulerer mælk, har begge kulturer samme biokemiske og fysiologiske egenskaber. På ISP Jir. 2 medium, ISP nr. 4 medium og Bennett's agar 20 producerer kulturen N497-34 mere rødliggråt luftmycelium uden gult exudat; dens kolonier på ISP nr. 5 medium og næringsagar er mindre; dens kolonier og Czapek-saccharose-agar viser flødefarvede linier eller cirkler; dens kolonier på glucose-asparagin er 25 rødliggrå snarere end hvide til flødefarvede og producerer gult snarere end intet opløseligt pigment. Disse kulturvariationer er af mindre betydning og kan forekomme blandt forskellige stammer af en art af Streptomyces. Kulturen N497-34 betragtes derfor som en hidtil 30 ukendt stamme af Streptomyces endus Anderson & Gottlieb

DK 158988 B

10 subs, aureus Tomita, Nakano, Sato, Shirahata, Yoshida & Morimoto. Den er blevet deponeret hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklau/n Drive, Rockville, Maryland 20832, LI.S.A. i henhold til Budapest-trak-5 tatens bestemmelser d. 10. januar 1984, under ac- cessionsnr. ATCC-39574. Opretholdelsen af den deponerede kultur N497-34 i the American Type Culture Collection garanteres under den effektive løbetid af dette patent.

10 Det hidtil ukendte antibiotiske stof ifølge opfindelsen blev opnået ved gæring af den hidtil ukendte stamme af Streptomyces endus subsp. aureus, ATCC-39574 og ekstraktion af hele væsken ved naturligt pH med methyliso-butylketon og koncentrering af opløsningen til en vis-15 køs olie. Olien blev suspenderet i heptan og batch- behandlet med silicagel. Silicagel-kagen blev elueret med chloroform, chloroform/ethylacetat, ethylacetat og ethylacetat/acetone. Efter koncentrering gav ethyl-acetat-fraktionen en lille mængde råt produkt, hvor-20 fra antibioticum CP-63517 blev krystalliseret som det blandede natrium/kalium-salt.

Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-39574 kan dyrkes ved en temperatur på 24-36 °C under submerse betingelser med omrøring og beluftning på medier bestående 25 af carbonhydratkilder, såsom sukkerstoffer, stivelser og glycerol; organiske nitrogenholdige stoffer, såsom sojabønnemel, casaminosyrer og gærekstrakt; vækst-stoffer, såsom "grain solubles", fiskemel og bomuldsfrømel; mineralsalte indeholdende sporelementer, så-30 som jern, cobalt, kobber og zink, og calciumcarbonat eller -phosphater som puffermidler. Antibioticumet kan udvindes ved ekstrahering af hele væsken ved forskellige organiske opløsningsmidler, f.eks. n-butanol, methylisobutylketon eller chloroform, ved en 35 pH-værdi i området 4,0-8,0 eller fraskillelse af myceliet, efter at væksten er fuldført, og ekstrahe- 11 DK 1589888 ring af myceliet; filtratet smides væk. Ekstrakten koncentreres til en tynd sirup, opløses i f.eks. heptan og chromatograferes på silicagel til opnåelse af den rene forbindelse.

5 Inoculum fremstilles ved skrabning af vegetative celler fra skråsubstrater eller Roux-flasker podet med ATCC-39574-kulturen. Et fast medium som er egnet til start af vækst på skråsubstrater og Roux-flasker er ATCC medium nr. 172.

ATCC 172 10 Ingredienser q/1

Glucose 10

Opløselig.stivelse 20 Gærekstrakt 5 "NZ Amine A"* 1 15 Calciumcarbonat 1

Destilleret vand til 1000 ml; pH til 7,0 med Κ0Η filsættes agar 20 * Varemærke for enzymatisk nedbrudt casein,

Humko Sheffield Chemical Co., Inc.

20 Vegetative celler fra skråsubstrater anvendes til at pode enten rystekolber eller inoculumtanke; eller alternativt podes inoculumtankene fra rystekolber. I rystekolber vil væksten almindeligvis have nået dens maksimum på 96-120 timer, medens væksten i inoculum-25 tankene sædvanligvis vil være i den mest favorable periode i løbet af 72-96 timer. En 'fermentor podes med vegetativ væske fra rystekolberne eller inoculum-tanken under fuldstændig aseptiske betingelser og gæres i et tidsrum på 48-120 timer. Beluftning opret-30 holdes i rystekolben ved omrøring på en ryster eller i tankene ved, at steril luft tvinges igennem en spreder med en hastighed på 0,5 til 2 volumener luft pr. volumen væske pr. minut. Omrøringshastigheden af-

DK 158988B

12 hænger af den anvendte type omrører; en rystekolbe køres sædvanligvis ved 150-200 slag pr. minut og en fermentor med 300 til 1700 omdr./min. Sterilitet må bevares hele tiden. Temperaturen reguleres mellem 5 28 og 36 °C. Skumning under gæringen kan holdes nede med sterile antiskummemidler, f.eks. raffineret sojebønneolie eller et andet egnet antiskummemiddel, som sættes aseptisk til sammensætningen eller til fermentoren efter behov efter podning.

10 Rystekolber fremstilles under anvendelse af et af de følgende medier:

CL13MZ

Ingredienser g/1

Glucose 20

Sojemel 10 15 ”NZ Amine YTT"* 5

Natriumsulfat 0,5

Cobaltchlorid 0,002

Calciumcarbonat 2

Vand til 1 liter, pH 6,9-7,0

JDY TT

20 Ingredienser q/1

Cerelose 10

Majsstivelse 5

Majsstøbevand 5 "NZ Amine YTT"* 5 25 Cobaltchlorid 0,002

Calciumcarbonat 3

Vand til 1 liter, pH 6,9-7,0 *.Varemærke for enzymatisk nedbrudt casein, 3ø Humko Sheffield Co., Inc.

DK 158988 B

13 100 ml medium fordeles i 300 ml rystekolber og steriliseres ved 120 °C og 103 kPa i 30 minutter. Efter afkøling podes mediet med en vegetativ cellesuspension fra S. Endus subsp. aureus ATCC-39574 skråkulturen 5 dyrket på ATCC 172 uiedoium i agar. Kolberne rystes ved 28 DC på en roterende ryster med en forskydning på 3,8-5,1 cm og 150-200 slag/min i 3-4 dage. En kolbe anvendes til at pode en 5 liters gæringsbeholder indeholdende 3 liter af et af de følgende medier: 10 CN-2 (nedenfor) eller CL13MZ eller JDY TT (ovenfor).

CN-2

Ingredienser q/1

Cerelose 10

Majsstivelse 10

Sojebønnemel 10 15 "NZ Amine YTT"* 10

Cobaltchlorid 0,002

Calciumcarbonat 1 * Varemærke for enzymatisk nedbrudt casein,

Humko Sheffield Co., Inc.

20 Der tilsattes 1 ml af et antiskummemiddel, og derpå blev beholderne forseglet og steriliseret ved 120 °C og 103 kPa i 45 minutter. Beholderne blev podet med en kolbe (omkring 3 % inoculum), gæret i 96-124 timer ved 30 °C, omrørt med 1700 omdr./min med en beluft-25 ningshastighed på et volumen luft pr. volumen væske pr. minut.

Da gæringen var fuldført (baseret på en antibiotisk skiveprøvning over for B. subtilis ATCC 6633), blev fermentorerne stoppet, og gæringsmassen filtreret 30 ved dennnaturlige pH-værdi ved hjælp af et filter-hjælpemiddel, f.eks. "Celite". Filterkagen blev op-slæmmet i methanol, koncentreret i vacuum, fortyndet med 2-3 volumener vand og derpå ekstraheret to gange

DK 158988 B

14 med 1/3 til 1/2 volumen af et med vand ublandbart opløsningsmiddel, såsom methylisobutylketon eller n-butanol. Opløsningsmiddellaget blev skilt fra den vandige fase ved afsugning eller centrifugering, 5 filtreret, og filtratet koncentreret i vacuum til en viskøs olie.

Bioaktiviteten af dyrkningsvæsken og efterfølgende udvindingsstrømme kan følges ved anvendelse af en af de følsomme stammer Bacillus subtilis ATCC 6633 10 eller Staphylococcus aureus ATCC 6538. Komponenterne i dyrkningsvæsken og udvindingsstrømmene kan visualiseres ved tyndtlagschromatografi (tic) under anvendelse af silicagel-plader ("Silica gel G" med partikelstørrelse svarende til maskevidde 62-210 jjm 15 fra E. Merck) i rent ethylacetat. De udviklede plader sprøjtes med vanilin-reagens (3 g vanilin i 75 ml ethanol og 25 ml 85 % phosphorsyre) og opvarmes til 80 °C. Antibioticumet CP-63517 viser sig som en grønlig plet. Den udviklede tic-plade kan også over-20 hældes med agar podet med enten S. aureus eller B. subtilis, hvortil der er sat tetrazolium-farve 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid-monohydrat, 98 % Aldrich Chemical CO., Inc. T-8485-9), og inkuberes ved 37 °C i 16 timer for at visualisere 25 antibioticumet (hvidt mod en lyserød baggrund).

Opskalering i store fermentorer blev udført ved fremstilling af rystekolber indeholdende 0,7 liter CL13MZ-eller JDY TT-medium. Rystekolbeinoculumet blev gæret i 3-5 dage ved 28 °C og anvendt til at pode 30 en 190 eller 6540 liters fermentor indeholdende 96 eller 4600 liter JDY TT-medium. Der anvendtes omkring 1 liter inoculum i tanken. Efter gæring i 5-7 dage blev fermentoren indhøstet, hvorved der blev opnået henholdsvis 96 eller 4230 liter. Hele dyrknings-35 væsken blev ekstraheret med 1/5 volumen .methyliso-

DK 158988 B

15 butylketon ved naturligt pH, adskilt på en Alpha DeLaval separator eller en Podbielniak extractor, og opløsningsmidlet blev koncentreret i vacuum til en olie. Olien blev yderligere koncentreret til en 5 sirup, som blev suspenderet i heptan, omrørt med silicagel, filtreret igennem et lag af silicagel og vasket gentagne gange med heptan. Antibioticumet blev elueret trinvis med chloroform, chloroform/-ethylacetat, ethylacetat og endelig 50 % acetone i 10 ethylacetat. Elueringen blev efterfulgt af tyndt-lagschromatografi og bioprøvning af fraktionerne.

De aktive fraktioner blev kombineret, koncentreret og chromatograferet igen for at isolere antibioticumet CP-63517. Passage af de aktive eluater igennem en 15 søjle af granulært kul fjernede forstyrrende materialer og forbedrede udvindingen, således at der blev udvundet krystallinsk CP-63517.

Den antibiotiske forbindelse ifølge opfindelsen med formlen (I) er sur, og den vil danne kationsalte 20 ved omsætning med basiske midler. Alle sådanne salte er omfattet af opfindelsen. Disse salte fremstilles ved konventionelle metoder for (ionophore) poly-ether-antibiotica. Ved en metode vaskes en opløsning af forbindelsen med formlen (I) i et flygtigt, med 25 vand ublandbart organisk opløsningsmiddel med en vandig opløsning indeholdende mindst ét støkiometrisk ækvivalent og fortrinsvis et stort overskud af et passende basisk middel. Efter tørring af den organiske opløsning, inddampes den i vacuum til op-30 nåelse af det ønskede kationsalt. Typiske basiske midler, som kan anvendes til dette formål, inkluderer alkalimetalhydroxider, såsom natriumhydroxid og kaliumhydroxid, jordalkalimetalhydroxider, såsom calciumhydroxid og bariumhydroxid, og ammoniumhydroxid.

35 Antibioticumet CP-63517 udviser inhiberende virkning på væksten af et antal Gram-positive mikroorganismer.

I tabel I nedenfor sammenfattes resultaterne af in

DK 158988 B

16 vitro MIC-prøvninger. Til denne prøvning podes hver organisme i en række reagensglas med CP-63517 for at bestemme den minimale koncentration af antibioticumet i jLig/ml, som inhiberer organismens vækst over et 5 tidsrum på 24 timer (MIC).

Svinedysenteri er en af de mest almindelige svine-sygdomme i U.S.A. Desuden er sygdommen fremherskende i mange andre lande og forårsager årligt tab for mange tusinder af dollars for svineavlere rundt 10 om i verden. Det er for nyligt blevet opdaget, at en stor spirchæt er den forårsagende organisme for sygdommen. Denne organisme, Treponema hyody-senteriae, er nu blevet isoleret og vist at være i stand til at frembringe sygdommen [Harris, D.L. et al., 15 "Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med/SAC, 67: 61-64: 1972]. Prøvnings- ; data, som er citeret i det følgende, vedrører prøvninger gennemført med denne organisme. Det må bemærkes, 20 at det ikke vides, om T. hyodysenteriae er den eneste forårsagende organisme for svinedysenteri. Af de tilgængelige data kan det imidlertid konkluderes, at den er en primær kilde til infektionen.

DK 158988 B

17

TABEL I

CR-63517.

Organisme MIC jjq/ml

Staphylococcus aureus 01A005 0.39 01A052 0.39 5 01A110 0.39 01A106 0.78 01A539 0.78 01A543 3.12

Staphylococcus eoidermidis 01B087 0.78 10 01B111 0.39

Streptococcus pyogenes 020054 0.10

Erysio. rhusio 04A005 0.39

Lactobacillus casei .09B001 0.39 L. catenaforme 09C001 0.39 15 Corynebacterium pyocrenes 11D001 12.5 11D002 12.5 11D003 12.5 . Peptococcus sp. 17B001 <0.10

Haemophilus parahemol. 54B002 25 20 Pasteurella multocida 59A013 50 59A048 0.39 P. haemolytica 59B018 0.39 59B046 0.39 59B061 50 25 Bordetella bronchi 73A006 0.39 73A016 6.25

Bacteroides vulgates 78E032 25

Fusobacterium plauti 84G001 0.39 F. necrophorum 84C0Q4 25 30 Moraxella bovis 93A001 50

Treponema hyodysenteriae 94A001 6.25 94A002 6.25

DK 158988B

18

Den velkendte protozoiske sygdom, coccidiosis, ved-bliver at være et alvorligt problem, og dens bekæmpelse er af økonomisk betydning for veterinærvidenskaben, især for fjærkræindustrien. Coccidiosis er 5 resultatet af infektion med en eller flere arter af Eimeria eller Isospora (med henblik på en sammenfatning, se Lund og Farr i "Diseases of Poultry", 5th. ed., Biester and Schwarte, Eds., Iowa State Univeristy Press, Ames, la., 1965, side 1056-1096. Der er seks 10 arter af coccidier, som frembringer let skelnelig morbiditet hos modtagelige kyllinger. Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima og E. mivati frembringer skade enten direkte ved nedbrydning af epithelceller i fordøjelsesvejen eller 15 indirekte via produktion af toxiner. Tre andre arter af protozoer, som tilhører den samme slægt, antages at være relativt uskadelige; imidlertid er E. mitis E. hagani og E. praecox i stand til at reducere tilvækst, nedsætte fodereffektivitet og indvirke skade-20 ligt på ægproduktionen.

Antibioticum CP-63517 og dens kationsalte udviser udmærket aktivitet over for coccidie-infektioner hos fjærkræ. Når de inkorporeres i kyllingers foder i niveauer på 5-40 ppm, er disse forbindelser effektive 25 til at bekæmpe infektioner, som skyldes Eimeria tenella og E. acervulina.

Effektivitetsdata for antibioticum CP-63517 og dets salte over for coccidieinfektioner hos kyllinger blev opnået på følgende måde. Grupper på 3-5 ti dage gamle 30 SPF white leghorn cockerel kyllinger blev fodret med en mæsk indeholdende antibioticum CP-63517, dets na-triurTw og/eller kaliumsalt eller kendte midler

DK 158988 B

19

Monensin eller Stenorol ensartet dispergeret deri.

Efter at have været på denne ration i 24 timer blev hvBE kylling indpodet per os med oocyster af den bebestemte art af Eimeria, som skulle prøves. Andre grup-5 per på 3-5 ti dage gamle kyllinger blev fodret med lignende mæsk uden nogen prøveforbindelse. De blev også inficeret efter 24 timer og tjente som inficerede kontroldyr. Endnu en anden gruppe på 3-5 ti dage gamle kyllinger blev fodret med mæsken uden nogen 10 prøveforbindelse og blev ikke inficeret med coccidier.

Disse tjente som normale kontroldyr. Resultaterne af behandlingen blev bedømt efter 5 dage i tilfælde af E. acervulina og 6 dage for andre udsættelser. Tabel II sammenfatter de opnåede resultater.

DK 158988 B

20

"co „ n a ooor^oo^^-.o<-s H

-g n N n a ιοσίΓ-πσισονοο in

^ oorrioroHwmioio· oooohco s? -p Hcnior^oiocoio cn ^j· H

^ />* #·"% ^ <»» ^ Λ Λ Λ <Μ^*-η-~ηΓΟΟΟΟΟ o o o ro roinoor-vomcN co o • · · · ·*···»··*«· i oooo ooooooooo o

r—I

o o\cn h o o o o o -c οοοοηοιοοοιηιθΜ"!ΡΐηΗο y ·>·< *ι·>·ι·.%·»·.·ι·»·ΐ^*ι^*

£ OOOOOOOOOOOOOOHO

-D

2 ^ o oooo op-oonMio^rio o -P -H .... ......... .

HjJ OOOH HH OOMHOOO O

co ω .§-c~. ooooonnooc^N^æocjo 'γ··Η

c ΟΟΟΟι—ΙΟΓΊΟΟγΗ«—ΙΟΟι—ICNO

0 lp

W O CO

1—1 _1 m s r- < ω I ·, .η aooooinorocnmoooootncn co ^ cn cj H cs in «a· m n h

o i—I

0

«S - (U

C G

•H iH

flj flj Rt r-' i-i

r-1 H - H 5 G

i—I iH rH k* ^

(1) (DO) Vi U

.G G G 0) <D

1 <U Φ Oi C O

g +1 -P +> K fO

0 •H (tJ tf tf ft tf

«Ρ -P *H ·Ρ iH *r *H

£ P P M J- M

£ ® <u aa) o; <u c ε ε ε ε ε ι—i -ri «Η *Η ·Η ·Η Η WWW Η 1.,1-- C Η r- Ή 1 “ ** Ή Ο γ* Ο ο i2 ^ W Μ ** Μ V ω η C Ο « Ο

Ν w <U G Ό C

5 c ι G d> I <D

g ft O -P ft -P

o. Q ϋ S ω u w

DK 158988 B

21

O

~ -P C >n P

ω co p · o I— ^ p 05 ^ l·— r-i

VJD r, - (D C -P O O

cj\ -ρ->·05θ-ΡΓ~·ωρ

Η <D-C-PC005COChC-P

w +JO-H.QCCQrHCDC

•PCB .C ' -P O

r^. B^-HPOC C PiC

[Λ -H _J -P CD Η) ·Η \0 -H

, f-, 4J o -p CA O 05

ΙΛ P(C · < p .CO I O. O

CO Ld CO O CD O CO CD

- · r-i D IA C P

o\| .η n co ω o- o- ocd

00 CO -Η P CO ·Η ·· ·Η O

ri P O XI C 0C5| 05 -H

• O CD O C P r N| (B p

O -Η -P O CO CD O Ή C

JJ o O l·- O O 05 · -H

m LO· U CD O CD Ό I— -P CD

O' O O T3 CD -Η P C

r. -CM CJCO-H H Dl Cl) Φ ID

"Γ E i—I ·Ηι—l-P P P C CO O O

£ CD -Ρ Ή C O CO ·Η P Ή

[Γ .c o CCDCO-OPCOBP

7“ U CM CO C O O O- -H O

IA (D 0— ΓΛ O O l·-

• CD -P O I P LO

77 p IA r-| OCD Q.-PCD

ρω °co co c c X CO c I ω ECO E -H O Dl P o LU ω ,1 -p < O p -Η O ω ·Η O 4-) r: co -pcD-P o co - ω c

jo +j ·. coeco··' ω = b -h rz i—I 005 -H O ^ 05 O

3 PiC rPU^HiHE DC P Q.

CI5 ·.< ω ·Η CO MO CD · O 05 CD

ω CO · -PPBQl-PCO-HPC

f_i VO Cp OLdiHCDOIXCDO

co LT\ -P l·- —- >-> O CP I—I -P

ω ω o >-» co p jo co 05 P CO C<rPM0-PQCC0 83 r—I O ω I CO CM C -Ρ -Ρ Ή ω lA·' > o ε γα ·ρ ή ω cn C ·Η I Ο CO 05 Τ) CO ΙΑ = ΙΟ·ΙΟΡίΟ.·ΗΡ>0) -p ω Q.O.CVJ O C CD Ε c u~> c > ia -ρ -ρ ω rp ω o o ω-ρω ooeocd σι c i—i c _c · o ο ή o.

• -P D ·Η P Ni O P O O.

14 050 O CM | 0- O CD Ή 3

ω _Y 3 PO.P CO -P Q- O P

ωο- 05050· -PX.CU1

p .O -OCCt-COCCLdP

σο_π-ι o ω o < 04P

05 CO •'•POQC-piCP-CD

ω ωχ ρ co o -p ω m 44 05= 05830^05^0-4-)0

c W -Hi—I P P P D CC

σ - p ωω-H-Hpcoco p r r ω-ΡΞίορ-ωο-ρχ co o i—i -p -p oc o co ω

D. -HO -P O 3 · O -Η C -O

co ρ ρ o ω η o · l_ o

-H CO PC -Ρ X EX PC P

ω c cd · o ω γ-η c ω oo<e°co«c-p>

CO O-P Q-OrsCQ-ZBcaLd-C

ξ: cn

- - r—I

DK 158988B

22

Som angivet ved dataene i tabel I har det hidtil — ukendte antibiotiske stof ifølge opfindelsen anti- bakteriel aktivitet over for en række forskellige Gram-positive bakterier, såsom Staphylococcus 5 aureus, Staphylococcus epidermidis og Streptococcus pyogenes. Dette gør forbindelsen med formlen (I) og dens salte nyttige til sanitetsformål, såsom vask-ning af hænder og sterilisering af hospitalsoverflader- og udstyr.

10 Endvidere har den antibiotiske forbindelse med formlen (I) aktivitet over for Treponema hyodysenteriae, en mikroorganisme som forårsager dysenteri hos svin. I overensstemmelse hermed er det antibiotiske stof ifølge opfindelsen:.meti formlen (I) nyttigt til bekæm-15 pelse af svinedysenteri. Til dette formål kan forbindelsen med formlen (I) indgives til svin alene eller, fortrinsvis, i et farmaceutisk præparat, hvori forbindelsen med formlen (I) er blandet med en farmaceutisk acceptabel bærer eller fortyndingsmiddel.

20 Et farmaceutisk præparat fremstilles ifølge standardprocedurer for et veterinært antibioticum. F.eks. kan der fremstilles kapsler ved fyldning af gelatinekapsler med forbindelsen med formlen (I), passende fortyndet med et inert fortyndingsmiddel, såsom glu-25 cose, lactose, saccharose, stivelse eller cellulose.

Tabletter kan fremstilles på konventionel måde, f.eks. ved komprimering af en blanding af forbindelsen med formlen (I), et fortyndingsmiddel, såsom lactose eller stivelse, et bindemiddel, såsom gelatine eller guar-30 gummi, og et glittemiddel, såsom magnesiumstearat eller paraffinvoks. Ligeledes kan forbindelsen med formlen (I) indgives oralt i form af elixirer, sirupper, opløsninger og suspensioner. Opløsninger og suspensioner kan være vandige, ikke-vandige eller

DK 158988 B

23 delvis vandige. Til parenteral indgivning foretrækkes sterile vandige opløsninger. Parenteral indgivning inkluderer intramuskulær, intraperetoneal, subkutan og intravenøs brug. Til intravenøs brug bør den to-5 tale koncentration af opløste stoffer kontrolleres således, at præparatet gøres isotonisk.

Mængdeforholdet mellem forbindelsen med formlen (I) og den farmaceutisk acceptable bærer vil afhænge af den overvejede dosering og indgivningsvejen; imidler-10 tid vil mængdeforholdet normalt være i området 1:10 til 2:1, især 1:5 til 1:1.

Hvis forbindelsen med formlen (I) skal anvendes til at bekæmpe svinedysenteri, er det også hensigtsmæssigt at indgive forbindelsen ved at blande den i 15 dyrets foder. I dette tilfælde vil forbindelsen med formlen (I) blive sat til dyrets foder i et niveau, som vil give den passende daglige dosering af forbindelsen med formlen (I).

Den udstedende dyrlæge vil i sidste ende bestemme doseringen 20 af forbindelsen med formlen (I), som vil blive indgivet for at bekæmpe svinedysenteri, og denne dosering vil variere efter indgivningsvejen og alvorligheden af dyrets symptomer. Imidlertid vil forbindelsen (I) normalt blive indgivet oralt i doseringer i om-25 rådet 20-50 mg pr. kg legemsvægt pr. dag og fortrinsvis 10-30 mg pr. kg legemsvægt pr. dag, sædvanligvis i delte doser. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at anvende doseringer uden for.disse områder..

Endvidere forøger antibioticumet med formlen (I) 30 ifølge opfindelsen og de farmaceutisk acceptable basesalte deraf effektiviteten af foderudnyttelse hos svin

DK 158988 B

u og drøvtyggere, dvs. de virker vækstfremmende. Meka-nismen for udnyttelsen af hovednæringsportionen (carbonhydrater) af drøvtyggerfodere er velkendt. Mikroorganismer i dyrets vom nedbryder carbonhydrater 5 til dannelse af monosaccharider og omdanner derpå disse monosaccharider til pyruvatforbindelser. Pyru-vater metaboliseres ved mikrobiologiske processer til dannelse af acetater, butyrater eller propionater, tilsammen kendt som flygtige fede syrer (UFA). Med 10 henblik på en mere detaljeret omtale, se Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, side 408-410.

Den relative effektivitet af VFA-udnyttelse diskuteres 15 af McCullough i "Feedstuffs", 19. juni 1971; og Church et al., i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, 1971, side 622 og 625. Selv om acetater og butyrater udnyttes, udnyttes propionater med større effektivitet. En gavnlig forbindelse sti-20 mulerer derfor dyret til at producere en højere andel af propionater ud fra carbonhydrater, hvorved de forøger carbonhydratudnyttelseseffektiviteten.

Værdien af dyrefodere er almindeligvis blevet bestemt direkte ved fodring af dyret. GB patentskrift nr.

25 1 197 826 angiver en in vitro vomteknik, hvorved de ændringer i fodere, som frembringes af mikroorganismer, måles lettere og med større nøjagtighed ved bedømmelsen af dyrefodere. Denne teknik involverer anvendelsen af et apparat, hvori dyrets fordøjelsesprocesser 30 gennemføres og undersøges in vitro. Dyrefoderne, vom-inoculumet og forskellige vækstfremmende midler indføres i og udtrækkes fra en laboratorieenhed under omhyggeligt styrede betingelser, og de ændringer, der finder sted, undersøges kritisk og fremadskridende

DK 158988 B

25 under mikroorganismernes forbrug af foderet. En forøgelse i propionsyreindholdet i vomvæsken angiver, at der er blevet frembragt en ønskelig reaktion i samlet vomfunktion af det vækstfremmende middel i fodersammensætningen. Ændringen i propionsyreindhol-5 det udtrykkes som procent af det propionsyreindhold, der findes i kontrolvomvæsken. Langsigtede in vivo fodringsundersøgelser anvendes til at vise en pålidelig korrelation mellem propionsyreforøgelse i vomvæsken og forbedret dyreoptræden.

10 Vomvæske opsamles fra en fistuleret kalv, som fodres med en kommerciel opfedningsration plus hø. Vomvæsken filtreres umiddelbart igennem osteklæde, og 10 ml sættes til en 50 ml konisk kolbe indeholdende 400 mg standardsubstrat (68% majsstivelse + 17 % cellulose + 15 15 % ekstraheret sojabønnemel), 10 ml af en puffer ved pH 6,8 og prøveforbindelsen. Kolberne gennem-blæses med oxygenfrit nitrogen i omkring 2 minutter og inkuberes i et rystende vandbad ved 39 °C i omkring 16 timer. Alle prøvninger gennemføres tredobbelt.

20 Efter inkubation blandes 5 ml af prøven med 1 ml 25 % metaphosphorsyre. Efter 10 minutter tilsættes 0,25 ml myresyre, og blandingen centrifugeres ved 1500 omdr./min i 10 minutter. Prøver analyseres derpå ved gas-væske-chromatografi ved metoden beskrevet af 25 D.W. Kellog, J. Dairy Science, 52^, 1690 (1969). Maksimumshøjder for eddikesyre, propionsyre og smørsyre bestemmes for prøver fra ubehandlede og behandlede inkubationskolber.

Når det blev prøvet ved denne in vitro procedure gav 30 antibioticum CP-63517 -i niveauer på 20 og 10 ^ig/ml anledning til forøgelser på henholdsvis 96 % og 95 % i produktionen af propionsyre i forhold til produktet 26

DK 15 8 9 8 8 B

i kontrolopløsningen uden tilsat antibioticum CP-63517.

Ved sammenligning frembragte det kommercielt tilgængelige "Monensin" (et andet polycyclisk-ether-antibioti-cum) ved 10^ug/ml omkring 20 % forøgelse af propion-5 syren i forhold til kontrollen [J. Arner. Chem. Soc., 89, 5737 (1967)],' og det førnævnte antibioticum 53607 frembragte ved 20yug/ml en forøgelse på 57 % af pro-pionsyreproduktionen (US 4 361 649).

Når det blev sammenlignet med "Salinomycin" [J. Anti-10 biotics, 2J_: 814 (1974)], frembragte antibioticum CP- 63517 omkring 86 % forøgelse i propionsyren ved niveauet 20 yug/ml og omkring 66 % forøgelse ved 5 ^jg/ml sammenlignet med forøgelsen på omkring 65 % for "Salinomycin" ved 10 yug/ml og en forøgelse på omkring 43 % ved 20 15 ^ug/ml og omkring 40 ved 5 yjg/ml for antibioticum 53607 (US 4 361 649).

På basis af disse data kan det forudsiges, at antibioticum CP-63517 vil forbedre foderudnyttelsen hos drøvtyggere, såsom kvæg og får, og hos monogastriske dyr, 20 såsom svin og kaniner. Antibioticum CP-63517 kan inkorporeres i fodersammensætninger som den frie syre, natriumsaltet, kaliumsaltet eller blandinger deraf.

Rå former af antibioticum CP-63517 eller tørret gæringvæske indeholdende antibioticumet kan inkorporeres i 25 fodersammensætninger i koncentrationer, der giver den ønskede styrke.

Det følgende eksempel tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

30 EKSEMPEL

Isoleriq af antibioticum CP-63517 fra qærinqsvæske Hele væsken fra en 10 beholders gæring af kulturen ATCC-

DK 158988 B

27 39574 ( totalvolumen omkring 25 liter) blev ekstraheret med det halve volumen methylisobutylketon. Ekstrakten blev koncentreret i vacuum til en brun olie (20 g).

Dette materiale blev chromatograferet på en 5 x 100 5 cm søjle pakket med en silicagel af chromatografisk kvalitet i ethylacetat. Søjlen blev udviklet med ethylacetat med en strømningshastighed’på 10 ml/min, og der blev optaget fraktioner på 10 ml hver. Disse fraktioner blev undersøgt ved tyndtlagschromatografi på 10 silicagel-plader udviklet i ethylacetat. Pladerne blev sprøjtet med 3 % vanilin i ethanol/85 % phosphor-syre (3:1) og opvarmet til 80 °C. Det ønskede anti-bioticum CP 63517 viser sig som en grøn plet under disse betingelser. Fraktionerne indeholdende CP 63517 15 blev kombineret (totalvolumen omkring 300 ml) og om- rørt med 2 g "Darco G60" kul (ICI America Inc.

Wilmington, Delaware 19899, U.S.A.) i 15 minutter.

Blandingen blev filtreret, og filtratet blev omrørt med 300 ml 5 % dibasisk natriumphosphat-puffer, og 20 pH-værdien blev indstillet til 10,0 med 1 N natrium hydroxidopløsning. Faserne blev adskilt, og ethyl-acetatopløsningen blev tørret over vand frit natrium-sulfat, filtreret og inddampet i vacuum. Den gule viskøse olie, som blev tilbage efter inddampningen, 25 blev opløst i et lille volumen acetone, hvorpå der skete krystallisation. Krystallerne blev opsamlet ved filtrering og tørret i vacuum, hvorved der blev opnået 800 mg CP-63517 som natriumsaltet; smp. 215-220 °C, UV ?\ 232 nm, e}% = 155. Infrarødt spektrum 30 (KBr) cm"1: 3436, 2964, 2928, 287o, 2728, 1666, 1563, 1462, 1404, 1372, 1319, 1293, 1271, 1234, 1205, 1167, 1100, 1050, 1033, 995, 980, 967, 940, 926, 858, 538.

Optisk drejning [α]ρ = +25° (C = 0,5 methanol).

Analyse: beregnet for C^H-^Oj^Na: C 63,49,- H 8,89; N 0,0; 35 fundet: C 62,45; H 8,61; N 0,0.

DK 158988B

28

Den frie syreform af CP 63517 blev fremstillet ved omrøring af en chloroformopløsning af CP-63517 med et lige så stort volumen vand og sænkning af pH-værdien til 3,0 med phosphorsyre. Faserne blev derpå adskilt, 5 og chloroformopløsningen blev inddampet i vacuum til opnåelse af den frie syre af CP-63517 som et amorft fast stof; smp: 95-105 °C, UV % 232 nm, Eil.-.: 161.

r i max

Infrarødt spektrum (KBr) cm : 3474, 2968, 2932, 2877, 1715, 1670, 1460, 1380, 1315, 1265, 1233, 1202, 1165, 10 1113. 1099, 1066, 1046, 1021, 987, 950, 923, 900.

Optisk drejning: C Cd 3 p = +47,4° (C = 0,5 methanol).

Analyse: beregnet for C^HygO.^: C 65,10; H 9,07; 0 25,83; fundet: C 64,05; H 8,93; 0 27,03 som forskel) 15 Strukturen (I) af CP-63517 blev bestemt ved et ^H-NMR og højopløsnings-massespektrografi udført af Earl B. Whipple, PhD. og R.S. Ware, Central Research,

Pfizer Inc., Groton, Connecticut, U.S.A.

Claims (8)

1. Polycyclisk-ether-antibioticum, betegnet CP -63517, med formlen OMe (Ty-He OH / Me f O Me w Me 5 /e \ o i 1/-4 r i /_ h )— Me. || . I ^ 1/ d \ ^ [/ n \/ / p \ I i I I Η η Η H i0', C02a Me Me Me Me ^ 'α^ΟΗ (I) hvori Me betyder methyl, og farmaceutisk acceptable kation-5 salte deraf.

2. Antibioticum ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i form af natrium- eller kaliumsaltet.

3. Fremgangsmåde til forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos svin eller kvæg, kendetegnet ved, 10 at svinene eller kvæget indgives en foderudnyttelsesfor bedrende mængde af antibioticumet ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt kationsalt deraf.

4. Foderblanding til kvæg eller svin, kendetegnet ved, at den indeholder antibioticumet ifølge krav 1, i en 15 mængde, som er effektiv til at forbedre foderudnyttelsen og fremme væksten af kvæget eller svinene. DK 158988 B

5. Fremgangsmåde til fremstilling af antibioticumet ifølge krav 1 eller farmaceutisk acceptable kationsalte deraf, kendetegnet ved, at Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-39574 eller en mutation deraf med væsentlig 5 samme egenskaber og med evne til at producere antibioticumet ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt kationsalt deraf dyrkes i et vandigt næringsmedium indeholdende assimi-lerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte under submerse, aerobe gæringsbetingelser, indtil der er produceret 10 en udvindelig mængde af antibioticumet eller et farmaceutisk acceptabelt kationsalt deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den nævnteStreptomyces endus subsp. aureus er stammen ATCC-39574.

7. Biologisk ren kultur af stammen Streptomyces endus subsp. aureus ATCC-39574, som er i stand til at producere antibioticumet ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt kationsalt deraf i udvindelig mængde, til anvendelse ved udøvelse 20 af fremgangsmåden ifølge krav 5.

8. Biologisk ren kultur ifølge krav 7 i frysetørret form.