HU203789B - Process for producing polycyclic acidic ether-type antibiotica of anticoccidial and growth-stimulating activity - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás (I) általános képletű - a képletben Me—CH3 - új savas policiklusos éter típusú antibiotikum - amely abszolút sztereokémiája a képletnek felel meg - és gyógyászati szempontból elfogadható kationos sóik előállítására, mely tápanyagkeverékek előállítására alkalmas, amelyek baromfi-, szarvasmarha- vagy sertéstápként szolgálnak.

Az (I) általános képletű vegyület az antibiotikumok savas policiklusos étercsoportjához tartozik. Ez a család olyan jól ismert vegyületeket foglal magában, mint

- a monenzim (The Merck Index, 10. kiadás, Merck and Co., Inc., Rahway, N.J., 1983; 6100 sz. címszó),

- a nigericin (ugyanitt, 6390 sz. címszó),

- a narazin (ugyanitt, 6271 sz. címszó),

- a laszalocid (ugyanitt, 5204 sz. címszó) és

- a szalinomicin (ugyanitt, 8193 sz. címszó).

A témával foglalkozik Westley cikke [Polyether Antibiotics, Adv. Appl. Microbiol., 22, 177-223 (1977)].

A találmány szerinti vegyülethez szeikezetileg legközelebb áll a portmicin. Ezt az antibiotikumot egymástól függetlenül írják le a következő irodalmi helyek;

- Hamill et al., 4 582 822 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás,

- Kusakabe et al., 158 179 sz. európai szabadalmi bejelentés,

- Tetrahedron Letters, 28, 3357-3360 (1987),

- J. Antibiotics, 40,237-238 (1987).

Ez az utóbbi vegyület a tetrahidrofurán B gyűrűn egy alfa-hidrogénatomot tartalmaz, míg a találmány szerinti vegyület ugyanezen a helyen egy alfa-metilcsoportot hordoz.

Az említett vegyületeket általában kokcidiosztatikumként, takarmányadalékként (a növekedés elősegítésére) és/vagy a sertés-dizentéria ellen használható szerként ismerik.

Az Actinomadura sp. ATCC 53708 tenyészete, vizes közegben aerob körülmények között fermentálva, egy új savas policiklusos éter antibiotikumot, az előbbiekben meghatározott (I) képletű vegyületet termel.

A találmány tárgya eljárás az említett (I) képletű vegyület előállítására - ideértve ennek gyógyászati szempontból elfogadható kationos sóit -, amely abból áll, hogy az említett Actinomadura sp. ATCC 53708 törzset vizes táptalajban - amely asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmaz - fermentáljuk, előnyösen süllyesztett aerob körülmények között, amíg kinyer hető mennyiségű említett (I) képletű vegyület képződik.

Antikokcidiális szerként, a sertés-dizentéria megelőzésére vagy kezelésére és/vagy növekedést fokozó anyagként való felhasználás esetén az (I) képletű vegyületet nem feltétlenül különítjük el a fermentléből és állítjuk elő lényegében tiszta alakban, hanem esetleg nyers alakban használjuk fel: vagy kicsapott formában, micéliummal keverve (ezt a fermentléből szűréssel nyerjük ki) vagy olyan szilárd anyagként, amelyet a teljes fermentlé porlasztva vagy fagyasztva szárításával állítunk elő.

Az említett, gyógyászati szempontból elfogadható kationos sók közé tartoznak a következők, de a fogalom nem korlátozódik ezekre: nátrium-, kálium-, kalci2 um-, ammónium-, Ν,Ν’-dibenzil-etilén-diamin-, N-metil-glukamin-(meglumin) és dietanol-amin-só. Kitüntetett kationos só a kálium- és a nátriumsó.

A hatóanyagokból előállítható tápkeverékek egyike szarvasmarha vagy sertés takarmányozására használható és az (I) képletű vegyületet olyan mennyiségben tartalmazza, amely hatásos ezekben az állatokban a növekedés elősegítése és/vagy a takaimányhasznosítás vonatkozásában vagy sertések esetében a dizentéria megelőzésére vagy kezelésére.

A másik baromfi esetében alkalmazható és az (I) képletű vegyületet olyan mennyiségben tartalmazza, amely hatásos a baromfiban fellépő kokcidiális fertőzés leküzdésére.

Ugyancsak alkalmazható a hatóanyag a növekedés elősegítésére és/vagy a takarmányhasznosítás hatékonyságának fokozására sertésben és szarvasmarhában. Az eljárás abban áll, hogy a sertésnek vagy szarvasmarhának az (I) vegyületet a növekedést elősegítő vagy a takaimányhasznosítás hatékonyságát fokozó mennyiségben - különösen táp-takarmánykeverék alakjában - beadjuk. Alkalmazható a dizentéria megelőzésére vagy kezelésére sertésben, amely abból áll, hogy a sertésnek olyan mennyiségben adjuk be az (I) képletű vegyületet, amely hatásos a dizentéria sertésben való megelőzése vagy kezelése tekintetében, és alkalmazható a kokcidiális fertőzés kiküszöbölésére baromfiban, amely abból áll, hogy a baromfinak az (I) képletű vegyület antikokcidiálisan hatásos mennyiségét adagoljuk be, különösen takarmánykeverék alakjában.

A találmány szerinti (I) képletű policiklusos éter antibiotikum termelésére képes tenyészetet Actinomadura sp.-ként nevezzük meg. Ezt az ATCC-ben (Rockville, Maryland) helyeztük letétbe, típustenyészetként, az 53708 számon. A szabadalom megadása esetén a szabadalom oltalmi ideje alatt biztosítjuk, hogy ez a letétbe helyezés állandó érvényben maradjon az ATCC-ben és a köz számára könnyen hozzáfélhető legyen a tenyészet.

Az új tenyészetet egy talajmintából (Tuzla, Isztambul, Törökország) különítettük el és a Pfizer Inc. törzsgyűjteményében az N777-1 számon tartottuk nyilván. A tenyészet leírását és osztályozását L.H. Huang végezte. Azt találta, hogy a tenyészet az actinomycetesekre jellemző, szűk mérethatárok közé eső hifákat termeli, valalmint jellemző egy olyan légmicélium, amelyen rövid spóraláncok jelennek meg és egy nemfragmentált szubsztrát-micélium. A teljes sejtelemzés eredményei ugyancsak azt jelzik, hogy a törzs az Actinomadura genushoz tartozik.

A mikroorganizmus ferde agar tenyészetét ATCC 172 húslevesbe visszük be és rázógépen 4 napon át 28’C-on tenyésztjük. A tenyészetet 20 percen át centrifugáljuk, háromszor mossuk steril desztillált vízzel és olyan táptalajokra visszük át, amelyeket általában alkalmaznak az Actinomycetales azonosítására.

A tenyésztést 28 'C-on végezzük és az eredményeket különböző időpontokban, de legáltalánosabban a 14. napon olvassuk le. A színeket a kialakult terminológiának

HU 203 789 Β megfelelően írjuk le, de a pontos színeket a „The Color Harmony Manual” 4. kiadása szerinti színszalagokkal való összehasonlítás alapján határozzuk meg.

A teljes sejt aminosav- és cukormeghatározását a következő módszerek szerint végezzük:

- Becker et al., Appl. Microbiol., 72,421-423,1964;

- Stanecket al., Appl. Microbiol., 25, 226-231, 1974;

- Lechevalier, J. Láb. Clin. Med., 77,934-944,1968.

A tenyészetet a következőképpen azonosítottuk:

Élesztőkivonat-malátakivonat agar (ISP#2 közeg,

Difco)

Jó növekedés, krémszínűtől (2 ca) sötésszürke-fekete pontokkal feketéig (szürkéhez közeli sorozat: 5iH, 5 ml); kiemelkedő, ráncos; légmicélium: nullától gyengéig, színtelen; fonák: krémszínűtől halványsárgáig (2 ca, 2 ea) fekete (szürkéhez közeli sorozat 5 ml) pontokkal; oldható pigment nincs jelen.

Zablisztagar (ISP#3 közeg, Difco)

Mérsékelt növekedés, krémszínű (2 ca), kissé kiemelkedő, laza; légmicélium: nullától gyérig,, színtelen; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment krémszínű (2 ca).

Szervetlen só - keményítő agar (ISP#4 közeg,

Difco)

Gyenge növekedés, krémszínű (2 ca), vékony, lágy; légmicélium: nullától gyérig, színtelen; fonák: krémszínű (2 ca), oldható pigment nincs.

Glicerin-aszparagin agar (ISP#5 közeg, Difco)

Növekedés: gyengétől mérsékeltig, krémszínű (2 ca), vékony, puha; légmicélium nincs; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment nincs.

Czapek-szacharóz agar (Waksman: The Actinomycetes. Vol. 2, 328, #1 sz. közeg; 1961)

Növekedés: mérsékelttől jóig, krémszínű (2 ca), mérsékelten kiemelkedő, puha; légmicélium nincs; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment nincs.

Glükóz-aszparagin agar (ugyanitt, #2 sz. közeg)

Mérsékelt növekedés, krémszínű (2 ca), vékonytól mérsékelten kiemelkedőig; puhától ráncosig; légmicélium nincs; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment nincs jelen.

Gordon-Smith-f. tirozin agar (Gordon-Smith: J. Bact. 69,147-150,1955)

Növekedés mérsékelttől jóig, krémszínű (2 ca), kissé kiemelkedőtől mérsékelten kiemelkedőig, simától ráncosig; légmicélium nincs; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment halványsárgás (2 ea).

Kalcium-malát agar (Waksman: Bact. Rév. 27, 129,1957)

Gyér növekedés, krémszínű (2 ca), vékony, sima; légmicélium nincs; fonák: krémszínű (2 ca), oldható pigment nincs.

Kazeinagar (Gordon-Smith, 1. az előbbiekben)

Jó növekedés, krémszínű (2 ca), kiemelkedő, simától ráncosig; légmicélium nincs; fonák: halvány sárgás (2 ea), sárgás (2 ga) oldható pigmenttel.

Benett-f. agar (Waksman, 1. az idézett könyvet, #30. sz. közeg, 331. o.)

Jó növekedés, krémszínű (2 ca), kiemelkedő, ráncos, légmicélium nélkül; fonák: krémszínűtől halványsárgásig (2 ca, 2 ea); oldható pigment halványsárgás (2 ea).

Emerson-agar (ugyanitt, #28. sz. közeg, 331. o.) Mérsékelt növekedés, krémszínűtől halványsárgásig (2 ca, 2 ea); kiemelkedő, ráncos; légmicélium nincs, fonák sárgás (2 ic), oldható pigment nincs.

Tápagar (ugyanitt, #14. sz. közeg, 330. o.) Növekedés: gyengétől mérsékeltig, krémszínű (2 ca), vékonytól enyhén kiemelkedőig; légmicélium nincs; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment nincs.

Zselatinagar (Gordon és Mihm, J. Bact. 73, 15-27,

1957)

Jó növekedés, krémszínű (2 ca), kiemelkedő, ráncos; légmicélium nincs; fonák: krémszínűtől halványsáigásig (2 ca, 2 ea); oldható pigment halványsárga (2 ea).

Keményítő agar (ugyanitt)

Jó növekedés, krémszínű (2 ca), kiemelkedő, ráncos; légmicélium nincs; fonák: krémszínűtől halványsárgásig (2 ca, 2 ea); oldható pigment nincs.

Burgonya-sárgarépa agar (Lechevalier Láb. Clin. Med., 77, 934-944, 1968, de: 30 g burgonya, 2,5~g sárgarépa és 20 g agar)

Gyér-mérsékelt növekedés, fehéres színű (szürkéhez közeli sorozat, 2 ba), vékony, sima; légmicélium nincs vagy gyér, színtelen; fonák: színtelentől krémig (2 ca); oldható pigment nincs.

Csapvízdgar (2%-os)

Gyenge növekedés, krémszínű (2 ca), vékony, sirriS; légmicélium nullától gyérig, színtelen; fonák: színW lentől krémszínűig (2 ca); oldható pigment nincs.

Gauze-f. ásványi táptalaj (Gauze et al., Problems m the Classification of Antagonistic Actinomycetes, English Ed., 13,1957)

Gyengétől mérsékeltig terjedő növekedés, krémszínű (2 ca), vékony, sima; légmicélium nullától gyérig, színtelen; fonák: krémszínű (2 ca); oldható pigment nincs.

Gauze-f. szerves táptalaj 2. (ugyanitt)

Növekedés jó, krémszínű (2 ca), kiemelkedő, ráncos, légmicélium nincs; fonák: krémszínűtől halványsárgásig (2 ca, 2 ea); oldható pigment nincs.

Morfológiai tulajdonságok

A morfológiai tulajdonságokat 3 heti inkubálás után figyeljük meg, szervetlen só-keményítő agaron.

Légmicélium: színtelen, fehértől krémszínűig; spóraláncok egyenesek, elgörbültek vagy hurkoltak, 2-9 spóra/spóralánc; a spórák gömbszerűek, oválistól elliptikusig; átmérő 0,8-1,4 μ vagy a méret 1,1-1,8 · 0,81,2 μ; sima (pásztázó elektronmikroszkópos felvételek alapján).

Biokémiai tulajdonságok

- melamint nem termel;

- hidrogén-szulfid nem képződik;

- a zselatint folyósítja;

- a keményítőt nem hidrolizálja;

- a nitrátot nem redukálja nitritté;

- növekedés és lebontási reakció nem figyelhető meg sem Jensen-f., sem Levin-Schönlein-f. cellulózos húslevesen;

HU 203 789 Β

- a tejet nem koagulálja és nem peptonizálja;

- kazeinbontás pozitív;

- tirozinbontás negatív;

- kalcium-malát bontás negatív.

Szénhidráthasznosítás:

asszimilálja a glükózt, arabinózt, fruktózt, mannitot, ramnózt, szacharózt, xilózt, adonitot, cellobiózt, glicerint, maltózt, ribózt, keményítőt és trehalózt;

nem hasznosítja az inozitot, raffinózt, dulcitot, eritritet, galaktózt, laktózt, mannózt, melecitózt, melibiózt, alfa-metil-D-glükozidot, szalicint, szoibitot és szorbózt.

Más pozitív tesztek:

- acetát- és piruváthasznosítás;

- eszkulinhidrolízis és

- xantin- és hipoxantinlebontás.

A következő tesztek negatív eredményűek: benzoát-, citrát-, dextrin-, laktát-, malát-, mukát-, oxalát-, fenol-, propionát- és szukcináthasznosítás; adenin- és tirozinlebontás és hippuráthidrolízis.

A hőmérsékleti viszonyok hatása 'C 28 °C 37 ’C 45 ’C jó növekedés jó növekedés jó növekedés jó növekedés

Teljes sejtelemzés

A teljes sejt hidrolizátuma a következőket tartalmazza; mezo-diamino-pimelinsav, glükóz, galaktóz, maduróz, mannöz és ribóz.

Az N777-1 tenyészet jellemzői a következők:

- krémszínű szubsztrátmicélium,

- rövid, színtelen légmicélium,

- rövid spóralánc, amely lehet egyenes, görbült vagy hurkolt és sima spórafelület.

Hasznosítja a glükózt, arabinózt, fruktózt, mannitot, ramnózt, szacharózt, xilózt, adonitot, cellobiózt, glicerint, maltózt, ribózt, keményítőt, trehalózt, acetátot, és a piruvátot.

Lebontja a xantint, hipoxantint és az eszkulint.

A teljes sejthidrolizátumokban mezo-diamino-pimelinsav és maduróz van jelen.

így az N777-1 tenyészet az Actinomadura genushoz tartozónak minősül, amint ezt H. Lechevalier definiálta.

Az ismert Actinomadura speciesek közé tartoznak hasonló krémszínű szubsztrátmicéliummal és/vagy hasonló biokémiai tulajdonságokkal, a következők;

- A. cremea subsp. rifamycini,

- A. madurae subsp. simaoensis és

- A. routienii.

Az N777-1 tenyészet a sima spórák, a nitrátredukáló-képesség hiánya, a raffinózhasznosítás hiánya és az arabinóz és a ramnőz hasznosítása tekintetében különbözik az A. cremea subsp. rifamycini-től.

Az N777-1 tenyészet az A. madurae subsp. simaoensis-től abban különbözik, hogy a szubsztrátmicélium színtelentől narancsbama színével szemben inkább krémszínű; légmicéliuma inkább színtelen, mint színtelentől ibolyásfehérig terjedő színű; a nitrátot nem redukálja, a tirozint nem bontja el és képes a xantin lebontására.

Az A. routienii-vel szemben a következő különbségek állapíthatók meg; pszeudosporangiumok nem képződnek; nem hidrolizálja a keményítőt; nem koaguláltatja a tejet; képes a mannit, fruktóz és a glicerin hasznosítására.

Az N777-1 tenyészet a biokémiai tesztek többségének eredményei tekintetében hasonló az A. alboluteahoz, de a következő jellemzőkben eltér ettől; nem hidrolizálja a keményítőt; nem koaguláltatja a tejet; szubsztrátmicéliuma inkább krémszínű, mint barna-sötétbarna; a spóraláncok inkább rövidek, mint hosszúak.

Az előbbiekben bemutatott adatok alapján az N7771 tenyészetet az Actinomadura genushoz tartozónak tekintjük és „Actinomadura sp,”- ként jelüljük. Ezt a tenyészetet ATCC 53708 számon helyeztük letétbe az ATCC-ben, 1988. jan. 8-án.

A találmány szerinti (I) antibiotikum könnyen előállítható oly módon, hogy ezt az Actinomadura sp.-t 24-36 ’C hőmérsékleten süllyesztett körülmények között tenyésztjük, kevertetés és levegőztetés közben, a következő komponenseket tartalmazó táptalajokon;

- szénhidrátforrások, mint cukrok, keményítők, glicerin;

- szerves nitrogénforrások, mint szójaliszt, kazaminosavak, élesztőkivonat;

- növekedést elősegítő anyagok, mint oldható maganyagok, halliszt, gyapotmagliszt;

- ásványi sók, amelyek nyomelemeket - vas, kobalt, réz, cink stb. - tartalmaznak és

- pufferként kalcium-karbonát vagy foszfátok.

A tenyésztés befejezése után az antibiotikum könynyen kinyerhető oly módon, hogy a teljes fermentlevet egy szerves oldószerrel, így n-butanollal, metil-izobutil-ketonnal, vagy kloroformmal extraháljuk a 4,0-8,0 közötti pH-tartományban. A kicsapódott antibiotikumot tartalmazó micéliumot szűrjük és a szurletet elvetjük, vagy eljárhatunk úgy is, hogy a teljes fermentlevet porlasztva vagy fagyasztva szárítjuk.

Egy másik megoldás szerint a micéliumot vagy a teljes szárított fermentlevet az említett szerves oldószerek valamelyikével extraháljuk.

A tisztított antibiotikumot kívánt esetben a szokásos koncentrálási eljárásokkal - só- vagy szabadsav-képzés, kromatografálás, kicsapás és/vagy kristályosítás különítjük el a szerves kivonatból, amint ezt a továbbiakban példákkal szemléltetjük.

A fermentáció szokásos módon való végrehajtása esetén először inokulumot készítünk, oly módon, hogy lekaparjuk a vegetatív sejteket, amelyeket megfelelő táptalajokon, Actinomadura sp. ATCC 53708-cal beoltott ferde agarcsövekben vagy Roux-palackokban tenyésztettünk. A kapott vegetatív sejteket rázott lombikok vagy inokulumtankok beoltására használjuk fel, megfelelő táptalajok alkalmazásával.

Egy másik megoldás szerint az inokulumtankokat rázott lombiktenyészettel oltjuk be.

Megfelelő tenyésztési periódus után (ez általában 120-144 óra rázott lombikban és 168-196 óra inokulumtankban) ugyancsak megfelelő táptalajt tartalmazó fennentort oltunk be steril körülmények között a rázott

HU 203 789 Β lombikban vagy inokulumtankban előállított vegetatív tenyészettel. A növekedés befejeződése után (általában kb. 120-196 óra) az antibiotikumot - tetszés szerint nyers vagy tiszta alakban állítjuk elő az előbbiekben leírt általános módszerek valamelyikével, vagy a következőkben bemutatott speciális eljárásokkal.

Az (I) képletű vegyület in vitro antibakteriális aktivitását a szokásos módszerekkel vizsgáljuk. Ennek során a minimális gátló koncentráció (MIC) értékét határozzuk meg, pg/ml-ben, egy vagy több mikroorganizmussal szemben.

Az International Collaborative Study on Antibiotic Sensivity Testing által javasolt egyik eljárás szerint (Ericcson és Sherris.· Acta Pathol. Microbiol. Scandinav., Supp. 217, Section B, 64-68, 1971) agy-szív infúziót (BHI) tartalmazó agart és inokulumreplikáló berendezést alkalmazunk. A beoltott kémcsöveket egy éjjelen át tenyésztjük, majd standard inokulumként való felhasználás céljából 100-szoros hígítást alkalmazunk (20 000-100 000 sejtet, kb. 0,002 ml-ben, viszünk az agar felületére; 20 ml BHI-agar/csésze).

A vizsgálandó vegyületből 12 kétszeres hígítást alkalmazunk; a kiindulási koncentráció 200 pg/ml. A lemezeket 37 ’C- on végzett 18 órás tenyésztés után olvassuk le; ennek során az egyedül álló telepeket nem vesszük figyelembe.

A kísérleti organizmus érzékenységét úgy definiáljuk, mint a vegyület azon legalacsonyabb koncentrációját, amely - szabad szemmel való leolvasás mellett képes a növekedés teljes gátlására.

A többi policiklusos éter antibiotikumhoz hasonlóan a találmány szerinti (I) képletű vegyület jellegzetesen a Gram-pozitív mikroorganizmusokkal szemben mutat antibakteriális aktivitást, ezenkívül hatásos a Treponema hyodysenteriae - a sertésdizentéria kiváltója - ellen, amint ezt az I. Táblázatban bemutatjuk.

I. Táblázat

Az (I) képletű vegyület in vitro antibakteriális aktivitása

Organizmus A törzs száma MIC, pg/ml

Clostridium perfringens	10A006 10A009	0,39 0,20
Actinomyces pyogenes	14D002	0,39
	14D008	0,39
	14D011	0,39
Treponema hyodysenteriae	94A001	0,20
	94A002	0,20
	94A007	0,20

Az (I) képletű vegyületnek és sóinak csirkék kokcidiális fertőzésével szembeni hatékonyságára vonatkozó adatokat a következők szerint kaphatunk.

3-5 db, 10 napos, patogénmentes fehér Leghom, hosszúnyakú csirkét tartalmazó csoportokat olyan takarmánypéppel etetünk, amely homogén eloszlásban az (I) képletű vegyületet vagy nátrium- és/vagy káliumsóját tartalmazza. 24 órán át ezzel a takarmánnyal való etetés után mindegyik csirkét per os a vizsgálandó Eimeria-fajta oocisztáival inokuláljuk.

A 3-5 db, 10 napos csirkéket tartalmazó más csoportoknak hasonló pépes takarmányt adunk, ez azonban nem tartalmazza az (I) képletű vegyületet vagy sóját. 24 óra múlva ezeket is megfertőzzük és ezek szolgálnak fertőzött kontroll gyanánt.

További 3-5 db, 10 napos csirkéket tartalmazó csoportokat ugyanezzel a pépes takarmánnyal etetünk, amely nem tartalmaz antibiotikumot és ezeket a csirkéket nem fertőzzük meg kokcidiumokkal. Ezek szolgálnak normál kontroll gyanánt.

A kezelés eredményeit 5 nap elteltével értékeljük az E. acervulina esetében és 6 nap múlva mindegyik más kórokozó esetében.

Az antikokcidiális aktivitás mérésére használt kritérium: 0-4 osztályzat - a sérülések száma alapján - az E. tenella esetében („J. E. Lynch: A New Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity”, Am. J. Vet Rés. 22,324-326,1961) és

0-3 osztályzat a többi species esetében, J. Johnson és W. H. Reid értékelő rendszerének módosítása alapján („Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks”. Ex. Párásítói. 28,30-36,1970).

Az aktivitást úgy határozzuk meg, hogy az egyes kezelt csoportok sérülésre vonatkozó osztályzatát elosztjuk a fertőzött kontroliéval. Ebben a tesztben az (I) képletű.. vegyület és kationos sói kiváló aktivitást mutatnak E. te- f * nella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti és E necatrix fertőzéssel szemben baromfiban, csirkék pépes takar-:;, mányában kb. 1,0-25 ppm koncentrációban alkalmazva. Egy érzékeny E. tenella fajtával szemben pl. az (I) képle-:tű vegyület igen alacsony dózisban - 5 ppm - a károso-; dás 100%-os kiküszöbölését eredményezi.

A találmány szerinti (I) képletű vegyület általában ugyancsak használatos egyes más, ismert antikokcidiális szerekkel kombinálva, amilyen pl. a nikarbazin, 4,4’-dinitro-karbanilid vagy egy naftalain-amin (utóbbira vonatkozóan 1. Hamill et aL előbbiekben idézett, 4 582 822 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását).

A kokcidiőzis megelőzésére vagy kiküszöbölésére baromfiban a találmány szerinti vegyületet orálisan adjuk be a baromfinak, megfelelő vivőanyagban. A gyógyszert célszerűen az ivóvízzel vagy a baromfitáppal, mint vivőanyaggal adagoljuk be, úgy, hogy a hatóanyag terápiás adagját a napi ivóvíz vagy takarmánymennyiség vigye be a szervezetbe.

A hatóanyagot közvetlenül bemérhetjük az ivóvízbe - előnyösen cseppfolyós koncentrátum alakjában -, vagy közvetlenül hozzáadhatjuk a takarmányhoz, esetleg premix vagy koncentrátum alakjában.

A hatóanyagot tartalmazó premix vagy koncentrátum (megfelelő vivőanyaggal) az a forma, amelyet általában alkalmaznak a hatóanyag tápba való bevitelére.

A gyógyhatású anyag lehet jelen tiszta alakban (pl. szabad savként vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóként), vagy meghatározott aktivitású nyers

HU 203 789 Β alakban, így nedves vagy száraz micéliumként vagy szárított teljes fermentlé formájában.

A megfelelő vivőanyagok tetszés szerint cseppfolyós vagy szilárd halmazállapotúak, amilyenek pl. a következők:

- víz,

- különböző lisztek, pl. szójaolaj-pogácsaliszt, gyapotmagolaj-pogácsaliszt, kukoricacső-liszt és

- ásványi anyag keverékek, amelyeket a baromfitápokban általában alkalmaznak.

Különösen hatékony vivőanyag maga a baromfitáp, azaz annak egy kis hányada.

A vivőanyag megkönnyíti az aktív anyagok homogén eloszlatását a kikészített takarmányban, amellyel a premixet elegyítjük. Ez azért fontos, mivel a találmány szerinti hatékony anyagból csak kis mennyiségre van szükség. Fontos, hogy a vegyületet alaposan összekeverjük a premix-szel, majd a takarmánnyal. Ennek elérésére a hatóanyagot megfelelő olajos vivőanyagban amilyen pl. a szójaolja, kukoricaolaj, gyapotmagolaj stb. - diszpergálhatjuk vagy oldhatjuk. Alkalmazhatunk illékony szerves oldószert is. Ezután a diszperziót vagy oldatot összekeverjük a vivőanyaggal.

Magától értetődik, hogy az aktív anyag mennyisége a koncentrátumban tág határok között változhat, mivel a kikészített takarmányban a hatónyag mennyiségét úgy állíthatjuk be, hogy a premixből egy megfelelő mennyiséget összekeverünk a takarmánnyal, a hatóanyag kívánt szintjének elérésére.

A takarmánygyártók nagy hatékonyságú koncentrátumokat fehérjét tartalmazó vivőanyaggal, így a fent leírt szójaolaj-pogácsaliszttel vagy más liszttel kevernek össze és így olyan koncentrált adalékokat állítanak elő, amelyek közvetlenül alkalmasak baromfi-takarmányozásra. Ilyen esetekben a baromfi a szokásos módon etethető.

Egy másik megoldás szerint az ilyen koncentrált adalékokat közvetlenül a baromfitáphoz adjuk és így táplálkozástani szempontból kiegyensúlyozott, kikészített tápot állítunk elő, amely a találmány szerinti vegyületek közül egyet vagy többet a gyógyászati szempontból hatásos szinten tartalmazza. A keverékeket a szokásos eljárások szerint alaposan összekeverjük - pl. egy kétköpenyes keverőben -, a homogenitás biztosítására.

A baromfi-takarmányozásban való felhasználáshoz a találmány szerinti vegyület koncentrációja a különböző körülmények függvényében változik.

Hatásos megelőző intézkedést jelent a folyamatos, alacsony szintű gyógyszerezés, a növekedési periódus alatt, azaz az első 5-12 hét során, csirkék esetében.

Már kialakult fertőzések esetében a fertőzés megszüntetésére magasabb koncentrációra lehet szükség. Az (I) képletű vegyületet a tápban általában a kb. 1,0-25 ppm, előnyösen a kb. 2,5-124 ppm tartományba eső koncentrációban alkalmazzuk.

Ivóvízben való bevitel esetén ugyanezt a napi gyógyszerdózist kell biztosítanunk. Ekkor tehát figyelembe kell venni a táp és az ivóvíz átlagos napi fogyasztásának tömegarányát.

Az (I) képletű vegyület és sói aktivitása sertésben vagy szarvasmarhában a növekedés fokozása és/vagy a takarmányhasznosítás területén közvetlenül mérhető oly módon, hogy az állatok vizsgált csoportjainak a takarmánnyal különböző mennyiségű (I) képletű vegyületet vagy sóját adagoljuk be.

Egy másik megoldás szerint - 1 197 826 sz. brit szabadalmi leírás - in vitro „bendő” módszer alkalmazható az antibiotikumok takarmányokban való alkalmazása értékelésére.

A sertésdizentéria megelőzésében vagy kezelésében való alkalmazáshoz vagy szarvasmarhában vagy sertésben a növekedés elősegítésére és/vagy a takarmányhasznosítás fokozására az (I) képletű vegyületet vagy sóját előnyösen takarmányadalékként alkalmazzuk. A takarmányokat teljesen hasonló módszerekkel állítjuk elő, mint amelyeket az előbbiekben a baromfitáp esetére leírtunk. Ugyanúgy gondot fordítunk arra, hogy olyan takarmányokat állítsunk elő, amelyekben a gyógyhatású anyag egyenletes eloszlásban van jelen.

Az (I) képletű vegyület koncentrációja szarvasmarha vagy sertés esetében általában a kb. 0,25-25 ppm alkalmazási tartományba esik. Kérődzőkben az (I) képletű vegyület orálisan is alkalmazható, bólusz alakjában, amelyet a rumenoretikuláris zsák visszatart Ily módon a gyógyhatású anyag lényegében állandó sebességgel szabadul fel hosszabb időtartamon - pl. 4-8 héten - át oly dózist eredményezve, amely egyenértékű az előbbiekben jelzett, takarmánnyal bevitt napi dózissal, azaz:

átlagos napi dózis (mg) - (0,25-25) ppm · átlagos napi takarmányfelvétel (kg)

Az ilyen, szabályozott felszabadulást biztosító bóluszt pl. a 4 601 893 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Cardinal) ismertet.

A találmányt a következő példákkal szemléltetjük. Magától értetődik azonban, hogy a találmány nem korlátozódik az ezekben a példákban szereplő konkrét részletekre.

1. példa

Az Actinomadura ATCC 53708 törzzsel végzett fermentáció

Az (I) képletű vegyület elkülönítése nátriumsóként

Az Actinomadura sp.-t kiindulásként úgy tenyésztjük, hogy az ATCC 53708 tenyészettel ferde kémcsöveket vagy Roux-palackokat oltunk be, amelyek egy szilárd táptalajt - ATCC No. 172 táptalaj - tartalmaznak. Ennek összetétele a következő:

Gramm/liter glükóz 10 oldható keményítő 20 élesztőkivonat 5 enzimes kazeinhidrolizátum 1 kalcium-karbonát 1 desztillált víz 1000 ml-re

A pH-t KOH-dal 7,0-ra állítjuk be és hozzáadunk 20 g agart.

HU 203 789 Β

Közben rázott lombikokat készítünk elő, valamelyik következő táptalaj alkalmazásával:

C' táptalaj Gramm/liter cerelóz 10 szójaliszt 10 fermentációs maradék (kukorica) 5 kukoricakeményítő 10 nátrium-klorid 5 kobalt-klorid 0,002 kalcium-karbonát 1

JDYTT táptalaj Gramm/liter cerelóz 10 kukoricakeményítő 5 kukoricalekvár 5 enzimes kazeinhidrolizátum 5 kobalt-klorid 0,002 kalcium-karbonát 3

100-100 ml táptalajt töltünk 300 ml-es rázott lombikokba és a lombikokat 120 'C-on 30 percen át 100 kPa nyomáson sterilizáljuk. Lehűlés után a táptalajt vegetatív sejtszuszpenzióval oltjuk be, amelyet az említett Actinomadura sp. ferde agar tenyészetéről kaparással nyertünk ki.

A lombikokat 28 *C-on rázógépen rázatjuk 5-7 napon át [elmozdulás: 3,81-6,35 cm, 150-200 ciklus/perc (CPM)].

Időközben 5 literes fermentációs tankokat készítünk elő, amelyek 3-3 liter előbbi, C’ vagy JDYTT táptalajt tartalmaznak, vagy alkalmazhatjuk a következő táptalajt is:

UK 1-2	Gramm/liter
cerelóz	45
szójaliszt	10
kukoricalekvár	10
kobalt-klorid	0,002
magnézium-szulfát	0,10
kalcium-karbonát	3
mangán-szulfát	0,10
vas(HI)-szulfát	0,10
A táptalajhoz 1 ml habzásgátló szert (P2000, 10 tö-

meg% etilén-oxidot tartalmazó polipropilénglikol) adunk, az edényeket lezáijuk és 45 percen át 120 °C-on, 100 kPa nyomáson sterilizáljuk. Az edényeket ezután 1 rázott lombikkal oltjuk be (kb. 3% inokulum). A fermentációt 30 ‘C-on 120-168 órán át végezzük, 1700 fordJperc kevertetési sebességgel (RPM), percenként 1 térfogat levegő/1 térfogat közeg levegőztetési sebességgel.

A fermentáció befejeződését B. subtilis ATCC 6633mal végzett antibiotikum korongpróba alapján határozzuk meg. A fermentorokat ekkor leállítjuk és a fermentlevet természetes pH-η szűrjük, diatómaföld alkalmazásával. A szűrőlepényt metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót vákuumban töményítjük, 2-3 térfogat vízzel hígítjuk, majd kétszer extraháljuk 1/3-1/2 térfogat metil-izobutil-ketonnal vagy n-butanollal. Az oldószeres réteget leszivatással vagy centrifugálással különítjük el a vizes fázistól, majd porlasztás után vákuumban betöményítjük. Nyers alakban, viszkózus olajként az (I) képletű antibiotikumot kapjuk.

A fermentlé bioaktivitása és a fermentáció utáni kinyerési lépések érzékeny Bac. subtilis ATCC 6633 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538 törzs alkalmazásával követhetők. A fermentlében jelen levő komponensek és a kinyerési lépésekhez tartozó anyagok Analtech GF szilikagél-lemezek alkalmazásával mutathatók ki vizuálisan, eiuálószerként etil-acetát alkalmazásával.

A futtatólemezeket vanillin reagenssel permetezzük be (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85%-os foszforsavban) és 80 *C-ra melegítjük fel. Az (I) képletű antibiotikum bíborszínű foltként jelenik meg.

Eljárhatunk úgy is, hogy a futtató TLC lemezt agárral rétegezzük felül, beoltjuk S. aureus-szal vagy B. subtilis-szel - amely tenyészethez 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólium-klorid-monohidrátot adtunk - és a tenyészetet 37 *C-on 16 órán át inkubáljuk az antibiotikum vizuális kimutatására (fehér foltok bíborszinű háttérrel szemben).

A nagy fermentorokban való tenyésztésre úgy térünk át, hogy rázott lombiktenyészeteket állítunk elő, 0,7 liter C’ vagy JDYTT táptalaj alkalmazásával. A rázott lombikinokulumot 5-7 napon át 28 *C-on te?nyésztjük és ezt használjuk fel 200 vagy 6000 literes^· fermentációs tankok beoltására, amelyek 100, ill. 4000 liter UK1-2 táptalajt tartalmaznak. Tankonkéntkb. 1 liter inokulumot használunk fel. 7-10 napon át végzett fermentáció után a tenyésztést leállítjuk.

A kisebb fermentációkból kapott teljes fermentlevet természetes pH-n 50 liter metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. A szerves kivonatot vákuumban ciklon desztillálóval és forgó bepárlóval olajjá töményítjük.

Az olajat kétszer kromatografáljuk, hexánban szuszpendált 500 g „oszlop” tisztaságú szilikagélen. Az első oszlopot etil-acetáttal, a másodikat pedig 1:1 kloroform: aceton eleggyel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat TLC-vel azonosítjuk, az előbbiekben leírt módszer alkalmazásával.

Végül a második szilikagéloszlopról kapott aktív frakciókat florisilen kromatografáljuk, eiuálószerként 19:1 kloroform; metanol elegy alkalmazásával. A termékfrakciókat egyesítjük, híg foszforsavval, majd dinátrium-hidrogén-foszfát-pufferrel kirázzuk - a nátriumsó előállítására -, nátrium-szulfát fölött szárítjuk, sztrippeljük és a maradékot éterből kristályosítjuk. így az (I) képletű vegyület nátriumsójához jutunk (915 mg).

Op.: 245-249 ’C [a]??—19,0’ (c-1, metanol)

Elemzési eredmények: a C^HrOiíNa képletre számított: C 62,47 H 8,97%; talált C 62,89 H 9,22%.

¹³C-NMR (kémiai eltolódás - ppm - CDCb-ban;

zárójelben a hidrogénatomok számát tüntetjük fel):

182,8 (0), 110,0 (0), 106,0 (0),99,1(1),87,2 (1), 86,9 (0), 86,2 (1), 86,2 (0), 84,8 (1), 83,4 (0),

HU 203 789 Β

82,6 (1), 80,2 (1), 78,5 (1), 75,2 (1), 74,8 (1), 74,6 (1),

66.4 (1), 60,3 (3), 57,9 (3), 56,9 (3), 44,5 (1), 39,0 (1),

36,9 (1), 36,8 (2), 35,9 (2), 35,4 (2), 35,2 (2), 35,1 (1),

35,0 (1), 31,3 (2), 30,9 (2), 30,5 (1), 28,2 (3), 27,1 (2),

26,1 (2), 25,0 (3), 21,0 (3), 18,3 (3), 16,7 (3), 15,3 (3),

13.4 (3), 13,1 (3), 11,2 (3), 10,7 (3), és 10,6 (3).

A teljes feimentlevet tartalmazó nagy fermentertankok feldolgozását úgy végezzük, hogy a kb. 4000 liter térfogatú teljes fermentlevet 1800 liter metil-izobutil-kenonnal extraháljuk, majd az oldószeres réteget Podbielniack extraktorban elkülönítjük és vákuumban süni sziruppá töményítjük be. A koncentrátumot kétszer eldörzsöljük azonos térfogatú tiszta metanollal, elkülönítjük a metanolban nem oldható olajat és a metanollal eldörzsölt anyagot vákuumban sziruppá töményítjük be.

Ezt kétszer extraháljuk hexánnal, és az egyesített hexános kivonatot acetonitrillel. Az acetonitriles kivonatot eltesszük, az anyag későbbi kinyeréséhez. A hexános oldatot vákuumban betöményítjük, majd részletekben szilikagélen kromatografáljuk. A szilikagélről való deszorbeáltatást szűrőtölcséren végezzük, először hexánnal, majd metilén-kloriddal, etil-acetáttal és végül acetonnal.

A metilén-kloridos és etil-acetátos kivonatokban jelen levő aktív frakciókat betöményítjük, a maradékot hexánban oldjuk és savas vízzel mossuk, majd 1%-os v jzes N-metil-D-glukamin-oldattal extraháljuk. A vizes fázist nátrium-kloriddal kisózzuk és kétszer extraháljuk azonos térfogatú etil-acetáttal.

A szerves rétegeket egyesítjük, aktív szénnel kezeljük, szűrjük, pH-9,0 nátrium-foszfát-pufferrel mossuk, nátrium-szulfát fölött szárítjuk, vákuumban betöményltjük és éterből kristályosítjuk. 50,8 g nátriumsót kapunk, amely azonos a kisebb léptékű fermentáció során kapott termékkel.

2. példa

Az (I) képletű vegyület szabad sav alakjának előállítása

Az (I) képletű vegyület szabad sav alakját úgy állítjuk elő, hogy a nátriumsó klorofoimos oldatát erőteljesen kirázzuk azonos térfogatú pH-2 sósavoldattal, rázótölcsérben.

A fázisokat szétválasztjuk és a klorofoimos réteget vízzel mossuk, majd vákuumban bepároljuk. így a szabad savat kapjuk; op.: 87-90 ’C [a]2f—6,9° (c-1, metanol).

Elemzési eredmények: a C45H7₈Oi4*O,5H₂O képletre számított C 63,43 H 9,34%; talált: C 63,35 H 9,53%.

3. példa

Az (1) képletű vegyület nátriumsójának előállítása

Az előző példa szerint előállított szabad savat (45 mg) 100 ml kloroformban oldjuk. Hozzáadjuk 0,5 g nátriumkarabonát 100 ml vízzel elkészített oldatát és a kapott keveréket rázótölcsérbe visszük át, majd több percen át erőteljesen rázzuk, A kloroformos réteget elkülönítjük és a vizes réteget friss kloroformmal mossuk.

Az egyesített kloroformos kivonatokat nátrium-szulfát fölött szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. 41 mg nátriumsót kapunk, op.: 230-235 ’C.

Elemzési eredmények: a C₄jHr!Oi4Na képletre számított C 62,47 H 8,97%; talált C 62,20 H 9,14%.

4. példa

Az(I) képletű vegyület rubidiumsójának előállítása

Az (I) képletű vegyület rubidiumsójának előállítására 30 mg szabad savat 50 ml kloroformban oldunk. Az oldathoz 35 mg rubidium-karbonátot adunk 25 ml vízben és az elegyet 2 órán át kevertetjük.

A szerves fázist elkülönítjük és a vizes réteget azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos kivonatokat bepároljuk; így fehér színű sziláid anyagot kapunk. A rubidiumsót éterből kristályosítjuk, lassú bepáríással. A kapott kristályok röntgendiffrakciós vizsgálatát J. Bordner végezte el.

5. példa

Az (I) képletű vegyület káliumsójának előállítása

Az (I) képletű antibiotikum káliumsójának előállítására 130 mg szabad savat 100 ml kloroformban oldunk. Az oldathoz 100 mg kálium-karbonátot adunk, 100 ml vízben oldva és a kapott elegyet több percig kevertetjük, majd rázótölcsérbe visszük át és több percig erőteljesen rázzuk.

A szerves fázist elkülönítjük és vákuumban bepároljuk. Fehér por alakjában kapjuk az (I) képletű vegyület káliumsóját. Op.: 255-260 ’C [a]#—19,6’ (c-1, kloroform).

Elemzési eredmények: a C45H77O14K képletre számított C 61,34 H 8,81%; talált C 60,91 H 8,83%.

Claims (5)

1. Eljárás az új (I) képletű vegyület - amely képletben Me jelentése -CH₃-csoport - és gyógyászati szempontból elfogadható kationos sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az Actinomadura sp. ATCC 53708 törzset süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztjük egy asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó vizes táptalajban, és a keletkezett (I) képletű vegyületet vagy sóját kívánt esetben kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületet vagy sóját kinyerjük a fermentléből.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületet nátrium- vagy káliumsója alakjában állítjuk elő.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületet vagy sóját kicsapott formában, micéliumot tartalmazó keverék alakjában nyerjük ki a fermentléből szűréssel.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületet vagy sóját nyers alakban nyerjük ki, a teljes fermentlé porlasztva vagy fagyasztva szárításával.