PL159781B1

PL159781B1 - Sposób wytwarzania nowego eteru wielopierscieniowego PL PL PL PL

Info

Publication number: PL159781B1
Application number: PL1989277609A
Authority: PL
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1989-02-07
Publication date: 1993-01-29
Also published as: CN1035132A; PT89615A; NO903459D0; EP0328303B1; YU47016B; JPH0730081B2; NO178199B; ATE87924T1; DE68905838D1; ZA89898B; PL277609A1; IE62781B1; YU28089A; PH25500A; HU203789B; DK54889A; IL89148A0; NO903459L; AU608688B2; FI92411B

Abstract

Sposób wytwarzania nowego eteru wielo- pierscieniowego o wzorze przedstawionym na rysunku, a takze jego farmakologicznie dopusz- czalnych soli kationowych, znamienny tym, ze prowadzi sie pod powierzchniowa hodowle drob- noustroju Actinomadura sp. ATCC 53708 w warunkach aerobowych, w wodnej pozywce zawierajacej przyswajalne zródla wegla i azo- tu, do uzyskania dajacej sie wyodrebnic ilosci tego eteru. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytweurzania nowego eteru wieiipiθrścieiiowθgi o wzorze przedstawionym na rysunku, a także jego fαreakoiigijznii dopuszczalnych soli kationowych. Te nowe związki znajdują zastosowanie jako lek przeciw kokcydiozie, w leczeniu iub profilaktyce czerwonki świń iub jako środek pobudzająoy wzrost bydła iub świń.

Nowy związek o wzorze przedstawionym na rysunku jest przedstawicielem grupy wielopierścieniowych antybiotyków eterowych, będących kwasam. Rodzina ta obejmuje takie dobrze znane związki jak m^i^^j^!^;yna /The Merck Indek, Wydanie 10, Merck and Co., Ino., Rahway, N.Y. 1983, hasło nr 6100/, nigerycyna /jak wyżże/, hasło nr 6390/, narazin /Jak wyżej hasło nr 6271/, iasaiocid /jak wyżce, hasło nr 5204/ i θaleiomycyeα /jak wyżej hasło nr 8193/. Tematu tego dotyczyła praca przeglądowa Weefley^, Polyether Antlbiotics, Adv, Appl. MicrobiC., tom 22, strony 177 - 223 /1977/. Związkiem najbardziej zblióonym strukturainie do związku o wzorze prziiatawioιym na rysunku jest portmycyna, antybiotyk opisany w opisie patenoowm St. ZJedn. nr 4582822, europejskim zgłoszeniu patentowym nr 158 179, Tetrahedron

Letters, tom 28, strony 3357 - 3360 /1987/ i J. Antibiotice, tom 40, strony 237 - 238 /1987/. Portmycyna zawiera wodór w titrhhydifUuΓaiowye pierścieniu B, natomiast związek o wzorze przedstawionym na rysunku zawiera w tej pozycji grupę (meylową. Powyższe związki są ogólnie znane jako środki przeciw kokcydiozie, jako dodawane do paszy środki pobudzające wzrost, i/lub Jako środki przeciw czerwonce świń.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania nowego eteru wi.elipieΓŚcieniowego o wzorze przedstaw^nym na rysunku, a także jego farmakologicznie dopuszczalnych soli kationowyjh polega na tym, że prowadzi aię pidpowOerzjheiową hodowlę iroinou8triju Actinomadura sp. ATCC 53 708 w warunkach azotawych, w wodnej pożywce zawierającej przyswajaine źródła węgla i azotu, do uzyskania dającej się wyodrębnić ilości tego eteru.

Do farmakologicznie dopuszczalnych soli kationowych związku wytwarzanego sposobem ^według ^wynalazku rależą np. tal ^tawa, potasowa, wapniowa i amonowa ^oraz tal ^z N,N’-d^wubenzyl^oetytaiwdwuaminą, N-metyloglukaminą /megluminą/ i dwuetanotaamną.

159 781

W niniejszym opisie wszelkie wzmianki na temat związku wytwarzanego sposobem„według wynalazku lub związku o wzorze przedstawionym na rysunku odnoszą się zarówno do wolnego kwasu, jak i jego soli katoonowych.

Związek o wzorze przedstawionym na rysunku jest z łatwością wytwarzany przez Actinomadiira s^p. w czaaie je^go wzrostu prowadzonej w temperaturze ok^oł^o 24 - ³⁶°C, ^w bdowli p°dpowierzchniowej w pożywce poddawanej mieszaniu i naRow^e^m^. Pożywka ta zawiera źródła węglowodanów, takich jak cukry, skrobia i gliceryna, zawierające azot, substancje organiozne, takie jak mąka sojowa, hydrooizat kazeiny i ekstrakt drożdżowy, substancje wzrostowe takie jak rozpuszczalne składniki zbóż, mączka rybna i mączka z nasion bawwłny, sole mineralne zawierające pierwiastki śladowe, takie jak żelazo, kobaat, Medź, cynk itd. oraz węglan wapniowy lub fosforowy jako środki btrforujące. Po zakończeMu wzrostu, antybiotyk wyodrębnia się łatwo przez ^ekstrahowanie pełnej brzeczki rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak n-butanol, keton medyloloizobutylowy oraz ch^oro^oim, w zakresie pB 4,0 - 8,0 lub przez odsączenie grzybni zawwerającej wytrącony antybiotyk i odrzucenie przesączu, lub po prostu przez suszenie rozpyłowe lub liofiliaację pełnej brzeozki. A-tematynie, grzybnię lub pełną wysuszoną brzeczkę ekstrahuje się jednym z ^mmenionych rozpuszczalników organicznych. Gdy potrzebny jest oczyszczony antybiotyk, wodrębMa aię go z ekstraktu organicznego znanymi mitidail. zatężania, tworzenia soli lub wolnego krasu, chrommaograffi, wytrącania i/lub krystaaizacji, co opisano w podanyoh dalej przykładach.

Zgodnie ze standartową techniką prowadzenia fermeniacj przygotowuje się najpierw inokulum przez zdrapanie komórek wegetatywnych rosnących na gdpowlednich podłożach, na skosach lub w kolbach Roiu^a, zainikulolaiych Actirnomadura sp. ATCC 53708. Pobrane kommrki wegetatywne służą do inokulacci idpowlednich podłoży wzrostowych zawartych w otrząsanych kolbach lub pojemnikachlnikulajyjnych. Alternatywnie, zawartość pojemników inokulacyjnych zaszczepia się mateΓiadθm z wytrząsanych kolb. Po odpowiednim okresie wzrostu /na ogół 120 - 144 godzin w wytrząsanych kolbach i 168 - 196 godzin w pojemnikach inokulacyjnych/ zaszczepia się w warunkach aadptyjinyjh odpowlednid podłoże wzrostowe zawarte w fdΓmentatiΓZd, pobierając w tym celu mieela! z wytrząsany^ kolb lub pojemników inokulacyjnych. Po zakończeniu wzrostu /zazwyczaj około 120 - 196 godzin/ antybiotyk się w postaoi nie oczyszczonej lub,

Jeśli Jest to pożądana, oczyszczonej jedną z metod opisanych ogólnie pow^że, względnie metodą opisaną w poniższych przykładach.

Πτ^ηοηΜΐΤ zdolny do wytwarzania związku o wzorze przedstawionym na rysunku nosi nazwę Actinomadura sp. i został on zdeponowany w A^me^ican Type Culture Coilectiin, Roikvilld, Maryland, pod numerem ATCC 53708. Ciągłość depozytu drobnouutroju i Jego powβzdihnr dostępność są zapewnione w okresie trwania patentu w przypadku Jego przyznania. Dostęp do drobnoustroju w toku rozpatrywania zgłoszenia patentowego jest mooiina zgodnie z przepisami 37 CFR 1,14 i 35 USC 122. Weszytkie ograniczenia po^zedinej dostępności zdeponowanego drobnoustroju zostają nidodwlialnie usunięte po przyznaniu patentu.

Nowy driinoultrój ATCC 53708 ierzyiani z próbki gleby pobranej w Tuzla, Istambuł, Turcja i oznaczono w kolekcji hodowU Pfizer Inc. numerem N777-1. Stwierdzono, że ten drobnoustrój wdw^^za wąskie strzępki charakterystyczne dla promieniowców, grzybnię pow^erzną, na której pow^ają krótkie łańcuszki spor i niepofragmentowaną grzybnię substratową. Wyniki analiz z całych komórek także wskazują na jego przynależność do rodzaju Λοίίπϋβάη^.

Hodowlą droinoultΓiju ze skosu zrtijidpiiii pożywkę ATCC 172 i pozostawiono do wzrostu na 4 dni w edmpedaturze 28°C, na lyZΓiątaΓCd. Następnie hodowlę wirowano przez 20 minut, przemyto trzykrotnie Jałową wodą destylowaną i zaszczepiono na pożywkach pow^ediinie używanych do identyfikacji przddθtawicCedi Actiiii(nizjaeldt.

Hodowle w temperaturze 28°C, a wynnki odczytywano w różnym czasie, lecz najczęściej w czternastym dniu. Barwy opisywano zgodnie z powszechnie stosowaną terminologią, lecz dokładnie określano je przez porównanie z wzorcami kolorów The Color Harmony Manuul,

159 781 wyd. IV. Analizę zawrotości aMLnokwaaów i cukrów w całych komórkaoh przeprowadzono odpowiednio według Bicte/a i Inn^ych, Appl. Microbiol.., tom 12, strony ⁴21 - ⁴²³ /1964/ i St^ane°^k'^ai innych, Appl. (Licrobiol., tom 28, strony 226 - 2S1 /1974/ oraz LeoheeaUe^a, J.Lab. Clin. Med., tom 71, strony 9S4 - 944 /1968/.

DrobnouutróJ identyfkoowano naatępująoo.

1. Pożywka agarowa z ekstraktem drożdżowym i ekstraktem słodu /pożywka ISP nr 2, Difco/: wzrost dobry, kolonie kremowe /2 ca/ z ciemnoszarymi, do czarnych /blisko szarej serii 5

M./ pltmaM, wzniesione, pommrszozonei grzybni poβOitΓznθJ brak lui rzadko rozsiana, bezbarwnej odwrotna strona kremowa do iladożółtawej /2 ca, 2 en/ z ozarnymi /blisko szarej serii 5 M./ plroam.! irak rozpuszczalnego barwnika.

2. Pożywka agarowa z mąką owsianą /pożywka ISP nr 3· Difco/: wzrost umiarkowany, kolonie kremowe 12 ca/, nieznacznie wzniesione, gładkiej grzybni lowOetrznej brak lub rzadko rozsiane, bezbarwnej odwrotna strona kremowa /2 ca/j barwnik rozpuszczalny kremowy /2 oa/.

S. Pożywka agarowa z solami nieorganicznym, i skrobią /pożywka ISP nr 4, Mfoo/i wzrost słaby, kolonie kremowe /2 ca/, płaskie, gładkiej grzybni low0etrznej brak lub rzadko rozsiana, bezbarwnej odwrotna strona kremowa /2 ca/j brak rozpuszczalnego barwinka.

4. Pożywka agarowa z gliceryną i asparaginą /pożywka ISP nr 5· Difco/: wzrost średni do umiarkowanego, kolonie kremowe /2 ca/, płaskie, gładkiej brak grzybni posw^rznejj odwrotna strona kremowa /2 ca/j brak rozpuszczalnego barwnika.

5. Pożywka agarowa Czapka z sacharozą /Waksman, The Actinomytea, tom 2, podłoże nr 1, strona 326, 1961/: wzrost umiarkowany do dobrego, kolonie kremowe /2 oia/, umarkowanie wzule słone, gładkiej brak grzybni low0itrznejj odwrotna strona kremowa /2 oa/j brak rozpuszczalne go barwnika.

6. Pożywka agarowa z glikozą i asparaginą /j.w., pożywka nr 2/: wzrost umiarkowany, kolo nie kremowe /2 ca//, płaskie do umiarkowanie wzniesionych, gładkie do pomir8ZczcnychJ brak grzybni powwitrzneJj odwrotna strona kremowa /2 ca/j brak rozpuszczalnego barwnika.

7. Pożywka agarowa Gordona i Smitha z tyrozyną /Gordon i Smith, J. BarterioC., 69: 147-150, 1955/: wzrost umiarkowany do dobrego, kolonie kremowe /2 ca/, nieznacznie do umiarkowanie wzniesionych, gładkie do lomarβzczonychJ brak grzybni powOetrzneJj odwrotna strona kremowa /2 ca/j rozpuszczalny barwnik bladożółtawy /2 ea/.

8. Pożywka agarowa z jabłczanem wapniowym /Waksman, Bcteriol. Rev. 21, 1-29, 1957/: wzrost ograniczony, kolonie kremowe /2 ca/, płaskie, gładkiej brak grzybni powOitΓznetj odwrotna strona kremowa /2 ca/j brak rozpuszczalnego barwnika.

9. Pożywka agarowa z kazeiną /Gordon i Smith, J. BateriM., 69: 147-150. 1955/: wzrost dobry, kolonie kremowe /2 ca/, wzniesione, gładkie do lO(nirBzczonythJ brak grzybni powietrznej j odwrotna strona blrdcżółtaor /2 ea/j z żóławym /2 ga/ rozpuszczalnym barwnikiem.

10. Pożywka agarowa BrnieMa /Waksman, Bcceriol. Rev. 21, pożywka nr S0, strona 331/: wzrost dobry, kolonie kreirae /2 ca/, wzniesione, lomaa8zczoeeJ brak grzybni powOitrznetj odwrotna strona kremowa do blldcżółtaoej /2 ca, 2 ea/j barwnik rozpuszczalny bladożółtawy /2 ea/.

11. Pożywka agarowa Bireona /j.w., pożywka nr 28 , strona 331/: wzrost umiarkowany, kolonie kremowe do blldcżółtao^ych /2 ca, 2 ea/, oznie3icet, pomiaszczonej brak grzybni powietrznej: odwrotna iercer żółtawa /2 ic/j brak rozpuszczalnego barwnika.

12. Pożywka agarowa /j.w., pożywka nr 14, iercel 33<^^ϊ wzrost słaby do umiarkowanego, kolonie kremowe /2 ca/, płaskie do nieznacznie wzniesionych: brak grzybni low0etrzeθj, odwrotna strona kremowa /2 ca/j brak rozpuszczalnego barwnika.

13. Pożywka agarowa z żelatyną /Gordon i Mihm, j. Ββ^ΜοΙ. 73, 15-27, 1957/: wzrost dobry, kolonie kremowe /2 ca/, wzniesione, lomar8zczceeJ brak grzybni powOitrzeejJ odwrotna ieroer kremowa do blldożółeroej /2 ca, 2 ea/j barwnik rozpuszczalny bladożółtawy /2 ea/·

159 781

14. Pożywka agarowa ze skrobią /J.w·, wzrost dobry, kolonie kremowe /2 ca/, wzniesione» pomarszczone; brak grzybni powietrznej; odwrotna strona kremowa do bladożółtawej /2 ca, ea/; brak rozpuszczalnego barwrd.ka.

15. Pożywka agarowa z ziemniakami 1 m^rohwi^ /LecheTalier, Lab.Clln.Med.» 71» 934—944, 1968, lecz z użyciem jedynie 30 g ziemniaków, 2,5 g marchwi i 20 g agaru/j wzrost słaby do umin^ko^^nzegio, kolonie nieczysto białe ^liaki szarej serii 2 ba/, płaskie, gładkie, grzybni powwetrznej brak lub rzadko rozsiane, bezbarwna; odwrotna strona bezbarwna do kremowej /2 c^h brak rozpuszczalnego barwnika.

16. 2% pożywka agarowa z wodą wodociągową: wzrost słaby, kolonie kremowe /2 ca/, płaskie, gładkie; grzybni powiβtrzntj brak do rzadko rozsianej, bezbarwna; odwrotna strona bezbarwna do kremowej /2 ia/; brak rozpuszczalnego barwnika.

17. Podłoże mineralne Gauza^a 1 /Gauze i inta, Problems in the Claaeification of Antagoiźst Actlnomyeeee, ^datae anielskie, strona 13, 1957/: wzrost słaby do umiarkowanego, kolonie kremowe /2 ca/, płaskie, gładkie; grzybni powiθtrznθj brak lub rzadko rozsiane, bezbarwna; odwrotna strona kremowa /2 ca/; brak rozpuszczalnego barwnika.

18. Podłoże organiczne Gatze*a 2 /j.w./: wzrost słaby, kolonie kremowe /2 ia/, wzin.esione, pomarβzczonθ; brak grzybni powietrznθt;<odwrotna strona kremowa do bladożółtawej /2 ca, 2 ea/; brak rozpuszczalnego barwnika.

Cechy mri‘o^ogiczne 0robnouθeΓOju obserwowano po 3 tygodniaoh inkubacji na pożywoe agarowej z solami nieorganicznymi i skrobią: grzybrda powwetrzna bezbarwna, biała do kremów^, łańcuszki spor proste, zakrzywione lub haczykowego, 2 - 10 spor w łaóouszku, spory ku.iste, owalne do eliptycznych, o średnicy 0,8 - 1,4 /im lub ^udarach 1,1-1,8 z 0,8-1,2 pm; gładkie, co stwierdzono dzięki badaniom pod mikroskopem skanningowym.

Właściwości biochemiczne: melanina nie wytwarza się; siarkowodór nie wytwarza się; żelatyna ulega upłyrndaniu; skrobia nie ulega ^ddolizie; azotany nie ulegają redukcji do azotynów; nie występuje wzrost i nie występuje rozkład na bulionie z celulozą Jensen'a lub Levina i Schoieneento, nie występuje koagulacja i peptonizacja mleka: test na trawienie kazeiny Oodaani, test na rozkład tyrozyny ujemny; test na rozkład jabłczmu wapnia ujemni. Wyoi^3^E^^ł;an^e węglowodanów: glikoza, mbiniza, fruktoza, mannit, ramnoza, sacharoza, ksyloza, adonnt, celibioza, gliceryna, maKiza, rybiza, skrobia i trehaloza przyswajalne; inizyt, rafinoza, dulcit, erytryt, gelaktiza, laktoza, mawnosa, mmeerytoza, meeibioza, (A-metyto~G-glikozyO, sa^^c^yna, sorbit i sirbiza nie wykorzystywane.

Wynnki dodatnie uzyskani takie w testach wykorzystywania ictenu i pirogronianu, hydrolizy tskuliny iraz rozkładu ksantyny i hiplksαntnny. Wyrinki ujemne uzyskano w testach wykorzystywania benzoesanu, cytrynianu, dekstryny, mleczanu, jabłczanu, śluzanu, szczawianu, fenolu, prop^nimu i bursztynianu, rozkładu adeniny i tyrozyny oraz hydrolizy hipiurnnianu.

W temperaturze 21°C, 28°C, 37°C i 45°C obserwowano dobry wzrost.

A^nnza całych klaaΓtk wykazała, że hydrolizaty całych komórek zawierały kwas m^(^-dw^aainopeaetiniiy, glikizę, galaktizę, madurozę, mannozę i rybizę.

D[obnoolerój ATCC 53708 charakteryzują: krtaliα grzybnia substratowa, krótka, bezbarwna grzybnia eowietΓzna, krótkie łańcuszki spor, priste, zakrzywione lub haczykowate oraz spiry i gładkiej powierzchni. Wyi!:oizyatuje in glikizę, arabinizę, fruktozę, manni, ramnozę, sacharozę, ksylizę, adonnt, celobiozę, glicerynę, maatizę, rybizę, skrobię, trehalizę, ictan i pirigrinian, Ksantyna, hipoksantyna i eskadro są przezeń rozkładane. Hydoolizaty całych komórek wykazują ibecniść kwasu aezo-Oiuaainopiaelinoitgl i madturozy. Tak więc drobnou^rój ten należy Oo rodzaju Actinomadura, według definicji H. Lechetajierr.

Znanymi gatunkami ActinoalOurα mającymi podobną kremową grzybnię substratową i/uub podobne właściwości biochemiczne są A^rem^ subsp. rUamycini, A.madurae subap. simaiensis i A. routlenii. OmajWann Oribnouetrój różni się oO A.cremea subsp. rfamycini gładkimi spirami, niezdolnością Oi redukowania azotanów, niezdolnością di wykorzystywania rafnnozy i wykorzystywaniem arabidzy i ramnozy.

159 781

Drobnoustrój ATCC 53708 różni się od A.madurae subsp. simaoensis raczej kremową a nie bezbareną d° ^pornarańczowobrązowej grzytaią substratową, raczej taztarwną, a nie tazbarwną ^do różowo-biał^ej grzybiiią ^powietrzną, niezdolnością rozkładu tyrozyny i zdolnością ^do rozkładu ksantyny. Od A.routienii różni się on nieobecnością ^peeu<ioepor^angió^w, toezdolnością do hydrolizy skrobii i koagulacji mleka oraz zdolnością ^do wykorzystywania mannita, fruktozy i ^gliceryny.

Drobnoustrój ATCC 53708 jtodotay do A.albulutea w więłcszości testów toochemtoznyto, leoz różni toę o^d niego niezdolnością ^do ^hydrolizy skrobi i taagulacji mięta, racz^ej taemroą, ^atoe brązową ^do ciemntorązowej grzytaią substratową i -raczej tatokirni, ^a toe długimi łańcuszkami spor. Ha podstawie przedstawionych powyżej dan^ych totonouatriij ATOC ⁵³⁷⁰⁸ został ^uznany za ^przedstawiciela rodzaju Actinomadura 1 nazwany Actinorntoura sp.

Zwi^ązek o wzorze przedstawionym na rysunku znajduje zastosowanie w sposobie ptoudzania wzrostu ^bydła i ^świń i/tab polepszania wykorzystywania prozy przez ^bydło i rólnta, w profilaktyce i leczeniu czerwonki u ^świń oraz w leczeniu tataydiozy drobiu. Przykładowo związek o wzorze ^przedetawionym na rysunku może stanowić slcładnik tampozyoji prozowych dla ^bydła lub ^świń, zawtarających tan związek w ilości statecznie pobudzaj^ącej wzrost i/lub polapszająo^ej wykorzystanie paszy przez b^ydło lub ^świtoe, wzgl^ę<łnie zapobiegając^ czereonce ^{u ś}wiń, Z talei kompozycje ^paszowe dla drobiu mog^ą zawierać ten związek w ilości ^stateo^znla leoząroj takcydiozę.

Stanowiący róodek terapeutyczny związek o wzorze ^przedatawionym na rysunku możro także stosować w połączeniu z innymi, znan^ymi lekami przeciw takoydiozie, takimi Jak nikarbazyna, 4,4-dwunitrokarbanilid lub naftalenoamina /opis patentowy St. ^Zjedn. Ameryki nr 4 ⁵82 822/.

Zwi^ązek wytworzony sposobem według wynalazku podaje się drotoowi doustnie, w odpowiednim nośnita, wygodnie po prostu w wodzie pitnij lub pokarmie, a wówczas terapeutyczna ^dawta tego związku przyjmowana jest z toienną porcją wo^dy lub potarmu. ^Zwi^ązek można tozpośrednio dozować do wo^dy pitnej, ^korz^ystnie w formie płynnego tancentratu, względnie todawać tozpośrednio do potarmu jata talii, ^bądź w postaci przedmieszki lub koncentratu. Uż^ywanie przedmiiszek lub tancentratów órodków terapeutycznych w celu wł^ączinia ich do pasz jest powszechnie stosowanym zatoegiem. Środek terapeutyczny można stosować w zasadniczo czystej postaci /np. jako wolny kwas lub jego farmakologicznie dopuszczalną bóI/, bądź też w postaci nie oczyszczonej, z oznrozoną zawartością związku, takiej jak mokra lub sucha ^grzybnia lub wysuszona pełna tozecz^ka. Odpowiednimi notoikami s^ą ciekłe lub stałe substancje, takie jak woda, różne mączki, na przykład laczka z makuchów sojow^ych lub lnianych i mączka z taczanów takur^ydz^y, oraz mieszanki mineralne, takie jak te powszechnie stosowane w pokarmie dla drobiu. Szczególnie statecznym nośnikiem jest sam potarm dla drobiu, użyty w małej porcji. Nośnik zapewnia równomrórne rozprowadzenie róodka terapeutycznego w ^gotowym pokarmie, z którym miesza się prztornirozkę. Jrot to waróe, ponieważ ze względu na siłę działania omawianego związku należy ^go stosować w rnałyta dawkato. Ważne jest, a^by związek ten został dobrze wymieszany w przedmie^izci, a następnie w pokarmie. ^Tak więc związek można dyspergować lub rozpuszczać w odpowieto nim rozcieńczalniku olejowym, takim jak olej sojowy, olej tatarydzian^y, olej z nasion toweł^ny, itp. względnie w lotnych rozpuszczalnikach or^ganicznyc^h, a nas^tępnie mieszać z nośnikiem, ^Jlst zrozroiata, ró zawartość róodka terapeutycznego w koncentracie może zmieniać się w sz¹rokim zakresró, a jego rowartośó w gotowym pokarmie można toprowadzió do ^żądanej wartości stosując odpowiednią ilość przedmieszki.

Koncentrtoy ^o wysokim sdiężroiu mogą zawierać (domieszki noróików białkow^ych, takich jak rnączta z matatoów s°^jowych i inne mączki, ^a wówczas stanowią stancintrowane dodatki odpowiednie to bropośretoiego starrniania ^drobiu. Alternatywnie, takie skororotrowane dodatki toda^je się do potarmu ^dla toobiu w celu wytworzenia gotowego potaimiu o ztolansowanej wartroci odżywczej, rowierającego stateczną terapitoycztoe ilość omawianego związku. Mieszanki pokarmowe miroza się tokłatoie w celu ^osiągni^ęcia jednorodności znanymi sprotoami, np. w mieszalniku ^do toał sypkich ^z automatycznym tozowaniem składników.

159 781

Ilość środka terapeutycznego podawana drobiowi będzie różna w różnych warunkach. Skutecznym środkiem zaradczym Jeat ciągłe atoaowanie leku w niewielkiej ilości podczas okresu wzrostu kurcząt, to Jest podczas pierwszych 5 — 12 tygodni. W leczeniu infekcji może byó konieczne stosowanie wyższych dawek. Dawka środka terapeutycznego w pokarmie tynoei około 1,0 - 25 ppm, korzystnie około 2,5 - 12,5 ppm. Przy podawaniu w wodzie pitnej stosuje się dawkę zapewniającą tę samą dawkę dzienną leku pomnożoną przez stosunek wagowy średniej dziennej konsumpcji pokarmu do średniej dziennej konaummcji wody.

W profilaktyce lub leczeniu czerwonki świń lub dla pobudzania wzrostu i/lub zwiększaniu wydajności wykozystania paszy przez bydło lub świnie związek o wzorze przedstawionym na rysunku korzystnie podaje się Jako dodatek paszowy Pasze, przygotowuje się metodą w ^^łnL analogiczną do przytoczonej powyżej mmtody przygotowywania pokarmu dla drobiu, jednorodnie rozprowadzając w nich środek terapeutyczny. Dawka związku w paszy dla bydła lub świń na ogół około 0,25 - 25 ppm. Przeżuwaczom związek można także podawać drn^^tnLe jako dużą pigułkę /bolus/, zatrrzmnywaną w pierwszych częściach żołądka, żwaczu i czepou, ^wa^ającą środek terapeutyczny z zasadniczo stałą szybkością przez przedłużony okres, na przykład

4-8 tygodni, i zapewne jącą dawkę równoważną pow^azaj dziennej dawce paszy, np. średnia dzienna dawka /mg/ = /0,25 - 25 ppmf z średnia dzienna konslppcja paszy /kg/

Przykładem takiej pigułki o kjntrojowanym uwwanianiu jest bolus opisany w opisie patentowym St. Zjedn. Ammryki nr 4 601 893.

Aktywność związku o wzorze przedstaw^nym na rysunku 1 Jego soli w pobudzaniu wzrostu iAub polepszaniu wytoozyatania paszy u świń 1 bydła można mierzyć bezpośrednio, cjdβjąo badanym grupom zwierząt różne dawki tych związków w paszy. Alternatywnie można stosować metodę in ritro oceny zawartości żwacza /brytyjski opis patentowy nr 1 197 826/.

Działanie crrrciwbakteryjie ln vitro związku o wzorze przedstawionym na rysunku bada się standardowym, metodami pomaru najniższego etętonia lnhibitującego /MIC/, wyrażonego w Ug/ml, z użyciem Jednego lub większej lcozby drjbl0U8arjjów.

Jedna z tych metod Jest zalecana przez Internationa! Cooiaboratiye Study on AnUbiotic SeniStivitz Testing /Erieceon i Sheeris, Acta, Pathologica et Microbiologia Scandinav, suplement 217, sekcja Bs 64-68 /1971/. Wyyoozystuje się w niej agar mózgono-sercowy /BHI/. Wyrosłe przez noc hodowle rozcieńcza się stukrotnle dla uzyskania lno^lum standardowego /20 000 - 100 000 komórek w około 0,002 m/, które umieszcza się na ^Όβ^^η! agaru /20 m agaru BHI na płytce/. Stosuje się 20 dwukrotnych rozcieńcześ testowanego związku, przy początkowym stężeniu 200 /lg/ml. Pojedyńcze kolonie po^mia się podczas badania płytek po 18 godzinach w t^p^a^rze 37°C. Za wartość MIC w teście z danym organ^nem przyjmuje się najniższe stężenie związku zdolne do ^^y^^o^n^a całkowitego eapowonia wzrostu, przy ocenie okiem nieuzbrojonym. Podobnie Jak inne mieljpirΓŚcrenjoor antybiotyki eterowe, związek o wzorze przedstawionym na rysunku działanie crrrciwbakterzjne wobec bakterii GΓap-dojaanich, jak również działanie przeciw Trepo^ema hyodyzarle:eiae, /czynnik nywojujjcz czerwonkę śwwń/.

159 781

Wyniki próby przedstawia poiUższa tabela

Tabela

Dobrooetrój	Humer szczepu	MIC / jug/m./
Closiridim pθrfringeis	10A006	0,39
	10A009	0,20
Actinomootes pyogenee	148002	0,39
	148008	0,39
	148011	0,39
Trep^iema hyodytθntθriαe	94AOO1	0,20
	94AOO2	0,20
	94A007	0,20

Dane o skuteczności związku o wzorze przedetawioiym na rysunku i jego soli wobeo kokoydiozy u kurcząt otrzymano następującą metodą. Grupy 10-dniowych, wolnych od patogenu samców kurcząt rasy biały leghorn /po 3-5 ptaków/ karmiono mieszanką pastewną zawierającą związek o wzorze przedstawloiym na rysunku lub jego sól sodowa 1/lub potasowa równoce.θrriLe w niej rozprowadzone. To 24 godzinach od rozpoczęcia podawania tego pokarmu każde kurozę zakażono przez doustne podanie poszczególnych testowanych gatunków Eimeria. Inne grupy 10-dniowych kurcząt /po 3-5 ptaków/ karmiono podobną mieszanką pastewną, lecz bez badanego związku lub jego soli. Kluczęta te także zakażono po 24 godzinach dla uzyskania osobników kontrolnych. Oaobniki kontrolne dla opisanych grup stanowiła grupa 10-dniowych kurcząt /3-5 ptaków/ karmona tą samą mLeszaikca pastewną, lecz bez antybiotyku, i nie zarażona.

oszacowano po 5 dniach w przypadku E.acerwulina i po 6 dnlaob dla wszystkich innych gatunków.

Krrteria stosowane przy pomiarze aktywności przedw kokcydiozie obejmowały skalę uszkodzeń od 0 do 4 dla E^enoUa /według J.E.Lynch, A Rew Method of the Primary Ενθί^υ^ of AnUcoccidial Activity Am. d^^Rees, 22, 324-326, 1961/ i od 0 do 3 dla innych gatunków /według skali podanej przez J. Johnsona i W.H.Reeda, AAmcoccidial Druga. Loaion Scoring Teohniques in Battery and Ploor Ben ln Chicka, E^IPsciU., 28 , 30-36, 1970/.

Aktywność obliczono dzieląc wy^Qik oceny uszkodzeń każdej grupy traktowanej przez i oceny uszkodzeń osobników zarażonych kontrolnych. W teście tym badane związki przejawiały doskonałą aktywność przecie zakażeniu drobiu EI..^ tenella, E. scen/ulina, E. marima,

E. bruneti 1 E. necatriz, po włączeniu tych związków do mieszanki pokarmowej dla kurcząt w stężeniu około 1,0 - 25 ppm. Na przykład w przypadku wrażliwego E. tenoHa, związek o wzorze przedstawionym na rysunku powodował zwalczenie 100% uszkodzeń w dawce wynoozącej zaledwie 5 ppm.

Wym^zek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład i. PeΓeeeiacJα z udziałem Actinomadura sp. ATCC 53708. izolowanie związku o wzorze przedstowtonym na rysunku w postaci soli sodowej.

Actinomadura sp. icicalnc początkowo irokulując podłoże stałe w skosach lub w kolbach Rouza za pomocą kultury ATCC 53708. Stosowano pożywkę ATCC nr 172 o następującym składzie:

159 781 glikoza ¹⁰skrobia rozpuszczalna 20 ekstrakt z drożdży ⁵enzymatyczny hydrolizat ^kazelny 1 węglan wapniowy ¹woda destylowana do 3.000 ml ^pH doprowadzono do 7,0 za pomoc^ą KOH, dodaó agar 20

Tymczasem przygotowano kolby do wytrząsania stosując jedną z następująoyoh pożywek:

Cl S/Htr

Cerelose /glikoza techniczna 10 i^ks sojowa 10 substancja sucha po fer^^^t^tt^cji kukurydzy 5 skrobia kukurydziana 10 chlorek sodowy 5 chlorek kobaltowy 0,(002 węglan wapniowy 1

JDYTT g/litr

Cerelose /gUkoza tectaiczna/ ¹⁰ skrobia kukurydziana 5 namo^k lcukurydziany 5 enzymatyczny hdrolizat Rzeiny ⁵ chlorek kobaltowy 0,002 węglan wapniow^{y 3}

Po WO ml pożywsi umieszczono w kolbach ^do wy trząs ani a o pojemności 3°° ml i przsproo 5 wadzono wyjaławianie w temperaturze 120 C i pod ciśnieniem 1,03 z 10 Pa w ciągu 30 Einut. Po sciiłodzeniu ^pożywkę zainokulowano zawiesiną ^komórak wegetatywnych poiiranych ze stasu wyżej opisanej ^hodowli Actinomadura sp. ^Kolby wytrząsano w temperaturze ²8°C na wytrząsarce o amplitudzie 3,8 - 6,4 cm i ^prędkości oho towej 150 - ²⁰0 obrotów na minutę ^przsz 5-7 ^dni.

W międzyczasie przygotowano naczynia fermentac^yjne o pojemności 5 litrów, zawierające po 3 litry jednej z ^powyższych pożywek C* lub JDYTT, ^bądź poż^ywkę UK1-2 o składzie:

g/Htr

Cerelose /glikoza tec^hnlczna/ 45 mąka sojowa 10 namo^k RRrydziany 10 cRorek Rbaltowy 0,002 siarczan magnezow^y 0,10 węglan wapniowy 3 siarczan man^ganowy 0,10 siarczan ^żelazowy 0,10

Dodano antyapieniacz /glikol prop^ylenowy, KOOO, zawierający 10% wagow^ych tlenku etyle^nu, ¹ ml/, naczynia zamknięto i poddano wyjaławianiu w temperaturze 120^oC pod Rśnieniera 1,03 ^χ l⁰^, przez 45 minut. Następnie zawartość naczyń zainokulowano zawartością poszczególnych wytrząsanych Rlb /około 3% inokulum/ i pozostawiono do fermentacji przez 120 - 168 godzin w temperat^urze ³°°^C, prowadz^ąc mieszanie z prędRścią ¹700 obrotów/minut^ę, przy prę^dkości napowietrzania ¹ objętość powietrza/1 objętość oieczy ⁿa minut^ę.

159 781

Po zakończeniu fermentacji /stwierdzonym w oparciu o test antybiotykowy przeciw B.subtilis ATCC 6633 oa płytkach/, zatdtymaoo naczynia fermentacyjne i ich zawartość przesączono przy naturalnym pH przez ziemię okrzemkową. Placek fiirΓatyjny zryspergowano w metanolu, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczono 2-3 objętościami wody i następnie wyekstrahowano ^nuk^conie 1/3 - 1/2 obtętości albo ketonu metylkwoizot^tylowego, albo n-butanolu. Warstwę rozpuszczalnika oddzielono od fazy przez odessanie lut wirowanie i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując antybiotyk o wzorze przedstawionym na rysunku, w formie nie oczyszczonoj, jako lepki olej.

Aktywność biologiczną brzeczki i wyodrębnianych kolejno jej frakcji można testować przy użyciu wrażliwych szczepów Bcillus subMlis ATCC 6633 lub Staphylkcoccua aureus ATCC 6538. Składniki brzeozki i wyodrębniane frakcje można uwidocznić używając płytek z żelem krzemionkowym GF Analiezh i stosując jako eluent ratas etylu. Rozwirtęte płytki opryskuje się odczynnikiem waMllkiwta /3 S waMliny w 75 m etanolu i 25 m 85% kwasu fosforowego/ 1 ogrzewa do temperatury 80°C. Stanowiący produkt antybiotyk pojawia się Jako purpurowa plamka. Na rozwinięte płytki do chromatokraaii cienkowarstwowej można także nałożyć warstwę agaru drinzkuOowaoagk S. aureus lub B. sab^Hs, z dodanym janooikdzianea chlorku 2,3,5-tóójfonylo-2H-ietΓazolu i iikubować w temperaturze 37°C przez 16 godzin w celu uwidocznienia antybiotyku /białe plamki oa różowym tle/.

Zwiększenie skali w dużych zbiornikach fermentacyjnych przeprowadzono przez przygotowanie kolb do wytrząsania zawierających 0,7 litra podłoża C* lub JDYTT. Inokulim w w^rząsanych kolbach wzrastało przez 5-7 dni w tem^^i^(^'hurze 28°C, a następnie służyło do szczepienia za^w^alto^i^^ fermentatorów o pojemności 200 lub 6000 lirrów, zawierających odpowiednio 100 lub 4000 lirrów pożywki UK1-2. Stosowano w przybliżeniu 1 litr inokulum w każdym fermentatorze. Fermentację zakończono po 7 - 10 dniach.

^łoą brzeczkę z mniejszej szarży wyekstrahowano 50 lirrami metylkioizkbutylowego ketonu przy naturalnym pH. Ekstrakt organiczny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w destylatowe w cyklonem i wyparce oZΓktoiej. Uzyskany olej poddano dwiukotiie na

500 g żelu krzemionkowego zdtspeΓgkwroego w heksanie. Pierwszą kolumnę rozwijano octanem eiy0iwtm, drugą mieszaniną C^CC^:rcaizo w stosunku 1 : 1. Frakcje zawierające produkt didentyfkZiwano powżej opisaną metodą c^u·zmarokΓaaii cieMkiarstikWij. Aktywie frakcje z drugiej kolumny z żelem krzemionkiwym poddano kstriecdoie chΓomarikτarii oa florisilu, używając jako eluanta mieszaniny CHCljjCHjOH w stosunku 19:1. Zawierające produkt frakcje połączono, poddano wytrząsaniu z rkdcaeύcklnym HjPO4 i następnie ze stroziiąctm bufor ortofosforanem sodowym /w celu utworzenia soli sodGow!/. Po wiauezeniu oad NagSO^ i odpędzeniu pozostałość poddano krystalizacji z eteru w celu iyodrębnienir soli skrkiij związku o wzo^rze pr^de^dstaiionta na rysuob /915 “£/ o ⁱampeΓatuΓda to^biia 245 - 249°C /^χ /^= ^-10° /c=l, CH^OO/.

AnaHza elementarna dla Ο^ΗγγΟ^Νβ: C, 62,47, H 8,97, stwierdzono: C 62,89, H 9,22.

NMR /przesunięcie chemiczne /ppm/ ^w CDClj z liczbą atomów wodoru podaną w nawiasach/:

182,8 /0/, 110,0 /0/, 106,0 /0/, 99,1 /1/, 87,2 /1/, 86,9 /0/, 86,2 /1/, 86,2 /0/, 84,8 /1/, 83,4 /0/, 82,6 /1/, 80,2 /1/, 78,5 /1/, 75,2 /1/, 74,8 /1/, 74,6 /1/, 66,4 Λ/, 60,3 /3/,

57,9 /3/, 56,9 /3/, 44,5 /1/, 39,0 /1/, 36,9 /1/, 36,8 /2/, 35,9 /2/, 35,4 /2/ 35,2 /2/,

35,1 /1/, 35,0 /1/, 31,3 /2/, 30,9 /2/, 30,5 /1/, 28,2 /3/, 27,1 /2/, 26,1 /2/, 25,0 /3/,

21,0 /3/,18,3 /3/ 16,7 /3/, 15,3 /3/, 13,4 /3/, 13,1 /3/, 11,2 /3/, 10,7 /3/ i 10,6 /3/.

Obróbka pełnej brzeczki z ^dużego fermentatóra obejmowała eks trahowaMe ^około 4000 litrów pełn^{ej b}rz^eczki 1800 litrami btonu metylowoizobtylowego, oddzielenie roz^puszczalⁿika ^{w ek}Mraktorze Podbielnacka i jego zatężenie ^do rzabiego syropu ^pod ^zmni^ejszonym Manieniem. Koncentrat robarto bukrotnie z równ^ą objętością cz^ystego etanolu, oddztólono od ole^ju Merozpuszraalnego ^w ratanolu i frakcję metanolową zatężono pod zanl^ejθzonym MśMeMem do bnsystencji ^syropu. Syrop ^wyekatrahowano bukrotnie heksanem 1 ^połączone frakc^je bkaanowe ^wyek^strahowano raetonitrylem, bóry zachowano do operacji odzyskania Hebra ratężono pod·

159 781 zmiejszonym ciśnieniem, a następnie poddano porcjami chromatografii na żelu krzemionkowym. Zl krzemionkowy poddano nt lejku iiOraaoyjnym desorpcji najpierw heksanem, a następnie ohloakiem metylenu, octanem etylu i na końcu acetonem. Aktywne frakcje, które były w eluatach po elucji C^Clg i octanem etylu zatężono, rozpuszczono w heksanie 1 przemyto zakwaszoną wodą, a następnie wyekstrahowano 1% wodnym roztworem N-maeoli-D-gltJf miny w woddie.

Fazę wodną poddano działaniu chlorku sodowego 1 wyekstrahowano równą objętością octanu etylu. Waretwy organiczne połączono, potraktowano węglem aktywnym, przesączono, przemyto stanowiącym bufor /pH 9*0/ fosforanem sodowym, wysuszono nad siarczanem sodowym, zatężono pod zMO-ejszojmym ciśnieniem i poddano krystalizacji z eteru. Otrzymano 50*8 g soli sodowej identycznej z produktem firronjaojl na mnejszą skaLę.

Przykład II. Związek o wzorze przedstawionym na rysunku w postzoi wolnego kwasu. Związek o wzorze przedstawionym na rysunku w postaci wolnego kwasu wytworzono przez energiczne ^trząsanie w razdzielaozu soli sodowej w chloroformie z równą objętością kwasu solnego /pH 2/. Po rozdzieleniu się faz warstwę chloΓoiamnową przemyto wodą, z następnie odparowano pod zimOejezonym olśnieniem, otrzymując wolny kwas o temperaturze topnienia 87 - 90°l. / oć / d - -6*9° /c=l, Mesina/.

Analiza elementarna dla Ο^ΗγθΟ^ z 0,5 HjO: l 63,43, H 9,34.

Stwierdzono: l 63,35, H 9,53.

Przykłed III. Sól sodowa związku o wzorze przedstawionym na rysunku.

Winy kwas z przykładu II /45 mg rizpuszozono w 100 m. chloroformu. Dodano roztwór węglanu sodowego /0,5 g/ w wodzie /100 m./ 1 powwtałą imeszznlnę energicznie wytrząsano w rozdzielaczu przez kilka minut. Oddzielono warstwę ahloroiomlową, a warstwę wodną przemy to świeżym ahloroiam]ea. Połączone ekstrakty ahloΓiOonnowe wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono 1 odparowano, otrzymując 41 mg soli sodowej o temperaturze topnienia 230 - 235°l.

Anotizz elementarna dla Ο^ΗγγΟ^Νβ: l 62,47, H 8,97.

S0witrZziOi: l 62,20, H 9,14.

Przykład IV. Sól rubidcia związku o wzorze przedstawionym na rysunku.

Rozpuszczono 30 ml wolnego kwasu w 50 ml chloroformu. Do chloroformu dodano węglan rubidu /35 mg w 25 ml wody/ i całość m.esztno przez 2 godziny. OidzZeloni fazę organiczną a warstwę wodną wyekstrahowano równą objętością chloroformu. Połączone ekstrakty chloroformowe odparowano, otrzymując białą substancję stałą. Sól rubi^ć^t^wą poddano rekryαiatizacji przez powolne odparowanie z eteru.

Przykład V. Sól potasowa związku o wzorze przedstawionym nt rysunku.

Rozpuszczono 130 ms wolnego kwasu w 100 ml chloroformu. Dbano 100 mg KglOj w 100 ml wody i powwtałą mieszaninę mieszano przez kilka minuu, z następnie umieszczono w rozdzielaczu i energicznie wytrząsano przez kilka minu;. Fazę organiczną oddzielono i odparowano pod imajej8ionya ciśnieniem, otrzymując produkt w postaci białego proszku o temperaturze topnienia 255 - 26O°l. / O( /|⁵ = - 19^,6° /^c=l, tolmfora/.

Anotiza elementarna dla l45H7₇0₁4K: l 61,34, H 8,81. StiitrZzini: O 60,91, H 8,83.

159 781

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowego eteru wielopierścieniowego o wzorze przedstawionym na rysunku, a także jego farmakologicznie dopuszczalnych soli kationowyoh, znamienny tym, że prowadzi się pidpowOθrzchniową hodowlę drobnoustroju Actinomadura sp. ATCC 53708 w warunkach aerobowych, w wodnej pożywce zawierającej przyswajalne źródła węgla i azotu, do uzyskania dającej się wyodrębnić ilośoi tego eteru.

2. Sposób według zastrz, 1, z n a m 1 Θ η n y t y I», że eter bnia się w postaci soli sodowej iub potaso:^, 3. Sposób według zaetrz. 1. z n a m 1 e η n y t y 01. że eter bnia się z brzeozkl. 4. Sposób według zaetrz. 1, z n a m 1 e η n y t y m, że eter

że eter wlilipiθrścienOooy w postaci wytrąconej odzyskuje się w mieszaninie z grzybnią drogą filtraoji brzeozkl.

5. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że eter wieiipierścienOowy wyodrębnia się jako surowy produkt drogą suszenia rozpytawego iub liofiizzaoji pełnej brzeczki.