Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia mieszaniny antybiotyków 35763* 36926, 37277 i 37932 o dzialaniu synergistycznym.W pismiennictwie, dotyczacym antybiotyków, znane sa liczne doniesienia, zwiazane ze zjawi¬ skiem synergizmu: The Journal of Antibiotdjcs 25, no. 6, 371 (1972); J. Chem. Soc. 190, 1653 (1966); Buli. Soc. Chim. Belg. 68, 716 (1959); J. Amer.Chem. Soc. 82, 4414 (1960); Tetrahedron Letters 2687 (1971); J. Aniabiotkas. Soc. A 14 (1961); Nature 187, 598 (1960)', J. Chem Soc. 2286 (1960); Antimicrobial Agents nad Chemotherapy 360—365 (lfi64); Tetra¬ hedron Lettens 4231—4238 (1966); Organie Mass Spectrometry 6, 151—166 (1972); Tetrahedron Let¬ ters 369—372 (1966) oraz J. Chem. Soc. 190, 1669— 1676 (1966).Mieszanina antybiotyków o dzialaniu synergi- stycznym, wytwarzana sposobem wedlug niniejsze¬ go wynalazku nalezy do grupy innych mieszanin synergistycznych: mikamycyny. prystdnamycyny, ostreogrycyny, atreptograminy, antybiotyku P.A.* 114, vernamycyny i wirginiamycyny.Wytwarzana sposobem wedlug wynalazku mie¬ szanine antybiotyków, stanowiacych zwiazki 35 763 i/lub 36 926 i/lub 37 277 i/lub 37 932, stosuje sie w ilosci 10—100 ppm jako skladnik biologicznie czymr- ny mieszanki paszowej, zwiekszajacej wzrost i podnoszacej wydajnosc zywienia zwierzat.Wchodzacy w sklad mieszaniny antybiotyków zwiazek 37 277 w postaci krystalicznej wykazuje 25°_ skrecalnosc optyczna (a) ^ = + 11° w etanolu o stezeniu 1%, charakterystyczne widmo w nadfio¬ lecie z maksimami absorpcji roztworu etanolowego przy 225, 274, 282, 303 i 355 mji, absorpcje wlasci¬ wa E^^ odpowiednio 309,3, 36,67, 45,01, 70 i 20. jego sklad w analizie wagowej charakteryzuje sie zawartoscia 60,91% wegla, 5,98% wodoru, 10,45% azotu i 22,66%*tlenu (z róznicy), zas jego roztwór chloroformowy wykazuje widmo w podczerwieni, charakteryzujace sie pasmami absorpcji przy: 3,05, 3,40, ,570, 5,77, 5,93, 6,07, 6,62, 6,82 i 7,67 mikronów.-Wchodzacy w sklad mieszaniny antybiotyków zwiazek 36 926 charakteryzuje sie . zawartoscia 57,89% wegla, 6,78% wodoru, 8,04% azotu i 27,99% tlenu (z róznicy), posiada sumaryczny wzór C26H35- ° N3O7 i wykazuje skrecalnosc optyczna (a) D = = —130° w 1% roztworze w etanolu, absorpcje w ultrafiolecie roztworu etanolowego charakteryzuja- 2t cego sie maksimum przy 214 my. i absorpcji wla- 1% sciwej E j = 723,8, oraz posiada charaktery¬ styczne pasma absorpcji w podczerwieni (tablet¬ ka KBr) przy 2.95, 3.40. 5.75, 5.98, 6.23, 6.58, 6.87, 7.45,, 8.25, 8.38, 8.80, 9.08, 10.15, 10.35, 11.10 i 13.30 mikronów.Wchodzacy w sklad mieszaniny antybiotyków zwiazek 37 932 w postaci krystalicznej wykazuje ° skrecalnosc optyczna (a) D = + 5,0 w stezeniu 80 0,25% w chloroformie, roztwór etanolowy wyka- M57399 5^ 8 zuje widmo w nadfiolecie z charakterystycznymi maksymami przy 226, 276, 283, 305 i 355 mfi i ab¬ sorpcje wlasciwa E L<;m Odpowiednio 364.4, 36.8, 43.49, 70.25 i 20.07, w analizie wagowej charakte¬ ryzuje sie skladem 59.41ty» wegla, 6d!9/« wodoru, 5 .66% azotu, 23.92°/o tlenu (z róznicy), oraz po- Jsiada charakterystyczne pasma absorpcji w pod¬ czerwieni (tabletka KBr) przy 2.96, 3.05, 3.38; 5.68, .73, 5.93, 5.98, 6.13, 6.50, 6.58, 6.88, 7.40, 7.65, 8.08, 8.45, 8.60, 9.03, 9.45, 9.70, 9.98, 10.55, 11.00, 11.25, " 11.60, 12.35 i 13.25 mikronów.Mieszanina antybiotyków, stanowiaca skladnik biologicznie czynny mieszanki paszowej, wytwarza¬ na jest przez szczep Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 w napowietrznej hodowli podpowiedz- 15 chnipwej na plynnym podlozu, zawierajacym przy¬ swajalne zródlo wegla i azotu az dó uzyskania znacznego stezenia antybiotyków w brzeczce, a nastepnie poszczególne antybiotyki lub ich mie¬ szanine izoluje sie z hodowli. Mieszanine stanowia 20 zwiazki o charakterze makrocyklicznych laktonów i depsypeptydy, które rozdziela sie i izoluje z brzeczki fermentacyjnej metodami ekstrackji przy uzyciu rozpusizczalników, rozdzialu przeciwprado- wego„ chromatografii kolumnowej, badz kilkoma *. wymienionymi metodami lacznie. Poszczególne an¬ tybiotyki, wchodzace w sklad mieszaniny, charak¬ teryzuja sie dzialaniem antybiotycznym. Surowy preparat mieszaniny antybiotyków lub wydzielone z mieszaniny czyste zwiazki o charakterze makro- * cyklicznych laktonów i czyste zwiazki depsypepty- dowe wykazuja w znacznym stopniu synergistycz- ne dzialanie antybiotyczne. Surowa mieszanina an¬ tybiotyków, czyste pojedyncze antybiotyki, wcho¬ dzace w jej sklad, oraz czyste zwiazki o charakte- *5 rze makrocyklicznych laktonów i. zwiazki depsype- ptydowe wykazuja dzialanie jako stymulatory wzrostu pisklat i swin* jak równiez stosowane sa jako czynniki terapeutyczne w zwalczaniu biegun¬ kiswin. 4° Drobnoustrój, stosowany przy wytwarzaniu an¬ tybiotyków sposobem wedlug wynalazku, zostal wyizolowany z prób ziemi z Egiptu. Hoduje sie go na agarze kartoflano-marchwiowym. Drobnoustrój ten nalezy do klasy aktynomycetesy wytwarza spo- 4i rangia podobnie, jak drobnoustroje z rodzaju Acti¬ noplanes. Dlatego do hodowli tego drobnoustroju stosuje sie takie same podloza jak do badan dro¬ bnoustrojów z tego rodzaju. Zawiesiny tego dro¬ bnoustroju przygotowuje sie w ten sposób, ze ka- M walki hodowli agarowej rozgniata sie w malych probówkach, zawierajacych 0,2 ml sterylnej wody destylowanej, zawartosc wyplukuje sie woda de¬ stylowana sterylna w takiej ilosci, aby uzyskac lacznie objetosc 5 ml hodowli. Tak sporzadzona za- 55 wiesine stosuje sie do przeszczepiania hodowli na rózne podloza w probówkach, skosach agarowych, jak tez na plytkach Petriego. Hodowle inkubuje sie w temperaturze 28°C, z wyjatkiem przypad-. ków specjalnie zaznaczonych. Odczyty dokonywa- w ne sa w odstepach czasu w ciagu 22 dni dla nie¬ których badan, a dla wiekszosci po 14 dniach.Barwy hodowli odczytywane wedlug Slownika barw* drugie wydanie, z 1950 r. wg. Maerz i 4 Paul'a, jak równiez wedlug wlasnych opisów. No¬ wy szczep (Pfizer F.D. 24 090) zlozono w kolekcji szczepów American Type Culture Collection w Rock- ville, Maryland, 11 marca 1974, gdzie zostala za¬ rejestrowana jako Actinoplanes auranticolor ATCC 31011. Ciaglosc hodowli i jej powszechna dostep¬ nosc beda zagwarantowane po uzyskaniu praw pa¬ tentowych. Dostepnosc do hodowli w okresie za¬ twierdzania zgloszenia jest zastrzezona prawnie Postanowieniem 14 i 35 USC 112. Wszystkie za¬ strzezenia zwiazane z powszechna dostepnoscia zdeponowanego szczepu zostana usuniete po uzy¬ skaniu praw patentowych.Podloza, sluzace do identyfikacji i charakterysty¬ ki hodowli, jak rówoiez odnosniki literaturowe ze skladem podlóz podane sa ponizej: — 2°/o agar w wodzie wodociagowej,, — Agar kartoflano-marchwiowy. M. P. Lecheva- lier, J. Lab. & Clin. Med. 71, 934^-944 (1968).Stosuje sie tylko 30 g kartofli i 2,5 g marchwi/ lecz 20 g agaru.— Agar Czapek'a-sacharozowy. Waksman. S.A., The Actinomycetes 2, 32S (1961) Podloze No. 1, strona 328.— Agar glukozowo-asparaginowy. Waksman, jak powyzej, Podloze No. 2, strona 328.— Agar z ekstraktem z drozdzy i ekstraktem slo¬ dowym. Antibiotics Ann. 1956/1957, strony 947 —953.— Agar Hickey^ i Tresnera J. Bact. 64, 891—892 (1952). ¦-. ¦ — Agar kartoflano-glukozowy. 100 g obranych i pocietych kartofli w 500 ml wody ogrzewa sie w parze, filtruje przez lniane plótno, dodaje 10 g glukozy, 20 g agaru i uzupelnia woda do obje¬ tosci 1 litra.— Agar skrobiowy. J. Bact. 73, 15—27 (1957) — Zelatyna. J. Bact. 73, 15—27 (1957).— Agar tyrozynowy. J. Bact. 69, 147—150 (1955).— Agar peptonowo-zelazowy. Difco — Mleko odtluszczone Difco — Bulion dekstrozowo-azotanowy. Waksman, S.A., The Actinomycetes 2,v328 (1961). Podloze No. 1 z dodatkiem 3.0 g glukozy w miejsce sacharozy bez dodatku agaru.— Bulion z dodatkiem azotanów organicznych, J. Bact. 73, 15—27 (1957).— Podloze" ATCC 172. Katalog American Type Culture,. wydanie 10, strona 235 (1972).— Podloze do badan wykorzystania wegla. J. Bact.,, 56, 107—114 (1948).Opis hodowli na róznych podlozach: Agar zwyczajny na wodzie wodociagowej — wzrost slaby,x rzadki, splaszczonyL prawie 9D2 (bla¬ do rózowy); brak grzybni powietrznej; grzybnia podstawowa bezbarwna do 9D2; brak pigmentu rozpuszczalnego..Agar Czapek'a^sacharozowy — wzrost umiarko¬ wany prawie dobry, splaszczony, prawie 9G6 (bla¬ do pomaranczowy); brak grzybni powietrznej; grzybnia podstawowa prawie 9G6; brak pigmentu rozpuszczalnego.Agar glukozowo-asparaginowy — wzrost umiar¬ kowany, wznoszacy sie, chropowaty, prawie 9L909 573 '. 6 (lekko pomaranczowa); brak grzybni powietrznej; brak pigmentu rozpuszczalnego. % Agar z ekstraktem z drozdzy i ekstraktem slo¬ dowym — brak wzrostu.Agar Hickeya i Tresnera — wzrost umiarkowa¬ ny prawie dobry lekko wznoszacy sie i chropo¬ waty, prawie 9F9 (pomaranczowa matowa); na po¬ wierzchna jasno bialawy meszek; grzybnia podsta¬ wowa prawie 918; pigment rozpuszczalny lekko brazowawy.Agar kartoflanp-glukozowy — wzrost umiarkowa¬ ny, wznoszacy sie, chropowaty, prawie 9L9 (jasno pomaranczowa); brak grzybni powietrznej; grzyb¬ nia podstawowa prawie 9L9; brak "pigmentu roz¬ puszczalnego.Agar tyrozynowy — wzrost slaby prawie umiar¬ kowany, splaszczony, prawie 13A10 (czerwonawo pomaranczowy, matowy); brak grzybni powietrz¬ nej; grzybnia podstawowa prawie 10D11; pigment rozpuszczalny brazowy.Zelatyna — wzrost umiarkowany, splaszczony, prawie 9KL2 (czerwonawo pomaranczowy); brak pigmentu rozpuszczalnego? Agar skrobiowy — wzrost umiarkowany prawie dobry, wznoszacy sie, prawde 9KI0 (pomaranczo¬ wy); lekko bialawy meszek; grzybnia podstawowa prawie ¦ 9KI0; pigment rozpuszczalny blado zólty.Skrobia hydrolizowana jest w stopniu slabym; uplynnianie zelatyny intensywne; redukcja azo¬ tanów do azotynów nie zachodzi na zadnym z po¬ dlóz nawet po 22 dniach hodowli (obserwuje sie bardzo slaby wzrost na bulionie dekstrozowo-azo- • tanowym i dobry na bulionie z azotanami orga¬ nicznymi; wytwarzanie H2S jest slabe; na agarze peptonowo-zelazowym brak pigmentu rozpuszczal¬ nego; nie obserwuje sie koagulacji, badz hydroli¬ zy mleka nawet po 22 dniach hodowli; tyrozyna nie jest rozkladana; na podlozu ATCC 172 obser¬ wuje sie dobry wzrost w temperaturze 21—37°C, przy czym optymalna temperatura wynosi 28— 37°C; brak wzrostu w temperaturze 45°C. Zuzy¬ wane sa cukry arabinoza, fruktoza* glukoza, man- nitol, rafinoza, ramnoza, sacharoza i ksyloza, na¬ tomiast nde obserwuje sie wykorzystywania ino¬ zytolu. Na zadnym podlozu nie wydziela sie przy¬ kry zapach.Sporangia wytwarzane sa jedynie na agarze kar- toflano-marchwiowym. Tworza one warstwe pali¬ sadowa. Wymiary sporangów wynosza 5,5—11 X X4,5—8 mikronów szerokosci i 9—12 mikronów wysokosci. Splprangia wystepuja w calkiem duzej ilosci, posiadaja nieregularny ksztalt, a przez ich stopniowe rozmiekszanie nastepuje uwolnienie spor.Sporangia z agaru kartoflowo-marchwiowego po trzytygodniowej inkubacji uwalniaja spory, w wa¬ runkach gdy fragmenty hodowli zanurza sie w ciagu kilku godzin w temperaturze 21°C w roz¬ tworze Ig glukozy i 1 ml Tween 80 w objetosci 1 litra wody (jest to modyfikacja roztworu, sto¬ sowanego przez M. L.^Higgins^a, J. Bact., 94» 495— 498, 1967). Spory w sporangium ulozone sa w ksztalcie nieregularnych lancuchów, a po uwolnie¬ niu przyjmuja ksztalt kulisty o srednicy 1,6 mi¬ krona lub rozszerzonej elipsy o wymiarach 1.6— 2.2 X 1.1—1.6 mikronów. Prawie wszystkie wyka¬ zuja zdolnosc poruszania sie.Przy wstepnej identyfikacji porównywano te ho¬ dowle z A. aurantLcolor ATCC 15330. Nowo wyizo- lowany szczep A. auranticolor ATCC 31011 jest podobny do szczepu A. auranticolor ATCC 15330 pod wzgledem cech morfologicznych, barwy i za¬ wartosci rozpuszczalnego pigmentu na agarze Ben- netta, agarze odzywczym, agarze glukozowo-aspa- raginowym, agarze glicerolo-asparaginowym, aga¬ rze z jablczanem wapnia i agarze tyrozynowym.Zadna z hodowli nie redukuje azotanów do azo¬ tynów; obydwie hodowle wytwarzaja male ilosci H2S, a na agarze peptonowo-zelazowym -nie wy¬ twarzaja melanin; obydwie hydrolizuja skrobie.Szczep A. auranticolor ATCC 15330 nie, powoduje zadnych zmian odtluszczonego mleka, podczas gdy hodowla nowego szczepu spowodowala sklarowa¬ nie mleka w trzech probówkach z szesciu bada¬ nych, a po 21 dniach powstal zólto-kremowy roz¬ puszczalny pigment.Szczep A. auranticolor ATCC 31011 zuzywa glu¬ koze, anabdnoze, fruktoze, mannitol, rafinoze, ram- noze, sacharoze i ksyloze. Szczep A. auranticolor ATCC 15330 zuzywa równiez, wszystkie wymienio¬ ne cykru z wyjatkiem rafiinozy. Sporangia i spory obydwu hodowli sa podobne, przy czym spory A. auranticolor 15330 maja ksztalt bardziej wydlu¬ zony.Najistotniejsza róznica pomiedzy szczepami po¬ lega na tym, ze szczep A. auranticolor ATCC 15330 w hodowli podpowierzchniowej nie wytwarza an¬ tybiotyku, podczas gdy szczep A. auranticolor AT¬ CC 31011 wytwarza mieszanine w/w antybiotyków.Hodowle szczepu A. auranticolor ATCC 31011 prowadzi sie na plynnym podlozu, metoda podpo- wierzchniowa, stosujac napowietrzanie i mieszanie w temperaturze 28—36°C. Podloza hodowlane za¬ wieraja przyswajalne zródlo wegla, jak na przy¬ klad cukry, skrobie i melase; zródlo azotu orga¬ nicznego, jak kazeine, enzymatyczny hydrolizat ka¬ zeiny, make sojowa, make z ziaren bawelny, make z orzechów ziemnych i gluten pszenny. Dobre wy¬ niki uzyskuje sie, dodajac 'do podloza czynniki wzrostowe, takie jak rozpuszczalny slód gorzelnia¬ ny, maka rybna, ekstrakt drozdzowy oraz sole, jak chlorek sodu i weglan wapnia, sladowe ilosci me¬ tali zelaza, magnezu, cynku, kobaltu i manganu.W przypadku pienienia podloza fermentacyjnego dodaje sde czynniki przeciwpienne, jak oleje ro¬ slinne lub silikonowe srodki gaszace piane. Podlo¬ ze fermentacyjne napowietrza sie, podajac 1/2 do 2 objetosci, czystego powietrza na objetosc brzecz¬ ki na minute. Podloze miesza sie przy uzyciu urzadzen, stosowanych w przemysle fermentacyj¬ nym. Podczas przeszczepiania i w czasie hodowli szczepu musza byc zachowane warunki jalowosd.Inoculum do przeszczepienia hodowli, wytwarza¬ jacej mieszanine antybiotyków, otrzymuje sie przez przeniesienie szczepu ze skosu agarowego na po¬ dloze hodowlane, jak na przyklad podloze ATCC 172, opasane w odnosniku literaturowym podanym uprzednio. Szczep ze skosu stosuje sie do posie- wania hodowli w kolbach lub w tankach fermen¬ tacyjnych, mozna tez przygotowac hodowle posie- 40 45 50 5599 573 7 8 wowa w tankach przez przeszczepienie hodowli kolbowej. W trzesawkowej hodowli w kolbach ma¬ ksymalny wzrost osiaga sie po 4 dniach, podczas gdy. hodowla posiewowa w tankach osiaga naj¬ lepszy wzrost po 2 lub 3 dniach. W hodowli pro¬ dukcyjnej najwyzsza aktywnosc antybiotyku uzy¬ skuje sie po 20 do 30 godzinach fermentacji.Przebieg procesu wytwarzania antybiotyku kon¬ troluje" sie przy pomocy znanej metody biologicz¬ nej okreslenia aktywnosci antybiotycznej wobec wrazliwego szczepu Staphylococcus aureus. Aktyw¬ nosc antybiotyku w brzeczce oznacza sie przy uzy¬ ciu standardowej metody plytkowej i krazków bi¬ bulowych wysyconych badana brzeczka na podsta¬ wie wielkosci strefy zahamowania wzrostu szczepu wzorcowego wokól krazka. Po osiagnieciu maksy¬ malnego stezenia antybiotyku w brzeczce, produk¬ ty fermentacji izoluje sie z calej brzeczki, badz z przesaczu. W tym ostatnim przypadku grzybnie usuwa sie przez filtracje lub wirowanie. Do tego celu uzywane sa prasy filtracyjne, wirowi lub inne urzadzenia.Analize mieszaniny antybiotyków w hodowli, jak równiez z surowych i oczyszczonych preparatach, ekstrahowanych z brzeczki fermentacyjnej, prze¬ prowadza sie przy pomocy chromatografii cienko¬ warstwowej na zelu krzemionkowym. Rozdzial mieszaniny antybiotyków na skladniki zalezy w znacznym stopniu od zawartosci antybiotyku*. Zbyt male stezenie uniemozliwia wydzielanie skladni¬ ków, wystepujacych w mniejszosci; zbyt duze ste¬ zenie antybiotyku nie pozwala na dobry rozdzial w wyniku ciagniecia sie skladników, wystepuja¬ cych w duzym stezeniu.Ukladem rozwijajacym w chromatografii cien¬ kowarstwowej jest mieszanina chloroform-etanol (9: 1). Chromatogram po rozwinieciu oglada sie w swietle ultrafioletowym przy dlugosci fali 254 mfi i 366 m|i. Identyfikacje skladników antybioty¬ ku przy pomocy bioautografii przeprowadza sie w ten sposób, ze plytke z zelem umieszcza sie na agarze odzywczym, zaszczepionym wrazliwym szczepem Staphylocooous aureus lub innego dro¬ bnoustroju. Glównymi skladnikami mieszaniny antybioty¬ ków, wytwarzanych przez szczep A. auranticolor ATCC 31011 sa zwiazki o charakterze makrocykli- cznego laktonu i zwiazki depsypeptydowe. Wyste¬ powanie lub brak któregos ze skladników, jak równiez procentowa zawartosc skladników jest rózna w róznych fermentacjach i zalezy od czasu trwania biosyntezy, pH i skladu podloza. Rózne warunki, podane w przykladach, wplywaja na to, ze glównymi skladnikami sa zwiazek 37 277 (de- psypeptydowy) i 36 926 (makrocykldczny lakton), a skladnikami wystepujacymi w malej ilosci sa zwiazki 37 932 (depsypeptydowy) i 35 763 (makro- cykliczny lakton).Poszczególne skladniki mieszaniny antybiotyków izoluje sie i rozdziela róznymi metodami, jak eks¬ trakcja rozpuszczalnikami, rozdzial przeciwprado- wy Craiga, chromatografia kolumnowa lub kilko¬ ma wymienionymi metodami lacznie. Ekstrakcje antybiotyków z brzeczki prowadzi sie róznymi rozpuszczalnikami, jak chloroform, octan etyki i keton metylo-izobutylowy. Do ekstrakcji antybio¬ tyków stosuje sie rozpuszczalniki w ilosci 1/3 do 1/2, badz równej objetosci brzeczki, ekstrahujac dwukrotnie w pH = 7. W zaleznosci od objetosci brzeczki, do przeprowadzenia ekstrakcji stosuje sie róznoraka aparature, jak lejki rozdzielcze, eks- traktory z mieszalnikiem,, mechaniczne ekstrakto- " ry, separatory i inne.Szczególnie przydatna metoda izolacji i rozdzialu skladników mieszaniny antybiotyku polega na tym, ze brzeczke niesaczona lub klarowny bulion po doprowadzeniu ph do wartosci 7 ekstrahuje sie dwukrotnie 1/3 do 1/2 objetosci ketonu metylo- izobutylowego^ Ekstrakt zateza sie przy zmniej¬ szonym cisnieniu, a nastepnie odtluszcza sie przez ekstrakcje heptanem lub eterem naftowym. Zate- zony ekstrakt po odtluszczeniu odparowuje sie przy zmniejszonym cisnieniu do suchej pozosta¬ losci. Uzyskany preparat poddaje sie przeoiprado- wemu rozdzialowi metoda Craiga (6 plyt) w ukla¬ dzie rozpuszczalników: toluen (5 czesci) : etanol (2 czesci) : bufor fosforanowy pH = 4.5 (3 czesci).Aparat napelnia sie faza górna i faza dolna po ich uprzednim rozdzieleniu. Po zakonczeniu podzialu, frakcje poddaje sie chromatografii cienkowarstwo¬ wej, a nastepnie odparowuje do' suchej pozostalo¬ sci przy zmniejszonym cisnieniu.Preparat uzyskany z frakcji, zawierajacych zwia¬ zki depsypeptydowe* rozpuszcza sie w chlorofor¬ mie, dodaje wegiel aktywowany, saczy i przesacz odparowuje przy zmniejszonym cisnieniu. Pozosta¬ losc po odparowaniu chloroformu rozpuszcza sie w acetonie. Po dodaniu heptanu wytraca sie osad, który rozpuszcza sie ponownie w malej ilosci chloroformu i nanosi na kolumne, wypelniona ze¬ lem krzemionkowym buforowanym w pH = 6, i rozwija kolumne ukladem chloroform: n-propa- nol (99: l°/o v/v) stosujac cisnienie 80 psi. Przy napelnianiu kolumny, zel zawiesza sie w tym sa¬ mym ukladzie. Funkcje, zebrane przy rozdziale, poddaje sie chromatografii cienkowarstwowej w celu identyfikacji zwiazków. Frakcje, zawierajace zwiazki depsypeptydowe, laczy sie, odparowuje przy zmniejszonym cisnieniu i poddaje krystaliza¬ cji z mieszaniny rozpuszczalników aceton-heptan.Frakcje po rozdziale, zawierajace zwiazki typu makrocyklicznych laktonów, laczy sie i odparowu¬ je przy zmniejszonym cisnieniu, uzyskujac sucha pozostalosc, która rozpuszcza sie w octanie etylu.Roztwór miesza sie z zelem krzemionkowym, sa¬ czy i przesacz odparowuje przy zmniejszonym ci¬ snieniu. Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie ety¬ lu i wytraca osad heksanem. Osad ten rozpuszcza sie w malej ilosci chloroformu i poddaje rozdzia¬ lowi chroniatograficznemu na kolumnie, wypelnio¬ nej buforowanym w pH =?= 6 zelem krzemionko¬ wym, zawieszonym w octanie etylu. Kolumne roz¬ wija sie, stosujac cisnienie 80 psi, przy uzyciu ukladu rozpuszczalników: octan-czterowodorofu- ran-heksan (80 : 20 : 20), wysycanego buforem fos- fofranowym o pH = 6.0. Frakcje 2 kolumny pod¬ daje sie chromatografii cienkowarstwowej i te, które zawieraja zwiazki typu makrocyklicznych laktonów, laczy sie i odparowuje przy zmniejszo¬ nym cisnieniu. Poszczególne frakcje poddaje sie 40 45 •0 55 6009 573 przeciwpradowemu rozdzialowi Cradga i/lub chro¬ matografii kolumnowej, stosujac rózne uklady roz¬ wijajace. Przy dokladnej identyfikacji zwiazków, zawartych we frakcjach* mozliwe jest otrzymanie pojedynczych izolowanych zwiazków typu makro- cyklicznych laktonów po odparowaniu frakcji do suchej pozostalosci.Szczep A. auranticolor ATCC 31011 wytwarza przynajmniej cztery zwiazki depsypeptydowe i cztery makrocykliczne Jaktony. Jednakze glówny¬ mi depsypeptydami sa zwiazek 37 277 (wystepu¬ jacy w wiekszej ilosci) i 37 932 (wystepuje w mniejszej ilosci) oraz zwiazki typu makrocyklicz- nych laktonów 36 926 (glówny) i 35 763 (wystepu¬ jacy w malej ilosci).Surowy preparat mieszaniny antybiotyków, o- trzymany bezposrednio z brzeczki, jak równiez oczyszczone pojedyncze skladniki wykazuja szero¬ kie spektrum aktywnosci przeciwbakteryjnej.Wsród drobnoustrojów, których wzrost hamowany jest przez antybiotyki, nalezy wymienic Salmo¬ nella typhosa, Shigella desyntertiae, Escherichia co- li, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens, Streptococcus faocalis Di- plocoocus pneumoniae, Bacdllus subtilis, Oorynoba- cterium diiphteriae, Clostridium septicum* Brucella abortus, Neisseria sicca, Lactobacillus acLdophilus oraz Pasteurella multocida.Interesujace jest, ze pojedyncze antybiotyki, otrzymywane sposobem wedlug wynalazku, wyka¬ zuja dzialanie przeciwdrobnoustrojowe typu bakte- riostatycznego. Natomiast surowy preparat miesza¬ niny (antybiotyków lub oczyszczone uprzednio i zmieszane zwiazki depsypeptydowe i oczyszczone zwiazki makrocyklicznych laktonów wykazuja dzia¬ lanie synergistyczne o charakterze bakteriobój¬ czym.Oznaczone indywidualnie i po zmieszaniu wobec podanych ponizej szczepów bakteryjnych, zwiazki typu makrocyklicznego laktonu 36 926 (A) (glów¬ ny skladnik) i zwiazek depsypeptydowy 37 277 (B) (glówny skladnik) charakteryzowaly sie najnizszy¬ mi stezeniami hamujacyrni w mdkrogramach (ml (M.I.C.) podanymi w tablicy 1.Tablica 1 Drobnoustrój Staph. aureus 005 Staph. aureus 400 Strep. faecalis Neisseria sicca Treponema hyodysenteriae Strep. pyogenes Bacteroides fragilis 35614.Clostridium inocuum Lastobacillus casei var. casei A 1.56 3.12 100 0.39 ¦ — 0.39 6.25 3.12 - B 12.5 12.5 50 — 12.5 50 100 6.25 A+B 0.10 0.78 1.56 0.10 — 0.10 0.78 0.20 0.20 Surowy preparat < 0.10 < 0.10 0.20 < 0.10 0.19 < 0.10 0.78 0.39 0.39 . | porównywalne wyniki uzyskano, stosujac w ba- 40 daniach zwiazek typu makrocyklicznego laktonu 763 (A'), wystepujacy w mniejszosci i zwiazek depsypeptydowy 37 932 (B') (wystepujacy równiez w mniejszej ilosci)., gdy oznaczane byly pojedynczo, badz w odpowiednich mieszaninach, na przyklad: W A' A; B' B w ukladzie (A'+B') (A'+B) (A+B') (A+B).Maksymalne dzialanie synergistyczne obserwuje sie przy polaczeniu oczyszczonych zwiazków ma- 50 krocykucznych laktonu i zwiazku depsypeptydo- wego w stosunku 1—2:1. Przypuszczalnie stosu¬ nek ten zachowany jest w brzeczce fermentacyjnej A auranticolor ATCC 31011 i w surowym prepa¬ racie mieszaniny izolowanej z brzeczki. Stwier- W dzenie to jest sprzeczne z innymi doniesieniami, dotyczacymi mieszanin dzialajacych synergistycz- nie. Zwykle zwiazki te w brzeczkach fermentacyj¬ nych i "w surowych preparatach wystepowaly w stosunku sub-optymalnym. W Wyniki doswiadczen przeprowadzone in vivo na myszach* zakazonych Staphylococcus aureus, przy podaniu doustnym i podskórnym róznych sklad¬ ników antybiotyku, przedstawione sa w Tabeli 2. fi$ Tablica 2 Zwiazek 36 926 Zwiazek 37 277 Zwiazek 36 926+37 277 (1 2 1) Surowy preparat miesza¬ niny antybiotku | (próba 1, tablica 6) PD6o wyrazone w mg/kg S. aureus 01A005 Doustnie 200 200 210 150—200 Podskórnie 200 200 60 72—120 | Antybiotyki, otrzymywane sposobem wedlug wy¬ nalazku, wzbudzaja zainteresowanie jako czynnik^ wzrostowe drobiu i swin z uwagi na szerokie spek¬ trum przeciwbakteryjne, jak równiez jako leM przedwbdegunkowe, ze wzgledu na ich duza ak¬ tywnosc wobec wywolujacych te chorobe beztleno¬ wych kretków Treponema hyodysenteriae.Dzialanie surowego preparatu mieszaniny (Próba 1, tablica 6) jako czynnika wzrostowego okresla sie na mlodych prosietach w 40-dniowej próbie skar¬ miania. Sredni dzienny przyrost wagi, ilosc zuzy-9*5T3 11 tej karmy i ogólna zywotnosc ulegly znacznej po¬ prawie (p < 0.01) w porównaniu z grupa kontrol¬ na, której nie podawano preparatu (tablica 3).T Sposób zywienia Kontrola (bez poda¬ wania preparatu) Podawano preparat (próba 1, tablica 6) [ 50 ppm ablica 3 Sredni prayroBt wagi (kg) 0.35 0.63 Srednie zuzycie karmy (kg) 0.91 1.35 Wydaj¬ nosc zywienia* 2.57 2.15 # funt karmy na funt przyrostu wagi Podobne wyniki mozna uzyskac stosujac surowy preparat antybiotyku, opisany w tablicy 6, w ilo¬ sci od 10 do 100 ppm.Stosujac pojedyncze czyste zwiazki 36 926; 37 932 i 37 277 lub mieszaniny czystych zwiazków w ta¬ kiej proporcji, jak wystepuja one w surowej mie¬ szaninie antybiotyku, przedstawionej w tablicy 6, uzyskano wyniki podobne.Aktywnosc jako czynników wzrostowych okre¬ slano w próbie zywienia pisklat. Obserwuje sie znaczny przyrost wagi (p < 0,01) pisklat, otrzymu¬ jacych diete z antybiotykiem w porównaniu z kon¬ trolnymi, którym antybiotyku nie podawano. (Ta¬ bela 4).Tablica 4 1 Sposób zywienia Kontrola (bez poda¬ wania preparatu) 1 Podawano preparat (próba 1, tablica 6) 1 10 ppm Sredni przyrost wagi (gramy) 566 608 Srednie zuzycie karmy (gramy) 939 94) Wydaj¬ nosc zywienia 1.66 1.56 | Podobne wyniki mozna uzyskac, stosujac w ilo¬ sci 10 do 100 ppm surowy preparat antybiotyku, opisany w tablicy 6.Stosujac pojedyncze czyste zwiazki 36 926; 37 932 i 37 277 lub mieszaniny czystych zwiazków w ta¬ kiej proporcji, jak wystepuja one w surowym pre¬ paracie antybiotyku, przedstawionym w tablicy 6, uzyskano wyniki podobne.Skutecznosc antybiotyku, bedacego przedmiotem wynalazku, w zapobieganiu infekcji badano na swiniach, zakazonych drobnoustrojami, wywoluja¬ cymi desyhterie. W tym celu stosowano skrawki sluzówki i kolonie od zakózonych zarazkami de- zynteril swin. Zdrowe swinie zakazono tym mate¬ rialem bezposrednio. Pokarm, zawierajacy anty¬ biotyk, podawano w Ciagu 28 dni. Wyniki przed¬ stawione sa w tabeli 5. *5 45 50 05 12 Tablica 5 Sposób podania antybiotyku Bez antybiotyku (Próba 1), (tablica 6) 50 ppm 37.5 ppm ppm 12.5 ppm 6.25 ppm (%) Zachoro¬ walnosc 100 0 0 0 0 50 ^ (%) Smiertel¬ nosc 40 0 0 0 0 Sredni przyrost wagi (kg) —0.13 0,66 0.57 0.68 0.61 0.47 Podobne wyniki mozna otrzymac, stosujac w ilo¬ sci 10 do 100 ppm mieszanine antybiotyku z ta¬ blicy 6; stosujac pojedyncze'zwiazki 36 926; 37 932 oarz 37 277 lub mieszaniny czystych zwiazków w takiej proporcji, jak wystepuja one w surowym preparacie antybiotyku, opisanego w tablicy 6, uzyskano podobne wyniki.Przyklad I. Przygotowanie plynnego sterylne¬ go podloza o skladzie: Glukoza Skrobia rozpuszczalna Ekstrakt drozdzowy Enzymatyczny hydrolizat kazeiny CaC03 Gramy/litr .0 .0 .0 .0 1.0 pH = 7.0 Szczep A. auranticolor ATCC 31011, przechowy¬ wany na skosie z podlozem ATCC 172, przenosi sie do szeregu kolb Erlenmayera o poj. 300 ml, za¬ wierajacych powyzsze podloze (50 ml) i hoduje na obrotowej trzesawce w ciagu 3—4 dni w tempe¬ raturze 28—30°C. Hodowle te w ilosci 5 ml przeno¬ si sie ponownie do kolb Erlenimayera poj. 300 ml, zawierajacych po 100 ml podanego powyzej podlo¬ za. Po wytrzasaniu w ciagu 3—4 dni w temperatu¬ rze 28—30°C, Uzyskane inoculum w ilosci 5—10°/o v/v przenosi sie do fermentatora czterolitrowego, zawierajacego dwa litry sterylnego podloza o skla¬ dzie: Ekstrakt drozdzowy Glukoza Wyciag namokowy kukurydzy Enzymatyczny hydrolizat kazeiny Chlorek kobaltu Gramy/litr 2.0 .0 1 ml .0 0.002 65 pH = 7.0 Fermentacje prowadzi sie w ciagu 20—30 godzin W temperaturze 28—36°C, mieszajac z szybkoscia 1700 obrotów/minute i napowietrzajac hodowle oko¬ lo jednej objetosci powietrza na objetosc brzeczki na minute.Jezeli jest to konieczne, pH calej brzeczki do¬ prowadza Sie do 7.0, a nastepnie brzeczke eks¬ trahuje 1/3 do 1/2 objetosci ketonem metyloizobu- tyldwym. Ekstrakt zateza sie przy zmniejszonym cisnieniu i odtluszcza przez ekstrakcje eterem naf-99 573 13 14 towym. Zawartosc antybiotyku w brzeczce, w eks¬ trakcie i we frakcjach, uzyskiwanych w dalszych etapach oczyszczania, okresla sie metoda chroma¬ tografii cienkowarstwowej na zelu krzemionko¬ wym, z uzyciem rozpuszczalników chloroform-eta- nol (9 : 1) i obserwacje chromatogramów w swietle ultrafioletowym przy 254 i 366 mjA. Odtluszczony i zatezony roztwór odparowuje sie przy zmniejszo¬ nym cisnieniu do sucha. Sucha pozostalosc poddaje sie przeciwpradowemu rozdzialowi w aparacie Craiga (6 plyt), stosujac uklad: toluen, 5 czesci: etanol, 2 czesci : bufor fosforanowy pH = 4.5, 3 czesci. Aparat napelnia sie faza górna i faza dol¬ na po ich uprzednim rozdzieleniu. Po zakonczeniu podzialu, frakcje poddaje sie chromatografii cien¬ kowarstwowej. .Zwiazek depsypeptydowy 37 277 odnajduje sie w górnej fazie w plycie 0. Drugi zwiazek depsypepty¬ dowy 37 932 równiez przechodzi do fazy górnej i odnajduje sie w plytach 1, 2 i 3. Zwiazek typu ma- krocyklicznego laktonu 35 763 przechodzi do fazy dolnej plyt 0 i 1. Zwiazek 36 926 odnajduje sie w dolnej fazie plyt 2, 3, 4 i 5.Faze górna plyty 0, zawierajaca zwiazek 37 277 odparowuje sie przy • zmniejszonym cisnieniu do suchej pozostalosci, rozpuszcza w chloroformie i miesza okolo 30 minut z weglem aktywowanym.Przesacz saczy sie i odparowuje przy zmniejszo¬ nym cisnieni. Pozostalosc rozpuszcza sie w aceto¬ nie, a nastepnie wytraca sie osad przez dodanie heptanu. Osad rozpuszcza sie w malej ilosci chlo¬ roformu i poddaje rozdzialowi chromatograficzne¬ mu na kolumnie, wypelnionej buforowanym w pH = 6 zelem krzemionkowym, zawieszonym w u- kladzie chloroform : n-propanol (99:1% v/v). Ko¬ lumne rozwija sie tym samym ukladem przy cis¬ nieniu 80 psi. Frakcje zebrane z kolumny poddaje sie chromatografii. Frakcje zawierajace zwiazek 37 277 laczy sie, odparowuje przy zmniejszonym ci¬ snieniu i uzyskany zwiazek krystalizujecie z mie¬ szaniny aceton-heptan.Zwiazek 37 277 nie posiada okreslonej temperatu¬ ry topnienia, ulega bowiem rozkladowi przy tem¬ peraturze 140—150°C Zwiazek ten jest nierozpusz¬ czalny w eterze dwuetylowym, heksanie, heptanie i w wodzie. Jest slabo rozpuszczalny w acetonie, benzynie i latwo rozpuszczalny w metanolu, etano¬ lu, chloroformie i chlorku metylowym. Zwiazek 37 277 charakteryzuje sie nastepujacymi wlasciwo¬ sciami; » Wegiel 60.91 Wodór 5.98 Azot 10.45 Tlen (z róznicy) 22.66 Zwiazek 37 277 jest optycznie czynny i wyka¬ zuje skrecalnosc (a) 2^° = +11° (c = 1.0, EtOH).Rozpuszczony w etanolu wykazuje absorpcje w nadfiolecie przy 225, 274, 282, 303 oraz 355 mji; eks- 1% tynkcja wlasciwa odpowiednio wynosi E 1 £L = = 309.3; 36.67; 45.01; 70 i 20.Widmo w podczerwieni zwiazku 37 277 przedsta¬ wione jest na fig. 1. W roztworze chloroformowym obserwuje sie w podczerwieni charakterystyczne pasma absorpcji przy 3.05; 3.40; 5.70; 5.77; 5.93; 6.07; 6.62; 6.82; i 7.67 mikronów.Frakcje z rozdzialu przeciwpradowego, zawiera¬ jace zwiazki 35 763 i 36 926, odparowuje sie przy zmniejszonym cisnieniu, a pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i uzyskany roztwór miesza z zelem krzemionkowym. Roztwór po odsaczeniu ze¬ lu odparowuje sie przy zmniejszonym cisnieniu, a pozostalosc ponownie rozpuszcza sie w octanie ety- lu, wytracajac nastepnie osad przez dodanie heksa¬ nu. Oddzielony osad rozpuszcza sie w malej ilosci chloroformu i poddaje sie chromatografii na zelu krzemionkowym buforowanym w pH=6 i zawie¬ szonym w octanie etylu. Kolumne rozwija sie mie- szanina octanu etylu : czterowodorofuranu : he¬ ksanu (80 : 20 : 20), wysycona buforem fosforano¬ wym pH = 6.0 przy cisnieniu 80 psi. Pierwsze 20 ml frakcje zebrane w ilosci 17 zawieraja zóltawy olej, który odrzuca sie. Frakcje od 26 do 40 za- wieraja zwiazek 36 926. Frakcje od 41 do 50 za¬ wieraja mieszanine zwiazków 36 926 i 35 763. Frak¬ cje od 26 do 40 laczy sie, zateza przy zmniejszonym cisnieniu i ponownie poddaje rozdzialowi chroma¬ tograficznemu na zelu krzemionkowym, zbierajac 20 ml frakcje. Pierwsze 15 frakcji zawieraja zólty olej, który odrzuca sie. Frakcje od 16 do 30 za¬ wieraja zwiazek 36 926. Frakcje .31—40 zawieraja mieszanine zwiazków 36 926 i 35 763. Frakcje" od 16 do 30 odparowuje sie przy zmniejszonym cisnieniu 80 i pozostalosc rozpuszcza sie w malej ilosci chloro¬ formu, a nastepnie .podaje na kolumne z zelem ' fosforanowym buforowanym w pH = 6.0 i zawie¬ szonym w chloroformie. Kolumne rozwija sie mie¬ szanina chloroformu : etanol (95.5 : 4.5*/o v/v^ przy 31 cisnieniu 130 psi, zbierajac 160 frakcji o objetosci 6 ml/Frakcje od 60 do 90 zawieraja wylacznie zwiazek 36 926. Frakcje te laczy sie i odparowuje przy zmniejszonym cisnieniu. Pozostalosc rozpusz¬ cza sie w malej ilosci etanolu i po dodaniu eteru 40 wytraca sie osad bezpostaciowy zwiazku 36 926.Zwiazek 36 926 rozpuszcza sie w metanolu, eta¬ nolu, chloroformie i chlorku metylenowym. Jest nierozpuszczalny w eterze dwuetylowym, heksanie i heptanie. 45 Zwiazek 36 926 nie posiada okreslonej tempera¬ tury topnienia, bowiem ulega rozkladowi przy oko¬ lo 100°C. Analiza zwiazku wykazuje obecnosc: Wegla 57.^9 w % Wodoru 6.78 Azotu 8.04 Tlenu (z róznicy) 27.29 Ciezar czasteczkowy w oparciu o spektrum ma¬ sowe wynosi 501, a wzór sumarycznuy okreslono | C26H35NS07.Zwiazek 36 926 wykazuje skrecalnosc optyczna (a) ^ = — 130 (c = 1.0, EtOH). Widmo w ultra¬ fiolecie wykazuje maksimum przy 214 mjA, w eta- ao nolu i absorpcje wlasciwa E j £L = 723.8.Widmo w podczerwieni zwiazku 36 926 przedsta¬ wione jest na fig. 2. Oznaczane metoda tabletki KBr wykazuja nastepujace pasma absorpcji: 2.95; 3.40; 5.75; 5.98; 6.23; 6.58; 6.81; 7.45; 8.25; 8.38; « 8.80; 9.08; 10.15; 10.35; 11.10 i 13.30 mikronów.99 573 16 Zwiazek ten jest podobny, badz identyczny z an¬ tybiotykiem A2315B, który przedstawiono na Czter¬ nastej Konferencji na temat czynników przeciw- drobnoustrojowych i chemioterapii^ 11—13 wrze¬ snia 1974.Zwiazek 35 763 izoluje sie i oczyszcza zblizona metoda^do tej, która stosuje sie do zwiazku 36 926.Zwiazek ten po oczyszczeniu rozpuszcza sie w me¬ tanolu, etanolu, chloroformie i chlorku metylenu.Jest on nierozpuszczalny w eterze dwuetylowym, heksanie i heptanie. Nie wykazuje okreslonej tem¬ peratury topnienia, rozklada sie bowiem przy tem¬ peraturze okolo 100°C.Analiza zwiazku wykazuje obecnosc: Wegla 61.29 Wodoru 6.73 Azotu 8.83 Tlenu (z róznicy) 23.15 Ciezar czasteczkowy w oparciu o spektrum maso¬ we wynosi 503, a wzór sumaryczny okreslono C^HrfN^.Zwiazek 35 763 jest czynny optycznie i wykazuje skrecalnosc (a) 2^° = —114° Widmo w ultrafiolecie wykazuje maksimum przy 218 mfi i absorpcje wlasciwa E 1£m= 668.9.Widmo w podczerwieni zwiazku 35 763 przedsta¬ wiono na fig. 3. Oznaczone metoda tabletki KBr wykazuje nastepujace pasma absorpcji: 2.9d; 3.38; .73; 6.00; 6.23; 6.60; 6.88; 7.23; 8.25; 8.38; 8.83 i .20 mikronów.Zwiazek 35 763 jest podobny, badz identyczny z antybiotykiem A-2315 opisanym w zgloszeniu ho¬ lenderskim 7 310 613.Frakcje po rodziale przeciwpradowym, zawiera¬ jace zwiazek 37 932, odparowuje sie pirzy zmniejszo¬ nym cisnieniu do suchej pozostalosci, która eks¬ trahuje sie eterem naftowym, a nastepnie poddaje rozdzialowi chromatograficznemu na kolumnie z zelem krzemionkowym w identyczny sposób, jak podano powyzej. Frakcje wlasciwe laczy sie i zwia¬ zek 37 932 otrzymuje sie przez krystalizacje z mie¬ szaniny aceton: heptan.Zwiazek 37 932 Jest rozpuszczalny w metanolu, etanolu, chloroformie i chlorku metylenowym. Jest nierozpuszczalny w eterze dwuetylowym, heksanie, heptanie i wodzie. Zwiazek ten nie wykazuje okre¬ slonej temperatury topnienia. Rozklad rozpoczyna sie okolo 185°C. Analiza elementarna wykazuje obecnosc: Wegla 59.41 Wodoru 6.01 Azotu 10.66 Tlenu (z róznicy) 23.92 lf lf Zwiazek 37 932 jest optycznie czynny i wykazu- ° je skrecalnosc optyczna (a) D = + 5.0° (c = 0.25, CHCI3). Widmo w ultrafiolecie roztworu etanolo- wego wykazuje maksima absorpcji przy 226, 276, / 283, 305 i 355 rai i absorpcje wlasciwa Elc'm od¬ powiednio 304.4, 36.8, 43.49, 70.25 i 20.07.Widmo w podczerwieni zwiazku 37 932 przedsta¬ wiono na fig. 4. Oznaczone metoda tabletki KBr wykazuja nastepujace pasma absorpcji: 2.96, 3.05, 3.38, 5.68, 5.73, 5.93, 5.98, 6.13, 6.50, 6.58, 6.88, 7.40, 7.65, 8.08, 8.45, 8.60, 9.03, 9.45, 9.70, 9.98, 10.55, 11.00, 11.25, 11.60, 12.35 i 13.25 mikronów.Przyklad II. Metode wedlug przykladu I moz¬ na powtórzyc, uzyskujac porównywalne wyniki, przy uzyciu podloza hodowlanego o skladzie: # Gramy/litr Glukoza 8.0 Tryptoza 3.0 Enzymatyczny hydrolizat kazeiny 1.0 Kwas glutaminowy 1.0 • Maka sojowa 0.5 NaCl 8.3 K2HPO4 2.4 KH2PO4 2.0 MnCl2 # 0.02 Przyklad III. Metode wedlug przykladu I mozna powtórzyc, uzyskujac porównywalne wyni¬ ki, przy uzyciu podloza hodowlanego o skladzie: Gramy/litr Glukoza 10.0 Maka sojowa - 10.0 Wyciag namokowy kukurydzy 1 ml Przyklad IV.. Metode wedlug przykladu I mozna powtórzyc, uzyskujac porównywalne wy¬ niki, przy uzyciu podloza hodowlanego o skladzie: Gramy/litr Melasa 10.0 Enzymatyczny hydrolizat kazeiny 1.0 Ekstrakt drozdzowy 2.0 Wyciag namokowy kukurydzy 1 ml Kazeina 3.0 PrzykladV. Metode wedlug przykladu. I po¬ wtarza sie. Ekstrakt metyloizobutylo-ketonowy z brzeczki po zakonczeniu fermentacji odparowuje sie do suchej pozostalosci przy zmniejszonym ci¬ snieniu i pozostalosc te ekstrahuje sie eterem naf¬ towym. Uzyskany sypki preparat rozdrabnia sie i oznacza w nim zawartosc ilosciowa skladników przy uzyciu metody cisnieniowej chromatograficz¬ nej. Sklad surowego preparatu mieszaniny anty¬ biotyku r kilku niezaleznie prowadzonych fermen¬ tacji przedstawiono w tablicy 6 (w procentach): Tablica 6 Nr próby 1. 2. 3. 4. 1 5- 763 8.5 3.1 6.0 9.4 8.4 36 926 • 32.0 39.5 38.6 47.8 31.9 37 932 8.7 7.8 .7 0.9 2.2 37 277 19.3 .9 .5 . 26.9 .3 Skladniki mieszane 1.3 1.2 2.4 0.5. 1.4 |99 573 17 PL