PL99855B1 - Sposob wytwarzania nowego antybiotyku bay g 7020 - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku Bay g 7020.Antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wy¬ nalazku, nadaje sie do zwalczania mikroorganizmów w medycynie i weterynarii, a jako czynny skladnik paszy dla zwierzat wzmaga i przyspiesza wzrost zwierzat i zwieksza stopien wykorzystywania przez nie paszy.Wiadomo, ze szereg antybiotyków pochodzenia mikrobiologicznego dziala przeciwko mikroorga¬ nizmom. Zakres dzialania tych antybiotyków jest jednak czesciowo niezadowalajacy, a poza tym maja one czesto jeszcze inne wady. Antybiotyki /Makta- mowe czesto traca aktywnosc pod wplywem peni- cylinazy, a chloramfenikol, tetracyklina i streptomy¬ cyna powoduja w wielu przypadkach powazne nie¬ pozadane dzialania uboczne (porównaj Walter Heilmeyer Antybiotika Fibal, wydawnictwo Georg Thieme, Stuttgart, wydanie 3, 1969, strony 248, 278—280 i 311—319).Stwierdzono, ze otrzymuje sie nowy antybiotyk Bay g 7020, gdy szczepy Actinoplanes SE 73, zdepo¬ nowane pod nr CBS 432/74 lub SE 73/3, zdepono¬ wane pod nr CBS 434/74, pojedynczo albo razem poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych w zwyklym srodowisku hodowlanym i otrzymany antybiotyk wyosabnia z brzeczki hodowlanej i/lub z grzybni znanymi sposobami. Stwierdzono równiez, ze nowy antybiotyk dziala silnie przeciw mikroorga¬ nizmom, a poza tym ma te wlasciwosc, ze przyspie- sza lub wzmaga wzrost zwierzat i polepsza wyko¬ rzystywanie przez nie paszy.Nowv antybiotyk mozna scharakteryzowac naste¬ pujacymi cechami: (1) Analiza elementarna 50,8% C, 7,2°/oH, 42% O daje nastepujacy wzór sumaryczny: CssHisChs. Na¬ lezy przy tym zaznaczyc, ze przy tak duzych cza¬ steczkach wielkosc bledu przy analizie elementarnej (± 0.8%) nie zawsze pozwala na ustalenie doklad¬ nego wzoru sumarycznego [R.B. Woodward, Angew.Chem.69, str. 50—51 (1957)1. Podany wzór suma¬ ryczny moze przeto wykazywac pewien blad. (2) Obliczony ciezar czasteczkowy: 1340 do 1390, bardzo prawdopodobnie 1370. (3) Widmo w swietle nadfioletowym fig. 1. Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego 13C: fig 2.Widmo w podczerwieni: fig. 3. Widmo magnetycz¬ nego rezonansu jadrowego 1H: fig. 4. (4) Antybiotyk jest rozpuszczalny w wodzie, niz¬ szych alkoholach o 1—4 atomach wegla, chloroformie i acetonie, trudno rozpuszcza sie w eterze etylo¬ wym, eterze naftowym i cykloheksanie, a miernie w octanie etylu. (5) Charakterystyczna jest dla czasteczki wrazli¬ wosc na kwasy. Przy wartosci pH=2 i w tempera¬ turze pokojowej 18—22°C aktywnosc antybiotyczna maleje w ciagu 1 godziny do zera, a równoczesnie zanika charakterystyczne pasmo widma w nadfio¬ lecie przy 267 nm. Antybiotyk, wytwarzany sposo¬ bem wedlug wynalazku, ulega równiez rozkladowi 99 8553 MUS 4 pod wplywem alkaliów. Przy ogrzewaniu w 0,1 n roztworze wodorotlenku sodowego w temperaturze 1C0°C w ciagu 30 minut powstaje zwiazek, który w swietle nadfioletowym wykazuje jedynie absor¬ pcje koncowa i ma aktywnosc in vitro przeciwko 5 bakteriom gram-ujemnym mniejsza niz uzyty anty¬ biotyk, ale jeszcze wyrazna. (6) Antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku, jest substancja obojetna, która nie wedruje przy elektroforezie. Przy kwasnej hydro- 10 lizie rip. za pomoca wodnego roztworu kwasu siar¬ kowego o stezeniu 10% wagowych w temperaturze 80°C, ulegaja odszczepieniu redukujace cukry.W ten sposób mozna latwo uwidoczniac antybiotyk metoda chromatografii cienkowarstwowej na plycie 15 z zelu krzemionkowego za pomoca kwasnych sub¬ stancji, reagujacych z cukrami, takich jak np. alde¬ hyd anyzowy z kwasem siarkowym albo benzydyna z kwasem trójchlorooctowym lub tymol z kwasem darkowym. Równiez opryskiwanie 10°/e kwasem % siarkowym i ogrzewanie w ciagu 10 minut w tem¬ peraturze 80°C daje na plycie niebieskoszaro za¬ barwienie. Ostatni z wymienionych odczynników proponowano stosowac do charakterystycznego wy¬ kazywania antybiotyków makrolidowych (E.S'ahl, 25 Dumschicht — Chromatographie, wyd. 2, 1967, »tr. 546).Wartosc Rf antybiotyku na plytach z zelu krze¬ mionkowego (f-my Merck, Darmstadt, Rep. Fed.Niemiec) przy uzyciu róznych eluentów podano w tablicy 1.Tablica 1 Eluent (czesci objetosciowe) Metanol + chloroform + 95 1 + 4 I • 50 + 50 100 + 0 n-butanol + lodowaty kwas octowy + woda 60 + 20 + 20 Wartosc Rf 0,025 0,49 0,755 0,715 0,470 Przy porównywaniu antybiotyku, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku, ze znanymi antybio¬ tykami rrozna pominac zwiazki, zawierajace azot, 5Q aromatyczne i nierozpuszczalne w chloroformie, poniewaz nowy antybiotyk sklada sie tylko z wegla, wcdoru i tlenu i nie zawiera azotu. Zawartosc cukrów, dajacych sie odszczepiac przez hydrolize i dajacych sie redukowac, rozpuszczalnosc i zabar- 55 Wienie za pomoca 10*/* kwasu siarkowego wskazuja na pewne podobienstwo do antybiotyków makroli¬ dowych, z których tylko nieliczne, nie zawierajace azotu, sa znane. Jednakze w przeciwienstwie do antybiotyku, wytwarzanego sposobem wedlug wy- 60 nalazku, makrolidy sa korzystnie skuteczne prze¬ ciwko organizmom gram-dodatnim, a nie gram- -ujemnym [Keller - Schierlein, Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe 30, str. 314 (1973)].Poza tym dotychczas nie znano antybiotyku makro- 65 Udowego, który wykazuje absorpcje przy 207 nm [Gottlieb, Shaw, Antibiotics II (1967) str. 1.59].Nieoczekiwanie stwierdzono, ze nowy antybiotyk jest wytwarzany przez podane wyzej szczepy Acti- noplanes i moze byc wyosobniony z dobra wydaj¬ noscia z srodowiska hodowlanego. Stwierdzono równiez nieoczekiwanie, ze antybiotyk ten wykazuje silne dzialanie przeciwko mikroorganizmom, zwla¬ szcza bakteriom, takze i przeciw gram-ujemnym bakteriom chorobotwórczym, a przy tym nie ma on podanych wyzej wad znanych antybiotyków. Nowy antybiotyk ma równiez nieoczekiwanie zdolnosc przyspieszania wzrostu zwierzat i polepszania ich zdolnosci do wykorzystywania paszy. Z tych wzgle¬ dów niniejszy wynalazek stanowi wzbogacenie far¬ macji i techniki.W procesie, prowadzonym sposobem wedlug wy¬ nalazku, mozna stosowac nowe szczepy Actinopla- nes SE 73 i SE 73/B. Szczepy te naleza do klasy Schizomycetes, rzedu Actinomycetales, rodziny Actinoplanaceae i gatunku Actinoplanes. Szczep SE-73 wyozobniono z gleby, a szczep SE-73/B otrzymano jako samorzutny mutant szczepu SE-73.Szczepy SE-73 i SE-73/B maja nastepujace cechy.Grzybnia ma szerokosc 0,3—1,3 mikrona i jest roz¬ galeziona. Zarodnie maja postac nieregularna, prze¬ waznie w zarysie w przyblizeniu kulista, ale z po¬ wierzchnia majaca garby, a srednica jej wynosi —18 mikronów. Zarodniki sa kuliste do elipsoidal¬ nych, wiciowate, poruszaja sie szybko i maja srednice 0,7—1,3 mikrona. Sa one umieszczone w zarodni w postaci zakrzywionych i sklebionych lancuchów.Cechy Jiodowli na róznych pozywkach, obserwo¬ wane po 14 dniach wzrostu w temperaturze 20—30°C, zebrane sa w tablicy 2.Tablica 2 Pozywka agar Czapka CPC (kazamino- pepton i agar Czapka) mleko-agar tyrozyna-agar [ Cechy hodowli W dobry do bardzo dobrego, SM pomaranczowa, LP slaba barwa brazowo-zólta Spg. +, powierzchnia grzybni Cienko oszroniona W dobry do bardzo dobrego, SM pomaranczowa do poma- ranczowo-brazowej, LP barwa brazowa, Spg. + + , powierzchnia grzyb¬ ni cienko oszroniona, W dobry do bardzo dobrego, SM pomaranczowa, LP barwa zlotobrazowa Spg. + + , powierzchnia grzyb¬ ni cienko oszroniona, kazeina ulega peptoni- 1 zacji.W Umiarkowany do dobrego, SM brazowa, LP barwa brazowa Spg. —, powierzchnia grzybni czesciowo cienko oszro¬ niona, ' |5 Tablica < 2 1 1 wytwarzanie melaniny peptonizacja mleka |:' ' 2 " krysztaly tyrozyny nie roz¬ puszczone, dodatonie dodatnie W oznacza wzrost, SM oznacza grzybnie jako pozywke, LP oznacza rozpuszczalny pigment, Spg. oznacza wytwarzanie zarodni, — oznaczabrak, 15 + oznacza wyrazne wystepowanie, + + oznacza bardzo wyrazne wystepowanie.Szczep SE-73/B odróznia sie cd szczepu SE-73 wzmozonym wytwarzaniem nowego antybiotyku.Prcces wedlug wynalazku mozna prowadzic za pomoca stalych, pólstalych lub cieklych pozywek.Korzystnie stosuje sie wodne pozywki ciekle. Po¬ zywki zaszczepia sie zwyklymi metodami, np. po¬ przez skosne rurki lub kulturami w kolbach.Hodowle prowadzi sie w warunkach acrobowych, 25 dowolnymi sposobami znanymi, takimi jak hodowle wytrzasane, np. w kolbach do wytrzasania, hodowle poruszane powietrzem lub hodowle wglebne. Ko¬ rzystnie prowadzi sie aerobowa hodowle wglebna w napowietrzanych kadziach fermentacyjnych, np. w 30 zwyklych zbiornikach do fermentacji wglebnej. Ho¬ dowle mozna prowadzic sposobem ciaglym lub nieciaglym, przy czym korzystnie stosuje sie sposób nieciagly.Hodowle mozna prowadzic we wszystkich po- '35 zywkach znanych, stosowanych do hodowania mi¬ kroorganizmów rzedu Actinomycetales. Pozywka powinna zawierac jedno lub wieksza liczbe zródel przyswajalnego wegla i azotu oraz sole mineralne, przy czym produkty'te moga wystepowac w postaci 40 okreslonych skladników pojedynczych, albo tez w postaci kompleksowych mieszanin, zwlaszcza biolo¬ gicznych produktów róznego pochodzenia. Jako zródla wegla mozna stosowac zwykle zródla wegla, np. takie jak skrobia, melasa, sproszkowane mleko, 45 dekstryna, cukry, np. sacharoza, maltoza, glikoza, laktoza, sorbit, gliceryna. Jako zródla azotu sto¬ suje sie znane organiczne i nieorganiczne zródla azotu, nip. make sojowa, make z nasion bawelny, lnu i grochu, rozpuszczalne i nierozpuszczalne pro- 50 teiny roslinne, namok kukurydziany, wyciag z drozdzy, peptony i wyciag miesny oraz sole amo¬ nowe i azotany, np. NH4C1, (NH^SOi, *NaNC3 i KNO3. Sole mineralne, które powinny sie znajdo¬ wac w pozywce, daja np. nastepujace jony: Mg++, 55 Na+, K+, Ca++, NH4+, Cl- S04 , PO4 i NO3—, jak równiez jony zwyklych pierwiastków sladowych, takich jak Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni.Jezeli zródla wegla i azotu albo uzyta woda nie zawieraja dostatecznych ilosci tych soli i pierwiast- 6Q ków sladowych, to korzystnie jest uzupelniac odpo¬ wiednio pozywke. Sklad pozywek moze byc bardzo rózny. Rodzaj i sklad pozywek zwykle zalezny od tego, jakie skladniki sa szczególnie korzystne do dyspozycji. ^ es Przy prowadzeniu procesu sposobem wedlug wy¬ nalazku moze byc korzystne stosowanie do hodowli szczepów Actinoplanes tylko wzglednie malych stezen rozpuszczalnych skladników pozywki i na¬ stepnie w ciagu pierwszych 3 dni prowadzenia hodowli czeste dodawanie tych skladników w postaci wyjalowionych, stosunkowo stezonych roztworów.Wartosc pH rozwijajacych sie kultur nalezy utrzy¬ mywac korzystnie okolo 6—8, zwlaszcza 6,5^-7,5.Zbyt znaczny spadek wartosci pH w kierunku od¬ czynu kwasnego mozna hamowac przez dodawanie organicznych lub nieorganicznych zasad, korzystnie CaCO. Jak w znanych procesach fermentacji mozna lez i tu stosowac samoczynne regulowanie war- 'of?i pH, wtryskujac do roztworu kultury w od- r(cpr«c3i czasu wyjalowione kwasy organiczne lub -;-organiczne, np. H2SO4, albo wyjalowione lugi, np. KuOH. ..:.-.-..¦ Korzystnie jest zapewnic wystarczajace stykanie rin mikroorganizmów z tlenem i substancjami, sta- rrwiacymi pozywke. Osiaga sie to zwyklymi spo- robami, takimi jak wytrzasanie i mieszanie.TT?dcwle mozna prowadzic w temperaturze okolo °C do okolo 40°C, zwlaszcza 25~35°C, a szczegól¬ nie korzystnie w temperaturze okolo 28°C. Czas trwania hodowli moze byc bardzo rózny, w zalez¬ nosci np. od skladu pozywki i temperatury hodowli.Optymalne warunki moga byc kazdorazowo latwo ustalone przez fachowca w dziedzinie mikrobiologii.Stwierdzono, ze najwieksza zawartosc antybiotyku, gromadzacego sie w brzeczce hodowlanej, osiaga sie zwykle po uplywie okolo 2—12, korzystnie 5—8 dni od rozpoczecia hodowania. Jak zwykle w procesach mikrobiologicznych nalezy unikac obcych zakazen srodowisk hodowlanych. W tym celu stosuje sie zwykle zabiegi, takie jak wyjalowianie srodowisk hodowlanych, naczyn stosowanych w procesie oraz powietrza, niezbednego do napowietrzania. Do wy- jalowiania mozna stosowac zwykle zabiegi, np. ste¬ rylizacje para wodna lub tez na sucho. Jezeli pod¬ czas hodowania powstaje w niepozadanych ilosciach piana, to mozna stosowac znane, chemiczne srodki do zwalczania piany, np. ciekle tluszcze i oleje, emulsje olej-woda, parafiny, wyzsze alkohole, takie jak oktadekanol, oleje silikonowe, zwiazki polio- ksyetylenowe lub polioksypropylenowe. Piane mozna tez tlumic lub usuwac za pomoca zwyklych urza¬ dzen mechanicznych, np. przy uzyciu sil odsrodko¬ wych.Antybiotyk, wytworzony sposobem wedlug wy¬ nalazku, mozna wyosabniac z grzybni i/lub ze sro¬ dowiska hodowlanego zwyklymi sposobami fizyko¬ chemicznymi, np. za pomoca zwyklych sposobów ekstrakcji, wytracania i/lub chromatograficznie.Wyosobniony antybiotyk mozna tez dalej oczysz¬ czac wymienionymi metodami, ale w wielu przy¬ padkach dalsze oczyszczanie nie jest konieczne, poniewaz ewentualnie obecne zanieczyszczenia nie wplywaja ujemnie na skutecznosc antybiotyku. We wszystkich operacjach wyosobniania i oczyszczania nalezy dbac o to, aby utrzymana byla wartosc pH=7,0 lub wyzsza korzystnie 7,0—9,0. Do podwyz¬ szania wartosci pH mozna stosowac zasady nieorga¬ niczne lub organiczne, np. amoniak, wodorotlenki metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych,7 #•«« 8 weglany lub wodoroweglany metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, np. KOH, NaOH, Na2CC3, NaHC03, CaC03, trójalkiloaminy, takie jak trójetyloamina, morfolina, i pirydyna. Do ustalania, w której frakcji przy stosowaniu wyzej podanych metod wyosobniania i oczyszczania nowy anty¬ biotyk znajduje sie w najwyzszym stezeniu albo o najwyzszej czystosci, mozna stosowac zwykle metody fizyko-chemiczne, np. mierzenie pasm w nadfiolecie przy dlugosci fali 267 nm, wartosci Rf lub korzystnie badanie aktywnosci przeciwko mi¬ kroorganizmom. Szczególnie korzystnie bada sie w takim przypadku aktywnosc przeciwko Esche- richia coli, np. Escherichia coli ATCC 9$37, za pomoca zwyklych prób plytkowych (porównaj np.P.Klein* Bakteriologische Grundlagen der chemo- therapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer- Verlag, Gottingen (1957), str. 86 i nastepne).Przy stosowaniu cieklej pozywki wodnej wyosob¬ nianie i oczyszczanie antybiotyku, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku mozna prowadzic np. w ten sposób, ze do brzeczki hodowlanej razem z grzybnia dodaje sie rozpuszczalnik, mieszajacy sie z woda i miesza dokladnie, powodujac z jednej strony ekstrahowanie czynnej substancji z grzybni, a z drugiej strony wyklarowanie brzeczki hodowla¬ nej. Jako rozpuszczalnik mozna stosowac np. nizsze alkiloalkohole o 1—4 atomach wegla, takie jak me¬ tanol, etanol, n- albo izopropanol lub III-rzed. bu¬ tanol, dwumetyloformamid, czterowodorofuran, a zwlaszcza aceton. Ilosc rozpuszczalnika mozna zmieniac w szerokich granicach, a korzystnie sto¬ suje sie objetosc rozpuszczalnika w przyblizeniu równa objetosci brzeczki hodowlanej. Nastepnie za pomoca saczenia, odwirowywania, osadzania itp. oddziela sie nierozpuszczone skladniki (grzybnia, wytracone proteiny itp.). Wodno-organiczny roz¬ twór zageszcza sie, korzystnie pod zmniejszonym cisnieniem, np. do objetosci uzytego srodowiska hodowli. Ewentualnie za" pomoca zasady (porównaj wyzej), korzystnie za pomoca NaOH, doprowadza sie wartosc pH powyzej 7,0 np. 9,0. Otrzymany roz¬ twór okresla sie nizej jako „roztwór I".Z roztworu I antybiotyk wyosabnia sie i ewen¬ tualnie oczyszcza za pomoca zwyklych procesów ekstrakcji, stracania i/lub chromatograficznie.Z metod chromatograficznych mozna stosowac me¬ toda chromatografii kolumnowej lub preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej. Jako srodki ad¬ sorpcyjne mozna stosowac wszystkie zwykle (nie kwasne) nieorganiczne lub organiczne srodki adsorp¬ cyjne, takie jak np. tlenek glinu, zel krzemionkowy, krzemian magnezu, wegiel aktywowany, celuloza, pochodne celulozy, sztuczne zywice, takie jak polia- midy, pochodne poliamidów itp., np. acetylowany poliamid lub zele dekstranowe. Jako srodek rozwi¬ jajacy w preparatywnej chromatografii *. cienko¬ warstwowej mozna stosowac najrózniejsze rozpusz¬ czalniki lub mieszaniny rozpuszczalników, w któ¬ rych antybiotyk jest 'rozpuszczalny. Korzystnie sto¬ suje sie mieszanine chloroformu z metanolem, np. : 1 w stosunku objetosciowym. Jako eluent w chromatografii kolumnowej takze stosuje sie roz¬ puszczalniki lul? ich mieszaniny, w których anty¬ biotyk jest rozpuszczalny, np. czterochlorek wegla, chlorek metylenu i korzystnie chloroform.W celu wyosobniania antybiotyku, wytworzonego sposobem wedlug wynalazku, korzystnie stosuje sie s metode ekstrakcji, ewentualnie w polaczeniu z me¬ toda chromatograficzna i metoda stracania. W sta¬ dium ekstrakcji nalezy dbac o to, aby w zaleznosci od tego, czy nowy antybiotyk ma znajdowac sie w fazie wodnej czy w fazie organicznej, rozpusz- i# czalnik byl tak dobrany aby antybiotyk byl w nim trudniej lub latwiej rozpuszczalny.Ekstrakcje mozna prowadzic np. w nastepujacy sposób: Roztwór I ekstrahuje sie zwyklymi sposo¬ bami (wytrzasanie, metoda przeciwpradowa itp.) za pomoca organicznych rozpuszczalników, nie miesza¬ jacych sie z woda. Jako rozpuszczalniki mozna sto¬ sowac zwykle rozpuszczalniki ekstrakcyjne, np. estry, takie jak octan etylu i octan butylu, wyzsze alkohole, takie jak alkohole amylowe, np. alkohol 50 n-amylowy, ketony nie mieszajace sie z woda, np. keton metyloizobutylowy, chlorowane nizsze weglo¬ wodory, np. chloroform, chlorek metylenu i cztero¬ chlorek wegla. Korzystnie stosuje sie octan etylu i octan butylu, a zwlaszcza octan etylu.Jezeli do ekstrakcji roztworu I stosuje sie octan etylu i/lub octan butylu, to organiczna faze odrzuca sie, gdyz nowy antybiotyk znajduje sie w fazie wodnej. Faze wodna nasyca sie nastepnie korzystnie nieorganiczna sola, stosowana zwykle do takich celów, np. NaCl, KC1, Na2S04 i/albo MgS04, w celu ulatwienia dalszej ekstrakcji. Ilosc dodawanej soli nie ma decydujacego znaczenia i oczywiscie zalezy ona od ilosci roztworu i rozpuszczalnosci soli i moze byc latwo obliczona. Roztwór ten ekstrahuje sie nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem, w któ¬ rym antybiotyk jest rozpuszczalny, takim jak opisano wyzej przy ogólnym wyjasnieniu ekstrakcji roztworu I, ale nie mozna do tego celu stosowac estrów. Wodna faze odrzuca sie i rozpuszczalnik 40 w fazie organicznej odparowuje np. do okolo 1/10—1/30 pierwotnej objetosci. Nastepnie wytraca sie antybiotyk przez dodanie organicznego srodka wytracajacego (rozpuszczalnika), w którym anty¬ biotyk ten jest trudno rozpuszczalny, np. eteru ety- 45 lowego lub nasyconego prostolancuchowego lub roz¬ galezionego albo cyklicznego weglowodoru, np. eterów naftowych, n-heksanu lub cykloheksanu, prowadzac wytracanie w znany sposób. W celu oczyszczenia osad mozna rozpuscic w wodzie i su¬ rowy antybiotyk otrzymuje sie przez odparowanie wody, korzystnie przez suszenie metoda wymra- zania.Surowy antybiotyk mozna w razie potrzeby oczy¬ szczac dalej zwyklymi metodami chromatograficz¬ nymi (chromatografia kolumnowa, preparatywna chromatografia cienkowarstwowa), przy czym jako srodki adsorpcyjne, jak wyzej wspomniano, mozna stosowac zwykle, niekwasne, nieorganiczne i orga¬ niczne srodki adsorpcyjne, np. tlenek glinu, zel krzemionkowy, krzemian magnezu, wegiel aktywo¬ wany, celuloza, pochodne celulozy, sztuczne zywice, takie jak poliamidy i pochodne poliamidów^ np. acetylowany poliamid itp.Jezeli do ekstrakcji roztworu I stosuje sie nie i5 octan etylu lub octan butylu, lecz inny rozpuszczal-•M55 ' 9 nik, np. czterochlorek wegla, to wodna faze odrzuca sie, poniewaz antybiotyk, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, znajduje sie w fazie organicznej.W tym przypadku organiczny rozpuszczalnik odpa¬ rowuje sie korzystnie do okolo 1/10^1/30 pierwotnej objetosci i przez dodanie odpowiedniego organicz¬ nego srodka wytracajacego, w którym antybiotyk jest trudno rozpuszczalny, np. eteru etylowego albo nasyconego weglowodoru o lancuchu prostym lub rozgalezionym albo weglowodoru cyklicznego, np. eteru naftowego, n-heksanu lub cykloheksanu, wy¬ traca sie antybiotyk zwyklymi sposobami. Osad rozpuszcza sie w wodzie i roztwór suszy przez wy- mrazanie. Otrzymany surowy produkt mozna oczy¬ szczac ewentualnie przez ekstrakcje octanem etylu lub octanem butylu, w którym niepozadane sub¬ stancje towarzyszace sa rozpuszczalne, odrzucajac roztwór organiczny i oczyszczac zwyklymi metoda¬ mi chromatograficznymi, np. metoda chromato¬ grafii kolumnowej lub preparatywnej chromato¬ grafii cienkowarstwowej, przy uzyciu zwyklych srodków adsorpcyjnych (porównaj takze wyzej po¬ dane informacje).Jak wyzej wspomniano, antybiotyk, otrzymywany sposobem wedlug wynalazku, mozna tez oczyszczac przez frakcjonowane wytracanie z roztworu suro¬ wego produktu w organicznym rozpuszczalniku, np. w acetonie, czterochlorku wegla, chloroformie i chlorku metylenu, za pomoca odpowiedniego orga¬ nicznego srodka wytracajacego, w którym anty¬ biotyk ten jest trudno rozpuszczalny, np. za po¬ moca eteru etylowego, nasyconego weglowodoru o lancuchu prostym lub rozgalezionym albo weglo¬ wodoru cyklicznego, np. eteru naftowego, n-iheksa- nu lub cykloheksanu.Nowe szczepy Actinoplanes, oznakowane dla po¬ trzeb laboratoryjnych SE 73 i SE 73/B, zlozono w urzedowych placówkach do deponowania pod nastepujacymi numerami: a) SE 73 ATCC — nr 31058 (2.08.1974 r.) CBS — nr 432.74 (12.08.1974 r.) FRJ — nr 2669 (9.08.1974 r.) b) SE 73/B ATCC — nr 31060 (2.08.1974 r.) CBS — nr 434.74 (12.08.1974 r.) FRJ — nr 2671 (9.08.1974 r.) ATCC oznacza American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Stany Zjednoczone Ameryki. CBS oznacza Central- bureau voor Schimmelcultures, Baam, Holandia, FRJ oznacza Fermentation Research Institute, Tokio, Japonia.Nowy antybiotyk mozna przeprowadzac w farma¬ ceutyczne preparaty, które oprócz nietoksycznych, obojetnych nosników, stosowanych w farmakologii, zawieraja substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku lub skladaja sie z tej substancji czynnej. Preparaty te moga wystepowac w jed¬ nostkach dozowania. Oznacza to, ze preparaty te wystepuja w postaci pojedynczych elementów, np. tabletek, drazetek, kapsulek, pigulek, czopków i ampulek, w których zawartosc substancji czynnej stanowi ulamek albo wielokrotnosc pojedynczej dawki. Jednostki dozowania moga zawierac np. 1, 2, 3 albo 4 dawki jednostkowe albo 1/2, 1/3 albo 1/4 dawki jednostkowej. Jednostkowa dawka zawiera korzystnie taka ilosc substancji czynnej, która po¬ daje sie przy stosowaniu i która zwykle odpowiada jednej dawce dziennej lub jej polowie, jednej trzeciej albo jednej czwartej.Pod okresleniem nietoksycznych, obojetnych nos¬ ników nadajacych sie do stpsowania w farmako- logii, rozumie sie róznego rodzaju stale, pólstale lub io ciekle rozcienczalniki, wypelniacze i srodki pomoc¬ nicze do formowania preparatów. Korzystnymi pre¬ paratami sa tabletki, drazetki, kapsulki, pigulki, granulaty, czopki, roztwory, zawiesiny, emulsje, pasty, mascie, zele, kremy, plyny do przemywania, pudry i preparaty do rozpylania. Tabletki, drazetki, kapsulki, pigulki i granulaty moga ofrok jednej lub wiekszej liczby substancji czynnych zawierac zwy¬ kle nosniki, takie jak (a) wypelniacze i Tozpuszezal- niki, np. skrobie, cukier mlekowy, cukier trzcinowy, glikoze, mannit i krzemionke, (b) substancje wia¬ zace, np. karboksymetyloceluloze, alginiany, zela¬ tyne i poliwinylopirolidon, (c) substancje utrzymu¬ jace wilgoc, np. gliceryne, (d) substancje rozsadza¬ jace, np. agar, weglan wapniowy i weglan sodowy, (e) substancje opózniajace rozpuszczenie, np. para¬ fine i (f) przyspieszacze pochlaniania, np. czwarto¬ rzedowe zwiazki amoniowe, (g) substancje zwilza¬ jace, np. alkohol cetylowy, monostearynian glice¬ ryny, (h) substancje adsorpcyjne, np, kaolin i ben- tonit oraz (i) substancje zwiekszajace poslizg, np. talk, stearynian wapnia i stearynian magnezu oraz stale glikole polietylenowe albo mieszaniny sub¬ stancji wymienionych pod (a) — (i).Tabletki, drazetki, kapsulki, pigulki i granulaty mozna zaopatrywac w zwykle powlok; i ettocski, ewentualnie zawierajace srodki powodujace nie¬ przezroczystego, przy czym powloki te moga miec taki sklad, ze oddawanie substancji czynnej naste¬ puje tylko lub zwlaszcza w okreslonej czesci prze- 40 wodu pokarmowego, ewentualnie z opóznieniem, przy czym jako osnowe mozna stosowac np. poli¬ mery i woski. Substancje czynna z jednym Jub wieksza liczba podanych wyzej nosników mozna ewentualnie umieszczac w mikrokapsulkach. 45 Czopki moga obok substancji czynnej zawierac zwykle nosniki rozpuszczalne albo nierozpuszczalne w wodzie, np. glikole polietylenowe, tluszcze, np. tluszcz kakaowy, albo wyzsze estry, np. estry alko¬ holu o 14 atomach wegla z kwasem o 16 atomach 50 wegla, lub tez mieszaniny tych substancji* Mascie, pasty, kremy i zele moga obok substancji czynnej zawierac zwykle nosnik^ np. jZ^iersece i roslinne tluszcze, woski, parafiny, r skrobie,, tfaga- kant, pochodne celulozy, glikole polietylenowe, sili- 55 kony, bentonit, krzemionke, talk i tlenek cynku albo ich mieszaniny.Proszki i preparaty do rozpylania moga oprócz substancji czynnej zawierac zwykle nosniki, np. cukier mlekowa, talk, krzemionke, wodorotlenek 60 glinowy, krzemian wapnia i sproszkowany poliamid albo mieszaniny tych substancji. Preparaty do ^roz¬ pylania moga dodatkowo zawierac zwykle srodki wypychajace, nfr. chlorofluoroweglowodory.Roztwory i emulsje moga oprócz substancji czyn- 65 nej zawierac zwyWe nosniki, .takie 4ak rozpuszczal-11 niki, substancje ulatwiajace* rozpuszczenie i emul¬ gatory, np. wode, alkohol etylowy, alkohol izopro¬ pylowy, weglan etylu, octan etylu, alkohol ben¬ zylowy, benzoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, dwumetyloformamid, oleje,, zwlaszcza olej z nasion bawelny, olej arachidowy, olej z kielków kukurydzy, olej oliwkowy, raczni- kowy i sezamowy, gliceryne, formalogliceryne, alkohol czterowodorofurfurylowy, glikole poliety¬ lenowe i estry kwasów tluszczowych z sorbitem lub mieszaniny tych substancji. Roztwory i emulsje do podawania pozajelitowego moga tez byc wyjalo¬ wiane i izotoniczne z krwia.Zawiesiny moga obok substancji czynnej zawie¬ rac zwykle nosniki, takie jak ciekle rozcienczalniki, np. wode, alkohol etylowy, glikol propylenowy, substancje ulatwiajace wytwarzanie zawiesiny, np. etoksylowane alkohole izostearynowe, estry polic- ksyetylenosorbitu i estry sorbitanowe, mikrokrysta¬ liczna celuloze, metawodorotlenek glinowy, bentonit, agar i tragakant albo mieszaniny tych substancji.Wspomniane wyzej preparaty moga tez zawierac srodki barwiace, konserwujace oraz dodatki polep¬ szajace zapach i smak, np. olejek mietowy i euka¬ liptusowy oraz substancje slodzace, np. sacharyne.Zwiazek o wlasciwosciach leczniczych powinien znajdowac sie w opisanych wyzej preparatach ko¬ rzystnie w stezeniu, wynoszacym okolo 0,1—99,5%, korzystnie okolo 0,5—95% wagowych calkowitej mieszaniny.Opisane wyzej preparaty farmaceutyczne moga oprócz czynnej substancji, otrzymanej sposobem wedlug wynalazku, zawierac inne substancje czyn¬ ne farmakologicznie. Preparaty te wytwarza sie zwyklymi sposobami, np. przez mieszanie czynnej substancji z nosnikiem lub z nosnikami. Substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, oraz preparaty lecznicze, zawierajace te substancje, ; mozna stosowac w medycynie i weterynarii w ce¬ lach zapobiegawczych oraz do zwalczania i/lub le¬ czenia wyzej podanych schorzen. Substancje czynna lub farmaceutyczne preparaty mozna podawac miejscowo, doustnie, pozajelitowo, dootrzewnowo i/lub doodbytniczo, korzystnie doustnie i pozajeli- towo, zwlaszcza domiesniowo lub dozylnie, ewentu¬ alnie takze jako trwale kroplówki. i - Zarówno w medycynie ludzkiej, jak tez i wete¬ rynaryjnej, w celu osiagniecia zadanego wyniku zwykle korzystnie jest stosowac substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, przy poda¬ waniu doustnym lub pozajelitowym w lacznej ilosci okolo 10 do okolo 1000, korzystnie 50—600 mg na 1 kg masy ciala w ciagu 24 godzin, ewentualnie w kilku dawkach pojedynczych. Pojedyncza dawka ..zawiera substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, korzystnie w ilosci okolo 50 do okolo 300, zwlaszcza 100—200 mg na 1 kg masy ciala, ale moze byc konieczne stosowanie odchylen od tych ilosci, w zaleznosci od rodzaju i masy ciala traktowanego obiektu, rodzaju i nasilenia scho¬ rzenia, rodzaju preparatu i sposobu jego podawania oraz okresu czasu wzglednie odstepów w czasie podawania. Tak np. w niektórych przypadkach wystarczaja dawki substancji czynnej mniejsze od wyzej rwanych, podczas gdy w innych przypadkach 69 $55 12 40 50 55 trzeba stosowac dawki wieksze od podanych wyzej.Dozowanie i sposób podawania moze okreslic kazdy fachowiec na podstawie posiadanej znajomosci rzeczy.Substancja czynna, wytworzona sposobem wedlug wynalazku, wykazuje przy nieznacznej toksycz¬ nosci silne dzialanie przeciw mikroorganizmom.Dzieki tym wlasciwosciom moze ona byc stosowana jsko substancja ezynna w chemoterapii w medy¬ cynie oraz jako substancja do konserwowania nieorganicznych i organicznych materialów, zwlasz¬ cza wszelkiego rodzaju produktów organicznych, np. polimerów, srodków smarnych, farb, wlókien, skóry, papieru, drewna, srodków zywnosci i wody.Substancja czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, jest skuteczna przeciw bardzo szerokie¬ mu zakresowi mikroorganizmów. Z jej pomoca mozna zwalczac gram-ujemne i gram-dodatnie bakterie, mikroorganizmy podobne do bakterii, jak równiez zapobiegac schorzeniom, wywolanym przez te chorobotwórcze mikroorganizmy oraz powodowac poprawe stanu i/albo uzdrawiac. Substancja ta jest szczególnie skuteczna przeciwko bakteriom i mikro • organizmom podobnym do bakterii, przeto nadaje sie szczególnie dobrze do profilaktyki i chemote¬ rapii w przypadkach miejscowych i ukladowych zakazen w medycynie i weterynarii, wywolywanych przez te chorobotwórcze bakterie i mikroorganizmy bakteriopodobne. Na przyklad mozna zwalczac miejscowe i/albo ukladowe schorzenia i/albo zapo¬ biegac schorzeniom wywolywanym przez nastepu¬ jace mikroorganizmy chorobotwórcze lub ich mie¬ szaniny: Micrococaceae, takie jak gronkowce, np. Staphy- loooccus aureus, Staph, aerogenes i Gaffyka tetra- gena (Staph. = Staphylococcus); Lactobacteriaceae, takie jak paciorkowce, np. Streptooocus pyogenes, a- lub /?-hemolizujace paciorkowce, nie (?-) hemo- lizujace paciorkowce, Str.viridans, Str.faecalis (drobnoustroje przewodu pokarmowego), Str.alala- ctiae, Str.lactis, Str.eaui, Str.anaerobis i Diploco- ccus pneumoniae (dwoinki zapalenia pluc). (Str.= Streptococcus); • Neisseriaceae, takie jak Neisserie, np. Neisseria gonorrhoeae (gonokoki), N. meningitidis (meningo- koki). N. catarrhalis i N. flava (N. = Neisseria); Oorynebacteriaceae, takie jak maczugowce, np.Corynebacterium diphteriae, C.pyogenes, C.diphthe- roides, C.acnes, C.parvum, C.bovis, C.renale, C.ovis, C.murisepticum, bakterie Listera, np. Listeria monocytogenes, bakterie rózy, np. Erysipelothrix insidiosa, bakterie Kurthia, np. Kurthia zopfii (C. = Corynebacterium); Mycobacteriaceae, takie jak bakterie wywolujace pratkowanie, np. Mycobacterium tuberculosis, M.bovis, M.avium, tak zwane nietypowe bakterie wywolujace pratkowanie z grup Runyona I, II, III i IV, M. leprae (M. = Mycobacterium); Enterobacteriaceae, takie jak bakterie Esche- richiae z grupy Coli: bakterie Escherichia, np.Escherichia coli, bakterie przewodu pokarmowego, np. E.aerogenes, E.cloacae, bakterie Klebsiella, np.K.pneumoniae, K.ozaenae, Erwiniae, np. Erwinia spec, Serratia mercescens (E. = Enterabacter) (K. = Klebsiella), bakterie Proteae z grupy Pro--13 teus: Proteus, np. Proteus vulgaris, Pr.morganii.Pr.rettgeri, Pr.mirabilis, Providencia, np. Pro- \'idencia sp. (Pr. = Proteus); Salmonelleae: bakterie Salmonella, np. Salmo¬ nella paratyphi A i B, S.typhi, S. enteritidis, S.cholera suis, S.typhimurium (S. = Salmonella), bakterie Shigella, np. Shigella dysenteriae, Sh.ambi- gua, Sh.flexneri, Sh.boydii, Sh.sonnei (Sh. =Shi¬ gella); Spirillaceae, takie jak bakterie Vibrio, np.Vibrio cholerae, V.proteus, V.fetus (V.= Vibrio), bakterie Spirillum, mp. Spirillum minus; Bacillaceae, takie jak wytwarzajace zarodniki aerobowo, np.Bacillus antracis, B.subtilis, B.cereus (B. =Bacillus), wytwarzajace zarodniki anaerobowo bakterie z ro¬ dzaju Clostridium, np. Clostridium perfringens, Cl.septicum, Cl. oedematiens, Cl. histolyticum, Cl. tetani, Cl. botolinum (Cl.= Clostridium); Mykoplasmy, takie jak np. Mycoplasma pneumo- niae, M.hominis, M.suis pneumoniae, M.gallisepti- cum, M.hyohinis (M. = Mycoplasma).Podane wyzej mikroorganizmy chorobotwórcze stanowia jedynie przyklady i w zadnym przypadku nie stanowia- ograniczenia. Ze schorzen, którym mozna zapobiegac za pomoca substancji czynnej, otrzymanej sposobem wedlug wynalazku, lub które mozna lagodzic i/albo z nich uzdrawiac mozna wy¬ mienic przykladowo nastepujace: schorzenia dróg oddechowych i jamy gardla, Otitis, Pharyngitis, Pneumonie, Peritonitis, Pyelonephritis, Cystitis, Endocarditis, zakazenia ukladowe, Bronchitis, Art- hritis, zapalenia miejscowe i schorzenia skóry.Substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, mozna takze stosowac w pelnym za¬ kresie w hodowli i utrzymywaniu zwierzat jako srodek wplywajacy korzystnie na wzrost i przyspie¬ szajacy wzrost oraz polepszajacy wykorzystywanie paszy u zwierzat zdrowych i chorych. Skutecznosc tej substancji czynnej zalezy przy tym w duzej mierze od rodzaju i plci zwierzat. Szczególnie war¬ tosciowe jest dzialanie tej substancji w hodowli i utrzymywaniu zwierzat mlodych i opasowych. Ze zwierzat, u których substancja czynna, otrzymy¬ wana sposobem wedlug wynalazku, moze byc sto¬ sowana do wzmagania i przyspieszania wzrostu oraz do polepszania wykorzystywania paszy mozna przy¬ kladowo wymienic nastepujace zwierzeta uzyteczne lub utrzymywane w innych celach: cieplokrwiste, takie jak bydlo, swinie, konie, owce, kozy, koty, psy, króliki, zwierzeta futerkowe, np. nurki i szyn¬ szyle, ptactwo, np. kury, gesi, kaczki, indyki, gole¬ bie, papugi i kanarki oraz zimnokrwiste, takie jak ryby, 'np. karpie i gady, np. weze.Ilosc substancji czynnej, otrzymanej sposobem wedlug wynalazku, która podaje sie zwierzetom w celu osiagniecia zamierzonego skutku* mozna dzieki cennym wlasciwosciom tej substancji zmie¬ niac w szerokich granicach i wynosi ona korzystnie okolo 5 do okolo 600, zwlaszcza 10—300 mg na 1 kg masy ciala na 1 dzien. Okres podawania tej sub¬ stancji moze wynosic od niewielu godzin lub dni do kilku lat. Odpowiednia ilosc substancji czynnej oraz czas trwania podawania zalezy zwlaszcza od ro¬ dzaju, wieku, plci, stanu zdrowia zwierzecia i wa¬ runków, w jakich jest ono utrzymywane i moze byc latwo ustalona przez kazdego fachowca. 69*55 14 Substancje, otrzymana sposobem wedlug wyna¬ lazku, podaje sie zwierzetom zwyklymi metodami.Sposób podawania zalezy zwlaszcza od postawy zwierzecia i stanu jego zdrowia. Tak np. podawanie moze odbywac sie raz lub wiele razy dziennie, w regularnych lub nieregularnych odstepach czasu, doustnie lub pozajelitowo. Korzystne jest w wiek¬ szosci przypadków podawanie doustne, zwlaszcza w rytmie przyjmowania pokarmu i/albo pojenia zwierzat. - Substancje czynna mozna podawac sama lub w po¬ staci preparatu, równiez w mieszaninie z nietok¬ sycznymi, obojetnymi nosnikami dowolnego rodzaju, np. z nosnikami i w preparatach, jakie opisano 1S wyzej przy omawianiu preparatów farmaceutycz¬ nych. Substancje te mozna ewentualnie podawac w postaci preparatów takze razem z farmakolo¬ gicznie czynnymi substancjami, solami mineralnymi, pierwiastkami sladowymi, witaminami, bialkami, tluszczami, barwnikami i/albo substancjami smako¬ wymi, w odpowiedniej postaci.Korzystne jest podawanie razem z pasza i/lub woda pitna, przy czym w zaleznosci od potrzeby substancje czynna podaje sie z caloscia lub tylko ^ z czescia paszy i/lub wody pitnej.Substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, mozna dodawac do paszy i/albo do wody pitnej zwyklymi sposobami, przez proste zmieszanie czystej substancji, korzystnie rozdrobnionej, albo w postaci preparatu w mieszaninie z jadalnymi, nie- trujacymi nosnikami, ewentualnie takze w postaci przedmieszki albo koncentratu paszowego. Pasza i/albo woda pitna moze zawierac substancje czynna, otrzymywana sposobem wedlug wynalazku, w ste¬ zeniu okolo 5—500, zwlaszcza 10—100 czesci wago¬ wych na milion. Optymalne stezenie tej substancji w paszy i/lub wodzie pitnej zalezy zwlaszcza od ilosci paszy i/lub wody, pobieranej przez zwierzeta i moze byc latwo ustalona przez fachowca. Rodzaj paszy i jej sklad nie ma przy tym znaczenia. Mozna stosowac wszystkie uzywane, znajdujace sie w handlu lub specjalnie zestawiane pasze, które korzystnie zawieraja skladniki, bedace zródlem energii i stanowiace material, niezbedny dla roz- 45 woju w równowadze niezbednej przy odzywianiu, w tym równiez witaminy i substancje mineralne.Pasza moze sie skladac np. z produktów i*oslinnyeh, takich jak siano, buraki, zboze i produkty zbozowe, z produktów zwierzecych, np. miesa, tluszczów, maki kostnej, produktów rybnych, witamin, np. witaminy A, D-kompleks, i B-kompleks, protein, aminokwasów, np. DL-metioniny i produktów nie¬ organicznych, np. wapna i soli kuchennej.Koncentraty paszowe zawieraja substancje czyn- 55 na, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, obok produktów jadalnych, np. maki zytniej, maki kuku¬ rydzianej, maki sojowej lub wapna ewentualnie inne produkty odzywcze i wykorzystywane do bu¬ dowy oraz proteiny, sole mineralne i witaminy. 60 Wytwarza sie je zwyklymi metodami mieszania.W przedmieszkach i koncentratach paszowych substancja czynna moze byc ewentualnie chroniona przed dzialaniem powietrza, swiatla i/lub wilgoci przez pokrycie jej powierzchni odpowiednimi srod- ^ kami, np. nietoksycznymi woskami lub zelatyna. 4015 M855 16 Przykladowo sklad paszy dla kurczat, zawiera¬ jacej substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, jest nastepujacy: 200 g pszenicy, 340 g kukurydzy, 361 g srutu sojowego, 60 g ioju wolowego, 15 g fosforanu dwuwapniowego, 10 g weglanu wapnia, 4 g jodowanej soli kuchennej, 7,5 g mieszaniny witaminowo-mineralnej i 2,5 g przedmieszki, zawierajacej substancje czynna. Po dokladnym zmieszaniu skladniki te daja 1 kg paszy.Mieszanina witaminowo-mineralna zawiera: 6000 jednostek witaminy A, 1000 jednostek witaminy D3, g Mvitaminy E. 1 mg witaminy k3, 3 mg rybofla- winy, 2 mg pirydoksyiny, 20 meg witaminy B12, mg pantotenianu wapnia, 30 mg kwasu nikoty¬ nowego, 200 mg chlorku choliny, 200 mg MnS04;H20, 140 mg ZnS04,7H20, 100 mg FeS04.7H?0 i 20 mg CuSCU. SHzO. Przedmieszka z substancja czynna zawiera zadana ilosc substancji czynnej, np. 20 mg i dodatkowo 1 g DL- metioniny oraz tyle maki so¬ jowej, aby otrzymac 2,5 g przedmieszki.Pasza dla swin, zawierajaca substancje czynna, otrzymana sposobem wedlug wynalazku, ma przy¬ kladowo nastepujacy sklad: 630 g paszowego srutu zbozowego (zlozonego z 200 g kukurydzy, 150 g srutu jeczmiennego, 150 g srutu owsianego i 130 g srutu pszenicznego), 80 g maczki miesnej, 60 g srutu so¬ jowego, 60 g maki tapioka, 38 g drozdzy piwnych, 50 g mieszaniny witaminowo-mineralnej dla swin {sklad np. jak w przypadku paszy dla kurczat), g TBieloriych makuchów lnianych, 30 g paszy £lut©nokukurydziahej, 10 g oleju sojowego, 10 g me¬ lasy z trzciny cukrowej i 2 g przedmieszki sub¬ stancji czynnej (sklad np. jak w przypadku paszy dla kurczat). Skladniki te po dokladnym zmieszaniu daja 1 kg paszy.Podane 'toyzej mieszanki paszowe sa korzystnie przeznaczone dla hodowli i tuczenia kurczat lub swin, ale mieszanki o takim samym lub podobnym skladzie mozna tez stosowac do hodowli i tuczenia iinnych zwierzat.Wysoka skutecznosc antybiotyku, otrzymanego sposobem wedlug wynalazku, przeciwko mikroorga¬ nizmom mozna wykazac w nastepujacych próbach. a) Badania in vitro. Antybiotyk, otrzymany spo¬ sobem wedlug wynalazku, rozciencza sie pasta odzywcza Muller-Hinton z dodatkiem l°/o glikozy do zawartosci 200 mikrogramów antybiotyku w 1 ml.Roztwór odzywczy zawieral w kazdej próbce IX 10« do 2X105 bakterii w 1 ml. Probówki z tym roztworem poddawano hodowli w ciagu 18 godzin i nastepnie okreSlano stopien zmetnienia. Brak zmetnienia wskazuje na skutecznosc antybiotyku.Przy zawartosci 200 mikrogramów antybiotyku na 1 ml nastepujace kultury bakterii nie wykazywaly Zmetnienia: Escherichia coli 14, Escherichia coli 165, Proteus vulgairis 1017, Klebsiella K 10, Klebsiella 63, Salmonella sp., Shigella sp., Enterobacter sp., Serratia sp., Proteus indolnegativ sp., Proteus indol- positiv sp„ Pasteurella pseudotuberculosis, Bru- cella sp., Bordetella bromchiseptica, Bacterioides sp., Staphylococcus aureus 133, Neisseria catarrhalis sp., Diploooccus pneumoniae sp., Streptococcus pyoge- ries W, ^EnteTococcus sp., Lactobacillus sp., Coryne- tecterium diptheriae gravis, Corynebacterium py- o^nes M, Ctostriditim botulinum, Ciostridium teta- 40 45 50 55 80 W ni, Pseudomonas aeruginosa sp., Aeromonas hydro- phila sp., Mycoplasma sp., (Sp. — „species" i ozna¬ cza blizej nie zidentyfikowane, ale charakterystyczne szczepy). b) Badania in vivo. W tablicy 3 podano oddzia¬ lywanie antybiotyku, otrzymanego sposobem wed¬ lug wynalazku, na szereg bakterii w badaniach ze zwierzetami, mianowicie bialymi myszami. Biale myszy zakazono dootrzewnowo podanymi w tablicy bakteriami.Tablica 3 Badanie na zwierzetach — z bialymi myszami Oznaczanie EDse po 24 godzinach Zarodek Dawka antybiotyku, otrzymanego sposobem wg wynalazku, w mg na 1 kg mas^ ciala Escherichia coli 165 Staphylococcus aureus 1 X 400 1X200 Podawanie podskórne, jednorazowo, 30 minut po za¬ kazeniu. ED50 stanowi dawke, przy której 50% za¬ kazonych zwierzat zyje jeszcze po uplywie 24 go¬ dzin. Dobra skutecznosc nowego antybiotyku jako srodka do wzmagania wzrostu mozna wykazac w nastepujacej próbie. Przy odkarmianiu substancje te mieszano z pasza i podawano kurczetom. Dawka wynosila 10 lub 25 czesci na milion. Dla porównania prowadzono próbe z pasza, nie zawierajaca dodat¬ ków. Próby prowadzono w ciagu 14 dni. Wyniki podane sa w tablicy 4.Ta Próba Próba porów¬ nawcza Z dodatkiem antybiotyku wedlug wyna¬ lazku w ilosci: ppm ppm blica 4 Liczba zwierzal 24 24 24 Srednia masa ciala (g) 358,2 372,5 383,7 Ciezar w 8/o 109 104,0 107,1 Wyjasnienia figur licy 5 rysunku podane sa w tab- Tablica 5 Numer figury 1 2 3 4 OJ:ieta dlugosc fali wnm ó w ppm dlugosc fali w cm-1 8 w ppm Rzedna % absorpcji °/o absorpcji 1) Fig. 1: widmo absorpcyjne w nadfiolecie.Widmo antybiotyku w nadfiolecie podano na fig. 1. X ir«x = 265 nm (C = 0,0091% w metanolu) [E^/cm] 265 nm = 164 iJ99355 : 17 2) Fig. 2: Widmo rezonansu jadrowego WC (fig. 2) mierzono dla roztworu antybiotyków w deutery- zowanym metanolu z czterometylosilanem jako wewnetrznym wzorcem, za pomoca spektro¬ metru XL-100(15") firmy Varian Associates, Paolo Alto, Kalifornia, St. Zjedn. Amer.. przy ,2 MHz, z wyeliminowaniem szumu protonów. 18 3) Fig. 3: Widmo absorpcyjne w podczerwieni.Widmo absorpcyjne antybiotyku w podczerwieni podano na fig. 3. Przy badaniu tej substancji opracowanej z KBr wykazuje ono pasma absorp¬ cyjne przy dlugosciach fal, wyrazonych w cm-1, podane w tablicy 6.Czestotli¬ wosc pasm cm-1 3440 2960 | 2920 3440 2960 2920 2850 1630 1570 1445 1405 1375 1310 ! : J_ Tabl Intensyw¬ nosc s m m s m m m m s m m m w i ca 6 Czestotli¬ wosc pasm cm-1 1290 1200 1060 1290 1200 1060 1020 985 940 905 780 750 Intensyw- 1 nosc w m s w m s s m m m m m Intensywnosci pasma widma IR oznaczono w tab¬ licy literami s, m i w. Pasmo s wykazuje co naj¬ mniej 2/3 intensywnosci najsilniejszego pasma w widmie, pasmo m wykazuje intensywnosc w grani¬ cach 1/3 do 2/3 intensywnosci najsilniejszego pasma, a pasmo w intensywnosc mniejsza niz 1/3 intensyw¬ nosci najsilniejszego pasma. 4) przedstawione na fig. 4 widmo 220 MHz rezo¬ nansu jadrowego ^ otrzymano dla roztworu anty¬ biotyku w deuteryzowanym metanolu, z czterome- tylosilanem jako wewnetrznym wzorcem, za pomoca spektrometru HR — SC firmy Varian Associates, Paolo, Alto, Kalifornia.Wytwarzanie nowego antybiotyku sposobem wedlug wynalazku mozna zilustrowac nastepujacy¬ mi przykladami. Procenty podane w przykladach, o ile nie zaznaczono inaczej, oznaczaja procenty wagowe.Przyklad I. Grzybnie szczepu Actinoplanes SE-73/B wyrosla na skosie agarowym o skladzie (procenty wagowe): pepton produkt hydrolizy kazeiny, kwasny K2HPO4.3H2O, p.a.KC1, p.a.MgS04, p.a.FeSCU, p.a. cukier trzcinowy agar woda 0,25% 0,25% 0,1% 0,05% 0,05% 0,01% 3,0% 2,0% do 100% 40 45 50 55 60 przeszczepia sie do kolb Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra, zawierajacych pq 140 ml roztworu pozywki, zwanej dalej „roztwór pozywki A", o skladzie: odtluszczona maka sojowa 3,0% gliceryna, najczystsza 3,0% CaCOa, p.a. 0,2% woda do 100% z dodatkiem obojetnego poliolu, zawierajacego grupy hydroksylowe, np. Niax Polyol LHT 67 (znak towa¬ rowy Union Carbide Belg. N.V.) w ilosci 1 kropla na 140 ml pozywTki w celu usuniecia piany. Po 8 dniach pra-^adzenia hodowli szczepu na obrotowej wytrza¬ sarce w temperaturze 28°C odwirowuje sie próbki hodowli. FoGOotaly klarowny roztwór bada sie me- tcda cgarowej plytki z otworami przeciwko Esche- ricliia coli ATCC 9637. Znajdujacy sie w hodowla¬ nym roztworze antybiotyk powoduje strefy zaha¬ mowania wzrostu o srednicy okolo 17 mm. Wy- osabniame antybiotyku z brzeczki prowadzi sie w sposób, opisany w przykladzie III.Przyklad II. Po 8 litrów roztworu pozywki o skladzie (procenty wagowe): dekstryna 0,4% gliceryna 0,2% wyciag z drozdzy 0,2% CaCOa 0,2% woda wodociagowa do 100% z dodatkiem 3,0 ml obojetnego poliolu, zawieraja¬ cego grupy hydroksylowe, np. Niax Polyol LHT 67 (znak towarowy Union Carbide Belg. N.V.) na 8 litrów pozywki, umieszcza sie w szklanym naczyniu fermentacyjnym z mieszadlem i urzadzeniem do na¬ powietrzania, doprowadza do wartosci pH=6,8 za pomoca wodorotlenku sodowego i wyjalawia w tem¬ peraturze 120°C. Po ochlodzeniu roztworu w naczy¬ niach fermentacyjnych zaszczepia sie po 240 ml (3,0% objetosciowe) kulturami szczepu Actinopla¬ nes SE — 73, wyroslymi w wytrzasanej hodowli w „roztworze pozywki A" w ciagu 3 dni, doprowa¬ dza powietrze w ilosci okolo 4 litrów/minute przy okolo 600 obrotach mieszadla na minute i utrzymuje w temperaturze 28°C.Po uplywie 17 i 24 godzin od rozpoczecia hodowli do naczyn fermentacyjnych dodaje sie po 0,4% dek¬ stryny, 0,2% gliceryny i 0,3% wyciagu z drozdzy, a po uplywie 30, 41, 48 i 54 godzin dodaje sie po 0,4% dekstryny, 0,2% gliceryny i 0,4% wyciagu z drozdzy w postaci stezonych mieszanin tych sklad¬ ników pozywki, przy czym kazdorazowo objetosc dodatku wynosi 200 ml. Wzrost objetosci kultury, powodowany przez te dodatki, kompensuje sie wystepujacym odparowywaniem wody. Laczna ilosc skladników pozywki wynosi: 2,8% dekstryny, 1,4% gliceryny, 2,4% wyciagu drozdzowego i 0,2% CaCOs.Proces hodowania konczy sie po uplywie 120 godzin.Przyklad III. Brzeezki hodowlane, otrzymane w szklanych naczyniach fermentacyjnych (5X8 lit¬ rów) w sposób, opisany w przykladzie II, laczy sie, dodaje 48 litrów acetonu, miesza w temperaturze okolo 25°C w ciagu 1 godziny i nastepnie odwiro¬ wuje. Klarowna pozostalosc, uwolniona od wyek¬ strahowanej grzybni, odparowuje sie w tempera¬ turze 20—35°C pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci Ofcojp 35 litrów, doprowadza za pomoca19 wodorotlenku sodowego do wartosci pH=9 i ekstra¬ huje 18 litrami octanu etylu. Organiczna faze od¬ rzuca sie, wodny roztwór nasyca sola kuchenna, doprowadza za prmoca wodorotlenku sodowego do wartosci pH=8,5 i dwukrotnie ekstrahuje 9 litrami octanu etylu. Wodna faze odrzuca sie i organiczna faze odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 1 litra. Z otrzymanego roztworu wy¬ traca sie surowy antybiotyk za pomoca 3 litrów n-heksanu, odsacza osad, przemywa go mala iloscia eteru i mieszajac dodaje do wody, przy czym za po¬ moca 10% roztworu weglanu sodowego "utrzymuje sie wartosc pH=7,3. Z roztworu tego przez liofili¬ zowanie otrzymuje sie 10,5 g surowego antybiotyku, zawierajacego nieco weglanu sodowego.Przyklad IV. oczyszczanie antybiotyku, otrzy¬ manego sposobem wedlug wynalazku, za pomoca preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (DC). Przy poddawaniu surowego antybiotyku, wy¬ tworzonego w sposób, opisany w przykladzie III, analizie metoda chromatografii cienkowarstwowej, barwniki pozostaja w punkcie poczatkowym, a anty¬ biotyk znajduje sie w najwyzszej strefie (eluent: chloroform i metanol 5 + 1 objetosciowo, plyty z zelu krzemionkowego F 254 firmy Merck, Darm¬ stadt, RFN. 1,00 g surowego antybiotyku poddaje sie preparatywnej chromatografii cienkowarstwo¬ wej na 20 plytach z zelu krzemionkowego (Merck F 254, 2 mm), eluujac chloroformem z metanolem + 1 objetosciowo. Wyosobnia sie najwyzsza strefe, pojawiajaca sie w swietle lampy nadfioletowej.Wydajnosc wynosi 344 mg. W przeliczeniu na su¬ rowy produkt wyjsciowy antybiotyczna aktywnosc przeciwko Escherichia coli ATCC 9837 w próbie plytkowej wynosi 152#/o, PrzykladV. Oczyszczanie antylkiotyku, otrzy¬ manego sposobem wedlug wynalazku, metoda chro¬ matografii kolumnowej. 10 g surowego antybiotyku, wytworzonego sposobem, opisanym w przykla¬ dzie III, rozpuszcza sie w 600 ml dwukrotnie desty¬ lowanej wody i saczy przez acetylowany polikapro- laktam, np. MN-poliamid SC-6Ac (firmy Macherey, Nagel und Co, Diiren, RFN, umieszczony w kolumnie o dlugosci 70 cm i srednicy 5 cm, odbierajac frak¬ cje, wykazujace absorpcje przy 67 nm. Glówna frakcje ekstrahuje sie chloroformem, roztwór chlo¬ roformowy odparowuje i pozostalosc suszy pod cis¬ nieniem 0,01 tor w temperaturze 60°C w ciagu 4 dni.Wydajnosc: 5,2 g. Aktywnosc przeciwko Escheri¬ chia coli ATCC, oznaczana metoda plytkowa, wy¬ nosi 148*/§ w przeliczeniu na produkt wyjsciowy.Przyklad VI. Oczyszczanie przez frakcjono¬ wane stracanie. 1,00 g surowego antybiotyku, otrzy¬ manego w sposób, opisany w przykladzie III, roz¬ puszcza sie w 100 ml acetonu i roztwór wyklaro- Z9 wany pi"zez odwirowywanie traktuje porcjami cykloheksanem, odwirowujac powstaly osad (tabli¬ ca 7).T a b 1 i c a 7 1 Dodatek cyklohek¬ sanu ml 28 17 60 Wytracony osad mg 43 125 182 157 120 Aktywnosc *) 69 119 135 1 109 115 *) Aktywnosc przeciwko Ercherichia coli ATCC 9637 metoda plytkowa.Ten sposób frakcjonowania mozna dalej ulepszac przez systematyczne zmienianie rozpuszczalników.Oczyszczony antybiotyk zawiera wedlug analizy: 50,6%C, 7,2%H i 0,42%O. Wyniki analizy moga w kazdym przypadku zawierac okolo ± 1% bledu.Podana w przykladach próbe dyfuzji plytkowej [porównaj P.Klein, Bekteriologische Grundlagen der Chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer-Verlag5 Góttingen (1957), str. 86 i nastep¬ ne] prowadzi sie w ten sposób, ze w plytco aga¬ rowej, zakazonej Escherichia coli ATCC 9637, wy¬ tlacza sie otwory w które wprowadza sie badana substancje w postaci wodnego roztworu. Nastepnie prowadzi sie hodowle w temperaturze 37°C w ciagu okolo 16 godzin. Strefy zahamowania wykazuja sku¬ tecznosc przeciwko uzytemu* zarazkowi. Na podsta¬ wie wielkosci stref zahamowania mozna wnioskowac o zawartosci antybiotyku, otrzymanego sposobem wedlug wynalazku. PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 40 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku Bay g 7020, skutecznego przeciwko bakteriom gram-do- datnim i gram-ujemnym, znamienny tym, ze szcze¬ py Actinoplanes SE 73, zdeponowane pod nr CBS 432/74, i/albo SE 73/B, zdeponowane pod nr CBS 434/74, poddaje sie hodowli w warunkach aerobo- wych w zwyklym srodowisku hodowlanym i otrzy¬ many antybiotyk, dzialajacy przeciwko bakteriom gram-dodatnim i gram-ujemnym, wyosabnia zwyk¬ lymi sposobami z brzeczki hodowlanej i/lub z grzybni i ewentualnie oczyszcza. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze od okolo 20°C do okolo 40°C. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie przy wartosci pH rozwijaja¬ cej sie kultury od okolo 6 do okolo 8.90 855 H — Hz 760 ' 200 ~~ 240 ' 203 320 360 400 FIG. 1 FIG. 2 FIG. 3 75 2025 —r— r— i CP5 \r uU^^^JJjH/^ V*^MwL*J[ —I T" —-l 3MB &M iooo m mtoo 11 10 9 8 V 6 5 4 3

2. . 1 0 PPM FIG. 4 PL PL PL