DE2510161A1

DE2510161A1 - Antibioticum, ein verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE2510161A1
Application number: DE19752510161
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Bauer; Werner Dr Frommer; Wilfried Dr Kaufmann; Karl-Georg Dr Metzger; Dietmar Dr Schaefer; Martin Dr Scheer; Delf Dr Schmidt; Theo Dr Schroeder
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1975-03-08
Filing date: 1975-03-08
Publication date: 1976-09-16
Also published as: AU498251B2; DE2510161C2; ES445805A1; DK96076A; PL99855B1; NZ180207A; ZA761359B; JPS5921597B2; IL49159A0; BE839310A; PH13303A; GB1500846A; DK140853B; SE7602118L; FR2303556B1; FR2303556A1; SE8107091L; DK140853C; NL7602416A; CS203115B2

Description

Bayer Aktiengesellschaft

OMdir>i Zentralbereich

LO IU IQ] Patente, Marken

und Lizenzen

509 Leverkusen, Bayerwerk S/Bä

, 7. März 1975

Antibioticum, ein Verfahren zu seiner Herstellung; sowie seine Verwendung als Arzneimittel

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein neues Antibioticum, ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung aus Actinoplanaceen-Stämmen sowie seine Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als antimikrobielles Mittel in der Human- und Tiermedizin sowie als Mittel zur Förderung des Wachstums und der Steigerung der Futterverwertung bei Tieren.

Es ist bereits bekannt geworden, daß eine Reihe von Antibiotica mikrobieller Herkunft antimikrobielle Wirkungen besitzen. Diese Antibiotica sind teilweise in ihren Wirkungsspectren nicht voll befriedigend. Sie weisen häufig noch weitere Nachteile auf. ß-Lactamantibiotica werden oft durch Penicillina.se inaktiviert, Chloramphenicol, Tetracycline und Streptomycin zeigen in vielen Fällen erhebliche unerwünschte Nebenwirkungen (vgl. Walter, Heilmeyer, Antibiotika Fibel, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 3. Auflage, 1969, Seiten 248, 278-280 und 311-319).

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Es wurde nun gefunden, daß man ein neues Antibioticum erhält, wenn man

die Actinoplanes-Stämme

SE 73 oder

SE 73/B

einzeln oder gemeinsam in einem Nährmedium züchtet und das Antibioticum nach bekannten Methoden aus dem Fährmedium isoliert.

Weiterhin -wurde gefunden, daß das neue Antibioticum eine starke antimikrobielle Wirkung aufweist und außerdem die Eigenschaft besitzt, bei Tieren das Wachstum zu beschleunigen bzw. zu fördern und die Futterverwertung zu verbessern.

Das neue Antibioticum kann durch die folgenden Eigenschaften charakterisiert werden:

(1) Die Elementaranalyse C 50,8 %; H 7,2 %; 0 = 42 % ergibt folgende empirische Summenformel Cc₈ Hq₈ 0,g.

Es muß hier darauf hingewiesen werden, daß bei so großen Molekülen die Fehlerbreite der Elementaranalyse (± 0,8 %) es nicht immer erlaubt, eine genaue Summenformel aufzustellen (R.B. Woodward, Angew. Chem. 69, S. 50-51 (1957)). Die genannte Summenformel kann daher einen gewissen Fehler aufweisen.

(2) Ermitteltes Molekulargewicht:

1340 bis 1390, sehr wahrscheinlich 1370

(3) Ultraviolettspektrum: Fig. 1; ¹³C-NMR-Spektrum: Fig. 2; IR-Spektrum: Fig. 3; H-NMR-Spektrum: Fig 4.

(4) Das Antibioticum ist löslich in Wasser, den niederen Alkoholen (C₁ - C.), Chloroform, Aceton; schwer löslich in Diäthyläther, Petroläther, Cyclohexan; mäßig löslich in Essigester.

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(5) Charakteristisch für das Molekül ist die Säureempfindlichkeit. Bei pH 2 und Raumtemperatur 18 bis 22⁰C geht die antibiotische Aktivität innerhalb 1 Stunde auf den Nullwert zurück. Gleichzeitig verschwindet die charakteristische Bande im UV-Spektrum bei 2.67 nm. Auch durch Alkali ■wird das erfindungsgemäße Antibioticum abgebaut. Beim Erhitzen in n/10 Natronlauge auf 10O⁰C über 30 Minuten entsteht eine Verbindung, die im ultravioletten Gebiet nur noch Endabsorption zeigt. Sie hat eine gegenüber dem eingesetzten Antibioticum verminderte, jedoch noch deutliche in-vitro Wirkung gegenüber grammnegativen Bakterien.

(6) Das erfindungsgemäße Antibioticum ist ein Neutralstoff, der bei der Elektrophorese nicht wandert. Bei der sauren Hydrolyse (z.B. mit wäßriger 10 fo (Gewicht) Schwefelsäure bei 80 C) werden reduzierende Zucker abgespalten. Dadurch ist es leicht möglich, das Antibioticum bei der Dünnschicht-Chromatographie auf einer Kieselgelplatte mit sauren Zuckerreagentien wie z.B. Anisaldehyd-Schwefelsäure oder Benzidin-Trichloressigsaure oder Thymol-Schwefelsäure sichtbar zu machen. Auch Besprühen mit 10 $iger Schwefelsäure und zehnminütiges Erhitzen auf 80⁰C ergibt eine blau-graue Anfärbung auf der Platte. Das letztgenannte Reagens wurde zum charakteristischen Nachweis von Makrolid-Antibiotica vorgeschlagen (E. Stahl, Dünnschicht-Chromatographie, 2. Aufl., 1967, S. 546).

Die Rp-Werte des erfindungsgemäßen Antibioticums auf Kieselgelplatten (Pa. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) mit verschiedenen Laufmitteln gibt Tabelle 1 wieder.

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B Ü 9 il'i '■-, I Π ^fn R

Tabelle 1

laufmittel (Volumenteile) Rp-Wert

Methanol + Chloroform

5+95 0,025

4 + 1 0,49

50 + 50 0,755

100 + 0 0,715

n-Butanol + Eisessig + Wasser

60 + 20 + 20 0,470

Bei der Abgrenzung des erfindungsgemäßen Antibioticums gegenüber bereits bekannten Antibiotica kann man die Stickstoffhaltigen, aromatischen und Chloroform-unlöslichen außer Betrecht lassen, da daß erfindungsgemäße Antibioticum nur aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff besteht und keinen Stickstoff enthält. Der Gehalt an abhydrolysierbaren reduzierbaren Zuckern, die Löslichkeit und die Anfärbung mit 10 $iger Schwefelsäure deuten auf eine gewisse Ähnlichkeit zu den Macrolid-Antibiotica hin, von denen einige wenige Stickstofffreie Vertreter bekannt sind. Die Macrolide sind jedoch im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Antibioticum vorzugsweise gegen grampositive Organismen wirksam und nicht gegen gramnegative (Keller-Schierlein, Portschritte der Chemie organischer Naturstoffe 3.0, S. 314 (973)). Weiterhin ist bisher kein Macrolid-Anitbioticum bekannt geworden, das bei 267 nm absorbiert (Gottlieb, Shaw, Antibiotics II (1967) S. 159).

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fi 0 9 B Ί Π / il fl 1 8

Überraschenderweise wird das erfindungsgemäße Antibioticum durch die oben genannten Actinoplanes Stämme gebildet und kann aus dem Kulturmedium in guter Ausbeute isoliert werden. Weiterhin ist es überraschend, daß das erfindungsgemäße Antibioticum eine starke antimikrobielle , insbesondere antibakterielle Wirkung, auch gegenüber gramnegativen Erregern aufweist, ohne die oben dargelegten Nachteile bekannter Antibio'tica zu zeigen. Das neue Antibioticum weist auch überraschenderweise die Eigenschaft auf, bei Tieren das Wachstum zu fördern und die Futterverwertung zu verbessern. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Bereicherung der Pharmazie und der Technik dar.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können die neuen Actinoplane s-Stämme

SE 73
SE 73/B
eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Stämme Actinoplanes species SE-73 und SE-73/B gehören der Klasse der Schizomyceten, der Ordnung der Actinomycetales, der Familie der Actinoplanaceae und der Gattung Actinoplanes an. Der Stamm SE-73 wurde aus Erde isoliert. Der Stamm SE-73/B wurde als Spontanmutante des Stammes SE-73 erhalten. Die Stämme SE-73 und SE-73/B haben die folgenden Merkmale:

Das Mycel ist 0.3 bis 1,3/U breit und ist verzweigt. Die Sporangien sind von unregelmäßiger Gestalt, im Umriß meist annähernd kugelig, aber mit buckeliger Oberfläche und einem Durchmesser von 5 bis 18/U. Die Sporen sind kugelig Ms ellipsoid, begeisselt, schnell beweglich und haben einen Durchmesser von 0,7 bis 1,3/U. Sie sind im Sporangium in Form von gekrümmten und geknäuelten Ketten angeordnet.

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Die Kulturmerkmale auf verschiedenen Nährböden (nach 14 !Tagen bei einer Wachstumstemperatur von 20 bis 3O⁰C beobachtet) gehen aus der nachstehenden Aufstellung hervor:

Czapek-Agar

(Casamino-PeptonCzepek-Agar)

Milch-Agar

Tyrosin-Agar

Melaninbildung

¥ gut bis sehr gut

SM orange

LP schwach bräunlich-gelb

Spg. +, Myceloberflache dünn bereift

¥ gut bis sehr gut

SM orange bis orange-braun

IP braun

SPG. ++, Myceloberfläche dünn bereift

¥ gut bis sehr gut

SM orange

LP goldbraun

Spg. ++, Myceloberfläche dünn bereift

Casein peptonisiert

¥ mäßig bis gut

SM braun

LP braun

Spg. -, Myceloberfläche zum Teil dünn bereift

Tyrosinkristalle nicht aufgelöst

positiv

Milch-Peptonisierung positiv

¥ = ¥achstum

SM = Substratmycel

LP = Lösliches Pigment

Spg. = Bildung von Sporangien

= Fehlen

= ausgeprägtes "Vorhandensein = sehr " "

Der Stamm SE-73/B unterscheidet sich vom Stamm SE-73 durch eine erhöhte Erzeugung des erfindungsgemäßen Antibioticums.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig flüssige Nährmedien verwendet.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z.B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z.B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Permentern, z.B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kultur kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.

Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Ordnung der Actinomycetales verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen infrage. Beispielsweise seien Stärke, Melasse, Molkepulver, Dextrin, Zucker, wie Saccharose, Maltrose, Glucose, Lactose, Sorbit und Glycerin genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen infrage. Beispielsweise seien Soj'abohnenmehl, Baumwollsamehmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z.B. NH.Cl,

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60933Β/η⁽ΠΒ

* 251016]

NaNO, und ENO₅ aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z.B. folgende Ionen:

Mg⁺⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, NH₄ ⁺, Cl", SO~~, PO₄ und ITO₅"

sowie Ionen der üblichen Spurenelemente wie Cu, Pe, Mn, Mo, Zn, Co und Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthält, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammen-Setzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen.

Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn der Kultivierung der Actinoplanes-Stämme nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandteile zu verwenden und damm im Laufe der ersten drei Kultivierungstage durch häufigere Zusätze diese Bestandteile in Form steriler, relativ konzentrierter Lösung dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttern. - Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8, insbesondere zwischen 6,5 und 7,5 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO, vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z.B. H₀SO., oder sterile Lauge, z.B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

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6 0 9 Π 3 8 / 0 9 1 8

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstemperatür kann zwischen etwa 20 und etwa 40 C, vorzugsweise zwischen 25 und 35°C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 28⁰C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge des sich in der Kulturbrühe anreichernden Antibioticums im allgemeinen ihr Maximum etwa 2 bis 12, vorzugsweise 5 bis 8 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z.B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel z.B. flüssige Fette und Öle, öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octodecanol, Siliconöle, Polyoxyäthylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z.B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

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Das erfindungsgemäße Antibioticum kann aus dem Mycel und/oder aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalischchemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z.B.

gemäß den üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Das isolierte Antibioticum kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feirgereinigt werden. Pur viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da die gegebenenfalls vorhandenen Verunreinigungen die Wirksamkeit des Antibioticums nicht nachteilig beeinflussen. Bei allen Isolierungs- und Reinigungsoperationen ist darauf zu achten, daß pH-Werte von 7,0 oder mehr, vorzugsweise zwischen 7,0 bis 9,0, eingehalten werden. Zur Erhöhung des pH-Wertes können anorganische und organische Basen verwendet werden, z.B. Ammoniak, Alkali- und Erdalkalihydroxide, Alkali- und Erdalkalicarbonate und Hydrogencarbonate, z.B. KOH, KaOH, Fa₂CO,, NaHCO,, CaCO,, Trialkylamine, wie Triäthylamin, Morpholin und Pyridin. Um bei den obengenannten Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden in welchen das erfindungsgemäSe Antibioticum in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen Methoden, z.B. Messen der UV-Bande bei 267 nm, der R^-Werte oder vorzugsweise die Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität herangezogen werden. Besonders günstig ist im vorliegenden Falle die Untersuchung der Aktivität gegen Escherichia coli (wie Escherichia coli ATCC 9637) mit Hilfe des üblichen Plattentests (vgl. z.B. P. Klein, Bakteriologische Grundlagen der chemotherapeutischen laboratoriumspraxis, Springer-Yerlag, Göttingen (1957), Seiten 86 folgende).

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Die Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Antibioticums kann z.B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden:

Zur Kulturbrühe einschließlich Mycelium wird ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel gegeben und gut vermischt, wodurch einerseits Wirkstoff aus dem Mycelium extrahiert wird und andererseits in vielen Fällen auch eine Klärung der Kulturbrühe erreicht wird.

Als Lösungsmittel können z.B. niedere Alkylalkohole (C₁-C.), wie Methanol, Äthanol, n- und i,-Propanol oder t.-Butanol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und besonders bevorzugt Aceton verwendet werden. Die Menge des Lösungsmittels kann in weiten Grenzen variiert werden. Bevorzugt wird etwa das gleiche Volumen wie es die Kulturbrühe hat, zugesetzt. Anschließend werden die nicht gelösten Bestandteile (Mycelium, ausgefällte Proteine u.s.w.) durch Filtration, Zentrifugation, Absetzen lassen u.s.w. abgetrennt.

Die wäßrig-organische Lösung wird zweckmäßigerweise im Vakuum z.B. etwa auf das Volumen des eingesetzten Kulturmediums eingeengt.

Gegebenenfalls wird mit einer Base (vgl. oben), vorzugsweise

mit NaOH, ein pH-Wert von über 7.0, z.B. ein pH-Wert von

9,0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung soll im folgenden als "Lösung I" bezeichnet werden.

Aus der "Lösung I" ka.nn das erfindungsgemäße Antibioticum mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der

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U () ⁽> ■ \ λ Ι ίι Μ 1 '■]

Säulenchromatographie oder der präparativen Dünnschicht Chromatographie durchgeführt werden. Als Adsorptionsmittel können alle üblichen (nicht sauren) anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z.B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, vernetzte Dextranderivate,· Kunstharze wie Polyamide,!Derivate von Polyamiden u.s.w., z.B. acetyliertes Polyamid. Als Laufmittel bei der präparativen Dünnscfcichtchromatographie können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen das erfindungsgemäße Antibioticum löslich ist. Bevorzugt wird eirii Gemisch aus Chloroform und Methanol (z.B. 5 : 1 "Volumenteile) eingesetzt. Auch als Laufmittel für die Säulenchromatographie können Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen das erfindungsgemäße Antibioticum löslich ist. Beispielhaft seien Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid und bevorzugt Chloroform genannt.

Bevorzugt werden zur Isolierung des erfindungsgemäßen Antibioticums Extraktionsverfahren, gegebenenfalls in Kombination mit Chromatographie-Verfahren und Fällungsverfahren verwendet. Bei der Durchführung der Extraktionsschritte ist darauf zu achten, daß je nach dem, ob das erfindungsgemäße Antibioticum in der wäßrigen oder organischen Phase vorhanden sein soll, die Extraktionsmittel so gewählt werden, daß in ihnen das Antibioticum schwer bzw. leicht löslich ist.

Das Extraktionsverfahren kann z.B. wie folgt durchgeführt werden:

Die "Lösung I" wird mit in Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln nach üblichen Methoden (Schütteln, Gegenstromverfahren u.s.w.) extrahiert. Als Lösungsmittel können die üblichen Extraktionsmittel, z.B. Ester, wie Äthylacetat und

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fs 0 μ ■■ 'ί .^!j / (! ίΠ B

Butylacetat, höhere Alkohole, wie Amylalkohole, z.B. n-Amyl-Alkohol, in Wasser nicht mischbare Ketone, z.B. Methylisobutylketon, chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, z.B. Chloroform, Methylenchlorid und Tetrachlorkohlenstoff eingesetzt werden. Bevorzugt werden Äthylacetat und Butylacetat insbesondere ithylacetat verwendet.

Wenn bei der Extraktion der "Lösung I" Äthylacetat (und/oder Butylacetat) eingesetzt werden, wird die organische Phase verworfen, da sich das erfindungsgemäße Antibioticum in der wäßrigen Phase befindet. Die wäßrige Phase wird anschließend zweckmäßigerweise mit einem für solche Zwecke überlicherweise verwendeten inerten anorganischen Salz, z.B. NaCl, KCl, NapSO. und/oder MgSO. gesättigt, um die nachfolgende Extraktion zu erleichtern. Die Menge des zuzufügenden Salzes ist unkritisch. Sie hängt verständlicherweise von der Menge der Lösung und von der Löslichkeit der Salze ab und kann leicht ermittelt werden. Diese Lösung wird mit einem in Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, in welchem das erfindungsgemäße Antibioticum löslich ist wie sie oben bei der allgemeinen Erklärung der Extraktion der "Lösung I" aufgeführt werden, wobei jedoch keine Ester verwendet werden können, extrahiert. Die wäßrige Phase wird verworfen und das Lösungsmittel der organischen Phase, z.B. auf etwa 1/10 bis 1/30 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Anschließend wird das erfindungsgemäße Antibioticum durch die Zugabe eines organischen JFällungsmittels (Lösungsmittel), in welchem das erfindungsgemäße Antibioticum schwer löslich ist, z.B. von Diäthyläther oder von gesättigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Petroläthern, η-Hexan, oder Cyclohexan nach den üblichen Methoden ausgefällt. Der Niederschlag kann zur Reinigung in Wasser gelöst werden und das rohe erfindungsgemäße Antibioticum durch Verdampfen des Wassers,

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vorzugsweise durch Gefriertrocknung, erhalten werden. Das rohe Antibioticum kann gewürschtenfalls nach den üblichen chromatographischen Methoden (Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie) feingereinigt werden, wobei als Adsorptionsmittel, wie bereits erwähnt, die üblichen nicht sauren anorganischen und organischen Adsorptionsmittel verwendet werden können, z.B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, Derivate von Polyamiden z.B. acetyliertes Polyamid u.s.v..

Wenn bei der Extraktion der "Lösung I" nicht Äthylacetat oder Butylacetat sondern ein anderes Lösungsmittel, z.B. CCl^ verwendet wird, wird die wäßrige Phase verworfen, da sich das erfindungsgemäße Antibioticum in der organischen Phase befindet. In diesem Falle wird das organische Lösungsmittel vorzugsweise auf etwa 1/10 bis 1/30 des ursprünglichen Volumens eingeengt und durch die Zugabe eines geeigneten organischen Fällungsmittels, in welchem das erfindungsgemäße Antibioticum schwer löslich ist, z.B. von Diäthyläther oder von gesättigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Petroläther, η-Hexan oder Cyclohexan nach den üblichen Methoden gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser aufgelöst und die Lösung gefriergetrocknet. Das erhaltene Rohprodukt kann, gegebenenfalls nach Extraktion mit Äthylacetat oder Butylacetat, worin unerwünschte Begleitstoffe löslich sind und wobei die organische Lösung verwerfen wird, nach den üblichen chromatographischen Methoden, z.B. durch Säulenchromatographie, präperative Dünnschichtchromatographie mit Hilfe der üblichen Adsorptionsmittel (vgl. auch die obigen Ausführungen) gereinigt werden. Zur Reinigung kann auch, wie bereits oben erwähnt, aus einer Lösung des Rohprodukts in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Aceton, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und

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"e-Iiylenc!:lorid) cLas erfindungsgecäße Antibioticum mit Hilfe eir.es geeigneten organischen Pällungsmittels, in welchem das erfindungsgesäße Antibioticum schwer löslich ist, s.B. von I^iäxhyläther, gesättigten geradkettigen oder verzweigten oder cyclischen Kohlenwasserstoffen z.B. Petroläther, n-Hexan "und Cyclchexan fraktioniert ausgefällt v/erden.

lie neuen Actinoplanes-Stämme mit den Laborbezeichnungen SZ 73 und SS 73/B wurden unter den folgenden Nummern bei offiziellen Hinterlegungsstellen hinterlegt:

a) SZ 73

ATOC-Nr. 31058 (2.8.74)

CBS -Kr. 432.74 (12.8.74)

PRJ -Kr. 2669 ( 9.8.74)

c) S3 73/B

ATCC-ITr. 31060 ( 2.8.74)

CBS -Nr. 434.74 (12.8.74)

PRJ -Kr. 2671 ( 9.8.74)

ATCC = American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.

CBS = Centralbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande PRJ = fermentation Research Institute, Tokyo, Japan

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Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nichttoxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthalten oder die aus dem erfindungsgemäßen Wirkstoff bestehen sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.

Zur vorliegenden Erfindung gehören auch pharmazeutische Zubereitungen in Dosierungseinheiten. Dies bedeutet, daß die Zubereitungen in Form einzelner Teile, z.B. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, SupposLiorien und Ampullen vorliegen, deren Wirkstoffgehalt einem Bruchteil oder einem Vielfachen einer Einzeldosis entsprechen. Die Dosierungseinheiten können z.B. 1, 2, 3 oder 4 Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird und die gewöhnlich einer ganzen, einer halben oder einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht.

Unter nichttoxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen sind feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Formulierungshilfsmittel jeder Art zu verstehen.

Als bevorzugte pharmazeutische Zubereitungen seien Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotions, Puder und Sprays genannt.

Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können den oder die Wirkstoffe neben den üblichen · Trägerstoffen enthalten, wie (a) Füll- und Streckmittel, z.B. Stärken, Milchzucker, Rohrzucker, Glukose, Mannit und Kieselsäure, (b) Bindemittel, z.B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinyl-

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B 0 9 H 3 U / U Ü 1 8

pyrrolidon, (c) Feuchthaltemittel, z.B. Glycerin, (d) Sprengmittel, z.B. Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumcarbonat, (e) Lösungsverzögerer, z.B. Ps.raffin und (f) Resorptionsbeschleuniger, z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen, (g) Netzmittel, z.B. Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, (h) Adsorptionsmittel, z.B. Kaolin und Bentonit und (i) Gleitmittel , z.B. Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste PoIyäthylenglykole oder Gemische der unter (a) bis (i) aufgeführten Stoffe.

Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen gegebenenfalls Opakisierungsmittel enthaltenden Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, daß sie den Wirkstoff nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intestinaltraktes,gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen z.B. Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.

Der Wirkstoff kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffen auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Suppositorien können neben dem Wirkstoff die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Trägerstoffe enthalten, z.B. Polyäthylenglykole, Fette, z.B. Kaakofett und höhere Ester (z.B. Cj.-Alkohol mit Cjg-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe.

Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B. tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyäthylenglykole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe

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Puder und Sprays können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B. Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, z.B. Chlorfluorkohlenwasserstoffe enthalten.

lösungen und Emulsionen können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe wie lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, z.B. Wasser, Äthylalkohol, Isopropylalkohol, Äthylcarbonat, Äthylacetat, Benzylalkohol, Benzylbezoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnußöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyäthylenglykole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Zur parenteralen Applikation können die lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.

Suspensionen können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, z.B. Wasser, Äthylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, z.B. äthoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyäthylensorbit- und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbessernde Zusätze, z.B. Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, z.B. Saccharin enthalten.

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Die therapeutisch wirksame Verbindung soll in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzusweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gewichtsprozent der Gesamtmischung vorhanden sein.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer dem erfindungsgemäßen Wirkstoff auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach bekannten Methoden, z.B. durch Mischen des Wirkstoffs mit dem oder den Trägerstoffen.

Zur vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Wirkstoffes sowie von pharmazeutischen Zubereitungen, die den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthalten, in der Human— und Veterinärmedizin zur Verhütung, Besserung und/oder Heilung der oben angeführten Erkrankungen.

Der Wirkstoff oder die pharmazeutischen Zubereitungen können lokal, oral, parenteral, intraperitoneal und/oder rectal, vorzugsweise oral und parenteral, insbesondere intramuskulär oder intravenös, gegebenenfalls auch als Dauertropfinfusion, appliziert werden.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den erfindungsgemäßen Wirkstoff bei oraler oder parenteraler Applikation in Gesamtmengen von etwa 10 bis etwa 1000, vorzugsweise 50 bis 600 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den erfin-

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H Ü 9 *-" J y / Ü Ü 1 8

dungsgemäßen Wirkstoff vorzugsweise in Mengen von etwa 50 bis etwa 300 mg/kg, insbesondere 100 bis 200 mg/kg Körpergewicht. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Objekts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der oben genannten Menge Wirkstoff auszukommen, während in anderen Fällen die oben angeführte Wirkstoffmenge überschritten werden muß. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierung und Applikationsart der Wirkstoffe kann durch jeden Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff weist bei geringer Toxizität eine starke antimikrobielle Wirksamkeit auf. Diese Eigenschaften ermöglichen seine Verwendung als chemotherapeutischen Wirkstoff in der Medizin sowie als Stoff zur Konservierung von anorganischen und organischen Materialien, insbesondere von organischen Materialien aller Art, z.B. Polymeren, Schmiermitteln, Farben, Fasern, Leder, Papier und Holz, von Lebensmitteln und von Wasser.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff ist gegen ein sehr breites Spektrum von Mikroorganismen wirksam. Mit seiner Hilfe können gramnegative und grampositive Bakterien, bakterienähnliche Mikroorganismen, bekämpft sowie die durch diese Erreger hervorgerufenen Erkrankungen verhindert, gebessert und/oder geheilt werden.

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B Ü 9 B Ί B I η <] 1 8

Besonders wirksam ist der erfindungsgemäße Wirkstoff gegen Bakterien und takterienähnliehe Mikroorganismen .

Er ist daher besonders gut zur Prophylaxe und Chemotherapie von lokalen und systemischen Infektionen in der Human- und Tiermedizin geeignet, die durch diese Erreger hervorgerufen werden.

Beispielhaft können lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden, die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger verursacht werden:

Micrococaceae, wie Staphylokokken, z.B. Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis, Staph. aerogenes und Gaffyka tetragena (Staph. = Staphylococcus);

Lactobacteriaceae, wie Streptokokken, z.B. Streptococcus py— ogenes,c£- bzw. ß-hämolysierende Streptokokken, nicht (f-)-hämolysierende Streptokokken, Str. viridans, Str.faecalis (Enterokokken), Str.alalactiae, Str.lactis, Str.equi, Str. anaerobis und Diplococcus pneumoiae (Pneumokokken) (Str. = Streptococcus);

Heisseriaceae, wie Neisserien, z.B. Neisseria gonorrhoeae, (Gonokokken), U.meningitidis (Meningokokken), N.catarrhalis und N.flava (N". = Heisseria);

Corynebacteriaceae, wie Corynebakterien, z.B. Corynebacterium diphtheriae, C.pyogenes, C.diphtheroides, C.acnes, C.parvum, C.bovis, C.renale, C.ovis, C.murisepticum, Listeria-Bakterien, z.B. Listeria monocytogenes, Erysipelothrix-Bakterien, z.B. Erysipelothrix insidiosa, Kurthia-Bakterien, z.B. Kurthia zopfii (C. = Corynebacterium);

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Mycobacteriaceae, wie Erreger von Mykobakteriosen, z.B. Mycobacterium tuberculosis, M.bovis, M.avium, sogenannte atypische Mykobakterien der Runyon-Gruppen I, II, III und IV, M.leprae (M. = Mycοbacterium);

Enterobacteriaceae, wie Escherichiae-Bakterien der Coli-Gruppe: Escherichia-Bakterien, z.B. Escherichia coli, Enterabacter-Bakterien, z.B. E.aerogenes, E.cloacae, Klebsiella-Bakterien, z.B. K.pneumoniae, K.ozaenae, Erwiniae, z.B. Erwinia spec. Serratia, z.B. Serratia marcescens (E. = Enterabacter) (K. = Klebsiella), Proteae-Bakterien der Proteus-Gkruppe: Proteus, z.B. Proteus vulgaris, Pr.morganii, Pr.rettgeri, Pr.mirabilis, Provdencia, z.B. Providencia sp. (Pr. = Proteus), Salmonelleae: Salmonella-Bakterien, z.B. Salmonella paratyphi A und B, S.typhi, S.enteritidis, S.cholera suis, S.typhimurium (S. = Salmonella), Shigella- Bakterien, z.B. Shigella dysenteriae, Sh.ambigua, Sh.flexneri, Sh.boydii, Sh.sonnei (Sh. = Shigella);

Spirillaceae, wie Vibrio-Bakterien, z.B. Vibrio cholerae, V. proteus, V.fetus (V. = Vibrio), Spirillum-Bakterien, z.B. Spirillum minus.

Bacillaceae, wie Aerobe Sporenbildner, z.B. Bacillus anthracis, (B.subtilis, B.cereus) (B. = Bacillus), Anaerobe Sporenbüiner Clostridien, z.B. Clostridium perfringens, Cl. septicum, Cl. oedematiens, Cl.histolyticum, Cl.tetani, Cl.botulinum (Cl. = Clostridium);

Mykoplasmen, wie z.B. Mycoplasma pneumoniae, M.hominis, M.suis pneumoniae, M.gallisepticum, M.hyorhinis (M. = Mycoplasma).

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Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich "beispielhaft und keinesfalls beschränkend aufzufassen.

Als Krankheiten, die durch den erfindungsgemäßen Wirkstoff verhindert, gebessert und/oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:

Erkrankungen der Atmungswege und des Rachenraumes; Otitis, Pharyngitis, Pneumonie, Peritonitis, Pyelonephritis, Cystitis, Endocarditis, Systeminfektionen, Bronchitis, Arthritis, lokale Entzündungen, Hautinfektionen.

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BOB?- '> H / (i Π 1 Pi

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann auch in allen Bereichen der Tierzucht und Tierhaltung als Mittel zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung bei gesunden und kranken Tieren verwendet werden.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Wirkstoffes ist hierbei weitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweist sich der erfindungsgemäße Wirkstoff bei der Aufzucht und Haltung von Jung- und Masttieren. Als Tiere, bei denen der erfindungsgemäße Wirkstoff zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung eingesetzt werden kann, seien beispielsweise folgende Nutz- und Ziertiere genannt:

Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe , Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z.B. Nerze und Chinchilla, Geflügel, z.B. Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter wie Fische, z.B. Karpfen und Reptilien, z.B. Schlangen.

Die Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften des Wirkstoffes weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 5 bis 600, insbesondere 10 bis 300 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

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Der erfindungsgemäße Wirkstoff wird den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Gesundheitszustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen oral oder parenteral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhythmus der Kahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann als reiner Stoff oder in formulierter Form, also in Mischung mit nichttoxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, z.B. mit Trägerstoffen und in Formulierungen, wie sie weiter oben bei den pharmazeutischen Zubereitungen beschrieben sind, verabreicht werden,

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen mit pharmazeutischen Wirkstoffen, Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen, Fetten, Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen in geeigneter Form verabreicht werden.

Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen als reiner Stoff, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit eßbaren nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form eines Praemix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser beigefügt werden.

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Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise den erfindungsgemäßen Wirkstoff in einer Konzentration von etwa 5 bis 500, insbesondere 10 bis 100 ppm (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter und/oder Trinkwassera.ufnähme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Aufbaustoffen einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z.B. Heu, Rüben, Getreide, Getreidenebenprodukten, tierischen Stoffen, z.B. Fleisch, Fetten, Knochenmehl, Fischprodukten, Vitaminen, z.B. Vitamin A, D-Komplex und B-Komplex, Proteinen, Aminosäuren, z.B. DL-Methionin und anorganischen Stoffen, z.B. Kalk und Kochsalz.

Futterkonzentrate enthalten den erfindungsgemäßen Wirkstoff neben eßbaren Stoffen, z.B. Roggenmehl, Maismehl, Sojabohnenmehl oder Kalk, gegebenenfalls mit weiteren Nähr- und Aufbaustoffen sowie Proteinen, Mineralsalzen und Vitaminen. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.

Vorzugsweise in Praemixen und Futterkonzentraten kann der Wirkstoff gegebenenfalls auch durch seine Oberfläche "bedeckenden geeigneten Mittel, z.B. mit nichttoxischen Wachsen oder Gelatine vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt werden.

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Beispiel für die Zusammensetzung eines Kükenfutters, das den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:

200 g Weizen, 340 g Mais, 361 g Segaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcart>onat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 2,5 g Wirkstoff-Praemix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus:

6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin D₃, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin K,, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 meg Vitamin IL₂, 5 mg Oalciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg Mn SO. x- H₂O, HO mg Zn SO. χ 7H₂O 100 mg Pe SO. χ 7H₂O und 20 mg Cu SO. χ 5H₂O.

Der Wirkstoff-Praemix enthält den erfindungsgemäßen Wirkstoff in der gewünschten Menge, z.B. 20 mg und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, daß 2,5 g Praemix entstehen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweineaufzuchtfutters, das äen erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:

630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 60 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung z.B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Praemix (Zusammensetzung z.B. wie beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.

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B 0 U H '* *J / fl '■'· 1

Die gute antimikrobielle Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Antibioticums kann durch die folgenden Versuche demonstriert werden:

a) In vitro-Versuche:

Das erfindungsgemäße Antibioticum wurde mit Müller-Hinton-Nährbrühe unter Zusatz von 1 fo Glucose auf einen Gehalt von 200 /Ug/Ml verdünnt. In der Nährlösung befanden sich jeweils 1 χ 10* bis 2 χ 10* Bakterien pro Milliliter. Die Röhrchen mit diesem Ansatz wurden jeweils 18 Stunden bebrütet und anschließend wurde der Trübungsgrad bestimmt. Trübungsfreiheit gibt Wirkung an. Bei der Dosierung von 200 /ug/ml waren die folgenden Bakterienkulturen trübungsfrei:

Escherichia coli 14; Escherichia coli C 165; Proteus vulgaris 1017; Klebsiella K 10; Klebsiella 63; Salmonella sp.; Shigella sp.; Enterobacter sp.; Serratia sp.; Proteus, indolnegativ, sp.; Proteus indolpositiv, sp.; Pasteurella pseudotuberculosis; Brucella sp.; Bordetella bronchiseptica; Bacteroides sp.; Staphylococcus aureus 133; Neisseria catarrhalis sp.; Diplococcus pneumoniae sp.; Streptococcus pyogenes W; Enterococcus sp.; Lactobacillus sp.; Corynebacterium diphteriae gravis; Corynebacterium pyogenes M; Clostridium botulinum; Clostridium tetani; Borrelia sp.; Pseudomonas aeruginosa sp.; Aeromonas hydrophile- sp.; Mycoplasma sp. (Sp. = "species" = nicht näher identifizierte, jedoch charakteristische Stämme).

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6 0 9 8 3 H / (J 91 8

t>) In vivo-Versuche:

Aus der folgenden Tabelle 1 geht die Wirkung des erfindungsgemäßen Antibioticums gegen eine Reihe von Bakterien im Tierversuch mit der weißen Maus hervor. Die weißen Mäuse vom Stamm CP₁ wurden intraperitoneal mit der jeweils angegebenen Bakterienart infiziert.

Tabelle 1

Tierversuch mit der weißen Maus Bestimmung der EDj-q nach 24 Stunden

Dosis in mg des erfindungsgemäßen ^eiin Antibioticums pro kg Körpergewicht

Escherichia CoIi 165 1 x

Staphylococcus aureus 1 χ

Therapie: einmalig 30 Minuten nach Infektion, subcutan.

Die EDcq ist die Dosis, bei der 50 $> der infizierten Tiere nach 24 Stunden noch überleben.

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Die gute Wirksamkeit des erf indungs gemäßen Antibiotikums als Mittel zur Förderung des Wachstums kann durch folgenden Versuch demonstriert werden:

Bei Pütterungsversuchen wurde die Substanz dem Putter untergemischt und an Küken verfüttert. Die Dosis betrug 10 bzw. 25 ppm. Verglichen wurde gegen eine Negativkontrolle (Putter ohne Zusätze). Versuchsdauer: 14 Tage.

Versuch

Anzahl Durchschnitts- Gewicht

Negativkontrolle Erfindungsgemäßes 10 ppm Antibioticum 25 ppm

24	358,2	100
24	372,5	104,0
24	383,7	107,1

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Erläuterungen der Fig. 1 bis 4

Fig. Nr. Abszisse Ordinate

Wellenlänge (nm) % Absorption σ in ppm

Wellenzahl (cm ) % Absorption S in ppm

1) Fig. 1: Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Das UV-Spektrum des Antibioticums wird in Figur 1 wiedergegeben

= 265 nm (C = 0,0091 % in Methanol)

265 nm = 164

cm

2) Fig. 2:

Das ^C-Kernresonanzspektrum (Fig. 2) wurde an einer Lösung des Antibioticums in deuterisiertem Methanol mit Tetramethylsilan als innerem Standard an derselben Lösung auf einem XL-100-Spektrometer (15'') der Firma Varian Associates, Paolo Alto, Kalifornien bei 25,2 MHz unter Protonenrauschentkopplung gemessen.

3) Fig. 3: IR-Absorptionsspektrum:

Das IR-Absorptionsspektrum des Antibioticums wird in Fig. 3 wiedergegeben. Es zeigt, wenn die Substanz zu KBr-Presslingen verpreßt wird, bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Zentimetern) Absorptionsbanden:

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0 H ■· >· ?· / f! M 1 R

Bandenfrequenz Intensität Bandenfreq.uenz Intensität cn"¹ öm"¹

3440	S	1290	W
2960	m	1200	m
2920	m	1060	S
3440	S	1290	ν W
2960	m	1200	m
2920	m	1060	S
2850	m	1020	B
1630	η	985	m
1570	S	940	m
1445	m	905	m
1405	m	780	m
1375	m	750	m
1310	w		■

Die IR-Bandenintensitäten werden mit s, m und w bezeichnet. Eine s-Bande weist mindestens 2/3 der Intensität der stärksten Bande im Spektrum, eine m-Bande eine Intensität im Bereich zwischen 1/3 und 2/3 der stärksten Bande und eine w-Bande weniger als 1/3 der Intensität der stärksten Bande auf. Diese Schätzungen sind auf der Basis der prozentualen Durchlässigkeit gemacht.

4) Das in Fig. 4 gezeigte 220 MHz H-Kernresonanzspektrum wurde an einer Lösung des Antibioticums in deuterisiertein Methanol mit Tetramethylsilan als innerem Standard auf einem HR-SC-Spektrometer der Firma Varian Associates, Paolo Alto, Kalifornien aufgenommen.

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8 0 H H 3 H / (I 9 1 8

—V

COPY

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Antibioticums kann durch die folgenden Beispiele erläutert werden. Alle ^-Angaben beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf Gewichtsprozente.

Beispiel 1

Auf Schrägagar der Zusammensetzung (Gewichtsprozente)

Pepton	0,25
Casein-Hydrolysat, sauer	0,25
K₂HPO₄ χ 3H₂O, p.a.	0,1
KCl, p.a.	0,05
MgSO₄, p.a.	0,05
FeSO₄, p.a.	0,01
Rohrzucker	3,0
Agar	2,0
Wasser	ad 100

gewachsenes Mycel des Stammes Actinoplanes SE-73/B wird auf je HO ml steriler, in 1-Liter-Erlenmeyerkolben befindlicher Nährlösung (im folgenden"Nährlösung A" genannt") der Zusammensetzung:

Sojamehl	, entfettet	3	,0	io
Glycerin	, reinst	3	,0	io
CaCO₅, ρ	.a.	0	,2
Wasser		ad 100

Hydroxylgruppen enthaltendes neutrales Polyol, z.B. ' Niax Polyol LHT 67 (Warenzeichen der Union Carbide BeIg. N.V.) 1 Tropfen / HO ml Nährlösung zur Entschäumung.

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überimpft. Nach 8-tägiger Kultivierung des Stammes auf der Rundschüttelmaschine bei 28 C werden Proben der Kulturen zentrifugiert. Die klare, überstehende Lösung wird itn Agar-Plattenlochtest gegen Escherichia coli ATCC 9637 getestet. Das in der Kulturlösung befindliche erfindungsgemäße Antibioticum verursacht Wachstumshemmzonen von etwa 17 mm Durchmesser. Die Isolierungdes erfindungsgemäßen Antibioticums aus den KuItürbrühen geschieht wie in Beispiel 3 beschrieben.

Beispiel 2

Je 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung (Gewichtsprozente)

Dextrin 0,4 $>

Glycerin 0,2 $>

Hefeextrakt 0,2 $

CaCO, 0,2 io

Leitungswasser ad 100 $

3,0 ml Hydroxylgruppenhaltiges neutrales Polyol (z.B.

Niax Polyol LHT 67 (Warenzeichen der Union Carbide BeIg. N.V.) je 8 Liter Nährlösung

werden in Glasfermenter mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung abgefüllt, mit Natronlauge auf pH 6,8 eingestellt und bei 120 C sterilisiert. Nach Abkühlung der Lösungen werden die Permenter mit je 240 ml (3,0 $> (Volumen)) von 3 Tage in "Nährlösung A" gewachsenen Schüttelkulturen des Actinoplanes-Stammes SE-73 beimpft, mit etwa 4 Litern Luft/Min. bei etwa 600 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und bei einer Temperatur von 28⁰C gehalten. 17 und 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung erhalten die Fermenter Zusätze von jeweils 0,4 $ Dextrin, 0,2 # Glycerin und 0,3 $ Hefeextrakt und nach 30, 41, 48 und 54 Stunden Zusätze von jeweils

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0,4 $> Dextrin, 0,2 $ Glycerin und 0,4 1° Hefe extrakt in Porm konzentrierter Gemische dieser Nährlösungskomponenten in einem Volumen von je 200 ml pro Zusatz. Ein Anstieg der Kulturvolumina durch diese Zugaben wird durch die aufgetretene Wasserverdunstung kompensiert. Das Gesamtangebot der Nährlösungskomponenten beträgt für Dextrin 2,8 $, für Glycerin 1,4 #, für Hefeextrakt 2,4 1° und für CaCO₅ 0,2 #. Nach 120 Stunden wird die Kultivierung beendet.

Beispiel 3

Die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühen von 5 Glasfermentern (5x8 Ltr.) werden vereinigt, mit 48 Liter Aceton versetzt, bei ca. 25°C eine Stunde gerührt und anschließend zentrifugiert. Der klare, vom extrahierten Mycel befreite Überstand wird bei 20 bis 35⁰C im Vakuum auf etwa 35 Liter eingeengt, mit Natronlauge auf pH 9 eingestellt und mit 18 Liter Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wird verworfen, die wäßrige Lösung nach Sättigung mit Kochsalz mit Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt und 2 mal mit 9 Litern Äthylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wird verworfen, und die organische Lösung im Yakuum auf' ca. 1 Liter eingeengt. Aus dieser Lösung wird das rohe Antibioticum mit 3 Liter η-Hexan ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit wenig Äther gewaschen und unter Rühren in Wasser eingetragen, wobei mit 10 $iger Sodalösung ein pH-Wert von 7,3 aufrecht erhalten wird. Durch Lyophilisieren erhält man aus dieser Lösung 10,5 g des rohen (etwas Soda enthaltenden) erfindungsgemäßen Antibioticums.

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Beispiel 4

Reindarstellung des erfindungsgemäßen Antibioticums durch präparative Dünnschichtchromatographie (DC)

Bei der analytischen DC des nach Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibioticums bleiben die Farbstoffe am Startpunkt, das erfindungsgemäße Antibioticum befindet- sich in der obersten Zone (Fließmittel: Chloroform + Methanol =5+1 (Volumen), Kieselgelplatten F 254 der Firma Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland).

1,00 g des rohen Antibioticums werden auf 20 Kieselgelplatten (Merck F 254, 2 mm) einer präparativen DC unterworfen (Fließmittel: Chloroform + Methanol =5+1 (Volumen)). Isoliert wird die unter der UV-Lampe erscheinende oberste Zone. Ausbeute : 344 mg.

Antibiotische Aktivität im Plattentest gegen Escherichia coli ATCC 9637: 152 $, bezogen auf das rohe Ausgangsmaterial.

Beispiel 5

Reindarstellung des erfindungsgemäßen Antibioticums durch Säulenchromatographie

10 g des rohen gemäß Beispiel 3 erhaltenen Antibioticums werden in 600 ml aqua bidest. gelöst und über ein acetyliertes PoIycaprolactam, z.B. MN-Polye.mid SC - β Ac (Firma Macherey, Nagel & Co., Düren, Bundesrepublik Deutschland), das sich in einer Säule von 70 cm Länge und 5 cm Durchmesser befindet, filtriert. Aufgefangen werden die bei 67 nm absorbierenden Fraktionen. Die Hauptfraktion.wird mit Chloroform extrahiert, die Chloroform-Lösung eingedampft und der Rückstand bei 0,01 Torr 4 Tage

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B U 9 H Ά \ι / U M 1 8

NST

bei 6O⁰C getrocknet.

Ausbeute: 5,2 g

Antibiotische Aktivität im Plattentest gegen Escherichia coli ATCC 9637: 148$, bezogen auf AuBgangsmaterial.

Beispiel 6

Reindarstellung durch fraktionierte Fällung

1,00 g des rohen gemäß Beispiel 3 erhaltenen Antibioticums wird in 100 ml Aceton gelöst. Die durch Zentrifugieren geklärte Lösung "wird portionsweise mit Cyclohexan versetzt und das entstehende Sediment durch Zentrifugieren gewonnen.

Zusatz ml Cyclohexan	Fällung in mg	fo Wirksamkeit
+ 10	43	69
+ 28	125	119
+ 17	182	135
+ 25	157	109
+ 60	120	115

' Im Plattentest gegen Escherichia coli ATCC 9637

Diese Fraktionierungsmethode kann durch systematische Variation der lösungsmittel weiter optimiert werden.

Das gereinigte Antibioticum ergibt die folgenden Analysenwerte: C 50,8 %; H 7,2 %', 0 42,0 %. Die Analysenwerte können jeweils um etwa - 1 % Fehler enthalten.

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Der in den Beispielen aufgeführte Plattendiffusionstest wird wie folgt vorgenommen (vgl. P. Klein, Bakteriologische Grundlagen der Chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer-Yerlag, Göttingen (1957), Seiten 86 folgende):

In eine durch Escherichia coli ATCC 9637 infizierte Agar-Platte werden Löcher gestanzt. Das zu prüfende Material wird als wäßrige Lösung in diese Löcher gegeben. Anschließend wird bei 37°C ca. 16 Stunden bebrütet. Hemmhöfe zeigen Wirksamkeit gegen den verwendeten Keim. Aus der Größe der Hemmhöfe kann auf den Gehalt an dem erfindungsgemäßen Antibioticum geschlossen werden.

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Claims

Patentansprüche

A/ Antibioticum, welches

(a) aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff besteht;

(b) löslich in Wasser, niederen Alkoholen, Chloroform und Aceton ist und schwerlöslich in Diäthylather, Petroläther und Cyclohexan ist;

(c) ein Neutralstoff darstellt und bei der Elektrophorese nicht wandert;

(d) bei der sauren Hydrolyse reduzierende Zucker abspaltet und

(e) im UV-Spektrum eine ausgeprägte Bande bei 267 nm aufweist.

2. Antibioticum gemäß Anspruch 1, welches die in Pig. 1 bis angegebenen UV-, IR- und NMR-Spektren besitzt.

3. Antibioticum gemäß Anspruch 1 mit der empirischen Summenformel C₅₈ H₉₈ O₃₆.

4. Antibioticum gemäß Anspruch 1, welches ein Molekulargewicht von etwa 1370 aufweist.

5. Antibioticum gemäß Anspruch 1, welches eine empirische Summenformel von Cc₈ Hq₈ O,g und ein Molekulargewicht von etwa 1370 aufweist.

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251016]

Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, welches gegen Gram-positive- und Gram-negative Bakterien wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die Actinoplanes-Stämme SE 73 und/oder SE 73/B unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Kulturmedium züchtet und das Antibioticum, welches gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien wirksam irt, nach den allgemein üblichen Verfahren aus der Kulturbrühe und/oder dem Mycelium isoliert und gegebenenfalls reinigt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei welchem die Züchtungstemperatur zwischen etwa 2O⁰C und etwa 40 C liegt.

8. Verfä: ren gemäß den Ansprüchen 6 und 7, bei welchem der pH-Wert der wachsenden Kultur bei etwa pH 6 bis etwa pH 8 liegt.

9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 8, bei welchem ein Antibioticum , welches

(a) aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff besteht;

(b) löslich in Wasser, niederen Alkoholen, Chloroform und Aceton ist und schwerlöslich in Diäthyläther, Petroläther und Cyclohexan ist;

(c) ein Keutralstoff darstellt und bei der Elektrophorese nicht wandert;

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b 0 H H A H I Q U 1 3

(d) bei der sauren Hydrolyse reduzierende Zucker abspaltet und

(e) im TJV-Spektrum eine ausgeprägte Bande bei 267 nm aufweist,

erhalten wird.

10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 9, bei welchem das Antibioticum die in Fig. 1 bis 4 angegebenen UV-, IR- und IiMR-Spektren besitzt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei welchem das Antibioticum die empirische Summenformel Cco H_Qq 0,/- besitzt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei welchem das Antibioticum ein Molekulargewicht von etwa 1370 aufweist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei welchem das Antibioticum eine empirische Summenformel von Cc₈ Hq₈ 0,g und ein

Molekulargewicht von etwa 1370 aufweist.

14. Antibioticum, erhältlich gemäß dem Verfahren der Ansprüche 6 bis 13.

15. Arzneimittel, feekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Antibioticum gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 und 14.

16. Verwendung des Antibioticums gemäß den Ansprüchen bis 5 und 14 zur Förderung des Wachstums und zur Verbesserung der Futterverwertung bei !Eieren.

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609838/091 8

17. Tierfutter, enthaltend das Antibioticum gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 und 14.

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609838/091 8

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