Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kompleksu nowych antybiotyków dezoksynara¬ synowych zawierajacego 20-dezoksynarasyne i 20- dezoksy-epi-17-narasyne. Kompleks antybiotyków dezoksynarasynowych jest srodkiem przeciwbakte- ryjnym przeciwkokcydiozowym a takze zwieksza wykorzystanie pokarmu u zwierzat przezuwajacych.W medycynie weterynaryjnej potrzebne sa ciag¬ le nowe i lepsze antybiotyki. Np. w przemysle dro¬ biarskim kokcydioza ciagle stanowi powazny pro¬ blem. Przyczyna kokcydiozy jest zakazenie jednym lub kilkoma szczepami z gatunku Eimeria lub Jsos- pora. Szczególowe rozwazania na ten temat mozna znalezc w pracy Lunda i Farra „Diseases of Poul- try", wydanie 5, wydawcy Biester i Schwarte, Iowa State University Press, Ames, Iowa. 1965, str. 1056— —1096. Straty wywolywane kokcydioza sa duze, stad istnieje potrzeba poszukiwania lepszych srod¬ ków przeciw tej chorobie.Przyspieszenie wzrostu zwierzat przezuwajacych, takich jak bydlo i owce, jest innym, pozadanym .gospodarczo, przedmiotem nauk weterynaryjnych.Szczególne zainteresowanie budzi przyspieszenie wzrostu osiagane droga zwiekszania przyswajania pokarmu.Mechanizm przyswajania weglowodanów, glów¬ nego skladnika pozywienia przezuwajacych, jest dobrze znany. Drobnoustroje w zwaczu zwierzecia rozkladaja weglowodany do jednocukrów a nastep- 15 2 30 nie przeksztalcaja te jednocukry w pirogronia-ny.Pirogroniany sa metabolizowane w procesach mi¬ krobiologicznych do octanów, maslanów lub pro¬ pionianów, znanych pod laczna nazwa lotnych kwasów tluszczowych (VFA). Szczególowe rozwa¬ zania na ten temat znajduja sie w pracy Longa |VPhysiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", wydawcy Philipson i wsp., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne. Anglia, str. 408—410.Problemy wzglednej wydajnosci przyswajania VFA sa dyskutowane przez McCullough'a w Feed- stuffa, czerwiec 19, 1971, str. 19, Eskelanda i wsp. w J.An.Sci., 33, 282) 1971) oraz Churcha'a i wsp. w „Digestive Physiology and Nutrition of Rumi- nants", tom 2, 1971, str. 022 i 625. Chociaz wszyst¬ kie lotne kwasy tluszczowe sa przyswajane,, to wy¬ dajnosc przyswajania propionianów jest wyzsza niz octanów i maslanów.Ponadto, w przypadku zbyt malej ilosci propio- nianu u zwierzat moze sie rozwijac ketoza. Ko¬ rzystny zwiazek stymuluje wytwarzanie wiekszej ilosci propionianów z weglowodanów, zwiekszajac w ten sposób wydajnosc przyswajania weglowoda¬ nów i zmniejszajac wystepowanie ketozy. 20-dezoksynarasyna i 20-dezoksy-epi-17-narasyna sa nowymi .antybiotykami polieterowymi, spokrew¬ nionymi najbardziej ze znanych antybiotyków po- lieterowych narasyna (czynnik A antybiotyku A- -28086 opisany w opisach patentowych St. Zjedn. 117 570117 570 3 Am. nr nr 4035481 i 4038384). Struktura narasyny zaproponowana w tych opisach i przez Occolowitz'a i wsp. w Biomed. Mase Spectrometry, 3, 272—277 (1976) zostala ostatnio potwierdzona przez H. Seto i wsp. w J. Antibioticsy, 30, (6), 530—532 (1977).Strukture narasyny przedstawia wzór 3.Zgodnie z doniesieniem Seto i wsp. narasyna jest blisko spokrewniona z salinomycyna czyli 4-deme- tylonarasyna. Ostatnio, J. W. Weatley i wsp. opi¬ sali w J. Antibiotics, 30 (7), 610—812 (1977) epimery C-17 dezóksy-(C-8)-salinomycyny.Chociaz epimery dezoksysalinomycyny sa analo¬ giczne do epimerów dezoksynarasyny wytwarza¬ nych sposobem wedlug wynalazku, to jednak nie sa znane sposoby chemiczne, za pomoca których epimery dezoksynanarysyny mozna by wytwarzac z epimerów dezoksysalinomycyny.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie sub¬ stancje antybiotyczne, a zwlaszcza kompleks .anty¬ biotyków dezoksynarasynowych zawierajacy co naj¬ mniej dwa indywidualne czynniki, 20-dezoksyna¬ rasyne i 20-dezoksy-epi-l,7-narasyne. Kompleks ten wytwarza sie w hodowli szczepu drobnoustroju Streptomyces aureofaciens Duggar, NRRL 11181.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze pro¬ wadzi sie hodowle Streptomyces aurofaciens NRRL 11181,,. w pozywce zawierajacej przyswajalne zród¬ la weglowodanów, azotu i sole nieorganiczne, w warunkach fermentacji podpowierzchniowej z na¬ powietrzaniem az do wytworzenia znacznej aktyw¬ nosci antybiotycznej, po czym wyodrebnia sie kom¬ pleks antybiotyków w postaci kwasów lub ich far¬ maceutycznie dopuszczalnych soli.Okreslenie „kompleks antybiotyczny" stosowane w nauce o fermentacji i niniejszym opisie, nie oznacza kompleksu chemicznego lecz mieszanine wspólnie wytwarzanych poszczególnych czynników antybiotycznych.Jak wiadomo fachowcom z dziedziny wytwarza¬ nia antybiotyków metoda fermentacji, stosunek poszczególnych czynników w kompleksie antybio- tycznym moze sie zmieniac w zaleznosci od stoso¬ wanych warunków fermentacji.W zakres wynalazku wchodza takze farmaceu¬ tycznie dopuszczalne sole 20-dezoksynarasyny i 20- -dezoksy-epi-17-narasyny. Dla uproszczenia w opi¬ sie stosuje sie okreslenie „,antybiotyki tezoksynara- synowe", które dotyczy 20-dezoksynarasyny, 2-0-de- zoksy-epi-17-narasyny, a takze ich dopuszczalnych w farmacji soli.Antybiotyki dezoksynarasynowe wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku hamuja wzrost drobno¬ ustrojów patogennych dla zwierzat i roslin. Sa one srodkami przeciw kokcydiozie a ponadto zwieksza¬ ja wydajnosc przyswajania pokarmu u przezuwa¬ jacych.Kompleks antybiotyków dezoksynarasynowych, zawierajacy 20-dezoksynarasyne i 20-dezoksy-epi- -17-narasyne, otrzymuje sie podczas fermentacji w eo postaci mieszaniny. 20-dezoksynarasyne i 20-dezo- ksy-epi-17-narasyne wyodrebnia sie z kompleksu antybiotyków dezoksynarasynowych i izoluje indy¬ widualne zwiazki w sposób przedstawiony w dal¬ szej czesciopisu. * 95 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Kompleks antybiotyczny zawiera równiez male* ilosci innych czynników, które usuwa sie w proce¬ sie izolacji. Kompleks antybiotyków dezoksynara¬ synowych jest rozpuszczalny w wiekszosci rozpu¬ szczalników organicznych ale nie rozpuszcza sie w wodzie. 20-dezoksynarasyne, jeden z czynników wytwa¬ rzanych sposobem wedlug wynalazku, ma taka sa¬ ma konfiguracje absolutna j,ak narasyna. Budowa 20-dezoksynarasyny przedstawia wzór 1.Budowe 20-dezoksy-epi-17-narasyny przedstawia wzór2. • Jedna z najlepszych metod odrózniania i identy¬ fikacji narasyny (A-28086 czynnika A), 20-dezoksy- Tabela 1 Narasyna i ' 216,5 178,4 132,0 122,0 106,5 99,6 88,5 78,4 77,1 75,1 73,8 72,0 70,8 68,5 67,6 56,1 49,9 49,3 41,1 38,7 36,6 36,2 35,5 32,9 1 30,9 30,5 29,4 29,0 28,0 26,1 24,0 21,5 19,0 18,0 16,4 15,7 14,3 13,2 13,0 12,1 12,1 7,0 6,3 20-dezoksynara- syna 1 2 216,8 177,9 125,2 121,9 105,0 99,3 88,1 78,1 76,6 75,0 73,7 72,3 71,1 68,3 56,2 49,9 49,3 41,0 40,0 40,0 36,3 35,6 32,8 31,7 31,7 30,3 29,6 29,0 28,1 25,;8 23,7 21,8 18,8 17,5 16,3 15,7 14,1 13,3 13,2 12,5 12,1 ¦ 7,3 6,5 20-dezoksy-epi- -17-narasyna 3 f 218/) 177,6 I 129,2 I 125,8 [ 107,0 1 99,4 85,6 fc 78,2 77,7 f 77,0 t 73,3 1 72,6 71,1 ; 69,1 1 57,7 L 49,3 L 48,7 38,9 | 36,6 L 36,4 36,2 35,7 33,9 1 33,7 f 32,8 30,5 L 29,3 1 29,0 r 28,2 24,7 f; 23,3 21,8 21,1 r 18,4 18,2 15,8 \ 14,3 13,7 13,5 12,5 \ 12,1 7,7 6,4117 570 $ jnaraisyny i 20-dezoksy-epiHl'7-narasyny jest spek¬ trometria magnetycznego rezonansu jadrowego 13C.W tabeli 1 przedstawiono widma 13C NMR po- ^wyzszych zwiazków w postaci wolnych kwasów, wykonane w deuterochloroformie. Wartosci podane sa w ppm.Inna dobra metoda odrózniania 20-dezoksynara- -syny- od 20-dezoksy-epi-17-narasyny i od znanych czynników A-280186 jest chromatografia bibulowa i cienkowarstwowa.W tabeli 2 podano przykladowo wartosci Rf dla narasyny (A-28086 czynnik A), A-28086 czynnika Dt 20-dezoksynarasyny i 20-dezoksy-epi-17-nara- syny, uzyskane z chromatografii bibulowej w róz- .nych ukladach, z zastosowaniem do wywolywania Bacillus subtilis ATCC 6032. 10 15 polarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak heksan, oraz nierozpuszczalne- w wodzie.Nalezy jednak zwrócic uwage, ze 20-dezoksyna¬ rasyna w postaci wolnego kwasu jest nietrwala w alkoholach, ulegajac przeksztalceniu w wolny kwas 20-dezoksy-epi-,17-narasyny. Np., 435,1 mg wolnego kwasu 20-dezoksynarasyny rozpuszczano w 40 ml metanolu i pozostawiono roztwór w ciagu 4 godzin w temperaturze pokojowej, przy czyni roztwór odparowano do sucha pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc -rozpuszczono w dioksanie i zliofiiizowano. Otrzymano 417,8 mg walnego kwa¬ su 20-dezoksy-epi-17-narasyny.W kompleksie dezoksynarasynowym znajduje sie równiez inna substancja, odpowiadajaca chromato¬ graficznie antybiotykowi A-28086-I, opisanemu w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4038384. Cho- Tabela 2 j Uklad rozpuszczalników 1 Woda, metanol, aceton (12:3:1), j wartosc pH doprowadzona do 1 10,5 za pomoca NH4OH a na- 1 stepnie obnizona do 7,5 za po- 1 moca H3PO4 | Woda, metanol, aceton (12:3:1), wartosc pH doprowadzona do J 10,5 za pomoca NH4OH a na¬ stepnie obnizona do 7,5 za po¬ moca HC1 1% ketonu metylowoizobuty- lowego i 0,5% NH4OH w wo¬ dzie [ Benzen wysycony woda Woda, keton metylowoizobu- , tylowy, octan etylu (98:1:1) Wartosci Rf Narasyna 0.20 0,42 0,56 0,51 0,77 A-28086D 0,11 0.25 0,38 0„51 0,61 Dezoksy- narasyna 0,08 0,21 0,33 0,74 0,51 Bpidezoksy- | narasyna 0,21 • 0,44 | 0,66 | 0,55 0,68 W tabeli 3 podano wartosci RF dla tych antybio¬ tyków, uzyskane z chromatografii cienkowarstwo¬ wej na zelu krzemionkowym z zastosowaniem ty¬ powego ukladu rozwijajacego.Uklad Octan etylu Nara¬ syna 0,29 Tabe \-28036D 0,35 la 3 Dezoksy- narasyna 0,42 Epidezo- ksynara- syna 0,74 Antybiotyki dezoksynarasynowe (20-dezoksynara- ;syna i 20-dezoksy-epi-narasyna) sa rozpuszczalne w wielu rozpuszczalnikach organicznych, takich np. jak metanol, etanol, dwumetylofonmamid,, dwu- metylosulfotlenek, octan etylu, chloroform, aceton :i benzen, ale nie wiele tylko rozpuszczalne w nie- 50 55 60 65 ciaz substancja ta wytraca sie poczatkowo razem z antybiotykami dezoksynarasynowymi, to latwo ja mozna oddzielic droga chromatografii na zelu krze¬ mionkowym.Na chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym substancja ta jest mniej polarna niz zarówno 20-dezoksynarasyna jak i 20-dezaksy- -epi-17-dezoksynarasyna, podczas rozwijania octa¬ nem etylu. Do wywolywania sluzyc moze odczyn¬ nik wanilinowy, czyli 3% roztwór waniliny w me¬ tanolu z dodatkiem 0,5 ml stezonego kwasu siar¬ kowego na 100 min roztworu.Po spryskaniu roztworem waniliny i ogrzaniu substancja ta, podobnie jak A-28086-I, daje nie¬ bieska plamke, podczas gdy antybiotyki dezoksy¬ narasynowe daja jasnozólte plamki, pózniej ciem¬ niejsze. 20-dezoksynarasyna i 20-dezoksy-epi-17-narasy- na sa zdolne do tworzenia soli. Farmaceutycznie dopuszczalne sole 20-dezolksynarasyny i 20-dezoksy-117 570 8 •epi-17-narasyny z metalaimi alkalicznymi i meta¬ lami ziem alkalicznych oraz z aminami sa równiez wytwarzane sposobem wedlug wynalazku.Okreslenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole" dotyczy takich Soli, których toksycznosc w stosun- 5 icu do zwierzat cieplokrwistych nie jest wieksza od toksycznosci wolnych zwiazków. Reprezentatywny¬ mi i odpowiednimi solami 20-dezoksynarasyny i 20- -dezoksy-epi-17-narasyny z metalami alkalicznymi i metalami ziem alkalicznych sa takie, jak sodowa, 10 potasowa, litowa, cezowa, rubidowa, barowa, wap¬ niowa i magnezowa.Odpowiednimi solami 20-dezoksynarasyny i 20- -dezoksy-epi-17-narasyny z aminami sa sole amo¬ niowe, pierwszo-, dTugo- i trzeciorzedowe alkilo- 15 amoniowe o 1-4 atomach wegla oraz hydroksyal- kiloamoniowe o 2-4 atomach wegla w grupie alki¬ lowej. Przykladowo sa to sole z wodorotlenkiem amonowym, metyloamina, Il-rz.-butyloamina, izo- propyloamina, dwuetyloamina, dwuizopropyloami- ao na, etanoloamina, trójetyloamina, 3-atninopropano- lem-1 i podobne.Kationowe sole 20-dezoksynarasyny i 20-dezoksy- -epi-17-narasyny z metalami alkalicznymi i meta¬ lami ziem alkalicznych wytwarza sie ogólnie przy- 25 jetem sposobem dla otrzymywania soli kationo¬ wych. Przykladowo, wolny kwas antybiotyku roz¬ puszcza sie w odpowiednim rozpuszczalniku, takim .jak aceton lub mieszanina dioksanu i wody, i do¬ daje roztwór zawierajacy stechiometryczna ilosc 30 •zadanej zasady nieorganicznej. Otrzymana sól wy¬ odrebnia sie znanymi sposobami, takimi jak sacze¬ nie lub odparowanie rozpuszczalnika.Sole z aminami organicznymi otrzymuje sie w podobny sposób. Np., gazowa lub ciekla amine do7 35 daje sie do roztworu czynnika antybiotycznego w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak aceton, a nastepnie rozpuszczalnik i nadmiar aminy od¬ parowuje sie.Korzystnym sposobem wytwarzania zadanej soli 40 jednego z antybiotyków dezoksynarasynowych jest zastosowanie odpowiedniej metody izolacji z brzecz¬ ki, np. doprowadzenie pH do odpowiedniej warto¬ sci za pomoca odpowiedniej aminy lub dodanie odpowiedniej soli kationowej do rozpuszczalnika 45 podczas ekstrakcji.Jak powszechnie wiadomo w farmacji weteryna¬ ryjnej, postac w jakiej podaje sie zwierzeciu anty¬ biotyk nie ma znaczenia. W wiekszosci przypad¬ ków, w organizmie zwierzecia lek ulega przeksztal- 50 ceniu w postac inna niz podana. Stad tez, rodzaj . soli, w postaci której podaje sie lek,, nie ma zna- czerfia dla sposobu podawaniia. Rodzaj soli moze byc natomiast wybierany w zaleznosci od wzgle¬ dów ekonomicznych, wygody i toksycznosci. 55 Sposobem wedlug wynalazku, nowe antybiotyki wytwarza sie podczas hodowli produkujacego de- zoksynarasyne szczepu Streptomyces aureofaciens w warunkach fermentacji podpowierzchniowej z napowietrzaniem, w odpowiedniej pozywce, pro- «o wadzonej az do uzyskania znacznej ilosci antybio¬ tyku.Antybiotyki wyodrebnia sie stosujac rózne tech¬ niki izolacji i oczyszczania, zwykle stosowane i zna¬ ne wpraktyce. 'as Drobnoustrój wytwarzajacy antybiotyki dezoksy— narasynowe otrzymano droga mutacji Streptomy¬ ces aurefaciens NRRL 80fl(2 za pomoca N-metylo— -N'-nitro-N-nitrozoguanidyny. Podstawy zaklasyfi¬ kowania S. aureofaciens NRRL 8092 jako szczepu Streptomyces aureofaciens Duggar zostaly opisane- w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4038384.Hodowla szczepu Streptomyces aureofaciens pro¬ dukujacego antybiotyki dezoksynarasynowe zostala, zdeponowana w kolekcji szczepów w Northern Re- gional Research Center, U. S. Dept. of Agriculture,, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois^ 61604, gdzie jest ogólnie dostepna pod numerem NRRL 11181.Hodowla, która zidentyfikowano jako NRRL 11181 zostala wyodrebniona i otrzymana droga mutacji hodowli Streptomyces aureofaciens wyizolowanej z próbek ziemi z Góry Ararat w Turcji. Oryginal¬ na próbke ziemi hoduje sie na plytkach agaro¬ wych. Usuwa sie pojedyncze kolonie mikroorga¬ nizmu z powierzchni agarowych plytek otrzymujac: hodowle pochodne.Jedna z pojedynczych hodowli wyodrebnionych z hodowli oryginalnej próbki ziemi zidentyfiko¬ wano jako NRRL 5758. Te naturalnie wybrana ho¬ dowle szczepi sie ponownie na plytkach i wybiera z niej jedna kolonie. Naturalna selekcje powtarza sie osiem razy a pojedyncza kolonie dziewiatej ge¬ neracji wybiera sie do dalszej selekcji. Wyodreb¬ niona kolonie dziewiatej generacji hoduje sie na okreslonej chemicznie pozywce agarowej zawiera¬ jacej 1% galaktozy jako jedyne zródlo wegla. Za¬ wiesiny zarodników otrzymuje sie przez ultra¬ dzwiekowe mieszanie agarowej pozywki w celu usuniecia zarodników, a kawalki strzepków zmniej¬ sza sie saczac zawiesine przez bibule Whatiman nr 1. Zawiesina zarodników wzrasta przez 72 go¬ dziny w temperaturze 30°C w cieklej komplekso¬ wej pozywce, której pH doprowadza sie do war¬ tosci 8,8 zawierajacej N-imetylo-N'-nitro-N-nitrozo- guanidyne. Wzrastajaca na pozywce hodowle zbie¬ ra sie i homogenizuje w rozcieraczu tkanek. Ho¬ mogenizowana hodowle rozciencza sie, szczepi na agarowych plytkach i inkubuje w temperaturze 30°C az pojedyncze kolonie beda dostrzegalne.Jedna z pojedynczych wybranych kolonii stosuje sie do rozpoczecia nowej hodowli zidentyfikowanej jako NRRL 8092. Hodowla zidentyfikowana jako NRRL 8092 wzrasta w chemicznie okreslonej po¬ zywce agarowej z glukoza jako jedynym zródlem wegla. Zawiesine zawierajaca zarodniki i kawalki strzepków otrzymuje sie przez ultradzwiekowe mieszanie pozywki. Mieszana zawiesine zarodni¬ ków i strzepków poddaje sie dzialaniu 2 mg/ml N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguoanidyny w komple¬ ksowej cieklej pozywce na wstrzasarce przy pH o wartosci 8,8, przez 96 godzin w temperaturze 30°C.Nastepnie zbiera sie hodowle, homogenizuje i szczepi na plytkach jak opisano wyzej. Jedna z pojedynczych kolonii wybrana z agarowych ply¬ tek hoduje sie otrzymujac hodowle zidentyfiko¬ wana jako NRRL 11181.Na podstawie niniejszego wynalazku mozna uzy¬ skiwac dalsze szczepy o takich samych zdolno—117 5 9 sciach biosyntetycznyoh jak S, auretfacieos NRRL 11181 (to znaczy zdolnosci do wytwarzania 20-dezor ksynarasyny i 20-dezoksy-epi-17-narasyny) podda¬ jac S. aureofaciens NRRL 5758, NRRL 8092 lub NRRL 11181 procesowi mutowania. 5 Chociaz dla otrzymania S. aureofaciens NRRL 11181 zastosowano N-metylo-N'-nitro-N-nitrozogua- nidyne, to w celu wywolania podobnej mutagenezy mozna stosowac inne znane czynniki mutagenne, takie jak promieniowanie ultrafioletowe, promie- 10 niowanie rentgenowskie, fale o wysokiej czestotli¬ wosci,, promieniowanie radioaktywne lub czynniki chemiczne. W zwiazku z tym, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kompleksu antybiotków de^ zoksynarasynowyoh, polegajacego na hodowaniu 15 Streptomyces aureofaciens o praktycznie takich sa¬ mych zdolnosciach biosyntetycznych jak NRRL 11181.Jako pozywke hodowlana dla wzrostu Strepto¬ myces aureofaciens NRRL 1181 mozna stosowac 29 dowolna z wielu znanych. Ze wzgledów ekonomicz¬ nych oraz uzyskania optymalnej wydajnosci i z uwagi na latwosc izolowania produktu, korzyst¬ ne sa jednak niektóre pozywki. Np., korzystnym zródlem weglowodanów podczas fermentacji w du- 25 zej skali jest dekstryna z tapioki i sacharoza, cho¬ ciaz mozna równiez stosowac glukoze, skrobie ku¬ kurydziana, fruktoze, mannoze, maltoze, laktoze i podobne substancje.Innymi uzytecznymi zródlami wegla sa oleje, » 30 takie jak kukurydziany, arachidowy, olejowy lub rybny.Korzystnym zródlem azotu jest enzymatyczny hydrolizat kazeiny, mozna jednak stosowac rów¬ niez peptony„ make sojowa, maczke z nasion ba- 35 welny oraz aminokwasy, takie jak kwas glutami¬ nowy, a takze podobne substancje. Do odzywczych soli nieorganicznych, stosowanych w pozywkach, naleza zwykle rozpuszczalne sole, zawierajace jo¬ ny sodu, magnezu, wapnia, amoniowe, chlorkowe, 40 weglanowe, siarczanowe, azotanowe i podobne.W skladzie pozywki powinny takze znajdowac sie pierwiastki sladowe, niezbedne dla wzrostu i rozwoju drobnoustroju. Takie sladowe pierwiast¬ ki zwykle wystepuja jako zanieczyszczenia innych 45 skladników pozywki w ilosciach zaspokajajacych wymagania wzrostowe drobnoustroju.Podczas fermentacji w duzej skali moze zacho¬ dzic koniecznosc dodawania malych ilosci, rzedu <02 ml/l, srodka przeciwpiermego, takiego jak glikol 50 polipropylenowy.Jakkolwiek nie ma to zasadniczego znaczenia, wytwarzanie antybiotyku jest zwiekszane przez do¬ danie malej ilosci oleju, takiego jak olej sojowy.,W celu wytwarzania znacznych ilosci antybioty- \ 55 ków dezoksynarasynowych korzystne jest stosowa¬ nie podpowierzchniowej fermentacji z napowietrza¬ niem, w fermentorach. Mniejsze ilosci mozna otrzy¬ mywac stosujac hodowle w kolbach na trzesaw- kach. / 60 Ze wzgledu na opóznienie w czasie rozpoczecia wytwarzania antybiotyku, zwiazane zwykle z za¬ szczepianiem duzych fermentorow zarodnikujaca postacia drobnoustroju, korzystne jest stosowanie inokulum wegetatywnego. 55 U Wegetatywne inokulum przygotowuje sie przez zaszczepienie malej objetosci pozywki zarodniku¬ jaca postacia lub fragmentami grzybni drobno¬ ustroju, otrzymujac swieza wzrostowa hodowle drobnoustroju. Tak przygotowane inokulum wege¬ tatywne przenosi sie nastepnie do wiekszego fer- mentora. W hodowli inokulum wegetatywnego moz¬ na stosowac pozywke taka sama jaka stosuje sie w fermentorach lub inna.Drobnoustrój produkujacy dezoksynarasyny wzrasta w temperaturze od okolo 20°C do okolo 40°C. Optymalne wytwarzanie dezoksynarasyn za¬ chodzi w temperaturze okolo 27—30°C.Jak to zwykle ma miejsce podczas fermentacji podpowierzchniowej z napowietrzaniem, przez po¬ zywke przepuszcza sie jalowe powietrze.Dla uzyskania dobrego wzrostu drobnoustroju w fermentorze, objetosci przepuszczanego powietrza wynosi korzystnie powyzej 0,1 objetosci na objetosc pozywki.Dla uzyskania wydajnej produkcji antybiotyku w fermentorze, objetosc przepuszczanego powietrza wynosi korzystnie powyzej 0,25 objetosci na obje¬ tosc pozywki, na jedna minute. Wyzszy poziom rozpuszczonego tlenu nie hamuje wytwarzania an¬ tybiotyku.Przebieg produkcji antybiotyków podczas fer¬ mentacji moze byc kontrolowany. W tym celu poT * biera sie próbki brzeczki lub ekstraktów grzybni i oznacza aktywnosc antybiotyczna wobec drobno¬ ustroju, o którym wiadomo,, ze jest wrazliwy na te antybiotyki.Jednym z drobnoustrojów uzytecznych do testo¬ wania antybiotyków wytwarzanych sposobem we¬ dlug wynalazku jest Bacillus subtilis ATCC 6633.Do oznaczen biologicznych stosuje sie technike krazków bibulowych na plytkach z agarem.Inna dogodna metoda kontroli wytwarzania an¬ tybiotyku jest metoda turbidometryczn^a za pomoca pólautomatycznego urzadzenia do oznaczen mikro¬ biologicznych „„Autoturb", opisanego przez N. R. Ku- zela'a i F.W. Kavanaugh'a w J. Pharmaceut. Sci., 60, (5), 764 i 767 (1971).Podczas oznaczania antybiotyków dezoksynarasy¬ nowych stosowano nastepujace warunki: Staphy- lococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314, pozywka o pH 7, inkubowanie w ciagu czterech godzin w temperaturze 37°C. Jako standard w urzadzeniu „Autoturb" stosowano A-28086, czynnik A, w ste¬ zeniach 1, 3, 3, 4 i 5 inkg/ml.Poczatkowa wartosc pH przed zaszczepieniem zalezy od stosowanej pozywki. Wartosc pH powin¬ na na ogól wynosic 6,0—7,5. Wartosc pH po zakon¬ czeniu fermentacji jest na ogól nieco wyzsza i wy¬ nosi 6,5—8,0.Aktywnosc antybiotyczna wykrywa sie zwykle w drugim dniu fermentacji. Maksymalne wytwa¬ rzanie antybiotyku zachodzi zwykle pomiedzy oko¬ lo czwartym i dziesiatym dniem* Opisane uprzednio antybiotyki dezoksynarasyno- we, otrzymane w procesie fermentacji podpo¬ wierzchniowej z napowietrzaniem, wyodrebnia sie z brzeczki fermentacyjnej za pomoca zwykle stoso¬ wanych w tej dziedzinie sposobów.Antybiotyki wytworzone w procesie fenmentacji117 570 11 12 znajduja sie zaTÓwno w grzybni jak i w przesa¬ czonej brzeczce. Najwyzsza wydajnosc wyodrebnia¬ nia uzyskuje sie wiec stosujac kombinacje róznych sposobów, takich jak saczenie, ekstrakcja i chro¬ matografia adsorpcyjna.Korzystnym rozpuszczalnikiem do oddzielania antybiotyków dezoksynarasynowych, zarówno z ca¬ lej jak i z przesaczonej brzeczki fermentacyjnej, jest octan etylu, chociaz inne zwykle stosowane rozpuszczalniki daja takze zadowalajace wyniki.Specjalnie korzystna metoda wydzielania anty¬ biotyków dezoksynarasynowych jest obnizenie wartosci pH calej brzeczki fermentacyjnej do oko¬ lo 3,0. Przy tej wartosci pH antybiotyki dezoksy¬ narasynowe oddziela sie razem z grzybnia za po¬ moca saczenia. Metoda ta zostala opisana dla wy¬ odrebniania pokrewnych antybiotyków, a miano¬ wicie A-28086, czynników A, B i D oraz salino- mycyny, przez Boeck'a i Berg'a w opisie paten¬ towym St. Zjedn. Aim. nr 4009262.W innej korzystnej odmianie, metoda ta polega na dodaniu do calej brzeczki wodoroweglanu, ta¬ kiego np. jak wodoroweglan sodowy, w ilosci oko¬ lo 1 g/litr. W tym przypadku, antybiotyki dezo¬ ksynarasynowe oddziela sie z grzybni w postaci soli.Dla wyodrebniania antybiotyków z grzybni ko¬ rzystnym rozpuszczalnikiem jest metanol, mozna jednaik stosowac inne nizsze alkohole i ketony.W procesie wyodrebniania antybiotyków dezo¬ ksynarasynowych mozna równiez stosowac z [po¬ wodzeniem destylacje azeotropowa. W tym przy¬ padku, do wodnej zawiesiny brzeczki fermentacyj¬ nej dodaje sie rozpuszczalnik organiczny tworzacy z woda mieszanine azeotropowa. Mieszanine pod¬ daje sie destylacji azeotropowej, w celu usuniecia co najmniej polowy objetosci wody z brzeczki.Otrzymuje sie mieszanine wodno-organiczna, w któ¬ rej antybiotyki dezoksynarasynowe znajduja sie w roztworze w rozpuszczalniku organicznym. Nie¬ rozpuszczalne produkty uboczne oddziela sie za po¬ moca saczenia lufo wirowania.Nastepnie antybiotyki dezoksynarasynowe wy¬ odrebnia sie z roztworu organicznego za pomoca znanych sposobów, takich ja!k odparowanie roz¬ puszczalnika, wytracanie za pomoca nie-rrozpusz- czalnika lub ekstrakcja.Przykladem rozpuszczalników organicznych two¬ rzacych mieszaniny azeotropowe z woda i stosowa¬ nych w procesie izolacji, sa takie, jak alkohol bu¬ tylowy, alkohol amylowy ,alkohol heksylowy, al¬ kohol benzylowy, octan butylu, octan amylu, 1,2- dwuchloroetan, pentanon-3, heksanon-2, benzen, cykloheksanom toluen, ksyleny i podobne.Metoda oparta na destylacji azeotropowej jest szczególnie korzystna w procesie prowadzonym w fermentorach w duzej skali. Zarówno woda jak i rozpuszczalnik oddestylowywane azeotropowo, moga byc odzielane za pomoca znanych sposobów i zawracane do powtórnego uzytku. Otrzymana w taki sposób woda nie zawiera zanieczyszczen i nie wymaga zabiegów oczyszczajacych.Dalsze oczyszczanie antybiotyków dezoksynara¬ synowych polega na dodatkowych zabiegach eks¬ trakcyjnych i adsorpcyjnych. Jako materialy ad- sorpcyjne mozna stosowac zel krzemionkowy, we¬ giel, Florisil (krzemian magnezowy produkcji fir¬ my Floridin Co., P.O.Box 989, Tallahassee, Fla.)- i podobne. 5 Alternatywnie ,stale skladniki brzeczki, w tym- skladniki pozywki i grzybnie, mozna stosowac bez. ekstrahowania lub wyodrebniania, ale korzystnie- po usunieciu wody, jako zródlo kompleksu anty¬ biotyków dezoksynarasynowych. Np., po zakoncze- io niu fermentacji brzeczke suszy sie droga liofiliza¬ cji lub suszenia w suszarni bebnowej i nastepnie, dodaje bezposrednio do mieszanek paszowych.W innym przypadku, po zakonczeniu fermentacji grzybnie oddziela sie i suszy, otrzymujac produkt,, 15 który mozna stosowac bezposrednio do mieszanek, paszowych. Podczas oddzielania grzybni przeznaczo¬ nej do powyzszego celu, dodatek Okolo 10 g/l we¬ glanu wapniowego ulatwia saczenie i pozwala na. otrzymywanie lepszego suchego produktu. 20 Stosujac opisane powyzej warunki, z hodowli: szczepu Streptomyces aureofaciens oznaczonego nu¬ merem NRRL 11181 otrzymuje sie jako glówne czynniki 20-dezoksynarasyne i 20-dezoksy-epi-17- -narasyne. Z hodowli S. aureofaciens NRRL 11181 25 izoluje sie takze inne czynniki ale w ilosciach zbyt malych by mozna je bylo zidentyfikowac i scha¬ rakteryzowac.Chociaz stosunek wzajemny poszczególnych czyn¬ ników zalezy od stosowanych warunków fermenta- 30 cji i izolacji, to -na ogól izoluje sie wiecej 20-dezo- ksy-epi-17-narasyny niz 20-dezoksynairasyny. 20-dezoksynarasyne i 20-dezoksy-epi-17-narasyne rozdziela sie i wydziela w postaci indywidualnych zwiazków za pomoca znanych metod, takich jak 35 chromatografia kolumnowa, chromatografia cien¬ kowarstwowa, rozdzial przeciwpradowy i podobne.Np., do rozdzialuj i20-dezoksynarasyny i ao-dezoksy- -epi-17-narasyny stosuje sie chromatografie kolum¬ nowa na zelu krzemionkowym i rózne mieszaniny 40 rozpuszczalników. Stosujac np. kolumne z zelem krzemionkowym i mieszanine benzenu i octanu etylu, eluuje sie najpierw 20-dezoksy-epi-17-nara- syne, a nastepnie 20-dezoksynarasyine. Przebieg; rozdzialu mozna sledzic stosujac chromatografie 45 cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym i 100% octan etylu jako rozpuszczalnik.Antybiotyki dezoksynarasynowe wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku sa czynnikami przeciw- bakteryjnymi. Np. wzgledna aktywnosc biologiczna wolnego kwasu 20-dezoksy-epi-<17-narasyny zostala przedstawiona w tablicy 4. Do oznaczen stosowano zwykla metode krazkowa dyfuzji w agar.Antybiotyki dezoksynarasynowe hamuja miedzy 55 innymi wzrost bakterii beztlenowych. Najmniejsze stezenia hamujace (MIC), przy których 20-dezoksy- -epi-17-narasyna (wolny kwas) hamuje wzrost róz¬ nych bakterii beztlenowych, podane sa w tabeli 5..Oznaczenia wykonywano stosujac standardowa me- 60 tode rozcienczeniowa na agarze, odczytujac wyniki; po uplywie 24 godzin inkubowania.Innym aspektem aktywnosci antybiotyków dezo¬ ksynarasynowych jest aktywnosc wobec szczepów Mycoplasma. Gatunek Mycyplasma, znany takze 65 pod nazwa drobnoustrojów wywolujacych zapale- 50117 570 13 Tabela 4 14 1 Drobnoustrój testowy 1 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus | 3074^ Staphylococcus aureus 3130 2 1 Streptococcus pyogenes (Grupa A) Streptococcus sp.(Grupa D) Diplococcus pneumo- niae Strefa zahamowania (mm) 300 mkg/ /krazek 16,9 19,5 19,0 12,0 17,0 16,0 30 mkg/ /krazek 13,8 15,4 1 17,2 10,0 14,6 13,0 1 oporny na penicyline G 2 oporny na. smetycyline.Tabela 5 J Bakteria beztlenowa 1 Actinomyces israelii W855 I lClostridium perfringens 81 Clostridium septicum 1128 1 Eubacterium aerofaciens T23'5 Peptococcus asaccharolyticus 1302 Peptococcus prevoti 1281 1 Peptostreptococcus intermedius j 1264 Peptostreptococcus anaerobius 1428 Propionibacterium acnes 79 Bacteroides fragilis llll MIC dmkg/ml) 8 16 16 16 8 4 4 4 2 | 128 1 nia oplucnej i pluc (PPLO), jest patogenny dla lu¬ dzi i róznych zwierzat.Czynniki aktywne przeciw drobnoustrojom PPLO sa szczególnie poszukiwane przez przemysl drobiar¬ ski. Najmniejsze stezenie hamujace (MIC) 20-dezo- ksy-epi-17-narasyny (wolny kwas) wobec róznych przykladowych gatunków Mycoplasma podane sa w tablicy 6. Oznaczenia wykonywano in vitro, sto¬ sujac metode rozcienczania brzeczki.Tabela 6 10 25 30 35 Drobnoustrój M. gallisepticum M. hyorhinis M. synoviae MIC (mkg/ml) 25,0 50,0 50,0 45 50 55 60 Antybiotyki dezoksynarasynowe sa takze czyn¬ nikami przeciwwirusowymi. Np., 20-dezoksy-epi- -17-narasyna wykazuje aktywnosc wobec wirusa kataru typu 3, wirusa ospy krowiej, wirusa opry- szczki i wirusa A grupy, co zostalo stwierdzone w tescie na hamowanie powstawania lysinek (in vi- tro), podobnym do opisanego przez Skninoifa w Applied Microbiology, 9 (1), 66—72 (1961).Antybiotyki dezoksynarasynowe moga wiec byc podawane doustnie, miejscowo lub pozajelitowo ssakom, w celu zwalczania wirusów. Dawka sto¬ sowana do zapobiegania lub zwalczania chorób wi¬ rusowych wynosi od okolo 1 do okolo 5 mg/kg cie¬ zaru ciala ssaka i zalezy od typu wirusa i od tego czy lek podawany jest zapobiegawczo czy terapeu¬ tycznie.Ponadto, roztwory zawierajace antybiotyk dezo- ksynarasynowy, korzystnie razem ze srodkiem po¬ wierzchniowo czynnym, moga byc stosowane do odkazania in vitro miejsca wystepowania wirusów, takich jak wirus choroby Heinego-Medina lub wi¬ rus opryszczki. Do zwlaczania wirusów stosuje sie roztwory zawierajace od okolo 1 do okolo 1500 mkg/ml antybiotyku dezoksynarasynowego.Ostre toksycznosci 20-dezoksy-epi-17-narasyny (wolnego kwasu) i 20-dezoksynarasyny (soli sodo¬ wej), wyrazone jako LD50, wynosza przy podawa¬ niu dootrzewnowym myszom odpowiednio 201 mg/ /kg i 5 mg/kg.Cenna wlasciwoscia antybiotyków dezoksynara- synowych wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku jest ich aktywnosc przeciwko kokcydiozie.Badania in vitro wykazuja np., ze 2i0'-dezoksynara- syna (sól sodowa)- i 20-dezoksy-epi-17-narasyna (wolny ikwas) sa aktywne w tak niskim stezeniu jak 0,2 ppm wobec Eimeria Tenella, drobnoustroju pierwotniakowego ,najbardziej zwiazanego z kokcy- dioza.Doswiadczenia z dodawaniem do pozywienia przeprowadzane na mlodych kurczetach potwier¬ dzaja, ze antybiotyki dezoksynarasynowe wykazuja in vitro aktywnosc wobec kokcydiozie. W doswiad¬ czeniu tym, dodawanie 100 ppm soli sodowej 20- -dezoksynarasyny do diety kurczat zakazonych Ei¬ meria tenell, chronilo je przed smiercia, zwieksza¬ lo przyrost wagi i zmniejszalo ilosc zmian choro¬ bowych. Wyniki powyzszego testu zestawiono w tabeli 7.W celu zapobiegania lub leczenia koksydiozy Tabela 7 Próba 1 1 Zakazona grupa kontrolna 1 Grupa, której po¬ dano 100 ppm 20 de- zoksyna- rasyny % smiertel¬ nosci 37,5 0 Przyrost ciezaru w g. 114 185 Wielkosc zimian 1 chorobo¬ wych 2 1 4,00 0,13 1 W kazdej próbie stosowano dwie klatki zawiera¬ jace po cztery kurczeta. 65 2 Maksymalne mozliwe zmiany przyjeto za 4,00.117 570 15 16 u drobiu, ptakom podaje sie skuteczna dawke an¬ tybiotyku dezoksynarasynowego, korzystnie doust¬ nie. Antybiotyk dezoksynarasynowy mozna poda¬ wac róznymi sposobami dla najlepiej z dopuszczal¬ nym fizjologicznie nosnikiem, korzystnie z karma przyswajana przez ptaki.W celu ustalenia odpowiedniego stezenia antybio¬ tyku dezoksynarasynowego nalezy rozwazyc wiele czynników, na ogól jednak podawana ilosc powin¬ na wynosic 0,003^-0,03% wagowych w stosunku do pokarmu, korzystnie 0,004—0,02%.Mieszanka pokarmowa przeciw kokcydiozie za¬ wiera karme dla drobiu i od okolo 35 do okolo 180 g/tone antybiotyku dezoksynarasynowego.Zdolnosc poprawiania stopnia wykorzystania po¬ karmu przez zwierzeta jest inna, cenna wlasciwo¬ scia antybiotyków dezoksynarasynowyeh. Np., an¬ tybiotyki dezoksynarasynowe poprawiaja stopien przyswajania pokarmu u przezuwajacych, które posiadaja rozwinieta funkcje zwacza.Jak wspomniano uprzednio, stopien przyswaja¬ nia weglowodanów u przezuwajacych moze byc zwiekszany w wyniku dzialania stymulujacego flo¬ re w zwaczu zwierzecia w kierunku wytwarzania propionianów zamiast octanów lub maslanów. Sto¬ pien wykorzystania pokarmu moze byc sledzony droga obserwowania wytwarzania i stezenia pro¬ pionianów w plynie ze zwacza, zgodnie z metoda podana w opisie patentowym St.Zjedn. Am. nr 4038384.W tabeli 8 podano wyniki testów in vitro, któ¬ rym podano sól sodowa 20-dezoksynarasyny i 20- -dezoksy-epi-!7-narasyne (wolny kwas). W tabeli przedstawiono stosunki stezen lotnych kwasów tluszczowych (VFA) w korbkach poddanych dziala¬ niu antybiotyku do stezen w kolbach kontrolnych.Antybiotyki dezoksynarasynowe wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuja skutecz¬ nosc w zwiekszaniu zawartosci propionianów i tym samyin stopnia wykorzystania pokarmu przy po¬ dawaniu przezuwajacym doustnie w ilosci od okolo 0,05 do okolo 5 mg/kg dziennie. Najlepsze wyniki uzyskuje sie przy podawaniu od okolo 0,1 do okolo 2^5 mg/kg dziennie. 10 15 *) 25 30 40 Korzystna metoda podawania antybiotyku jest mieszanie go z pokarmem zwierzecym, mozna jed¬ nak stosowac inny sposób podawania, np. w posta¬ ci tabletek, past, wlewów lub kapsulek.Powyzsze formy leku mozna sporzadzac stosu¬ jac znane w weterynaryjnej farmacji sposoby.Kazda indywidualna dawka jednostkowa powinna zawierac zwiazek wedlug wynalazku, w ilosci od¬ powiadajacej odpowiedniej dawce dziennej, która nalezy podac zwierzeciu.Antybiotyki dezoksynarasynowe mozna takze do¬ dawac do mieszanek paszowych przeznaczonych dó tuczenia przezuwajacych, takich jak bydlo i owce.Taka mieszanka paszowa zawiera pokarm i 1—j —30 g/tone antybiotyku dezoksynarasynowego.Czerwonka swinska jest pospolita choroba,, wy¬ stepujaca w Stanach Zjednoczonych i w innych' krajach i powodujaca na calym swiecie straty u hodowców swin. W opisie patentowym St.Zjednj Ameryki nr 3947586 podano, ze antybiotyki poli- eterowe sa uzyteczne w zapobieganiu i leczeniu czerwonki u swin.Poniewaz antybiotyki dezoksynarasynowe sa no¬ wymi antybiotykami z klasy antybiotyków polie- terowych, powinne one takze byc skuteczne w za¬ pobieganiu i leczeniu czerwonki u swin.Dla zapobiegania lub leczenia czerwonki u swin korzystne jest dodawanie skutecznej ilosci anty¬ biotyku dezoksynarasynowego do pokarmu.Antybiotyki dezoksynarasynowe " wytwarzane sposobem wedlug wynalazku powinny byc skutecz¬ ne w zapobieganiu i leczeniu czerwonki u swin przy podawaniu doustnym w dawce wynoszacej od okolo 35 do okolo 150 g/tone, sczzególnie korzystnie w dawce wynoszacej okolo 100 g/tone.Korzystna metoda podawania antybiotyku jest mieszanie go'z pokarmem zwierzecym, mozna jed¬ nak stosowac inny sposób podawanie, np. w po¬ staci tabletek, past, wlewów lub kapsulek. Kazda indywidualna dawka jednostkowa powinna zawie¬ rac zwiazek w ilosci odpowiadajacej odpowiedniej dawce dziennej, która nalezy podac zwierzeciu.Antybiotyki wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku mozna równiez) dodawac do mieszanek pa- Zwiazek 20-dezoksy-epi-17- -narasyna 20-dezoksy-epi-17- -narasyna 20-dezoksy-epi-17- narasyna 20-dezoksynarasyna 20-dezoksynarasyna 20-dezoksynarasyna Dawka mkg/ml 10 5 2 1 0,3 0,1 Tab el a 8 Stosunek stezen VFA w próbach testowych do stezen w próbach kontrolnych % molowy octanu 0,9093 0,9237 0,9581 0,8727 0,9084 0,9504 % molowy propionianu 1,2665 * 1,1836 * 1,0858 1,4597 * 1,3799 * 1,2148 % molowy maslanu 0,6560 0,8201 0,9414 0,3942 0,4582 0,6870 Calkowita ilosc VFA 1,0325 1,0487 1,0717 1,2096 1,1829 1,1892 *) Statystycznie znaczace wartosci (P. 0y0ll) wedlug testu LSD (R. G. D. Steel i J. H. Forris, „Principles and Procedures of Statistisc", McGraw-Hill, New York, N. Y., 1960, str. 106).117 570 17 18 szowych dla swin. Zawieraja one pokarm i sku- teczna ilosc antybiotyku dezoksynarasynowego.Jak wspomniano uprzednio, skuteczna ilosc wy¬ nosi w typowych przypadkach od okolo 35 do oko¬ lo 150 g antybiotyku dezoksynarasynowego na tone pokarmu.Antybiotyki dezoksynarasynowe sa czynnikami przeciwwirusowymi i wykazuja takze aktywnosc wobec bakterii beztlenowych, takich jak Clostri- dium perfringens. Nadaja sie one tym samym do zapobiegania lub zwalczania zapalenia jelit u kur¬ czat, swin, bydla i owcy, oraz do zwalczania za¬ trucia jelitowego u przezuwajacych.Niektóre zwiazki dezoksynarasynowe (20-dezo- ksynarasyna i jej sole) wykazuja zdolnosc wiaza¬ nia i przenoszenia jonów, bedac tym samym jono- forami (nosicielami jonów), patrz B. C. Pressman, Alkali Metal Ohelators — The Ionophores, w „In- organic Biochemdstory", tom 1, G. L. Eichhorn, Else- vier, 1973. Takie zwiazki mozna stosowac gdy za¬ chodzi potrzeba selektywnego usuwania poszczegól¬ nych kationów. Przykladem moze byc usuwanie i odzyskiwanie jonów srebrowych z plynów sto¬ sowanych w fotografii, usuwanie toksycznych ka¬ tionów ze scieków przed skierowaniem ich do oto¬ czenia oraz odsalania wody morsikiej.Zwiazek dezoksynarasynowy moze zostac uzyty jako jeden ze skladników elektrody jonowej (patrz O. Kedem i wsp., opis patentowy St.Zjedn.Ameryki nr 3755887).Zwiazki powyzsze zmieniaja zdolnosc przepusz¬ czania kationów przez membrany zarówno natural¬ ne jak i sztuczne. Zwiazek dezoksynarasynowy moze wiec byc skladnikiem membrany stosowanej do selektywnego przepuszczania kationów w gra¬ diencie stezenia. Jednym z potencjalnych wykorzy¬ stan tej wlasciwosci moze byc odzyskiwanie meta¬ li ciezkich i szlachetnych w skali przemyslowej (patrz E. L. Cussler, J. F. Evans i Sister M. A. Ma- tesick, Science, 172, 377 (1/71)).W innym aspekcie, 20-dezoksynarasyna i jej so¬ le wykazuja aktywnosc jako inhibitory enzymu ATP-azy. ATP-aza bedaca wrazliwym na metali alkaliczne enzymem znalezionym w membranie komórkowej, bierze udzial w procesie energetycz¬ nym koniecznym dla aktywnego transportu, któ¬ rym to terminem okresla sie serie wymagajacych energii przemian, w wyniku których plyny we¬ wnatrzkomórkowe i pozakomórkowe utrzymuja swój sklad.Inhibitory ATP-azy zmniejszaja ilosc energii po¬ trzebnej dla aktywnego przenoszenia. Testy in vitro wykazaly, ze sól sodowa 20-dezoksynarasyny ha¬ muje transport kationów przez ATP-aze w mito- chondriach watroby, a polowiczne stezenie sku¬ teczne wynosi 0,065 mkgfian. 20-dezoksynarasyna i jej sole sa takze potencjal¬ nymi czynnikami tonizujacymi serce. Np., w te¬ stach na izolowanych przedsionkach swinek mor¬ skich 20-dezoksynarasyna zwieksza kurczliwosc serca. Wyniki takiego testu sa wyrazane jako pro¬ cent maksymalnego napiecia kurczowego, jakie mo¬ ze byc wywolane przez podanie 10 ~4 mola norepi- nefryny. Sof sodowa 20-dezoksynarasyny w steze-' 10 15 25 30 35 40 45 50 55 60 niu 10~5 mola wywoluje srednio (± standardowy blad) zwiekszenie napiecia kurczowego o 43,8±1,4 (n = 4) procenta. Test ten zostal szczególowo opi¬ sany w opisie patentowym St.Zjedn.Ameryki nr 3985893.Antybiotyki wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku, sa wiec irówniez uzyteczne do wzmagania sily skurczowej miesnia sercowego u ssaków cie- plokrwistych.Sposób wzmagania sily skurczowej miesnia ser¬ cowego polega na podawaniu skutecznej ^lietok- sycznej ilosci 20-dezoksynarasyny lub jej dopusz¬ czalnej w farmacji soli. Skuteczna, nietoksyczna dawka wynosi od 30 do okolo 500 mkg/kg ciezaru ciala.Korzystna wielkosc dawki wynosi ponizej okolo 100 mkg/kg ciezaru ciala.W tym przypadku antybiotyk podaje sie pozaje- litowo, np. za pomoca wlewu dozylnego.Korzystnym sposobem (podawania jest kroplów¬ ka, podczas której antybiotyk podaje sie razem z typowym roztworem dozylnym, np. z roztworem glukozy. 20-dezoksynarasyne podaje sie korzystnie w daw¬ kach ponizej okolo 100 mkg/kg az de uzyskania pozadanego wzmocnienia sily skurczowej. Tym sa¬ mym ilosc podawanej 20^dezoksynarasyny mozna regulowac iloscia wlewu (potrzebna dla uzyskania zamierzonego efektu leczniczego.Podobnie jak podczas podawania innych czynni¬ ków inotropowych, ilosc podawanej 20-dezoksyna¬ rasyny moze byc rózna dla róznych przypadków klinicznych, w zaleznosci od indywidualnej tole¬ rancji na 20-dezoksynarasyne, rodzaju schorzenia serca, np. wielkosci uszkodzen miesnia sercowego oraz ogólnego stanu pacjenta.Sposób polegajacy na zastosowaniu dodatniego czynnika inotropowego, jakim jest 20-dezoksynara¬ syna, moze znalezc zastosowanie w róznych sytua¬ cjach klinicznych,, zaliczanych ogólnie do wstrza¬ sów serca. Nalezy do nich np. zawal miesnia ser¬ cowego, przewlekla niewydolnosc krazenia prawo- komorowa oraz pooperacyjny wstrzas serca.Przyklad I. A. Fermentacja w kolbach na wytrzasarce.Hodowle Streptomyces aureofaciens NRRL przy¬ gotowuje sie na skosach agarowych o nastepuja¬ cym skladzie.Skladnik K2,HP04 MgS04 • 7^ NH4NO3 CaCOs FeS04 • 7H20 MnCl2 • 1H£ ZnS04 • 7HzO Glukoza Agar Woda odmineralizowana Wartosc pH (bez korygowania) Ilosc 2 g 0,25 g 2 g 2,5 g 0,001 g 0,001 g 0,001 g 10 g 20 g do 1 litra 7,7 Skosy zakaza sie Streptomyces aureofaciens as NRRL 11181 i intabuje w temperaturze 30°C w cia-19 gu do 7 dni. Dojrzala hodowle na skosach pokrywa sie jalowa surowica wolowa i zdrapuje zarodniki jalowa eza. Otrzymana zawiesine zarodników i fragmentów grzybni w surowicy jalowej liofili¬ zuje sie formujac co najwyzej szesc pastylek. Jed¬ na pastylka liofilizatu stosowana jest do zaszcze¬ piania 50 ml pozywki wegetatywnej o nastepuja¬ cym skladzie.Skladnik Ilosc Glukoza 20 g Maka sojowa 15 g Wyciag namokowy kukurydzy 10 g CaC03 2 g Woda wodociagowa do 1 litra Wartosc pH skorygowana do 6,5 za pomoca 5n roztworu NaOH Zaszczepiona pozywke wegetatywna w kolbie Er- lenmeyera o pojemnosci 250 ml inkubuje sie w temperaturze 30CC w ciagu 24^8 godzin, na wy¬ trzasarce obrotowej o wychyleniu katowym 5 mm i 250 obrotach na minute.Tak otrzymane inokulum wegetatywne (50 ml) stosuje sie do zaszczepiania 250 ml jednej z naste¬ pujacych pozywek fermentacyjnych.Pozywka I: 17 570 Pozywka III: 20 Dekstryna tapiokowa 1 Hydrolizowana enzymatycznie kazeina 2 Enzymatyczny hydrolizat kazeiny 3 CaC03 MgS04 • 7HzO Melasa Rafinowany olej sojowy Woda wodociagowa Wartosc pH (bez korygowania) 60 g 6 g 2 g 2 g 0,5 g 15 g 5,0 ml/litr do 1 litra 6,6 i Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, Illinois * Ambeir EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.' N-Z Amine A, Shefield Chemical Co., Norwich, New York.Pozywka II 25 35 40 45 Skladnik Ilosc Dekstryna tapiokowa1 30 g Glukoza 15 S Hydrolizowana enzymatycznie kazeina2 3 S Enzymatyczny hydrolizat kazeiny 3 Wyciag drozdzowy CaCOs MgS04 • 7H20 Melasa Rafinowany olej sojowy Woda wodociagowa Wartosc pH (bez korygowania) 1 Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, Illinois 2 Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.* N-Z Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, NewYork. 65 1 g 2,5 g 2 g 1 g 5 g 5 ml/litr lo 1 litra 6,4 50 55 60 Skladnik Ilosc Maka sojowa 25 g Glukoza 20 g CaC03 2.0 g Na2S04 •10H2O i,o g Rafinowany olej sojowy 20 ml Oleinianmetylu 20 ml FeS04 •7H2Q 0,6 g MnCl2 •4H20 0.3 g Kwas askorbinowy 0,018 g Woda odmineralizowana do 1 litra Wartosc pH (bez korygowania) 6,5 Fermentacje prowadzi sie w ciagu do 10 dni, w temperaturze 30°C, na wytrzasarce obrotowej o wychyleniu katowym 5 mm i przy 250 obrotach na minute. B. Fermentacja w tankach fermenta¬ cyjnych.Fermentacje w tankach fermentacyjnych prowa¬ dzi sie stosujac pozywki wegetatywne i fermenta¬ cyjne opisane w punkcie A dla fermentacji w kol,- bach. Do zaszczepienia 400 ml pozywki wegeta¬ tywnej z drugiego etapu stosuje sie 10 ml inoku¬ lum wegetatywnego. Pozywka znajduje sie w kol¬ bie Erlenmeyera o pojemnosci 2 litry. Po inkubo- waniu w ciagu 24 godzin w temperaturze 30° C, 800 ml inokulum wegetatywnego z drugiego etapu stosuje sie do zaszczepienia 1O0- litrów pozywki pro¬ dukcyjnej w fermentorze o pojemnosci 165 litrów.Wartosc pH pozywki po sterylizacji w tempera¬ turze 121°C, w ciagu 45 minut, wynosi ok. 6,8±0,1.Proces fermentacji prowadzi sie w temperaturze 30±1°C, w ciagu 10 dni, przepuszczajac jalowe po¬ wietrze w ilosci wynoszacej 0;5 objetosci na obje¬ tosc pozywki, w ciagu jednej minuty, i stosujac zwykle mieszadla o obrotach wynoszacych 300 obr/min.Przyklad II. Wyodrebnienie kompleksu anty¬ biotyków dezoksynarasynowych.Wartosc pH calosci brzeczki fermentacyjnej (4 litry) otrzymanej w sposób podany wedlug przy¬ kladu I, na pozywce II, obniza sie do 3,0 za po¬ moca stezonego kwasu solnego i calosc miesza sie w ciagu 1 godziny. Otrzymany roztwór saczy sie przez 125 g ziemi okrzemkowej (Hyflo Super-Cel, produkowanej przez Johns-Manville Corp).Oddzielona grzybnie ekstrahuje sie porcjami w mieszalniku, stosujac lacznie 2 litry metanolu za¬ wierajacego 50 g NaHC03 na litr. Ekstrakt meta¬ nolowy odparowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem do objetosci okolo 450 ml i wartosc pH do¬ prowadza do 7,5 za pomoca stezonego kwasu sol¬ nego. Otrzymany roztwór ekstrahuje sie dwukrot¬ nie 500 ml chloroformu. Polaczone ekstrakty chlo¬ roformowe suszy sie nad Na2SOl? saczy i odparo¬ wuje przesacz pod zmniejszonym cisnieniem, otrzy¬ mujac 2,0 g surowego kompleksu antybiotyków dezoksynarasynowych.Przyklad III. Rozdzial dezoksynarasyny i epi- -dezoksynarasyny. 2 g surowego kompleksu antybiotyków dezoksy¬ narasynowych z przykladu II rozpuszcza sie w mi¬ nimalnej ilosci benzenu i nanosi na kolumne o wy-117 570 21 miar.ach 1,5X22 cm z zelem krzemionkowym Merck 7729. Opis otrzymanych frakcji, stosowane rozpu¬ szczalniki oraz wydajnosci podano w przedstawio¬ nej tabeli 9.Proces rozdzialu kontrolowano z,a pomoca chro¬ matografii cienkowarstwowej, stosujac do rozwija¬ nia octan etylu. Frakcje 16-<17 zawieraly 126 mg 20-dezoksy-epi-17-narasyny. Frakcje* 18-&3 zawiera¬ ly mieszanina 20-dezoksynarasyny i 20-dezoksy-epi- 17-narasyny. 22 10 Wartosc pH calej brzeczki fermentacyjnej (95 1) doprowadza sie do 3 za pomoca kwasu solnego i calosc miesza w ciagu 1 godziny, dodaje pomoc filtracyjna (ziemia okrzemkowa Hyflo Supercel) i saczy brzeczke. Odsaczona grzybnie ekstrahuje sie dwukrotnie okolo 45 litrami acetonu zawiera¬ jacego 50 g/litr NaHC03. Polaczone ekstrakty ace¬ tonowe zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac okolo 10 litrów roztworu wodnego pH, którego doprowadza sie do wartosci 8,0 za porno- Tabela 9 1 Frakcja 1 1 2 1 3 4 5 6 1 7 8 9 10 1 U i 12 13 14 15 16 17 18 1 19 20 21 22 23 24 25 Objetosc 3,0 litry 2,0 litry 60O ml 300 ml 300 ml 900 ml 2,0 litry 300 ml 450 ml 450 ml 1,2 litra 1,2 litra 1,0 litr 1,0 litr 1,5 litra 1,5 litra 450 ml 900 ml 1.0 litr 30O ml 150 ml 150 ml 450 ml 300 ml 450 ml Rozpuszczalnik Benzen Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu, Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu ' Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Benzen-octan etylu Octan etylu Octan etylu Octan etylu Octan etylu Metanol Metanol Stosunek 100% 9:1 4:1 4:1 4:1 4:1 4:1 4:1 4:1 4:1 4: 1 4: 1 4:dl 3:1 3:1 3:1 3: 1 3: 1 3: 1 100% 100% 100% 100% 100% 100% Wydajnosc (mg) *) I 24 20 85 5 7 18 22 7 22 9 7 5 12 14 28 100 26 70 54 12 180 1 125 170 1 40 [ 1100' [ ¦ 1 Po wysuszeniu nad Na2S04, odsaczeniu i odparowa niu przesaczu do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Mieszanine 20-dezoksynarasyny i 20-dezoksy-epi- -17-narasyny, otrzymana z frakcji 18-23, poddaje sie chromatografii cienkowarstwowej na plytkach preparatywnych, stosujac do rozwijania octan etylu.Dwie porcje mieszaniny, odpowiednio 105 mg i 130 mg, rozpuszcza sie w malej ilosci chlorku metylenu i umieszcza na dwóch plytkach preparatywnych Mercka. Po rozwinieciu plytek rozdzielane substan¬ cje obserwuje sie w swietle nadfioletowym. Kazda z powierzchni reprezentujacych dwie rozdzielane substancje usuwa sie z plytek i ekstr.ahuje miesza- - nina 1 : 1 metanolu i chlorku metylenu.W stosowanym ukladzie skladnikiem wolniej we¬ drujacym jest dezoksynarasyna. Z plytki zawiera¬ jacej 105 mg mieszaniny odzyskuje sie 7,5 mg 20- -dezoksy-epi-17-narasyny i 27 mg dezoksynarasyny.Natomiast z plytki, na która naniesiono 130 mg mieszaniny odzyskuje sie 4,0 mg 20-dezoksy-epi-17- -narasyny i 56 mg 20-dezoksynarasyny.Przyklad IV. Inny sposób izolowania 20-de- zoksyn,arasyny. 45 55 60 65 ca 5n roztworu NHC1. Otrzymany roztwór ekstra¬ huje sie trzykrotnie polowa objetosci chlorku me¬ tylenu.Polaczone ekstrakty organiczne odparowuje sie; pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac oleista pozostalosc, która rozpuszcza sie w górnej fazie mieszaniny lfl: 7 : 1 heksanu, metanolu i wody- Roztwór ekstrahuje sie szesciokrotnie porcjami po 300 ml dolnej fazy. Polaczone ekstrakty zateza sie; pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpusz¬ cza w dioksanie i liofilizuje, otrzymujac 19,4 g; kompleksu antybiotyków dezoksynarasynowych.Kilka szarzy otrzymanych w taki sam sposób la¬ czy sie i 40 g mieszaniny rozpuszczonej w toluenie zaladowuje sie na kolumne z zelem krzemionko¬ wym w chromatografie cieczowym (Waters' Asso¬ ciates Prep. LC (System 500). Kolumne eluuje sie; mieszanina 9 : 1 toluenu i octanu z szybkoscia 250 ml/min, kontrolujac odbierane frakcje za pomoca, chromatografii cienkowarstwowej.Frakcje 37-52 laczy sie, zateza pod zmniejszo-117 570 23 24 nym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza w dioksa¬ nie i liofilizuje, otrzymujac 7,8 g oczyszczonego produktu bogatego w 20-dezoksynarasyne. Produkt ten poddaje sie powtórnie chromatografii w sposób podany powyzej. Pierwsze 50 frakcji eluuje sie mieszanina 9 : 1 toluenu i octanu etylu, a nastep¬ nie zmienia uklad na 100% octan etylu. Frakcje 51-53 laczy sie, odparowuje pod zmniejszonym cis¬ nieniem, pozostalosc rozpuszcza w dioksanie i lio¬ filizuje otrzymujac 1,12 g 20-dezoksynarasyny w postaci soli sodowej.Przyklad V. Otrzymywanie wolnego kwasu 20-dezoksynarasyny. 200 mg soli sodowej 20-dezoksynarasyny rozpusz¬ cza sie w 10 ml octanu etylu i otrzymany roztwór przemywa 10 ml 0„1 n kwasu solnego a nastepnie dwukrotnie 5 ml wody. Warstwe organiczna odpa¬ rowuje sie do sucha a otrzymana pozostalosc roz¬ puszcza sie w dioksanie i liofilizuje, otrzymujac 139,6 mg wolnego kwasu 20-dezoksynarasyny w po¬ staci bialego osadu. .Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kompleksu nowych anty¬ biotyków dezoksynarasynowych zawierajacego 20- -dezoksynarasyne o wzorze 1 i 20-dezoksy-epi-17- 10 20 25 -narasyne o wzorze 2 lub ich farmaceutycznie do¬ puszczalne sole, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces aureofaciens NRRL 11181, w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla we¬ glowodanów, azotu i sole nieorganiczne, w warun¬ kach fermentacji podpowiarzchniowej z napowie¬ trzaniem, az do uzyskania znacznej aktywnosci an- tybiotycznej, po czym wyodrebnia sie kompleks antybiotyków w postaci kwasów lub ich farma¬ ceutycznie dopuszczalnych soli. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze kompleks antybiotyków dezoksynarasynowych lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli wyodreb¬ nia sie z brzeczki. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze z kompleksu antybiotyków dezoksynarasynowych izoluje sie 20-dezoksynarasyne ewentualnie w po¬ staci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. 4. Sposób wedlug zastrz. Z, znamienny tym, ze z kompleksu antybiotyków dezoksynarasynowych izoluje sie 20-dezakisy-epi-17-narasyne ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, ze kompleks antybiotyków dezoksynarasyno¬ wych, 20-dezoksynarasyne lub 20-dezoksy-epi-17- -narasyne wyodrebnia sie w postaci farmaceutycz¬ nie dopuszczalnej soli.CH3 oja s~4. i T/"~" OH 0 /xr- Wzór 1 •117 570 CH, \ CH3 VY YH rt^YY^f CH3 .OH."W"3 VJvl V-\ P" /i O CH3 H Wzór 2 H,C CH, OH HOOC CH, CH3 15 fv Y i 0H 9 \ A/\ lH H i J i H V.. CH3 CH, \ CH, CH, / CH, H . OH t Wzór 3 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL