CS204037B2

CS204037B2 - Method of preparing desoxynarasine antibiotic complex

Info

Publication number: CS204037B2
Application number: CS786777A
Authority: CS
Inventors: Walter M Nakatsukasa; Gary G Marconi; Norbert Neuss; Robert L Hamill
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-10-20
Filing date: 1978-10-18
Publication date: 1981-03-31
Also published as: GR71734B; AU519966B2; NO783545L; IL55738A0; IL55738A; RO77417A; ATA750778A; FR2406639A1; PT68661A; CA1119541A; MY8500595A; US4141907A; JPS6244553B2; FI783174A; DK465978A; PH14339A; FR2406639B1; CH636903A5; IT1101615B; PL117570B1

Description

Deoxynarasinový antibiotický komplex, složený z 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu, se produkuje submerzní aerobní fermentací Streptomyces aureofaciens NRRL 11181. 20-deoxynarasin a 20-deoxy-eipi-17-narasin se mohou oddělit a izolovat chromatografií. Deoxynarasinový komplex, 20-deoxynaira;sin a 20-deoxy-epi-17-narasin jsou antibakteriální a antikokcidiální činidla a také zvyšují využitelnost potravy u prežvýkavců.

Ve veterinární medicíně je stálá potřeba nových lepších antibiotik. Tak například je stále velmi rozšířeným problémem kokcidiosa v drůbežářství. Kokcidiosa vzniká infekcí jedním nebo více druhy Eimeria nebo Isospora (například přehled viz Lund and Farr „Diseases of Poultry“, 5th ed, Biesteir and Schwarte, Eds., Iowa Statě University Press, Ames, Iowa, 1965, str. 1056—1096). Ekonomické ztráty způsobené kokcidiosou jsou velké a požadují nalezení lepších antikokcidiálních činidel.

Zlepšení růstu prežvýkavců, jako je hovězí dobytek a ovce, je jiným ekonomicky žádoucím objektem veterinární vědy. Zejména zajímavý je růst dosažený zvýšeným využitím potravy. Mechanismus pro využívání hlavní výživné části (sacharidy) potravy prežvýkavců je dobře znám. Mikroorga2 nismy v žaludku přežvýkavců degradují sacharidy na monosacharidy a pak převádějí monosacharidy na sloučeniny kyseliny pyrohroznové. Tyto se pak metabolizují mikrobiologickými postupy na асе táty, butyráty nebo propionáty, obecně nazývané jako těkavé mastné kyseliny. Pro bližší diskusi viz Leng v „Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant“, Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, str. 408—410).

Relativní využití těkavých mastných kyselin je diskutováno McCulloughem v Feedstuffs, 19, 1971, str. 19; Eskeland aj. v J. An. Sci. 33, 282 (1971); a Church aj. v „Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants“, vol. 2, 1971, str. 622 a 625. I když acetáty a butyráty jsou také využívány, propionáty se využívají s vyšším účinkem. Dále jestliže je dostupné pouze malé množství propionátu, může se u zvířat vyvinout ketosa. Výhodné sloučeniny tedy stimulují produkci vyššího poměru propionátu ze sacharidů a tím se zvyšuje jejich využití a také snižují výskyt ketosy.

20-deoxynarasin a 20-deoxy-epi-17-narasin jsou nová polyetherická antibiotika, která jsou nejblíže příbuzná známému polyetherickému antibiotiku narasinu (antibiotikum A-28086 faktor A, USA patent číslo

035 471 a 4 038 384). Struktura narasínu, navržená v těchto patentech a Occolowitzem aj. v Biomed. Mass Spectrometry 3,

272—277 (1976) byla nedávno potvrzena v práci H. Seto aj. J. Antibiotics 30 · (6) 530 až 532 (1977), je následující:

Jak uvádí H. Seto aj., narasin je blízce příbuzný salinomycinu (salinomycin = 4-demethylnarasin). Nedávno J. W. Westley aj. uvádějí nález C-17 epimerů deoxy-(O-8)-salinomycinu [J.Antibiotics 30 (7) 610 až 612 (1977]]. I když epimery deoxysalinomycinu jsou analogické epimerům deoxynarasinu podle vynálezu, není znám chemický postup, kterým by se epimery deoxynarasinu mohly připravit z epimerů deoxysalinomycinu.

Vynález se týká deoxynarasinu, antibiotického komplexu, který se skládá alespoň ze dvou individuálních faktorů, 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu. Komplex se produkuje kultivací kmenu organismu Streptomyces aureofaciens Duggar NRRRL 11181.

Výraz „antiboitický komplex“,, jak se používá v literatuře o fermentacích a v tomto patentu, neznamená, že by šlo o chemický komplex, ale o směs současně produkovaných individuálních antibiotických faktorů. Jak je známo odborníkům zabývajícím se produkcí antibiotik fermentací, je poměr individuálních faktorů produkovaných jako antibíotický komplex velmi různý a závisí na podmínkách fermentace.

Farmaceuticky vhodné soli 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu tvoří •také součást vynálezu. Pro zjednodušení diskuse je výraz „deoxynarasinová antibio tika“ pro skupinu sestávající z deoxynarasinového antibiotického komplexu, 20-deoxynarasinu, 20-deoxy-epi-17-narasinu a farmaceuticky vhodných solí 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu.

Deoxynarasinová antibiotika podle vynálezu inhibují růst organismů, které jsou patogenní pro živočichy a rostliny. Podle jednoho rysu této aktivity se mohou deoxynarasinová antibiotika použít jako· činidla proti kokcidiose. Dále deoxynarasinová antibiotika zvyšují využití potravy u přežvýkavců.

Deoxynarasinový antibíotický komplex se skládá z 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu, které se získají fermentací ve formě směsi. 20-deoxynarasin a 20-deoxy-epi-17-narasin se oddělí a izolují z komplexu ve formě individuálních sloučenin postupem popsaným dále. Deoxynarasinový komplex také obsahuje minoritní faktory, které se oddělí níže uvedeným postupem. Deoxynarazinový antibiotický komplex je rozpustný v převážné části organických rozpouštědel, ale je nerozpustný ve vodě.

29-deoxynarasin

20-deoxynarasin je jedním z faktorů podle vynálezu a má stejnou absolutní konfiguraci jako narasin. Struktura 20-deoxynarasinu je znázorněna vzorcem I,

hého faktoru podle vynálezu, je znázorněna vzorcem II.

20-deoxy-epi-17-narasin

Struktura 20-deoxy-epi-17-narasínu, dru204037

Jednou z nejlepších metod pro rozlišení narasinu (A-28086 faktor A], 20-deoxynaraslnu a 20-deoxy-epi-17-naraslnu je použití ¹³C-nukleární magnetické resonanční (NMR) spektrometrie. Tabulka I shrnuje ¹³C spektra těchto sloučenin ve formě volných kyselin. Spektra měřena v deuterovaném chloroformu (údaje v ppm).

TABULKA I

Narasin 20-deoxynarasin 20-deoxy-epi-17-narasin

216,5	216,8	218,0
178,4	177,9	177,6
132,0	125,2	129,2
122,0	121,9	125,8
106,5	105,0	107,0
99,6	99,3	99,4
88,5	88,1	85,6
78,4	78,1	78,2
77,1	76,6	77,7
75,1	75,0	77,0
73,8	73,7	73,3
72,0	72,3	72,6
70,8	71,1	71,1
68,5	68,3	69,1
67,6	56,2	57,7
56,1	49,9	49,3
49,9	49,3	48,7
49,3	41,0	38,9
41,1	40,0	36,6
38,7	38,8	36,4
36,6	36,3	36,2
36,2	35,6	35,7
35,5	32,8	33,9
32,9	31,7	33,7
30,9	31,7	32,8
30,5	30,3	30,5
29,4	29,6	29,3
29,0	29,0	29,0
28,0	28,1	28,2
26,1	25,8	24,7
24,0	23,7	23,3
21,5	21,8	21,8
19,0	18,8	21,1
18,0	17,5	18,4
16,4	16,3	18,2
15,7	15,7	15,8
14,3	14,1	14,3
13,2	13,3	13,7
13,0	13,2	13,5
12,1	12,5	12,5
12,1	12,1	12,1
7,0	7,3	7,7
6,3	6,5	6,4

Jinou dobrou metodou pro odlišení 20-deoxynarasinu od 20-deoxy-epi-17-narasinu a od známých A-28086 faktorů je papírová chromatografie .a ' chromatografie na tenké vrstvě. Například Rf hodnoty narasinu (A-28086 faktor A], A-28086 faktor D,

20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasínu v různých chromatografických systémech při chromatografií na. papíře při .použití Bacillus subtilis ATCC 6633 jakožto' detekčního organismu jsou uvedeny v tabulce II.

TABULKA II

Systémy rozpouštědel

Narasin

Rf hodnoty

EpideoxyA-28086D Deoxynarasin narasin voda : ' methanol : aceton (12 : 3 : 1) — upraveno na pH 10,5 NH4OH a pak ‘ sníženo na pH 7,5 kyselinou fosforečnou voda : methanol: aceton (12 : 3:1) — upraveno na pH 10,5 NH4OH a pak sníženo na. pH 7,5 kyselinou chlorovodíkovou

1% methylisobutylketon (MIBK), 0,5% NH4OH ve vvdě benzen nasycený vodou voda : MIBK : ethylacetát (98 : 1 : 1)

0,20	0,11	0,08	0,21
0,42	0,25	0,21	0,44
0,56	0,38	0,33	0,66
0,51	0,51	0,74	0,55
0,77	0,61	0,51	0,68

chromatografii na tenké vrstvě silikagelu jsou shr

Rf hodnoty těchto antibiotik při nuty v tabulce III.

TABULKA III

Systém rozpouštědel		Rf hodnoty	Epideoxy-
	Narasin	A-28086-A	Dtoxynarasio	narasin
ethylacetát	0,29	0,35	0,42	0,74

Deoxynarasinová antibiotika (20-deoxynairasin a 20-deoxy-epi-17-narasln) jsou rozpustná v řadě organických rozpouštědel, jako je například methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, ethylacetát, chloroform, aceton a benzen, ale jsou pouze mírně rozpustná v nepolárních organických rozpouštědlech, jako je hexan, a sou nerozpustná ve vodě. Je však třeba uvést, že 20-deoxynarasin ve formě vo-lné kyseliny je nestabilní v alkoholech a přechází na 20-deoxy-epi-17-narasin ve formě volné kyseliny. Například 20-deoxynarasin ve formě kyseliny (435,1 mg) se rozpustí v methanolu (40 ml) a nechá se stát čtyři hodiny při teplotě místnosti. Roztok se pak odpaří k suchu ve vakuu, zbytek se znovu rozpustí v dioxanu a lyofilizací se získá

417,8 mg 20-deoxy-epi-17-oarasinu ve formě kyseliny.

Spolu s komplexem deoxynarasinu je ta ké produkována další sloučenina, která je chromatograficky shodná s látkou A-28086-I, popsanou v USA patentu č. 4 038 384. I. když tato sloučenina se původně sráží s deoxyoarasiolový<mi antibiotiky, snadno se od nich oddělí chromatografií na silikagelu. Při chromatografii na tenké vrstvě silikagelu je tato sloučenina méně polární než 20-deoxynarasin- nebo 20-'deoxy-epi-17-narasin při použití ethylacetátu jako vyvíjejícího činidla. Pro detekci je vhodné vanilinové reakční činidlo (3 % vanilinu v methanolu + 0,5 ml koncentrované kyseliny sírové na 100 ml roztoku). Po postřiku vanilinem a zahřívání tato látka stejně jako A-28086-I poskytuje modrou skvrnu, zatímco deoxynarasrnová antibiotika poskytují světle žluté skvrny, .které tmavnou později.

20-deoxynarasin a 20-deoxy-epi-17-narasin jsou schopné tvořit soli. Farmaceuticky vhodné soli s alkalickými kovy, kovy alka204037 lických zemin a amoniové soli 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu tvoří také součást vynálezu. Farmaceuticky vhodnými solemi jsou soli, ve kterých toxicita sloučenin jakožto celku není větší než toxicita sloučenin ve formě volné kyseliny. Příklady vhodných solí 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu s alkalickými kovy a kovy alkalických zemin jsou soli sodné, draselné, lithné, česné, rubidné, barnaté, vápenaté a horečnaté. Vhodné amoniové soli 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu zahrnují amonné, primární, sekundární a terciární alkylamoniové soli s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylu a hydroxyalkylamoniové soli s 2 až 4 atomy uhlíku v alkylu. Příklady amoniových solí jsou ty, které se vytvoří reakcí 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu s hydroxidem amonným, methylaminem, sek.butylaminem, isopr-opylaminem, diethylaminem, diisopropylaminem, ethanolaminem, triethylaminem, 3-amino-l-propanolem apod.

Soli 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu s alkalickými kovy a kovy alkalických zemin se připravují podle běžně známých postupů používaných pro přípravu kationtových solí. Například antibiotikum ve formě volné kyseliny se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako je aceton nebo směs dioxanu a vody, a přidá se roztok obsahující stechiometrické množství požadované anorganické báze. Takto- vzniklá sůl se může izolovat běžnými metodami, jako je fi^^Iti^cíc^e nebo -odpaření rozpouštědla.

Soli vzniklé s organickými aminy se mohou připravovat obdobným způsobem. Například plynný nebo kapalný amin se může přidat k roztoku antibiotického faktoru ve vhodném roztoku rozpouštědla, jako je aceton, a rozpouštědlo a přebytek aminu se mohou odstranit odpařením.

Výhodnou metodou pro přípravu požadované soli kteréhokoli z deoxynarasinových antibiotik je vhodný předběžný výběr izolačního postupu, jako je například úprava pH fermentačního média příslušnou bází nebo přidáním příslušné soli, obsahující požadovaný kation, k extrakčnímu rozpouštědlu.

Je dobře známo z veterinární farmaceutické praxe, že forma antibiotika není sigsignifikantní, jestliže se zvířata léčí antibiotiky. V mnoha případech podmínky uvnitř zvířete mění podané léčivo na jiné formy, než jsou ty, které byly aplikovány. Soli, které mají být aplikovány, nejsou tedy rozhodující pro léčení. Jednotlivé formy solí se však vybírají z důvodů ekonomických, z - důvodů snadné tvorby nebo toxicity.

Nová antibiotika podle vynálezu se produkují kultivací kmene Streptomyces aureofaciens, produkujícího deo^^ynairasin za submerzních aerobních podmínek ve vhodném živném médiu až do vzniku dostatečného množství antibiotické aktivity. Antibiotika čisticích metod používaných v praxi.

Organismus použitý pro- přípravu deoxynarasinových antibiotik byl získán mutací Streptomyces -aureofaciens NRRL 8092, indukovanou N-methyl-N‘-nitro-N-nitrosoguanidinem. Taxonomický základ, podle kterého byl kmen S. aureofaciens NRRL 8092 klasifikován jako kmen Streptomyces aureofaciens Duggar, je popsán v USA patentu č. 4 038 384.

Kultura Streptomyces aureofaciens použitelná pro produkci deoxynarasinových antibiotik byla uložena a tvoří část zásobní sbírky kultur v Northern Regional Research Center, U. S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, ze které je veřejnosti dostupná pod označením NRRL 11181.

Kultura, která zde byla identifikována jako- NRRL 11181, byla izolována a mutována z kultury Streptomyces aureofaciens, která byla původně izolována ze vzorku půdy získané z hory Ararat v Turecku. Původní vzorek půdy byl kultivován na agarových deskách a podkultury byly získány -odebíráním jednotlivých kolonií mikroorganismu z povrchu agarové desky. Jedna izolovaná kolonie získané z kultury původní půdy byla kultura, -která byla identifikováno jako NRRL 5758.

Výše uvedená kultura, vybraná z přírodního zdroje, byla znovu kultivována na desce a z ní byla znovu vybrána jedna kolonie. Tento postup přirozené selekce byl opakován osmkrát a devátá generace jednokoloniové izolace -byla vzata pro další selekce.

Devátá generace byla pěstována na chemicky definovaném agarovém médiu s 1 % galaktosy jakožto jediným zdrojem uhlíku. Suspenze spor byla připravena ultrazvukovým rozmícháním agarového média, - aby byly spory odděleny, a hyfální fragmenty byly minimalizovány filtrací suspenze přes filtrační papír č. 1 Whatman.

Suspenze spor byla -nechána růst 72 hodin při 30 °C na komplexním kapalném médiu, jehož pH bylo upraveno na 8,8 a která obsahovala 2 mg/ml N-methyl-N‘-nitro-N-nitrosoguanidinu. Kultura rostoucí na tomto médiu byla sklizena a homogenizována v - tkáňovém drtiči.

Homogenizovaná kultura byla zředěna, nasazena na agarové desky a inkubována při 30 °C tak dlouho, až byly jednotlivé kolonie odlišitelné. Jedna z individuálních vybraných kolonií byla použita pro počátek nové kultury, která je zde identifikována jako NRRL 8092.

Kultura identifikovaná jako 8092 byla ponechána růst na definovaném agarovém médiu s glukosou jakožto jediným zdrojem uhlíku. Suspenze sestávající jak ze spor, tak z hyfálních fragmentů se připraví ultrazvukovým rozmělněním agaravého média. Suspenze spor a hyfálních fragmentů se vystaví působení 2 mg/ml N-methyl-N‘-mtro-N-mtrosoguarndinu v komplexním kapalném médiu při pH 8,8. Suspenze se

0.4037 třepe 96 hodin při 30 °C, načež se sklidí, homogenizuje a umístí na deskách agaru a zpracuje postupem popsaným výše. Jedna individuální kolonie vybraná z agarových desek byla pěstována a získala se tak kultura identifikovaná jako NRRL 11181.

Odborníkům je známo, že je nyní možno připravit další kmeny, které mají stejné biosyntetické schopnosti jako S. auireofaciens NRRL 11181 (to jest schopnost produkovat 20-deoxynarasin a 20-deoxy-epi-17-narasin) tak, že se S. aureofaciens NRRL 5758, NRRL 8092 a NRRL 11181 vystaví mutagenům. I když se N-methyl-N‘-nitro-N-nitrosoguanidin používá pro přípravu NRRL 11181, mohou se použít pro- vyvolání stejné mutagenese i jiné mutageny, jako je ultrafialové světlo, X-paprsky, vysokofrekvenční vlny, radioaktivní záření a jiná chemická činidla. Součástí vynálezu je tedy metoda produkce komplexu deoxynarasinových antibiotik, která zahrnuje kultivaci Streptomyces aureofaciens, která má stejné biosyntetické vlastnosti jako NRRL 11181.

Živné médium používané pro růst Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 může být jedno z řady známých médií. Pro- ekonomickou produkci, optimální výtěžky a snadnou izolaci produktu jsou však určitá média výhodná. Tak například výhodnými zdroji sacharidů při fermentací ve velkém jsou tapioca, dextrin a sacharosa, i když glukosa, kukuřičný škrob, fruktosa, manosa, maltosa, laktosa apod. se mohou také použít. Kukuřičný, arašídový, sójový a rybí olej jsou jinými použitelnými zdroji uhlíku. Výhodnými zdroji dusíku je kaseín hydrolyzovaný enzymy, i když jsou peptony, sójová mouka, mouka z bavlněných semen, aminokyseliny, jako je glutamová kyselina apod. rovněž použitelné. Z živných anorganických solí, které se mohou přidávat do živného média, jsou vhodné rozpustné soli schopné poskytovat sodíkový, hořčíkový, vápníkový, amoniový, chloridový, uhličitanový, síranový, dusičnanový ion.

Hlavní stopové prvky nutné pro růst a vývoj organismu mají být také obsaženy v živém médiu. Tyto- stopové prvky se běžně vyskytují jako nečistoty v jiných složkách média v množství, které je dostatečné pro dosažení růstových požadavků organismu.

Může být také nutné přidávat malá množství (například 0,2 rnl/1) protlpěnících činidel, jako je polypropylenglykol, neboť zejména při produkci ve velkém je pěnění problémem.

I když to není nutné, může -se antíbiotická produkce zvyšovat přidáváním malých množství oleje, jako je sójový olej.

Pro- produkci dostatečných množství deoxynarasinových antibiotik je výhodná submerzní aerobní fermentace v tancích. Malá množství se mohou získat v třepané kultuře v baňkách. Vzhledem k časovému zpoždění při produkci antibiotika spojenému -s očkováním velkých tanků spórovou formou organismu je výhodné -používat vegetativní očko. Vegetativní očko -se připravuje naočkováním malého objemu živného média spórovou formou nebo myceliálními fragmenty a získá se tak čerstvá aktivně rostoucí kultura organismu. Vegetativní očko- se pak přenese do velkého tanku. Médium použité pro- růst -vegetativního očka se může použít stejné, jako je očko -použité pro velkou fermentaci, ale mohou se -použít i jiná média.

Organismus produkující deoxynarasin může růst při teplotách mezi 20° a asi 40 °C. Optimální produkce deoxynarasinu se objevuje při teploách asi 27° až 30 °C.

Při aerobním submerzním postupu kultivace se -sterilní vzduch vede živným médiem. Pro účinný růst organismu je -objem vzduchu používaný při produkci v tanku s výhodou větší než 0,1 objemu vzduchu na objem živného média za minutu. Pro- účinnou antibiotickou produkci je objem vzduchu -použitý při produkci v tanku -větší -než 0,25 -objemu vzduchu, na objem živného média za minutu. Vyšší hladiny rozpuštěného kyslíku nesnižují produkci antibiotika.

Produkce antibiotik se může sledovat během fermentace testováním vzorků živného média nebo extraktů myceliálních - pevných látek na antibiotický účinek proti organismům, které jsou citlivé na antibiotika. Jedním takovým -organismem použitelným pro testování a^t:ibiotik podle vynálezu je Bacillus -subtilis ATCC 6633. Biotest se s výhodou provádí použitím metody papírových kroužků na agarových deskách.

Jinou metodou vhodnou pro sledování růstu je turbidometrický test na poloautomatickém systému (Autoturb (R) microbiological assay systém, Elanco), popsaným N. R. Kužel a F. W. Kavanaugh v J. Pharmaceut. Sci. 60 (5j, 764 a 767 (1971).

Při testování deoxynarasinových antibiotik se používají následující parametry: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 v živném médiu (pH 7) se inkubuje 4 hodiny při 37 °C. Testované vzorky a standard -se rozpustí ve směsi methanol—voda (1: 1). Standard A-28086 faktor A je přítomen v Autoturb © v koncentraci 1, 2, 3, 4 a 5 qg/ml.

Původto pH nenačkovaného živného- média je různé podle použitého média. Obecně -pH má být v rozmezí od 6,0 do 7,5. Při konci fermentace je pH mírně vyšší mezi

6,5 až 8,0).

Obecně antibíotická aktivita je detegovatelná nejdříve druhý den fermentace. Maximální produkce antibiotické aktivity se objevuje mezi -čtvrtým a desátým dnem.

Po produkci za submersních aerobních podmínek se deoxynarasinová antibiotika mohou izolovat z fermentačního média metodami běžně používanými v dosavadní praxi. Antibiotika produkovaná během fermen204037 táce vznikají jak v myceliální hmotě, tak v žinvém médiu. Maximální získání deoxynarasinových antibiotik se dosáhne tedy kombinací metod, včetně filtrace, extrakce a absorpční chromatografie. Výhodným rozpouštědlem pro izolaci deoxynarasinových antibiotik jak z celého, tak z filtrovaného média je ethylacetát, i když jsou jiná běžně použitá rozpouštědla také vhodná.

Zejména výhodnou metodou pro oddělování deoxynarasinových antibiotik je snížení pH celého fermentačního média asi na 3,0. Při tomto pH se deoxynarasinová antibiotika oddělí od hmoty mycelia filtrací. Tato metoda je popsána pro izolaci příbuzných antibiotik, A-28086 faktorů А, В a D a salinomycinu, Boeckem a Bergem v USA patentu č. 4 009 262. Jiným vhodným rysem této metody je přidání hydrogenuhličitanu, jako je například hydrogenuhličitan sodný, к úplnému médiu v množství 1 g na litr. Použitím této metody se deoxynarasinová antibiotika s výhodou oddělí od hmoty mycelia ve formě soli. Pro izolaci antibiotik z hmoty mycelia je nejvýhodnějším rozpouštědlem methanol, vhodné jsou však i jiné nižší alkoholy a ketony.

S výhodou se také může použít azeotropická destilace pro izolaci deoxynarasinových antibiotik. Při této metodě se organické rozpouštědlo, které tvoří příslušný azeotrop s vodou, přidá к vodnému fermentačnímu médiu. Tato směs rozpouštědla a živného média se podrobí azeotropické destilaci tak dlouho, aby se odstranila alespoň polovina vody z média, a získá se směs vody a rozpouštědla, ve které jsou deoxynarasinová antibiotika v roztoku organického rozpouštědla. Nerozpustné vedlejší produkty se oddělí vhodným způsobem, jako je filtrace a centrifugace. Deoxynarasinová antibiotika se mohou izolovat z organického roztoku známými postupy, jako je odpaření rozpouštědla, srážení přidáním nerozpouštědla nebo extrakce.

Organická rozpouštědla, která tvoří příslušné azeotropy s vodou tak, aby se mohl provádět příslušný izolační postup, jsou například butylalkohol, amylalkohol, hexylalkohol, benzylalkohol, butylacetát, amylacetát, 1,2-dichlorethan, 3-pentanon, 2-hexanon, benzen, cyklohexanon, toluen, xyleny apod.

Izolace azeotropickou .destilací je zejména výhodná při fermentačních postupech ve velkém. Jak voda, tak rozpouštědlo předestilované v azeotropu se může oddělit známým způsobem a pak se může recyklovat pro další použití. Takto izolovaná voda je prosta znečištěnin a nevyžaduje postupy pro čištění odpadních vod.

Další čištění deoxynarasinových antibiotik zahrnuje další extrakční a adisorpční postupy. Jako adsorpční materiál se používá silikagel, uhlí, florisil (křemičitan hořečnatý, Floridin Co., P. O. Box 989, Tallahassee Fla.) apod.

Alternativně se mohou jako zdroj komplexu deoxynarasinových antibiotik použít pevné látky kultury, včetně složek média a mycelia, přímo bez extrakce, ale s výhodou po odstranění vody. Například po produkci deoxynarasinové antibiotciké aktivity se živné médium může vysušit lyofilizací nebo v bubnu a přímo přidávat jako přísada к potravě.

Podle jiného rysu se po produkci deoxynarasinové aktivity v živném médiu může mycelium oddělit a vysušením se získá produkt, který se může přímo použít jako přísada do potravy. Při separaci mycelia pro tyto účely se přidává uhličitan vápenatý (asi 10 g/1) jakožto pomocná filtrační látka a získá se tak zlepšený vysušený produkt.

Za podmínek dosud používaných se 20-deoxynarasin a 20-deoxy-epi-17-narasin izolují jako hlavní faktory z kmene Streptomyces aureofaciens popsaného výše a označeného jako NRRL 11181. Některé minoritní faktory se také izolují z S. aureofaciens NRRL 11181 v množstvích příliš malých, aby to umožnilo charakterizaci. I když poměr faktorů je různý v závislosti na fermentačních a izolačních postupech, obecně se izoluje více 20-deoxy-epi-17-narasinu než 20-deoxynarasinu.

20-deoxynarasin a 20-deoxy-epi-17-narasin se oddělí a izolují jako individuální sloučeniny použitím dobře známých metod, jako je chromatografie na koloně, chromatografie na tenké vrstvě, protiproudné roztřepávání apod. Například chromatografie na koloně silikagelu se použije pro oddělení 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu elucí kolony různými rozpouštědly. Například použitím směsi benzen— ethylacetát na koloně silikagelu se 20-deoxy-epi-17-narasin eluuje první a 20-deoxynarasin se eluuje později. Chromatografie na tenké vrstvě silikagelu při použití 100% ethylacetátu jako rozpouštědla je vhodné pro sledování průběhu fermentace.

Deoxynarasinová antibiotika podle vynálezu jsou antibakteriální činidla. Například relativní mikrobiologická aktivita

20-deoxy-epi-17-narasinu (volná kyselinaJ je popsána v tabulce IV. Pro test byla použita disková difúzní metoda.

TABULKA IV

Testovaný organismus

Zóna inhibice (mm)

300 (ťg/disk /tg/disk

Staphylococcus aureus 3055

Staphylococcus aureus 3074¹

Staphylococcus aureus 3130²Streptoc-occus pyogenes ·(Group A) Streptococcus sp. (Group D) Diplococcus pneumoniae

16,9	13,8
19,5	15,4
19,0	17,2
12,0	10,0
17,0	14,6
16,0	13,0

ípenicillin G rezistentní ²Methicillin rezistentní

Podle jednoho rysu deoxynarasinová antibiotika inhibují růst anaerobních bakterií. Minimální inhibiční koncentrace (MIC), při které 20-deoxy-epi-17-narasin (ve formě volné kyseliny) inhibuje různé anaerobní bakterie, jak bylo stanoveno· standardním zředovacím testem, je shrnuta v tabulce V. Konečná hodnota byla stanovena po 24hodinové inkubační periodě.

TABULKA V

Anaerobní bakterie	MIC (/zg/ml)
Actinomyces israelii
W855	8
Clostridium perfringens
81	16
Clostridium septicum
1128	16
Eubacterium aerofaciens
1235	16
Peptococcus
asaccharolyticus 1302	8
Peptococcus prevoti
1281	4
Peptostreptococcus
anaerobius 1428	4
Peptostreptococcus
intermedius 1264	4
Propionibacterium acnes
79	2
Bacteroides fragilis
111	> 128

Aktivita proti .. Mycoplasma je druhým důležitým aspektem antimikrobiální aktivitydeoxynarasinových antibiotik. Druhy Mycoplasma jsou také známé jako organismy podobné pleuropneumoniím (PPLO) a jsou patogenní u lidí a různých živočichů. Činidla aktivní proti · organismům PPLO jsou zejména nutná v drůbežářství. Minimální inhibiční koncentrace · (MIC) 20-deoxy-epi-17-narasinu (volné kyseliny) proti různým druhům Mycoplasma, jak bylo stanoveno in vitro zředovacími testy, je shrnuta v tabulce VI.

TABULKA VI

Organismus MIC (jxg/ml)

M. gallisepticum25,0

M.hyorninis50,0

M. synovíae50,0

Deoxynarasinová antibiotika jsou také antivirová činidla. Například 20-deoxy-epi-17-narasin je aktivní proti rhinoviru typ 3, vaccinia viru, viru herpes a viru chřipky typu A, jak bylo prokázáno in vitro testy Microbiology 9, 66—72 (1961).

Podle jednoho rysu vynálezu se může deoxynarasinové antibiotikum aplikovat orálně nebo parenterálně savcům a dosáhne se tak kontroly virů. Použitelné dávky pro prevenci nebo· léčení virových onemocnění jsou od 1 asi do 5 mg/kg tělesné hmotnosti savce v závislosti na typu viru a na tom, zda se droga používá profylakticky nebo· terapeuticky.

Dále roztoky obsahují deoxynarasinové antibiotikum, s výhodou spolu s povrchově aktivní látkou, se mohou použít pro dekontaminaci in vitro okolí, ve kterých se viry, jako polio nebo herpes, vyskytují. Roztoky obsahující asi od 1 do asi 1500 ^g/ml deoxynarasinového· antibiotika jsou účinné pro kontrolu těchto virů.

Akutní toxicity 20-deoxy-epi-17-narasinu (volná kyselina) a 20-deoxynarasinu (Na sůl) při intraperitoneální aplikaci myším jsou v hodnotě LDso 201 mg/kg a 5 mg/kg.

Antiřkokcidiální aktivita je důležitou vlastností deoxynarasinových antibiotik podle vynálezu. Například in vitro pokusy ukazují, že 20-deoxynarasin (Na sůl) a 20-deoxy-epi-17-narasin · (volná kyselina) jsou · aktivní vůči Eimeiria tenella, prvokem, který je nejvíce spojen s kokcidiosou, a to v množství 0,2 ppm.

Pokusy s krmením mladých kuřat potvrzují, že deoxynarasinová antibiotika mají antikokcidiální účinek in vivo. Při těchto pokusech 20-deoxynarasin (Na sůl) aplikovaný v množství 100 ppm v potravě kuřat

TABULKA VII vystavených Eimeria tenella preventivně za- sledky těchto testů jsou shrnuty v tabulce braňuje mortalitě, zlepšuje hmotnostní pří- VII.

růstky a snižuje počet zranění u kuřat. VýOšetření¹) % mortality infikované kontroly 37,5

20-deoxynarasin (100 ppm) 0 dvě klece po 4 kuřatech na každé ošetření ²) maximálně možný počet = 4,00.

Hmotnostní přírůstek (g)

114

185

Počet zranění²)

4,00

0,13

Pro prevenci nebo léčení kokcidiosy u drůbeže se účinné antikokcidiální množství deoxynarasinového antibiotika aplikuje ptákům, is výhodou orálně, a to denně. Deoxynarasinové antibiotikum se může dodávat mnoha způsoby, ale nejvýhodnější je aplikace spolu s fyziologicky vhodným nosičem, s výhodou s potravou ptáků. I když se musí brát v úvahu řada faktorů pro stanovení příslušné koncentrace deoxynarasinového antibiotika, je průměr aplikovaného množství v rozmezí 0,003 do 0,03 % hmotnostních potravy a s výhodou se používá 0,004 až 0,02

Vynález se také týká antikokcidiální směsi krmivá pro drůbež, obsahující krmivo pro drůbež spolu s 35 až 180 g deoxynarasinového antibiotika na tunu krmivá.

Schopnost zlepšeného využití krmivá u savců je jiným důležitým rysem deoxynara sinových antibiotik. Například deoxynarasinová antibiotika zlepšují využití krmivá u prežvýkavců.

Jak bylo uvedeno výše, účinnost využití sacharidů u prežvýkavců se zvyšuje ošetřením, které stimuluje flóru přežvýkavého žaludku tak, že produkuje spíše propionátové sloučeniny než acetátové nebo biltyrátové sloučeniny. Účinnost využití krmivá se sleduje produkcí a koncentrací propionátových sloučenin v kapalině přežvýkavého žaludku za použití metod popsaných v USA patentu 4 038 384.

Výsledky in vitro testů s 20-deoxynarasinem (Na sůl) a 20-deoxy-epi-17-narasinem (volná kyselina) ukazují poměr koncentrace těkavých mastných kyselin v ošetřených baňkách ke koncentraci v kontrolních baňkách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce VIII.

TABULKA VIII

Sloučenina	Dávka iUg/ml	Poměr ošetřených ke kontrole	celkové těkavé mastné kyseliny
molární % acetátu	molární % propionátu	molární % butyrálu
20-deoxy-epi-17-narasin	10	0,9093	1,2665*	0,6560	1,0325
20-deoxy-epi-17-narasin	5	0,9237	1,1836*	0,8201	1,0487
20-deoxy-epi-17-narasin	2	0,9581	1,0858	0,9414	1,0717
20-deoxynarasin	1	0,8727	1,4597*	0,3942	1,2096
20-deoxynarasin	0,3	0,9084	1,3799*	0,4582	1,1829
20-deoxynarasin	0,1	0,9504	1,2148*	0,6870	1,1892
* Statisticky signifikantní (P < 0,01) LSD test (R. G. D. Steel and „Principles and Procedures of Statistics¹', McGraw-Hill, New York	J. H. Torrie, . N. Y., 1960,	str. 106)

Deoxynarasinová antibiotika podle vynálezu jsou typicky účinná při zvyšování propionátů a tím se zvyšuje využití krmiv. Dávkování přežvýkavcům se provádí orálně v množství od 0,05 mg/kg/den do 5,0 mg/kg/ /den. Nejlepší výsledky byly dosaženy v dávkách asi od 0,1 .mg/kg/den asi do 2,5 mg/ /kg/den. Výhodnou metodou aplikace antibiotika podle vynálezu je smíšení s potravou zvířete, avšak aplikace se může provádět i jinými způsoby, například ve formě tablet, nápojů, pilulek nebo kapslí. Opravy těchto různých dávkových forem se provádějí dobře známými metodami z veterinární farmaceutické praxe. Každá jednotlivá dávková forma má obsahovat množství sloučeniny podle vynálezu, které přímo odpovídá denní dávce pro léčené zvíře.

Vynález se dále týká směsí krmiv upravených pro krmení prežvýkavců, jako je hovězí dobytek a ovce. Tyto směsi krmiv obsahují krmivo pro dobytek a od 1 do 30 g na tunu deoxynarasinového antibiotika.

Disenterie u prasat je běžnou nemocí v

USA a jiných zemích a ročně způsobuje škody po - celém světě. Podle USA patentu 3 947 586 jsou polyetherová antibiotika použitelná při -prevenci a léčení -disenterie u prasat. Vzhledem k tomu, že deoxynarasinová antibiotika jsou novou skupinou polyetherovýc-h antibiotik, měly by být také účinné při prevenci a léčení disenterie u prasat.

Pro prevenci nebo léčení disenterie u prasat se s. výhodou přidává účinné množství deoxynarasinového antibiotika do krmivá. Deoxynarasinová antibiotika podle vynálezu by měla být účinná při prevenci nebo kontrole disenterie u prasat při aplikaci prasatům orálně v množství 35 až asi 150 g aktivní sloučeniny na tunu krmivá. Zejména výhodný poměr by měl být asi 100 g aktivní látky na tunu. I když výhodnou metodou aplikace je smíšení s krmivém, mohou se aktivní sloučeniny také aplikovat jinými způsoby, například ve formě tabletek, nápojů, pilulek nebo kapslí. Každá individuální dávková jednotka by měla obsahovat takové množství antibiotika pode vynálezu, které je přímo· odvozené od vhodné denní dávky zvířete, jež se má léčit.

Vynález se dále týká -směsi krmivá, které obsahuje krmivo -běžně používané pro prasata a účinné množství deoxynarasinového antibiotika. Jak bylo uvedeno výše, účinné množství je takové, které je v rozmezí od 35 g do- 150 g deoxynarasinového antibiotika na tunu krmivá.

Deoxynarasinová antibiotika jsou antivirová a jsou také účinná proti anaerobním bakteriím, jako- je Clostridium perfringens. Deoxynarasinová antibiotika jsou tedy výhodná při léčení nebo- prevenci enteris u kuřat, prasat, hovězího dobytka a ovcí a při léčení enterotoxemie u přežvýkavců.

Určité deoxynarasinové sloučeniny (20-deoxynarasin a jeho soli) vykazují vlastnosti vážící ionty a transportující ionty, a jsou tedy ionofory (ion-bearors) (viz B. C. Pressman, Alkali Metal Chelators-The Iionophores, - v „Inorganlc Bioche^ii^t:ry“, vol. 1, G. L. Eichhorn, Elsevier, 1973). Tyto sloučeniny se mohou použít, jestliže se selektivně mají odstranit určité kationty. Příkladem takovéhoto- použití je odstranění a izolace iontů stříbra z roztoků ve fotografii a odstranění toxických kationtů z průmyslových vod předtím, než se -tyto vypouštějí do přírodního prostředí. Kromě toho se tyto sloučeniny mohou -použít -pro odsolování mořské vody. Deoxynarasinová -sloučenina -se může použít jako- jedna složka ion specifické elektrody (viz Kedem aj., USA patent č. 3 753 887). Tyto sloučeniny mění permeabilitu kationtů jak - v přírodních, tak v umělých membránách. Deoxynarasinová sloučenina se může tedy použít jako složka v membráně použité pro -selektivní transport kationtů proti koncentračnímu gradientu. Jednou z možných aplikací této vlastnosti je izolace těžkých vzácných kovů na průmys lové bázi [viz E. L. Cussler, D. F. Evans a Sister M. A. Matesick, Science 172, 377 (1971)].

Podle dalšího rysu 20-deoxynarasin a jeho soli jsou aktivní jako inhibitory enzymu ATPasy. ATPasa, enzym citlivý na alkalické kovy v buněčných membránách, se zúčastňuje na energii nutné pro aktivní transport. „Aktivní transport“ se týká energie vyžadující -série operací, při které si vnitrobuněčné a mimobuněčné kapaliny udržují své složení. Inhibitory ATPasy redukují energii nutnou pro aktivní transport. Testy in vitro- ukazují, že 20-deoxynarasin (Na sůl) v -množství 0,065 ^g/ml inhibuje transport kationtů ATPasy v mitochondriích jater na polovinu účinné koncentrace.

a jeho· soli jsou také potenciálními kardiotonickými činidly. Při testech na izolovaných předkomorách morčat vykazuje například 20-deoxynarasin zvýšené srdeční stahy. Výsledky tohoto- testu jsou vyjádřeny jako procenta maximální tenze stahů, které vzdorují dávce norepinefrinu (10-4 M). 20-deoxynarasin (Na sůl) v Ю“⁵ M koncentraci produkuje průměrný (± standardní odchylka) vzrůst tenze stahů o- 43,8 % - ± 1,4 (n = 4). Bližší popis tohoto testu viz USA patent 3 985 893.

Vynález tedy zahrnuje také zvýšení kontraktility srdečního- svalu teplokrevných savců, které zahrnuje aplikaci účinné netoxické dávky 20-deoxynarasinu nebo jeho farmaceuticky vhodné soli. Účinná netoxická dávka je v rozmezí asi od 30 asi do- 500 <g/kg tělesné hmotnosti. Výhodná dávka je v rozmezí asi od 30 asi do 100 jzg/kg tělesné hmotnosti. Při této metodě se antibotikum aplikuje parenterálně, například intravenosní infusí. Vhodnou metodou aplikace je metoda infúzní, při které je antibiotikum obsaženo v standardním intravenosním roztoku, jako je dextrosový roztok.

20-deoxynarasin se s výhodou aplikuje v dávkách pod asi 100 ^g/kg, až se dosáhne požadovaného zvýšení kontaktility. Pak se množství 20-deoxynarasinu aplikuje tak, že reguluje rychlost infúze nutné pro- udržení - požadovaného- stavu. Stejně tak jako při klinických aplikacích inotropních činidel, může dávka 20-deoxynarasinu být různá, a. to v závislosti na příslušném klinickém případě a faktorech, jako je individuální tolerance k 20-deoxynarasinu, na stavu poškození srdce, to jest na stupni poškození srdečního svalu a na věku a celkovém fyzickém -stavu pacienta.

Metoda podle vynálezu zahrnuje použití pozitivního inotropního činidla 20-deoxynarasinu, které může použít v řadě klinických situacích, široce klasifikovaných jako kardiogenní šok. Tyto podmínky zahrnují například infarkty myokardu, -srdeční záchvaty způsobené ucpáním a pooperativní srdeční šoky.

Vynález je blíže popsán v následujících příkladech.

Příklad 1

A. Fermentace v třepaných baňkách

Kultura Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 se připraví a udržuje na šikmém agaru následujícího složení:

Složka

Množství

K2HPO4 2g

MgSOé . 7 H2O 0,25g

NH4NO3 2g

СаСОз 2,5g

FeSOi. 7 H2O 0,001g

MnC12. Ί H2O 0,001g

ZnSO4.7 H2O 0,001g glukosa 10g agar 20g deionizovaná voda do 1 litru pH (neupravené)7,7

Šikmý agar se naočkuje kmenem Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 a naočkovaný agar se inkubuje při 30 °C až do 7 dnů. Vzrostlá šikmá kultura se převrství sterilním hovězím sérem a seškrábe se sterilním očkem tak, že se stáhnou spory. Vzniklá suspenze v hovězím séru, obsahující spory a myceliální fragmenty, se lyofilizuje maximálně do 6 peletek.

Jedna lyofilizovaná peletka připravená tímto způsobem se naočkuje do (0 ml vegetativního média následujícího složení:

Složka Množství glukosa 20g sójová mouka 15g kukuřičný výluh 10g

СаСОз 2g voda do 1 litru pH se upraví na 6,5 přidáním

N NaOH.

Naočkované vegetativní médium v 250ml Erlenmeyerově baňce se inkubuje při 30 °C 24 až 48 hodin na rotační třepačce s 250 otáčkami za minutu a výchylka 5,1 cm.

Inkubované vegetativní médium popsané výše (50 ml) se použije pro naočkování 250 ml jednoho z následujících fermentačních médií:

Médium I *Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, Illinois *'Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Mise.

***N-Z Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, New York

Médium II

Složka Množství

Tapioca dextrin* 30g glukosa 15g enzymem hydrolyzovaný kasein** 3g enzymatický hydrolyzát kaseinu*** 1g extrakt z kvasnic2,5 g

СаСОз 2g

MgSO4.7 H2O 1g

Blackstrap melasa 15g čištěný sójový olej 5,0 ml/1

H2O do 1 litru pH (neupravené)6,4 ‘Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, Illinois **Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

***N-Z Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, New York

Médium III

Složka

Množství

sójová mouka	25	g
glukosa	20	g
СаСОз	2,0	g
NazSO4.10 H2O	1,0	g
čištěný sójový olej	20	ml
methyloleát	20	ml
FeSO4.7 H2O	0,6	g
MnC12.4 H2O	0,3	g
askorbová kyselina	0,018 g
deionizované H2O do	1	litru
pH (neupravené)	6,5

Fermentace se provádí až do 10 dnů při teplotě 30 °C na rotační třepačce s 250 otáčkami za minutu a maximální výchylkou 5,1 centimetru.

B. Fermentace v tanku

Složka Množství

Fermentace v tanku se provádí použitím vegetativního a fermentačního média, jaké jsou popsány v oddílu A pro f&rmentaci v třepaných baňkách. Pro fermentaci v tanku se použije 10 ml vegetativního média v druhém stupni ve 21itrové Erlenmeyerově baňce. Po 24 hodinách inkubace při 30 ^OC se 800 ml vegetativního média druhého stupně použije pro naočkování 100 litrů fermentačního média v 1651itrovém fermentačním tanku. Hodnota pH média po sterilizaci při 121 °C po dobu 45 minut je přibližně 6,8 ± ± 0,1. Fermentace se provádí 10 dnů při

Tapioca dextrin* 60 g enzymem hydrolyzovaný kasein** 6 g enzymatický hydrolyzát kaseinu*** 2 g

СаСОз 2 g

MgSO4.7 H2O 0,5 g

Blaclkstrap melasa 15 g čištěný sójový olej 5,0 ml/1

H2O do 1 litru pH (neupravené) 6,6 °C '± 1 °C. Tank se provzdušňuje sterilním vzduchem rychlostí 0,5 objemů vzduchu na objem živného média za minutu a míchání se provádí běžným míchadlém s 300 otáčkami za minutu.

Příklad 2

Izolace deoxynarasinového komplexu

V celkovém fermentačním médiu (4 1) získaném metodou podle příkladu 1 za použití - média II, se sníží pH na 3,0 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové a mícháním po 1 hodinu. Vzniklý roztok se filtruje za použití filtrační pomocné hmoty {125 g Hyflo Super-Cel, diatomické hlinky, John-Manville Corp.j. Oddělený koláč mycelia se extrahuje postupně za použití míchadla množstvím 2 litrů methanolu, obsahujícího 50 g NaHCO3 na litr. Methanolický filtrát se odpaří ve vakuu na objem asi 450 ml, pH tohoto roztoku se upraví na pH

7,5 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Vzniklý roztok se extrahuje dvakrát chloroformem (500 ml) Chloroformové extrakty se spojí, vysuší síranem sodným a filtrují. Filtrát se odpaří ve vakuu -a získá se 2,0 g surového deoxynarasinového komplexu.

P ř í k 1 a d 3

Izolace deoxynarasinu a . epi-deoxynarasinu

Surový deoxynarasinový komplex (2 g), získaný postupem popsaným v příkladu 2, se rozpustí v minimálním množství benzenu a nanese se na kolonu 1,5 x 22 cm silikagelu (Merck 7729). Izolované fralkce, použité rozpouštědlo a získaný výtěžek jsou uvedeny v následující tabulce:

Frakce	Objem	Rozpouštědlo	Poměr -	Výtěžek (mg)
1	3,0 1	bbnzen	100 %	24
2	2,0 1	benzen : ethylacetát	9 : 1	20
3	600 ml	benzen : ethylacetát	4 : 1	85
4	300 ml	benzen : ethylacetát	4:1	5
5	300 ml	benzen : ethylacetát	4 : 1	7
6	900 - ml	benzen : ethylacetát	4 : 1	18
7	2,0 1	benzen : ethylacetát	4 : 1	22
8	300 ml	benzen : ethylacetát	4 : 1	7 .....
9	450 ml	benzen : ethylacetát	4 : 1	22
10	450 ml	benzen : ethylacetát	4 : 1	9
11	1,2 1	benzen : ethylacetát	4 : 1	7
12	1,2 1	benzen : ethylacetát	4 : 1	5
13	1,0 1	benzen : ethylacetát	4 : 1	12
14	1,0 1	benzen : ethylacetát	3 : 1	14
15	1,5 1	benzen : ethylacetát	3 : 1	28
16	1,5 1	benzen : ethylacetát	3 : 1	100
17	450 ml	benzen : ethylacetát	3 : 1	26
18	900 ml	benzen : ethylacetát	3 : 1	70
19	1,0 1	benzen : ethylacetát	3 : 1	54
20	300 ml	ethylacetát	100 %	12
21	150 ml	ethylacetát	100 O/o	180
22	150 ml	ethylacetát	100 o/o	125
23	450 ml	ethylacetát	100 o/o	170
24	300 ml	methanol	100 O/o	40
25	450 ml	methanol	100 o/o	1100

* Získaný po vysušení nad NazSOá, filtraci a odpaření filtrátu ve vakuu k suchu.

Frakce se analyzují chromatografií na tenké vrstvě použitím ethylacetátu jako systému rozpouštědel. Frakce 16 až 17 (126 mg) obsahují 20-deoxy-epi-17-narasin. Frakce 18 až 23 obsahují směs 20-deoxynarasinu a 20-deoxy-epi-17-narasinu.

Směs 20-deoxynarasinu a ' 20-deoxy-epi-17-narasinu, získaná výše uvedeným postupem pro· frakce 18 až 23, se chromatografuje preparativní chromatografií na tenké vrstvě použitím ethylacetátu jako systému rozpouštědel. Směs (105 mg) na jedné desce a 130 mg na druhé desce) se rozpustí v malém množství dichlormethanu a umístí se na silikagelovou (Merek) preparativní desku. Po vyvíjení jsou oba oddělené materiály patrné v ultrafialovém světle. Každý z obou pásů, reprezentující obě látky, se odstraní z desky a extrahuje se směsí dichlormethan : methanol (4:1). V tomto systému se deoxynarasin pohybuje z obou složek pomaleji. Z desky obsahující 105 mg materiálu se získá 7,5 mg 20-deoxy-epi-17-narasinu a 27 mg 20-deoxynarasinu. Z desky obsahující 130 mg směsi bylo izolováno 4,0 mg 20-deoxy-epi-17-narasinu a 56 mg 20-deoxynarasinu.

Příklad 4

Alternativní izolace 20-deoxynarasinu

Celkové fermentační médium (95 1) se upraví na pH 3 přidáním kyseliny chlorovodíkové a pak se míchá 1 hodinu. Přidá se pomocná filtrační hmota (Hyflo Supercel 3 °/o) a médium se filtruje. Oddělený filtrační koláč se dvakrát extrahuje 45 litry acetonu, který obsahuje 50 g NaHCO3 na litr. Acetonové extrakty se spojí a zahuštěním ve vakuu se získá asi 10 litrů vodného roztoku. Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na 8,0 přidáním 5 N kyseliny chlorovodíkové a vzniklý roztok se třikrát extrahuje V2 objemu dichlormethanu. Dichlormethanové extrakty se spojí a odpařením ve vakuu se získá olejovitý zbytek. Tento zbytek se rozpustí v 500 ml vrchní fáze systému rozpouštědel hexan—methanol—voda (10:7:1). Vrchní fáze se šestkrát extrahuje 300 ml dávkami spodní fáze. Tyto extrakty se spojí a zahuštěním ve vakuu se získá odparek, který se rozpustí v dioxanu. Dioxanový roztok se lyofilizuje a získá se 19,4 g deoxynarasinového komplexu.

Několik vzorků získaných stejným způsobem se spojí (40 g), rozpustí v toluenu a nanese se na kolonu silikagelu v kapalném chromatografu (Watersi Associates Prep LC/ /Systém 500). Kolona se eluuje směsí toluenu a ethylacetátu (9:1) rychlostí 250 ml/min a jímají se frakce objemu 250 ml. Obsah frakcí se sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Frakce 37 až 52 se spojí a jejich zahuštěním ve vakuu se získá odparek, který se znovu rozpustí v dioxanu, a lyofilizací se získá 7,8 g vyčištěného materiálu, který je bohatý na 20-deoxynarasin. Tento materiál se znovu chromatografuje na Waters* Prep. LC/System 500 postupem popsaným výše. Po· eluci 50 frakcí směsí toluen—ethylacetát (9:1) se eluční činidlo změní na 100 % ethylacetátu. Frakce 51 až 53 se spojí a odpařením ve vakuu se získá odparek, který se rozpustí v dioxanu a lyofilizací se získá 1,12 g 20-deoxynarasinu ve formě sodné soli.

Příklad 5

Příprava volné kyseliny 20-deoxynarasinu

Sodná sůl 20-deoxynarasinu (200 mg) se rozpustí v ethylacetátu (10 ml). Tento roztok se promyje 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou (10 ml.) a pak dvakrát vodou (5 ml). Vzniklá organická fáze se odpaří k suchu a získá se odparek, který se znovu rozpustí v dioxanu a lyofilizací se získá 139,6 mg volné kyseliny 20-deoxynarasinu ve formě bílé pevné látky.

Příklad 6

Krmivo pro kuřata pro kontrolu kokcidiosy

Vyvážené krmivo· s vysokou výživnou hladinou, upravené pro rychlý hmotnostní přírůstek kuřat, se připraví podle následujícího receptu:

Složka rozemletá žlutá kukuřice sójová mouka z oloupané sóji, extrahovaná rozpouštědlem, jemně rozemletá, 50 % proteinů živočišný tuk (hovězí lůj) vysušená rybí moučka (60 % proteinu) destilační výluhy z kukuřice fosforečnan vápenatý uhličitan vápenatý vitamínová směs (vitamíny A, D, E, K a B12, cholin, niacin, pantothenová kyselina, riboflavin, biotin, s glukosou jako hlavní složkou) sůl (NaCl) stopová minerální směs (MnSOá, ZnO, KJ, FeSCU, CaCO3)

2-amino-4-hydroxymáselná kyselina (hydroxyanalog methioninu)

Deoxynarasinový antibiotický komplex,

20-deoxynarasin nebo 20-deoxy-epi-17-narasin (asi 0,01 o/0 hmot.) se smísí s krmivém běžným míšením. Kuřata krmená tímto krmivém spolu s vodou ad libitum jsou chráněna proti vzniku kokcidiosy.

%	kg
50	453,6
30,9	280,2
6,5	58,9
5,0	45,3
4,0	36,3
1,8	16,3
0,8	7,2
0,5	4,5
0,3	2,7
0,1	0,9
0,1	0,9

Příklad 7

Zlepšené krmivo pro hovězí dobytek

Vyvážené vysoce výživné krmivo pro hovězí dobytek se připraví následujícím způsobem:

složka jemně rozemletá kukuřice rozemleté kukuřičné klasy dehydratovaná mouka z vojtěšky % proteinů sójová mouka z oloupané sóji, extrahovaná rozpouštědlem 50 % proteinů třtinová melasa močovina fosforečnan vápenatý uhličitan vápenatý chlorid sodný směs stopových minerálií vitamín A a D2 směs* vitamín E směs “ proplonát vápenatý * obsahující na 1 kg 4 500 000 mezinárodních jednotek vitamínu A, 513 200 mezinárodních jednotek vitamínu D2 a 877,8 g sójového krmivá s přídavkem 1 % oleje.

“ kukuřičné destilační výluhy obsahující 45 000 mezinárodních jednotek d-a-tokoferyl acetátu na 1 kg.

Deoxynarasinový antibiotický komplex, 20-deoxynarasin nebo 20-deoxy-epi-17-narasin (asi 0,004 % hmotnostní), se smísí s krmivém běžným způsobem. Smíšené krmivo se lisuje do peletek. Průměrná denní dávka je 6,81 kg na zvíře a toto množství odpovídá asi 300 mg antibiotika na zvíře za den.

Příklad 8

;%	kg
67,8	615,6
10	90,8
5	45,4
10	90,8
5	45,4
0,6	5,4
0,5	4,5
0,5	4,5
0,3	2,7
0,03	0,2
0,07	0,7
0,05	0,4
0,15	1,3

Směs se připraví běžnými metodami za použití následujících složek:

složky g/kg aktivní sloučenina150,0 křemičitan vápenatý20,0 uhličitan vápenatý rozemletá moučka z lastur830,0 celková hmotnost 1000 g

Tato směs se přidává do obchodního krmivá pro prasata a smíšením běžným způsobem se získá konečné krmivo, obsahující 100 g aktivní sloučeniny na tunu krmivá.

Zlepšené krmivo pro prasata

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

Způsob přípravy deoxynarasinového antibioticikého komplexu skládajícího se z 20-deoxynarasinu vzoirce I a 20-deoxy-epi-17-narasinu vzorce II nebo· jejich farmaceuticky vhodných solí, vyznačený tím, že se kultivuje Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 v živném médiu obsahujícím asimilovatelné zdroje sacharidů, dusíku a anorganických solí za submersních aerobních fermentačních podmínek, až vznikne dostatečná antibiotická aktivita, načež se antibiotický komplex isoluje ve formě kyselin nebo jejich farmaceuticky vhodných solí.